Abstract
Under spermatogenese hos pattedyr og i Drosophila melanogaster, mannlige kjønnsceller utvikle seg i en rekke viktige utviklingsprosesser. Dette omfatter differensiering fra en stamme cellepopulasjon, mitotisk forsterkning, og meiose. I tillegg, etter meiotisk kimceller gjennomgå en dramatisk morfologisk omforming prosessen så vel som en global epigenetisk rekonfigurering av bakterie linjen kromatin-den histon-til-protamin-bryteren.
Studerer rollen av et protein i post-meiotisk spermatoge hjelp mutagenese eller andre genetiske verktøy er ofte hemmes av avgjørende embryonale, pre-meiotisk, eller meiotisk funksjonene til protein under etterforskning. Den post-meiotisk fenotype av en mutant av et slikt protein kan være skjult gjennom et tidligere utviklings blokk, eller tolkningen av fenotype kan være komplisert. Modellen organisme Drosophila melanogaster tilbyr en bypass på dette problemet: intakte testikler ogselv cyster av kimceller dissekert fra tidlig puppe er i stand til å utvikle ex vivo i dyrkningsmedium. Å gjøre bruk av slike kulturer tillater mikroskopisk avbildning av levende kjønnsceller i testiklene og bakterie linjer cyster. Viktigere, de dyrket testikler og kjønnsceller også blitt tilgjengelig for farmakologiske hemmere, dermed tillater manipulering av enzymatiske funksjoner under spermatogenesen, inkludert post-meiotisk etapper.
Protokollen presenteres beskriver hvordan å dissekere og dyrke pupal testikler og bakterie linjer cyster. Informasjon om utviklingen av pupal testikler og kultur forhold er gitt sammen med mikroskop bildedata av levende testikler og bakterie linjer cyster i kultur. Vi beskriver også en farmakologisk test for å studere post-meiotisk spermatogenese, eksemplifisert ved et assay rettet mot histon-til-protamin-bryteren ved hjelp av histon-acetyltransferase inhibitor anacardic syre. I prinsippet kan denne dyrkningsmetode tilpasses for å møte mange other problemstillinger i pre-og post-meiotisk spermatogenesen.
Introduction
Utviklingen av hannkjønnscellene til mange arter er en sekvensiell prosess. Det er preget av en rekke viktige hendelser som kulminerer i dannelsen av morfologisk og epigenetically høyt spesialisert sædceller. I Drosophila melanogaster, bakterie-line stamceller på tuppen av testis skillet asymmetrisk å gi opphav til en ny stamcelle og spermatogonium, dvs. dattercelle som er forpliktet til differensiering (se figur 1 for en oversikt) 1,2 . Den spermatogonium gjennomgår fire runder med mitotiske divisjoner, og med utbruddet av meiose, en fase med imponerende vekst og transcriptional aktivitet kalt spermatocyte scenen. De celler som stammer fra en spermatogonium forblir koblet til hverandre og utvikle seg som et synkronisert innpakket bunt av to somatiske celler-en struktur som det refereres til som en cyste. Etter fullførelse av meiose, er morfologien av de mannlige kjønnsceller heltomorganisert (skjematisk vist i figur 1). Til å begynne med runde spermatider langstrakt for å danne hydrodynamisk hode struktur, og flagell utvikler seg. Til slutt blir sædcellene skilt fra hverandre ved hjelp av en kompleks, apoptose-relaterte mekanisme kalt individualisering 3-5.
I mange arter, inkludert Drosophila melanogaster og pattedyrarter, de morfologiske endringer av kjønnsceller er ledsaget av en bemerkelsesverdig epigenetisk omorganisering av haploid mannlige bakterie-line kromatin, kalt histoner-til-protamin bryteren (HP switch) 6 - 9. Muligens nesten alle kanonisk histon og mange histon-variantmolekyler er strippet fra DNA og erstattes av små grunnleggende proteiner, de protamines, noe som resulterer i meget kompakt nucleoprotamine struktur bestemt til kromatin av modne sædceller. Generell beskrivelse av HP-bryteren er than utskifting av kanoniske histoner første av histon varianter, så av overgangs proteiner, og til slutt av protamines. Alt dette er ledsaget av flere endringer i epigenetiske merker, som for eksempel en økning i acetylering nivåer av histon H4 like før histoner fjerning 7,10 - 12.
De fleste, om ikke alle, av de ovennevnte prosesser er essensielt for utviklingen av modne, fullt frukt sperm. Dette gjelder ikke bare i Drosophila, men også hos mennesker, som pattedyrspermatogenesen deler en betydelig mengde av likheten med systemet invertebrate 1,8,9. Studerer mannlig bakterie-celle utvikling er mye lettere i Drosophila modellsystemet. Fluer er genetisk svært tilgjengelig. Generering av mutanter, samt etablering av flue stammer uttrykker fusion gener eller RNA-interferens konstruerer tar litt innsats. Imidlertid, i studiet av post-meiotisk spermatogenese, bruk av en mutanterd enkle genetiske verktøy kunne nå en grense. I Drosophila spermatogenesen, opphører transkripsjon nesten helt med inngåelse meiotisk divisjoner. Således er post-meiotisk spermatogenese i hovedsak basert på translasjonelt trykt og lagret mRNA syntetisert i en utvidet meiotisk prophase 13-16. Derfor verktøy som RNA-interferens eller bruk av ikke-betingede mutanter er ikke egnet for å studere spesielt de post-meiotisk roller genprodukter som også oppfyller viktige funksjoner i pre-meiotisk eller meiotisk bakterie celle utvikling.
En fordel med Drosophila som kan utnyttes i slike tilfeller er evnen dissekert intakte testikler og selv cyster av kjønnsceller for å utvikle ex vivo i dyrkningsmedium 4,12,17 - 20. Disseksjon og dyrking av testikler eller bakterie linjer cyster ikke bare tillater mikroskopisk observasjon av bakterie-celle utvikling i levende celler, men enLSO bruk av farmakologiske analyser med, for eksempel, hemmere av enzymet komplekser som histon acetyltransferases (hatt), histon deacetylases (HDACs), topoisomerases, eller proteasom. Således er det mulig å manipulere enzymatiske funksjoner under post-meiotisk spermatogenese, og for å overvåke den utviklingsmessige resultater uavhengig av embryonale, pre-meiotisk eller meiotisk funksjoner 4,12.
I farmakologiske analyser, vi tidligere analyserte acetylering avhengige lokalisering av en bromodomain protein under meiotisk prophase samt relevansen av histon acetylering nivåer for epigenetisk HP bryteren i post-meiotisk spermatogenese ved å bruke spesifikke hemmere rettet hatter og HDACs 12,21. Targeting HP bryteren i disse analysene ble gjort mulig ved hjelp av en flue belastning som uttrykker fusion gener histone2AvD-RFP og protamineB-EGFP 12,22 i de endogene mønstre, og den observasjon atde første spermatider i pupal testiklene passerer gjennom HP veksle mellom 24 og 48 hr APF 12.
Protokollen presenteres beskriver disseksjon av testiklene og cyster fra Drosophila puppe, forholdene kultur, og en farmakologisk analysen med intakte pupal testiklene. For dette formål er pupal testiklene på rundt 24 timer etter at dannelsen puparium (APF) dissekert (se figur 1 og 2). På dette tidspunkt har testiklene ikke gjort forbindelser til andre vev og er omgitt av bare en tynn ytre kappe, som gjør det mulig bedre gjennomtrengning av de hemmende forbindelsene 23,24. Testiklene er bean- eller pæreformede organer som lett kan tas i kultur. Disse prøvene blir dissekert, dyrket og behandlet med spesifikke inhibitorer. Deretter blir virkningene av inhibitorene overvåket ved hjelp av immunfluorescens analyser og fluorescens mikroskopi av fusjonsproteinet ekspresjon, og ved sammenligning av det nukleære morphollogi av de behandlede kjønnsceller til ubehandlede kimceller. Forholdene som presenteres i denne protokollen også tillate direkte avbildning av å utvikle testikler og bakterie linjer cyster på kultur.
Protocol
Etikk uttalelse:
De eksperimentelle prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen innebærer utelukkende jobbe med Drosophila melanogaster og er ikke gjenstand for dyrevelferd lover i Tyskland.
1. Utarbeidelse av Media, verktøy og Fluer
- Forbered endret kommersielt tilgjengelig pulverisert M3 vekst medium uten kalium bikarbonat 17. FORSIKTIG: Irriterer øynene og huden. Supplement medium med 10% føtalt bovint serum, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin. Bruk varmeinaktivert og insekt-kultur-testet fetal bovine serum for best resultat. Filtrer det komplett medium (heretter kalt medium) gjennom et 0,2 mikrometer flasketoppfilter og lagre i aliquoter ved -20 ° C.. Før bruk, filter (0,2 mikrometer sprøyte filter tip) mediet på nytt for å fjerne bunnfall.
- Forbered inhibitor lagerløsninger for de farmakologiske analyser. Oppløsteve kjemikalier i passende løsemiddel og lagre i porsjoner. For eksempel, utarbeide en stamløsning av 28.69 mM anacardic syre (OBS: Irriterer øynene og huden) i dimetylsulfoksyd.
- Forbered verktøy for avbrudd av dissekert pupal testikler og disseksjon av enkelt cyster. Bruk to skarpe og stive nåler, snarere enn en pinsett. Den kapillære kraften som oppstår mellom de to armer av en pinsett gjør disseksjon av enkelt-cyster i små mengder medium meget vanskelig. Bruk for eksempel tuppen av en rustfritt stål insekt pin satt inn en innsprøytning sløyfe holderen.
- For å oppnå passende eldet puppe, frø ca. 10 store kultur ampuller (rør med 4 cm diameter) med et tilstrekkelig antall voksne fluer (ca. 40-60 fluer). Å analysere HP switch, bruker fluer uttrykker H2AvD-RFP og ProtamineB-EGFP i deres endogene mønster 12,16,22. Inkuber hetteglassene under standardbetingelser ved 25; ° C i ca 4-5 dager før tredje instar larver krype opp og starte pupation på veggene i hetteglassene 25.
2. Merking eller Collecting Hvit Pre-puppe du tak i 24-timers gammel puppe for Dissection
- For å teste påvirkning av visse kjemikalier på HP-bryteren, dissekere pupal testikler ved ca 24 timer APF 12. For å få iscenesatt puppe, ta de klargjorte fly kultur ampuller med forpuppes larver (se kapittel 1.4) og identifisere så mange hvite pre-puppe som mulig. Pre-puppe under den aller første skritt i pupation vises som urørlig, ikke-fôring, heller forkortet larver med vrengte spiracles og hvit-farget puparium. Den puparium blir tan-brun i løpet av 30 til 60 min, noe som indikerer den neste fasen av pupal utvikling 26.
- Marker plasseringen av pre-puppe med en permanent markør på utsiden av hetteglassene. Inkuber ampuller ved 25 ° C i ca 24 timer.
- Alternativtvelge den pre-puppe fra siden av hetteglasset med en liten børste fuktet med PBS-buffer. Deretter overfører pre-puppe til siden av en frisk 50 ml reaksjonsrøret og inkuber ved 25 ° C i ca 24 timer.
3. Disseksjon av pupal testikler ved ca 24 timer etter Puparium Formasjonen
- Distribuere flere dråper (ca. 80 mL hver) av medium på en 10 cm plast cellekultur eller petriskål. Ved hjelp av en bred pinsett eller en pensel fuktet med medium, plukke puppe på 24-timers APF scenen fra de ruges ampuller (se pkt 2). Overfør en puppe til hver dråpe medium på fatet.
- For disseksjon, bruk en stereo-mikroskop utstyrt med en fiberoptisk lyset. Ikke varm testiklene ovenfor RT under disseksjon som dette kan hindre utvikling i kultur.
- Dissekere puppe med to par nr 5 tang. Med ett par, ta puppe på sitt mest posteriordel (de bakre spiracles) og hold den i posisjon.
- Ta tak i fremre spiracles med den andre pinsett og åpne pupal operculum på sitt fremre enden. Skrelle av puppestadiet tilfelle inntil minst en del av brystkassen er eksponert.
- Fortsett å holde puppe i posisjon ved sin mest bakende. For å frigjøre det indre trykk i puppe, setter begge armer av en pinsett inn i hoderegionen til puppe.
- Rip puppe åpent ved å åpne tang og flytte pinsett i fremre retning. Sørg for at åpningen generert med denne bevegelsen er så stor som mulig i første forsøk. Unngå skade på puppe på sitt bakre enden før trykket har blitt gitt ut som dette kan føre til at testiklene blir skjøvet direkte gjennom den lille åpningen og oftest blir forstyrret.
- Legg merke til at når puppe er åpnet, den frigjorte interne trykket til puppe presser ut agglomerater av fettkroppsceller og vev gjennom large åpning i hoderegionen. Sjekk om pupal testikler har allerede blitt skjøvet ut av puppe med dette materialet; dette skjer i noen tilfeller. Testiklene er ikke koblet til noen andre vev ved 24 hr APF og derfor kan bli utvist lett fra puppe 23.
- Unngå å klemme på puppe med pinsett, da dette kan skade testiklene hvis de blir værende i puppe. Økning av størrelsen av åpningen ved hjelp av en pinsett.
- Så hold puppe på sitt mest bakende. Lukk andre pinsett og forsiktig strek ut innholdet i puppe fra posterior til anterior å frigjøre testiklene fra puppe.
- Samle testiklene ved å trekke dem inn i en pre-cut 200 mL pipette tips. Prøv å overføre bare en svært liten mengde av mediet for å redusere antall fettkroppsceller som overføres med testiklene. Plasser testiklene i medium i en frisk kultur parabolen. Vask testiklene flere ganger med medium til bare få fett kroppen celles forbli.
- For sanntidsavbildning overføre testiklene til en glassbunn kultur tallerken med medium og bruke en omvendt bildebehandling mikroskop. For farmakologiske analyser, fortsett med trinn 5.
4. Disseksjon av mannlige kjønns linjer cyster og Levende Imaging
- Overføre en eller flere pupal testikkel til en glassbunn kultur parabolen.
- Bruk en stereo-mikroskop med fiberoptisk belysning og to rustfritt stål nåler (se punkt 1.3) for disseksjon av mannlige bakterie linjer cyster.
- Med en nål, forsiktig prøve å peke ut én testikkel på sitt fremre eller bakre enden. Holde det på plass. Sett den andre nål inn i testis og forstyrre testis skjede ved å flytte nålen sidelengs. Mange av cyster vil bli frigitt fra testiklene ved denne bevegelsen.
- Fortsett å holde testis i posisjon med en nål. Forsiktig strek ut de gjenværende cyster fra testis med den andre nål.
- Separate aggregerte cyster enten ved gently flytte en nål sidelengs gjennom klyngen av cyster eller ved å overføre cyster til en frisk kultur tallerken med medium med en 200 mL pipette tips.
- Flytt kultur fatet til en invertert bildebehandling mikroskop for live avbildning av enkelt cyster. Disperse cyster igjen med en nål hvis det er nødvendig.
- Identifisere scenen av cyster ved hjelp fase-kontrast og fluorescens mikroskopi.
- Fokus på en cyste på den ønskede scenen. Bekreft fokus og stillingen av cyste ofte under lengre bildebehandling eksperimenter, som cyster ikke holder seg til bunnen av dyrkningsskål og derfor har en tendens til å flyte ut av fokus.
MERK: Belegg fatet med poly-L-lysin for immobilisering er skadelig for utviklingen av tidlig bakterie linjer cyster. I stedet kan de enkelte cyster isoleres. Med litt trening er det mulig å skille ut en bestemt cyste av svært forsiktig skyve den med nålen. Dette vil tillate overføring av enkelt cyster til egen kulture retter med et glass Pasteur pipette med en langvarig spiss som passer inn i synsfeltet til mikroskopet. De isolerte cyster deretter lett kan flyttes i kultur retter selv etter langvarig inkubering.
5. Farmakologisk analysen med intakte pupal Testikler
- Fyll hver brønn av en 24-brønners cellekulturplate med 500 ul medium for ett eksperiment av 12 replikater. Overføring en pupal testis til hver brønn, ved hjelp av en pre-cut 200 mL pipette tips.
- Kontroller for tilstedeværelse av protamines i de isolerte prøvene ved hjelp av et invertert fluorescens mikroskop. Testiklene skal være fri for ProtamineB-EGFP signal, som indikerer at HP-bryteren ikke har funnet sted i noen av cyster. Bytt testiklene som allerede viser ProtamineB-EGFP-positive cyster.
- Til de første 12 brønnene, tilsett 500 mL av medium som inneholder fortynnet inhibitorforbindelse (anacardic syre) for å nå den ønskede sluttkonsentrasjon(150 pM) i 1 ml medium per brønn. Bruk de resterende brønnene som ubehandlede kontroller; legge til 500 mL av mediet med den samme mengde oppløsningsmiddel som brukes som med de hemmende forbindelsene. Merk: Hvis mange forskjellige forbindelser og oppløsningsmidler blir brukt, kan det være mer effektivt å bruke medium alene som kontroll og for å teste påvirkning av økende konsentrasjoner av løsemidler i separate eksperimenter.
- Inkuber platen ved 25 ° C i 24 timer i mørket.
- Kontroller på nytt for tilstedeværelse av protamines i de inkuberte prøvene som beskrevet ovenfor. Kontroll testiklene skal nå vise en eller flere ProtamineB-EGFP-positive cyster, noe som indikerer overgang gjennom HP bryteren.
- Ved hjelp av en pipette med en 200 mL tips, overføre testiklene til poly-L-lysin-belagt lysbilder, lage squash forberedelser og beis med passende fluorescerende antistoffer som beskrevet andre steder 12,27,28.
Representative Results
Testis i Drosophila hanner er allerede dannet i embryoet og vedvarer i kroppens hulrom under larvestadier. Tredje stadium larver viser små, runde testikler omgitt av et lag av fremtidige pigmentceller og innebygd i fett kroppsvev (Figur 2A). Testiklene hos voksne mannlige fluer er lange, coiled rør, som er dekket av et lag av muskelceller som stammer fra underlivet platen og et pigment lag 24. Interessant, larve testiklene inneholder bare bakterie-linjeceller av pre-meiotisk og meiotisk faser inntil den primære spermatocyte trinn, som tilsvarer meiotisk prophase (se også figur 1) 23. De første årskull av mannlige kjønnsceller passere gjennom meiose under puparium formasjon. Ved ca 24 timer APF, har post-meiotisk trinn med langstrakt flag allerede utviklet, og alle kjerner inneholder histon H2AvD-RFP (figur 1 og 2B). Ingen av spermatider har gjennomgått tHan HP switch som ingen ProtamineB-EGFP signal kan oppdages av fluorescens mikroskopi (figur 2C). Ofte, testiklene dissekert på dette stadium inneholder en auto-fluorescerende struktur av variabel størrelse som minner om et agglomerat av fett kroppens celler, eller en til flere dråper olje (figur 2C, pilspiss). Denne strukturen innen testis er også synlig med fasekontrastmikroskopi. Til dags dato har vi ikke funnet noen beskrivelse av sin natur i litteraturen. Testikler dissekert på 36 hr APF virker strukket og i noen tilfeller allerede begynner å krølle (figur 2D). De har allerede festet til vevet i kjønnsorganene vokser ut fra underlivet imaginal plate 23,24. Videre er de ofte inneholder de første spermatider utover HP-bryter, som angitt ved ProtamineB-EGFP-signalet (figur 1 og 2D, pil). På 48 hr APF, testiklene har ytterligere langstrakt og tydelig starte curling påproksimale ende. Flere bakterie-linje cyster med protamin-positive kjerner bli synlig (figur 2E, pil).
Når testiklene dissekert på 24 timer APF er holdt i kultur for 24 timer, har de ikke forlenge som i intakt fly (sammenlign figur 2D og 2E med figur 6A). Dette er muligens på grunn av en mangel på posisjonelle og vekstsignaler normalt sendes fra utviklings kjønnsorgan kontakte testis på sitt bakre spissen 23,29. Videre gjør muskelen laget av testis skjede ikke utvikle fordi begynnende myotubes ikke kan migrere fra underlivet platen til testis 24. Testis tolle i denne situasjonen utelukkende tynn pigment lag-ser ikke ut til å vokse tilstrekkelig i kulturen til konvolutt det økende antallet utvikle kjønnsceller innenfor. Men kjønnsceller vokser, deler seg, og skille uavhengig av testis slire. Derfor, etter mer enn 36 timersr på kultur, vil de tidlige testiklene ofte sprenge åpne, og videreutvikling er ikke observert. Imidlertid, innenfor en kortere tidsperiode, er det mulig å registrere time-lapse ex vivo levende bilder av hele testikler utvikler seg i kultur, som vist ved figurene 3A -3 C (se også Opplysning video 1). En puppestadiet testis, dissekert ved ca 45 timer APF, ble inkubert i medium i 6 timer og avbildes hver 5 min. Innenfor denne tidsrammen, flere cyster av spermatider dukke opp fra HP bryter scenen og viser en lys ProtamineB-EGFP signal (Tall 3A '-3 C, åpne piler).
Som nevnt ovenfor, mannlige kjønnsceller i Drosophila testikkel utvikle seg som synkroniserte bunter av sammenkoblede celler, kalt cyster en. Figur 4A viser en oversikt over cyster dissekert fra en pupal testikkel på rundt 24 timer APF. Pre-meiotisk stadier, Meiotisk stadier, tidlig post-meiotisk etapper, og også cyster i tidlig kano scenen med langstrakte kjerner før HP-bryteren kan bli funnet (figur 1 og 4B -4 E). De isolerte cyster er svært skjøre og må håndteres med forsiktighet. De to somatiske cellene som danner cyste konvolutt kan lett forstyrres mekanisk. Germ linjer stamceller har evnen til å overleve og fortsette å dele etter genetisk ablasjon av de somatiske cyste celler in vivo 30. Det har blitt rapportert at in vitro, kimceller i 16-celle fasen separert fra deres somatiske konvolutten videreutvikle og differensiere 19. Faktisk, vi la merke til i vår kultur system som antagelig sent spermatocytter fullført meiotisk divisjoner med forstyrret cyste celler, riktignok veldig sjelden. Oftest er disse forstyrret cyster opphørt utvikling. Etter presenterte protokollen, intakte cyster kanskje i noen tilfeller develop ex vivo i dyrkningsmedium i maksimalt 72 timer. Imidlertid observerte vi at et rimelig antall cyster overleve opptil 48 timer med inkubasjon. Innenfor denne tidsrammen, de dyrkede cyster er i stand til å utvikle seg fra den primære spermatocyte scenen før etter meiotisk divisjoner samt fra runden kjerner scenen med histoner baserte kromatin før sent kano scenen utover HP bryter 12. Dette tillater direkte avbildning av vitale prosesser i spermatogenesen, som for eksempel spermatocytter inn meiotisk divisjoner (figur 5 og supplerende video 2). For dette forsøket ble RFP-merket histon variant H2AvD brukt som kromosom markør. Den primære spermatocyte fasen strekker seg ca. 3 dager in vivo 31. Derfor, for å spille inn meiotisk divisjoner, valgte vi cyster med spermatocytter som synlig hadde startet kromatin kondens (figur 5A, region 2). Meiotisk divisjon starter i spermatocytterpå den ene side av cyste, og deretter følger i en bølge i de resterende spermatocytter (i figur 5A fra region 2 til region 1, se også Opplysning video 2). Kondensering av kromatin snart fører til rask bevegelse kromosomer som er synlige som lyse flekker (figur 5A, region 2). Etter 30 min ble de første spermatocytter i denne regionen er allerede i telophase (figur 5B, pilspisser). Kromosomene i den yngre region 1 ordne på metafase plate 20 min senere (figur 5C). De komplette telophase og er klar til å gjennomgå cytokinese ca 15 min senere (figur 5D). Anaphase, telophase, og cytokinese varte ca 10 min i dette opptak (Supplemental video 2).
I pattedyr, så vel som i Drosophila, en markert økning i histon H4 acetylering markerer starten på histon-fjerning og HP bryteren under post-meiotiskspermatoge 6,11. Det har blitt foreslått at dette epigenetisk modifikasjon er en viktig komponent eller trigger av utviklings program av HP bytte 10,32. Tidligere behandlet vi Drosophila pupal testiklene i kultur med hemmere målretting hatter og HDACs å påvirke acetylering nivå av histon H4 under post-meiotisk stadier 12. I disse farmakologiske analyser, har vi funnet at histon acetylering er avgjørende for utviklingen av spermatogenesen fra etapper med histoner baserte kromatin til etapper med protamin-basert kromatin.
Figur 6 og 7 viser representative resultater av analysen ved hjelp av en farmakologisk anacardic syre for å målrette hatter i pupal testiklene. Testikler ved 24-timers APF ble dissekert fra en flue belastning uttrykke H2AvD-RFP og ProtamineB-EGFP. ProtamineB-EGFP protein var fraværende i disse tidlige pupal testiklene (Figur 6A og B). Etter 24 timerr på kultur, kontroll testiklene viste ProtamineB-EGFP signaler som indikerte at de første cyster hadde utviklet utover HP bryteren (Figur 6A ', åpne pilspisser). Dette var ikke tilfellet med prøvene som ble behandlet med 150 pM anacardic syre (figur 6B). Testikkel squash forberedelser og immunofluorescence analyser tilby mer detaljert informasjon (figur 7). I den ubehandlede kontrollen, kan kjerner av relativt store primære spermatocytter bli gjenkjent ved deres karakteristiske mønster av tre regioner av rikt farget DNA, som svarer til de største kromosomer (4C nivå) av Drosophila (figur 7A, kolonne 1). Acetylering av histon H4 er klart detekterbare på dette stadium (figur 7B, kolonne 1). Det første trinnet etter meiotisk divisjoner er kjent som Nebenkern scenen og er kjennetegnet ved ganske store, runde kjerner (se figur 4C, som ikke er vist i Figur 7). Det neste trinn er vist i figur 7 er angitt med flagellar vekst og den runde formen på bakterie cellekjerner, som allerede er mye mindre enn i tidligere stadier (figur 7A, kolonne 2) og viser meget lav til nesten upåviselige nivåer av histon H4 acetylering (figur 7B, kolonne 2). Den runde formen deretter elongates (figur 7A, kolonne 3), og acetylering av histon H4 er igjen tydelig påvisbar (figur 7B, kolonne 3). De spermatider da komme kanoen form scenen der HP bryteren skjer og histoner er erstattet av protamines (7A - 7 C, kolonne 4 og 5). Etter kano stadiet, protaminated kjerner deretter ytterligere langstrakt i en meget tynn nål form på modne sædceller (ikke vist her).
Testikkel squash preparater av testiklene behandlet med anacardic syre viste forskjellige resultater (Tall 7D </ Strong> - 7 F). Den kromatin i kjønnsceller behandlet med anacardic syre dukket opp mer kondensert enn den for den ubehandlede kontroll (sammenlign figur 7D, behandlet og 7A, kontroll). Immunfluorescens analyser avdekket at acetylering av H4 ble sterkt redusert eller fraværende i kjerner av kjønnsceller behandlet med anacardic syre (figur 7E). Det er kjent at høyt acetylerte histoner er forbundet med regioner av åpen kromatin, mens kromatin regioner som mangler histon acetylering ofte viser en undertrykkende struktur 33. Derfor er det ikke overraskende at behandling med syre anacardic påvirket kromatinstruktur av de behandlede bakteriecellekjerner. Viktigere, ble det ikke protamin-positive kjerner av sen kano scenen eller utover identifisert i behandlede testiklene (Figur 7F). Dermed våre data er konsistent med ideen om at HAT aktivitet er viktig for spermiogenesen å fortsette from histon-basert kromatin til protamin-basert kromatin etapper.
Figur 1. Oversikt over Drosophila spermatogenesen. Viser Den venstre panel sekvensen av stadier i bakterie-celle utvikling fra en stamcelle til individualisert sperm. Skjematiske tegninger viser den karakteristiske atom morfologi av kjønnsceller. En spermatogonium deler til å produsere 16 sammenhengende spermatocytter i en cyste. I løpet av denne fasen meste av transkripter som er nødvendig for post-meiotisk utvikling blir produsert, translasjonelt trykt, og lagret. Hovedtyngden av transcriptional aktivitet slutter med inntreden i meiotisk divisjoner. Den histon-til-protamin-bryteren i kromatin finner sted mellom begynnelsen og slutten av kano stadium. Stadier med en histon-basert kromatin er høyopplyst i rødt; stadier med protamin-basert kromatin er markert med grønt. Barene i det høyre panelet viser stadier av kjønnsceller som kan normalt finnes i utviklings testis hos larver, puppe på ca 24 og 36 timer etter puparium dannelse (APF), og voksne fluer.
Figur 2. Drosophila testikler på ulike stadier av utviklingen. (A) Fase kontrastrikt bilde av en litt klemt hel-mount testikkel av en tredje-instar larve (L3). Bare pre-meiotisk og meiotisk stadier kan bli funnet. Spermatogonier er begrenset til den fremre spissen under navet regionen (stjerne). Den gjenværende testikkel er fylt med spermatocytter (åpen pil). (B) Fase kontrastrikt bilde av en litt knust testikkel ved ca. 24 timer etter puparium formasjonen (APF). I tillegg til spermatocytter (åpen pil), inneholder testis spermatider i Nebenkern scenen (åpen pilspisser), med runde kjerner og spermatider i elongating stadier med økende flag (dobbel åpen pilspiss) (C - E). Hel-mount pupal testiklene uttrykke H2AvD-RFP og ProtamineB-EGFP (overlegg av fase-kontrast og EGFP og RFP fluorescens bilder). (C) pupal testikkel dissekert på ca 24 timer APF. Arrowhead markerer auto-fluorescens av antatte fett celler i kroppen. D) pupal testis dissekert på ca 36 hr APF viser det første ProtamineB-EGFP-positive cyste (pil). (E) pupal testikkel på ca 48 hr APF med en gruppe ProtamineB-EGFP-positive cyster (pil). I alle figurdeler, stjernetegn indikere hub regionen. Skala barer: 100 mikrometer.ank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Levende avbildning av histon-til-protamin-bryteren i en puppestadiet testikkel voksende ex vivo. (A) Fase kontrastrikt bilde av en pupal testikkel uttrykke H2AvD-RFP og ProtamineB-EGFP tatt i kultur på ca 45 timer etter puparium formasjonen (APF). Sædblæren er angitt med en fylt pil. En paragonium (dobbelt pilhode) forblir festet til testis. (A ') EGFP og RFP fluorescens av testis vist i (A). Den åpne pilen indikerer en ProtamineB-EGFP-positive cyste. Målestokk:. 100 mikrometer (B) Etter 2 t 30 min i kultur, flere videre cyster (åpen pil) dukke opp frOM den histon-til-protamin overgang. (C) Etter en ytterligere ca. 3 timer i kultur, dvs. et total av 5 timer 29 min i kultur, er en gruppe av cyster (åpen pil) med sterk ProtamineB-EGFP-signalet synlig ved den proksimale enden av testis. Se også Supplemental video 1. I alle figurdeler, stjernetegn indikere hub regionen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Isolerte cyster av kjønnsceller på ulike stadier av utviklingen. (A) Cyster dissekert fra en testikkel på ca 24 timer etter puparium formasjonen (APF). Overlay av fase-kontrast og H2AvD-RFP fluorescens (rød) bilder. Målestokk: 100 mikrometer.(B - E) forstørrelser av enkelt cyster i forskjellige stadier. Overlay kontrast differensial forstyrrelser (DIC) og H2AvD-RFP fluorescens bilder. Målestokk:. 20 mikrometer (B) Cyste i 16 spermatocytter (C) Cyste i 64 runde spermatider på Nebenkern scenen.. Den Nebenkern struktur utvikler seg fra smeltet mitokondrier og er synlig i DIC bilder ved siden av kjernen (åpen pilspiss). (D) Cyste i spermatider med rund H2AvD-RFP-positive kjerner og elongating flag (åpen pilspiss indikerer en elongating Nebenkern struktur som følger med økende axoneme.) (E) Apikale spissen av en cyste i spermatider på et tidlig stadium kano viser et langstrakt kjerneform. Den omfattende langstrakt flag er bare delvis synlig. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Figur 5. Live-avbildning av en enkelt 16-spermatocyte cyste gjennomgår meiose I ex vivo. Fluorescens bilder av en cyste i kultur uttrykker H2AvD-RFP. Avbildet er karakteristiske faser av meiose I. spermatocytter i cyste passere gjennom meiotisk avdelinger i en bølgelignende måte. (A) Kromosom kondensasjon begynner i kjerner i den ene side av cyste (2) og fortsetter gjennom cyste (retningen angitt med pilen ). Kjerner i motstander region (1) representerer et tidligere stadium av kromatin kondens, hvor histon-tett regioner markerer de tre store kromosomer kan fortsatt skimtes. Spermatocytter i regionen (2) inneholder fullt kondensert kromosomer, synlige som lyse fluorescerende flekker. (B) Etter 300; min, de første spermatocytter i regionen (2) er i telophase (åpen pilspisser), mens kromosom kondens fortsetter i regionen (1) (C) I de siste spermatocytter av region (1), er kromosomene (pilspisser) arrangert. på metafase plate 20 min senere. (D) Innenfor en annen 15 min, de siste spermatocytter synes å ha fullført telophase og er nå klar til å gjennomgå cytokinese (åpne pilspisser). Se også Supplemental video 2 Scale bar:.. 50 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Anacardic syre hemmer histon-til-protamin bryter i dyrkede pupal testiklene. Pupal testiklene expressi ng H2AvD-RFP og ProtamineB-EGFP og dissekert på 24 timer etter at dannelsen puparium (APF) ble inkubert i 24 timer i medium uten inhibitor (kontroll, A, A '; DMSO, dimetylsulfoksyd), eller i medium supplert med 150 pM anacardic syre ( B, B '). Hub regioner merket med en stjerne. (A, B) Ingen ProtamineB-EGFP-positive cyster kan observeres etter disseksjon. (A ') Etter 24 timer med inkubasjon, noen cyster gikk histon-til-protamin bryter og ProtamineB-EGFP-positive cyster (åpen pilspisser) kan observeres. (B ') Testikler behandlet med anacardic syre ikke utvikle ProtamineB-EGFP-positive cyster. Målestokk:. 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
68 / 51868fig7highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 7. Anacardic syre påvirker histon H4 acetylering og kromatinstruktur av spermatider Squash preparater av spermatid kjerner fra pupal testiklene (24 hr APF) uttrykker ProtamineB-EGFP inkubert i 24 timer uten inhibitor (A - C). Eller med 150 mikrometer anacardic syre (D - F). DNA farget med Hoechst fargestoff (A og D). H4 acetylering analysert immunofluorescently (B og E). Tilstedeværelse av protamines overvåket med ProtamineB-EGFP signal (C og F). Etter behandling med anacardic syre, vises det kromatin sterkt kompaktert (D) og H4 acetylering signalet er fullstendig redusert i alle spermatid trinn (E). I tillegg er den anacardic-syrebehandledetestiklene viser ingen cyster av sen kano scenen eller utover og ingen ProtamineB-EGFP signal (F). Målestokk:. 10 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplemental Video 1. Live-avbildning via EGFP og RFP fluorescens av histon-til-protamin bryteren i en pupal testikkel vokser ex vivo. Video av 6 timers tid selvfølgelig bildebehandling illustrerer histon-til-protamin overgang av økningen i forekomsten av ProtamineB- EGFP-positive cyster. Bilder ble kjøpt opp hvert 5 min. For detaljer, se figur 3. (Se "suppl_video_1.MOV" under Nedlastinger).
Supplemental Video 2. Live-avbildning av en enkelt 16-spermatocytter cyste gjennomgår meiose I ex vivo. Time-lapse fluorescerende avbildning av encyste på kultur uttrykker H2AvD-RFP i løpet av 80 min. Denne videoen viser de karakteristiske stadier av meiose I. Bilder ble kjøpt hver 1 min. For detaljer, se Figur 5. (Se "suppl_video_2.MOV" under Nedlastinger).
Discussion
Den presenterte protokollen beskriver to forskjellige applikasjoner basert både på evnen til å dissekere Drosophila testikler og enkelt bakterie-linje cyster ved en gitt utviklingsstadiet og på den ex vivo-utvikling av disse celler og vev i en dyrkningsskål. En anvendelse er den farmakologiske manipulering av vitale prosesser i løpet av utvikling av spermiene. Viktigst av alt gir dette tilgang til post-meiotisk spermatogenese som ikke er lett fått hjelp av funksjonelle analyser basert på flue genetikk. Det andre programmet er det mikroskopiske observasjon av levende og utvikle kjønnsceller og testikler. Spesielt dette programmet fordeler fra muligheten av Drosophila celler og organer i kultur for å overleve og utvikle seg på RT og under normal atmosfære. Derfor er tilstrekkelig til å oppnå meningsfulle resultater i rund-avbildnings eksperimenter en invertert avbildning mikroskop utstyrt med et oppvarmet trinn (oppvarming til standard avl temperatur på 25 ° C). Lengermer, mange transgene flue stammer som uttrykker fluorescerende protein-merket proteiner for direkte avbildning eksisterer eller lett kan etableres.
For å få pupal testikler eller bakterie linjer cyster av et bestemt utviklingsstadiet, er det avgjørende at man er kjent med timingen av Drosophila utvikling. Den eksakte tidspunktet for hvert trinn kan variere mellom laboratorier, kultur forhold, og fly stammer og må etableres empirisk. Som beskrevet ovenfor, er dette spesielt viktig for farmakologiske analyser som, for eksempel, er rettet mot HP bryteren. For slike eksperimenter, er det lurt å alltid se etter spermatider med en ProtamineB-EGFP signal før selve inhibitor test fordi timingen kan variere litt selv innenfor en populasjon.
Etter protokollen ovenfor bør sette eksperimentator å dissekere testiklene fra tidlige pupal stadier som intakte organer gratis festet fett kroppsvev. Disse testes og, enda mer så, isolert germ linjer cyster er svært skjøre. Derfor er det avgjørende å utvikle fingerferdighet og erfaring som er nødvendig for håndtering og overføring av testikler og cyster ved hjelp av tang, nåler, og pipetter. Spesielt studier rettet meiotisk og tidlig post-meiotisk bakterie-celle utvikling ville ha nytte av dette. Mens det er relativt enkelt å dissekere cyster av sen spermatider med lange flageller fra voksne testiklene, er det vanskelig å få tidligere stadier. Dissekere disse cyster fra tidlige pupal testiklene følger denne protokollen er mye mer effektiv. Husk at i et vanlig fly belastning, vil bare ca 50% av puppe være mann. Derfor, forberede seg til å dissekere minst dobbelt så mange pupper som antall testiklene nødvendig. Alternativt er det mulig å identifisere hann L3-larver ved hjelp av et stereo-mikroskop, som testes kan identifiseres som gjennomskinnelig rund organer er innebygd i den laterale fett kroppens vev av intakt larve 23,34, og for å samle dem i fersk kultur som ampuller kanbrukes til å plukke pre-puppe for regi og disseksjoner. Det er også mulig å identifisere hann pre-puppe 35.
Vi la merke til at begge de isolerte bakterie linjer cyster og de intakte pupal testiklene i kultur er følsomme for lys, så har også tidligere 18 rapportert. Dette lysfølsomheten kan også holde for noen kjemiske forbindelser som brukes i farmakologiske analyser. Derfor er det best å holde de kultur retter av en måling i mørket i løpet av inkuberingen. På samme måte, når du planlegger time-lapse bildebehandling eksperimenter med utviklings testikler og, spesielt, isolerte cyster, husk at for lange eksponeringstider og / eller altfor høye priser prøvetaking kan hemme ex vivo utvikling. Den riktige samplingsfrekvens bør bestemmes eksperimentelt.
Bakteriell og / eller fungal infeksjon og over-vekst i kultur retter utgjør et alvorlig problem. Infiserte kultur retter med for mange bakterier støtter ikke ex vivo develing av testiklene og cyster. Derfor inneholder den beskrevne kulturmedium penicillin og streptomycin (se trinn 1.1), men ved langtids inkubasjon, kan disse antibiotika bli degradert og deres aktivitet kan avta. Dette kan være en av årsakene til den begrensede tiden for overlevelse (maks. 72 timer) av dyrkede cyster som observeres ved bruk av protokollen ovenfor. Likevel er denne tidsperiode ikke kunne bli forlenget ved regelmessig utskifting av kulturmediet i rettene. Vi konkluderer med at andre faktorer kan påvirke overlevelsen i kultur, som for eksempel en mangel på vekstsignaler fra andre vev i kjønnsorganene. På den annen side er raskere i Drosophila enn i pattedyr etter meiotisk utvikling. I Drosophila, tar spermiogenesen ca 90 timer, og HP switch finner sted mellom 50 og 60 timer etter meiose 9,12. Dermed er de vanlige overlevelsestid på ca 48 timer oppnås med denne protokoll godt egnet til å følge sentrale utviklingsmessige prosesser i spermatogenesis, for eksempel meiotisk divisjoner eller HP-bryteren. Selv om bakteriell eller soppsporer kan unngås ved å bruke rene verktøy og medier, gjør present protokollen ikke gjøre bruk av strengt sterile arbeidsforhold fordi fluer og flue testiklene allerede inneholde bakterier når reist under standardbetingelser. Likevel kan noen programmer av denne kulturen teknikken nytte fluer dissekert eller hevet under aseptiske forhold (for protokoller, se 17,36,37).
Farmakologiske tester er avhengig av bruk av kjemiske forbindelser som virker som inhibitorer eller aktivatorer av forskjellige enzymer. Forbindelsene som vanligvis brukes i slike forsøk ofte variere mye i sine mål spesifisitet. Som en fordel, tilbyr dette potensial til å målrette hele enzym klasser, for eksempel med anacardic syre hemmer P300 / CBP, PCAF og MYST familiemedlemmer av HATS 38. Ulempen med dette kan være potensielle off-target eller cytotoksiske effekter Induktaed av slike forbindelser. Derfor bør hver forbindelse anvendes i en analyse med pupal testikler eller cyster bli testet for sin cytotoksisitet og spesifikk effekt ved forskjellige konsentrasjoner. Videre kan små variasjoner i de dyrkningsbetingelser, sammensatte konsentrasjon eller aktivitet, og variasjoner i cellen permeabilitet føre til variabilitet av de induserte effekter. Derfor er det nødvendig å måle effekten av behandlingen i hvert eksperiment. For eksempel når vi brukte anacardic syre på 150 mikrometer, observerte vi liten variasjon i styrken på kromatin kondens fenotype mellom og noen ganger i løpet av noen testikler, mens acetylering av histoner H4 var konsekvent redusert.
Farmakologiske analyser med Drosophila testikler i kultur har blitt brukt til å analysere pre-og post-meiotisk mekanismer av spermatogenesen 4,12,14,21. Siden det er vanskelig å få tilgang til post-meiotisk spermatogenese med genetiske verktøy for å målrette spillere med Essential pre-meiotisk og meiotisk funksjoner, utgjør dette ex vivo tilnærming et alternativ. Videre, i prinsippet, idet fremgangsmåten kan tilpasses til puls-chase eksperimenter for å følge utviklingen av behandlede kimceller over tid. Imidlertid har vi ennå ikke testet denne muligheten. Å gjøre bruk av tidlig pupal testiklene er en fordel i farmakologiske analyser. Først kan den tynne ytre kappe av de unge pupal testiklene (rundt 24 timer APF) gi økt permeabilitet av kjemiske forbindelser. For det andre, når man studerer post-meiotisk HP switch, pupal testiklene dissekert på 24 timer APF fra Protamine-GFP-uttrykke snøret muliggjøre en direkte avlesning av om HP bryteren var påvirket eller ikke.
Hittil har flere protokoller for ex vivo dyrking av Drosophila organer og vev inkludert testikler og bakterie linjer cyster blitt utviklet (se for eksempel 4,14,17,20,39,40). Dyrkingen medium og de generelle vilkår som benyttesi protokollen som presenteres her ble etablert i 1979 17. Kulturen systemet ble senere tilpasset in vivo avbildning av individualisering mekanismen i slutten av post-meiotisk cyster isolert fra voksne testiklene fire. Tidligere har vi rapportert at disse forholdene også støtte overlevelse og differensiering av meiotisk og tidlig post-meiotisk kjønnsceller i sine cyster for rundt 48 hr 12. I motsetning til andre kultursystemer 19 den observerte utviklings timing i disse kulturene var om lag lik timingen bestemmes fra faste prøver (for detaljer, se 12). H2AvD-RFP og Protamin-GFP fluorescens-signaler kan anvendes for å visualisere det nukleære kromatin morfologi og sammensetning av kjønnsceller i kultur. Vi fant at for entydig identifikasjon av utviklingsstadier i kultur, er dette en fordel i forhold til andre kriterier, for eksempel coiling av cyster. Viktigere, ikke fremlagt protokoll ikke innebære tillegg av fly extRACT eller andre vekst andre enn føtalt bovint serum faktorer. Videre viser vi her at forholdene er kompatibel med fluorescens mikros avbildning av meiotisk divisjoner ex vivo på kultur. Bilder kan fås med rimelig oppløsning i en lett-å-bruke medium som støtter langsiktig utvikling. Dette er i motsetning til protokoller slik kortsiktig (ca. 3 timer) observasjoner i Voltalef olje 41,42.
Prosedyrene som er beskrevet ovenfor for dyrking og farmakologisk behandling av pupal testikler og enkelt mannlige bakterie linjer cyster kan enkelt tilpasses til mange genetiske, epigenetisk, cellebiologiske, eller utviklings spørsmål som kan bli undersøkt i Drosophila spermatogenesen. Dette omfatter særlig forskning med fokus på bakterie-linje stamceller. Det har vist seg at stamcelle utvikling kan følges via direkte avbildning av kultivert voksen testiklene 20,43. Men den peristaltiske bevegelsen av det modne testis slireh forstyrrer bildet oppkjøpet. Derfor er enten avbildning gjort ved hjelp av fragmenterte testiklene 43 eller antall bilde eksperimenter utført må økes for å ta høyde for tapte datasett 20. Tidlig pupal testiklene (24 hr APF) er ennå ikke vedlagt muskelceller. Selv litt eldre testiklene (36-45 hr APF) synes å vise noen peristaltiske bevegelser (sammenlign figur 3 og Supplemental video 1). Derfor kunne dyrking av unge pupal testiklene som intakte organer tjener som et alternativ.
Videre, når de mestrer, evnen til å dissekere pupal testiklene og til slutt isolert bakterie-linje cyster vil tillate ytterligere programmer ved hjelp av enkle cyster som en kilde til en homogen, om enn liten, cellepopulasjon. For eksempel er det således mulig å utføre RT-qPCR å analysere den transkripsjonelle regulering av spesifikke gener under definerte faser av spermatogenese, som det allerede er vist
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anacardic acid | Merck Millipore | 172050 | brand: Calbiochem (EMD Millipore) |
| Anti-acetyl-Histone H4 | Merck Millipore | 06-598 | brand: Upstate |
| AxioCam MRm | Zeiss | ||
| AxioObserver.Z1 inverted microscope | Zeiss | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Dumont 5-Inox forceps | Dumont | multiple suppliers | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Sigma | F4135 | |
| Fiber optical illuminator | multiple suppliers | ||
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5 | Dianova | 711-175-152 | |
| Hoechst | Sigma | B1155 | |
| Inoculation loop or pin holder | multiple suppliers | ||
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0 | Plano GmbH | N5018 | In our hands both of these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter. |
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm | Plano GmbH | N5014 | |
| Multiwell plates, 24-wells | Becton Dickinson | 351147 | brand: Falcon |
| Pen Strep | invitrogen | 15070 | brand: Gibco |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma | S8398 | |
| Stemi SV6 binocular | Zeiss |
References
- Fuller, M. T. Genetic control of cell proliferation and differentiation in Drosophila spermatogenesis. Semin. Cell Dev. Biol. 9 (4), 433-444 (1998).
- de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138 (14), 2861-2869 (2011).
- Tokuyasu, K. T., Peacock, D. W. J., Hardy, R. W. Dynamics of spermiogenesis in Drosophila melanogaster. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 124 (4), 479-506 (1972).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130 (9), 1805-1816 (2003).
- Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can’t live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14 (8), 980-995 (2009).
- Govin, J., Caron, C., Lestrat, C., Rousseaux, S., Khochbin, S. The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis. Eur. J. Biochem. 271 (17), 3459-3469 (2004).
- Hecht, N., Behr, R., Hild, A., Bergmann, M., Weidner, W., Steger, K. The common marmoset (Callithrix jacchus) as a model for histone and protamine expression during human spermatogenesis. Hum. Reprod. 24 (3), 536-545 (2009).
- Kanippayoor, R. L., Alpern, J. H. M., Moehring, A. J. Protamines and spermatogenesis in Drosophila and Homo sapiens. Spermatogenesis. 3 (2), (2013).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochim. Biophys. Acta. , (2013).
- Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Jayaramaiah-Raja, S., Bartkuhn, M., Renkawitz, R., Renkawitz-Pohl, R. Transition from a nucleosome-based to a protamine-based chromatin configuration during spermiogenesis in Drosophila. J. Cell Sci. 120 (9), 1689-1700 (2007).
- Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Histone H4 acetylation is essential to proceed from a histone- to a protamine-based chromatin structure in spermatid nuclei of Drosophila melanogaster. Syst. Biol. Reprod. Med. 56 (1), 44-61 (2010).
- Olivieri, G., Olivieri, A. Autoradiographic study of nucleic acid synthesis during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Mutat. Res. Fund. Mol. Mech. Mut. 2 (4), 366-380 (1965).
- Gould-Somero, M., Holland, L. The timing of RNA synthesis for spermiogenesis in organ cultures ofDrosophila melanogaster testes. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 174 (2), 133-148 (1974).
- Barreau, C., Benson, E., Gudmannsdottir, E., Newton, F., White-Cooper, H. Post-meiotic transcription in Drosophila testes. Development. 135 (11), 1897-1902 (2008).
- Barckmann, B., Chen, X., et al. Three levels of regulation lead to protamine and Mst77F expression in Drosophila. Dev. Biol. 377 (1), 33-45 (2013).
- Cross, D. P., Shellenbarger, D. L. The dynamics of Drosophila melanogaster spermatogenesis in in vitro cultures. J. Embryol. Exp. Morphol. 53 (1), 345-351 (1979).
- Rebollo, E., González, C. Time-Lapse Imaging of Male Meiosis by Phase-Contrast and Fluorescence Microscopy. Drosophila Cytogenetics Protocols. Henderson, D. S. , Humana Press. 77-87 (2004).
- Kawamoto, T., Kawai, K., Kodama, T., Yokokura, T., Niki, Y. Autonomous differentiation of Drosophila spermatogonia in vitro. Dev. Growth Differ. 50 (7), 623-632 (2008).
- Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138 (16), 3367-3376 (2011).
- Leser, K., Awe, S., Barckmann, B., Renkawitz-Pohl, R., Rathke, C. The bromodomain-containing protein tBRD-1 is specifically expressed in spermatocytes and is essential for male fertility. Biol. Open. 1 (6), 597-606 (2012).
- Jayaramaiah Raja, S., Renkawitz-Pohl, R. Replacement by Drosophila melanogaster Protamines and Mst77F of Histones during Chromatin Condensation in Late Spermatids and Role of Sesame in the Removal of These Proteins from the Male Pronucleus. Mol. Cell. Biol. 25 (14), 6165-6177 (2005).
- Bodenstein, D. The postembryonic development of Drosophila. Biology of Drosophila. Demerec, M. , Wiley and Sons. 275-367 (1950).
- Susic-Jung, L., Hornbruch-Freitag, C., Kuckwa, J., Rexer, K. H., Lammel, U., Renkawitz-Pohl, R. Multinucleated smooth muscles and mononucleated as well as multinucleated striated muscles develop during establishment of the male reproductive organs of Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 370 (1), 86-97 (2012).
- Ashburner, M., Roote, J., et al. Laboratory Culture of Drosophila. Drosophila Protocols. Sullivan, W., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 585-599 (2000).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66 (1), 57-80 (1981).
- Hime, G. R., Brill, J. A., Fuller, M. T. Assembly of ring canals in the male germ line from structural components of the contractile ring. J. Cell Sci. 109, 2779-2788 (1996).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., et al. Cytological analysis of spermatocyte growth and male meiosis in Drosophila melanogaster. Drosophila Protocols. W, S. ullivan, et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).
- Stern, C. The growth of testes in Drosophila. I. The relation between vas deferens and testis within various species. J. Exp. Zool. 87 (1), 113-158 (1941).
- Lim, J. G. Y., Fuller, M. T. Somatic cell lineage is required for differentiation and not maintenance of germline stem cells in Drosophila testes. PNAS. 109 (45), 18477-18481 (2012).
- Fuller, M. T. Spermatogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
- Braun, R. E. Packaging paternal chromosomes with protamine. Nature Genet. 28 (1), 10-12 (2001).
- Görisch, S. M., Wachsmuth, M., Tóth, K. F., Lichter, P., Rippe, K. Histone acetylation increases chromatin accessibility. J. Cell Sci. 118 (24), 5825-5834 (2005).
- Demerec, M., Kaufmann, B. P. Drosophila Guide: Introduction to the Genetics and Cytology of Drosophila melanogaster. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1996).
- Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Sang, J. H. The Quantitative Nutritional Requirements of Drosophila Melanogaster. J. Exp. Biol. 33 (1), 45-72 (1956).
- Meynadier, G. Aseptic rearing of invertebrates for tissue culture. In: Invertebrate tissue culture. Vago, C. 1, Academic Press. New York. (1971).
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Price, B. D. Inhibition of histone acetyltransferase activity by anacardic acid sensitizes tumor cells to ionizing radiation. FEBS Lett. 580 (18), 4353-4356 (2006).
- Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. PNAS. 107 (32), 14217-14222 (2010).
- Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).
- Church, K., Lin, H. P. P. Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope. Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).
- Rebollo, E., González, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).
