Abstract
Under spermatogenes hos däggdjur och Drosophila melanogaster, manliga könsceller utvecklas i en rad viktiga utvecklingsprocesser. Detta inkluderar differentiering från en stamcellspopulation, mitotiska förstärkning och meios. Dessutom efter meiotiska könsceller genomgå en dramatisk morfologisk omformning processen samt en global epigenetisk omkonfigurering av groddlinjen kromatin-histon till protamin omkopplare.
Att studera rollen av ett protein i post meiotisk spermatogenes använder mutagenes eller andra genetiska verktyg hindras ofta av avgörande embryonala, pre-meiotisk eller meiotiska funktioner proteinet under utredning. Den post-meiotisk fenotyp av en mutant av ett sådant protein kunde skymmas genom ett tidigare utvecklings blocket, eller tolkning av fenotyp kan vara komplicerat. Den modellorganism Drosophila melanogaster erbjuder en bypass på detta problem: intakta testiklar ochäven cystor av könsceller dissekerade från tidig puppor kan utveckla ex vivo i odlingsmedium. Att använda sig av sådana kulturer möjliggör mikroskopisk avbildning av levande könsceller i testiklarna och i grodden linjer cystor. Viktigt är de odlade testiklar och könsceller blir också tillgänglig för farmakologiska hämmare, varigenom manipulering av enzymatiska funktioner under spermatogenes, inklusive post meiotiska etapper.
Protokollet presenteras beskriver hur man dissekera och odla PUPP testiklar och grodden-line cystor. Information om utvecklingen av PUPP testiklar och odlingsbetingelser finns vid sidan av mikroskopbilddata av levande testiklar och grodden-line cystor i kultur. Vi beskriver också en farmakologisk analys för att studera efter meiotisk spermatogenes, exemplifierad av en analys med inriktning på histon till protamin switch med hjälp av histonacetyltransferas hämmaren anacardic syra. I princip skulle denna odlingsmetod anpassas för att hantera många ovriga forskningsfrågor i före och efter meiotisk spermatogenesen.
Introduction
Utvecklingen av manliga könsceller hos många arter är en sekventiell process. Den kännetecknas av en rad avgörande händelser som kulminerar i bildandet av morfologiskt och epigenetiskt högt specialiserad spermier. I Drosophila melanogaster, grodd-line stamceller vid spetsen av testikel klyftan asymmetriskt för att ge upphov till en ny stamcell och spermatogonium, dvs dottercell som har åtagit sig att differentiering (se figur 1 för en översikt) 1,2 . Den spermatogonium genomgår fyra rundor av mitotiska motsättningar och med uppkomsten av meios, en fas med imponerande tillväxt och transkriptionsaktivitet som kallas spermatocyte stadiet. Cellerna ursprung från en spermatogonium förblir anslutna till varandra och utvecklas som en synkroniserad bunt lindade med två somatiska celler-en struktur kallad en cysta. Efter slutförandet av meios, är morfologin hos de manliga könsceller heltomorganiseras (schematiskt visad i figur 1). Initialt runda spermatider elongate att bilda den hydrodynamiska huvudstruktur och flagellum utvecklas. Så småningom är spermierna separeras från varandra genom en komplex, apoptos-relaterade mekanism kallas individualisering 3-5.
I många arter, inklusive Drosophila melanogaster och däggdjursarter, de morfologiska förändringar av könsceller åtföljs av en anmärkningsvärd epigenetisk ombildning av det haploida manliga könsceller-line kromatin, kallad histon till protamin switch (HP switch) 6-9. Möjligen nästan alla kanoniska histon och många histon-variantmolekyler strippad från DNA och ersätts av små basiska proteiner, de protaminer, vilket resulterar i mycket kompakta nucleoprotamine struktur specifik för kromatin mogna spermier. Allmänna egenskaper hos HP switch är than ersättning av kanoniska histoner först med histon varianter, därefter av övergångs proteiner, och slutligen av protaminer. Allt detta åtföljs av flera ändringar epigenetiska märken, såsom ett uppsving i acetylering nivåer histon H4 precis före histon borttagning 7,10 - 12.
De flesta, om inte alla, av de ovan nämnda processer är avgörande för utvecklingen av mogna, fullt fertila spermier. Detta är sant inte endast i Drosophila utan också i människor, såsom däggdjurs spermatogenes delar en avsevärd mängd av likhet med det ryggradslösa systemet 1,8,9. Studera manliga bakteriefri cellsutveckling underlättas i hög grad i Drosophila modellsystem. Flugor är genetiskt mycket lättillgänglig. Den generation av mutanter samt inrättandet av flyga stammar som uttrycker fusionsgener eller RNA interferens konstruktioner tar lite ansträngning. Men i studien av post-meiotisk spermatogenes, användning av mutanter end enkla genetiska verktyg kunde nå en gräns. I Drosophila spermatogenes upphör transkription nästan helt med inträde i meiotiska divisioner. Således efter meiotisk spermatogenes främst baserad på translation förtryckta och lagrade mRNA syntetiseras i en utökad meiotisk profas 13-16. Därför verktyg som RNA-interferens eller användning av icke-villkorliga mutanter är inte lämpliga för att studera specifikt efter meiotiska roller genprodukter som också fyller viktiga funktioner i pre-meiotisk eller meiotisk könscell utveckling.
En fördel med Drosophila som kan utnyttjas i sådana fall är möjligheten för dissekerade intakta testiklar och även cystor av könsceller att utveckla ex vivo i odlingsmedium 4,12,17 - 20. Den dissekering och odling av testiklar eller bakterie-linje cystor gör inte bara mikroskopisk observation av bakterie-cellutveckling i levande celler, men enlso användning av farmakologiska analyser med, t.ex. hämmare av enzymkomplex såsom histon acetyltransferaser (hattar), histondeacetylaser (HDAC), topoisomeraser eller proteasomen. Således är det möjligt att manipulera enzymatiska funktioner under efter meiotisk spermatogenes och övervaka de utvecklingsresultat oavsett embryonala, pre-meiotiska eller meiotiska funktioner 4,12.
I farmakologiska analyser, tidigare analyserade vi acetylering beroende lokalisering av ett bromodomain protein under meiotisk profas samt relevansen av histonacetylering nivåer för den epigenetiska HP switch i post-meiotisk spermatogenesen genom att använda specifika hämmare riktar hattar och HDAC 12,21. Inriktning HP switch i dessa analyser gjordes möjligt genom att använda en fluga stam som uttrycker fusionsgener histone2AvD-RFP och protamineB-EGFP 12,22 i de endogena mönster och observationen attde första spermatider i PUPP testiklar passerar HP växla mellan 24 och 48 timmar APF 12.
Protokollet presenteras beskriver dissektion av testiklar och cystor från Drosophila puppor, odlingsförhållanden, och en farmakologisk analys med intakta PUPP testiklar. För detta ändamål är PUPP testiklar vid omkring 24 h efter puparium bildning (APF) dissekerades (se figurerna 1 och 2). Vid denna tid, har testiklarna inte gjort kopplingar till andra vävnader och är omgivna av endast ett tunt yttermantel, vilket möjliggör bättre penetration av inhibitorföreningar 23,24. Testiklarna bean- eller päronformad organ som lätt kan tas i kultur. Dessa testiklarna dissekeras, odlade, och behandlas med specifika hämmare. Därefter effekterna av inhibitorer övervakas med immunofluorescens analyser och fluorescensmikroskopi fusionsproteinuttryck, och genom jämförelse av kärn Morpholnik för de behandlade groddceller till den för obehandlade könsceller. De villkor som presenteras i detta protokoll tillåter också levande avbildning utveckla testiklar och grodden linjer cystor i kultur.
Protocol
Etik uttalande:
De experimentella procedurer som beskrivs i detta protokoll innebär uteslutande arbeta med Drosophila melanogaster och är inte föremål för djurskyddslagar i Tyskland.
1 Beredning av media, verktyg, och Flugor
- Förbered modifierad kommersiellt tillgängliga i pulverform M3 medium utan kaliumbikarbonat 17. VARNING: Irriterar ögon och hud. Komplettera medium med 10% fetalt bovint serum, 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin. Använd värmeinaktiv och insekts kultur-testad fetalbovinserum för bästa resultat. Filtrera den fullständigt medium (som nedan kallas medium) genom ett 0,2 fim flaska-top filterenhet och förvara i alikvoter vid -20 ° C. Före användning, filter (0,2 ìm sprutfilter spets) mediet igen för att avlägsna fällningar.
- Förbered hämmare lagerlösningar för de farmakologiska analyser. Dissolve kemikalier i lämpligt lösningsmedel och förvara i alikvoter. Till exempel, bereda en stamlösning av 28.69 mM anacardic syra (VARNING: Irriterar ögon och hud) i dimetylsulfoxid.
- Förbered verktyg för störningar av dissekerade PUPP testiklar och dissektion av enstaka cystor. Använd två vassa och styva nålar, snarare än en pincett. Kapillärkraften som utvecklas mellan de två grenarna av en pincett gör dissektion av enstaka cystor i små mängder medel mycket svårt. Använd till exempel spetsen på en rostfri insekt stift in i en inympning öglehållaren.
- För att erhålla lämpligt åldern puppor, frö ca 10 stora odlingsflaskor (rör med 4 cm diameter) med ett tillräckligt antal vuxna flugor (ca 40-60 flugor). För att analysera HP switch, använd flugor som uttrycker H2AvD-RFP och ProtamineB-eGFP i deras endogena mönster 12,16,22. Inkubera flaskorna under normala förhållanden vid 25, ° C i ca 4-5 dagar tills tredje stadiet larver krypa upp och börja förpuppning på väggarna i ampullerna 25.
2 Markering eller Samla Vit Pre-puppor Skaffa 24h gammal Puppor för Dissection
- För att testa påverkan av vissa kemikalier på HP switch, dissekera PUPP testiklar vid ca 24 tim APF 12. För att få iscensatt puppor, ta de preparerade fluga kulturflaskor med pupating larver (se avsnitt 1.4) och identifiera så många vita pre-puppor som möjligt. Pre-puppor under det allra första steget i förpuppning visas som orörlig, icke-utfodring snarare förkortad larver med vrängs spiracles och vitfärgad puparium. Den puparium blir beigebrunt inom 30 till 60 minuter, vilket visar nästa steg i PUPP utveckling 26.
- Markera positionerna för för-puppor med en permanent markör på utsidan av flaskorna. Inkubera rören vid 25 ° C under ca 24 timmar.
- Alternativtplocka för-puppor från sidan av flaskorna med en liten borste fuktad med PBS-buffert. Sedan överföra pre-puppor till sidan av en färsk 50 ml reaktionsrör och inkubera vid 25 ° C under ca 24 timmar.
3 Dissekering av pupal Testiklar vid ca 24 h efter puparium Formation
- Fördela flera droppar (ca 80 l vardera) av medium på en 10 cm plastcellkultur eller en petriskål. Med hjälp av en bred pincett eller en pensel fuktad med medium, plocka puppor vid 24 hr APF scenen från de inkuberade flaskor (se avsnitt 2). Överför en puppa till varje droppe medium på skålen.
- För dissektion, använd en stereo-mikroskop utrustat med en fiberoptisk belysnings. Värm inte testiklarna ovanför RT under dissektionen eftersom det kan hindra normal utveckling i kulturen.
- Dissekera puppor med två par av nr 5 pincett. Med ett par, ta puppan som mest bakredel (de bakre spiracles) och håll den i läge.
- Ta de anteriora spiracles med den andra pincett och öppna pupal operculum vid sin främre ände. Dra av PUPP fallet fram till åtminstone en del av bröstkorgen är utsatt.
- Fortsätt att hålla puppa på plats av dess mest bakre änden. För att frigöra det inre trycket i puppan, sätt båda grenar en pincett i huvudet regionen i puppan.
- Rip puppan öppna genom att öppna tången och flytta pincetten i den främre riktningen. Se till att öppningen som genereras med denna rörelse är så stor som möjligt i det första försöket. Undvik att skada puppan vid dess bakre ände innan trycket har släppts eftersom det kan leda till att testiklarna skjuts direkt genom den lilla öppningen och oftast störs.
- Observera att när puppan öppnas, den frigjorda inre trycket i puppan pressar ut agglomerat av fett kroppens celler och vävnader genom laRGE öppning i huvudregionen. Kontrollera om PUPP testiklar redan har drivit ut ur puppan med detta material; detta sker i vissa fall. Testiklarna är inte ansluten till någon annan vävnad vid 24 h APF och därför skulle utvisas enkelt från puppa 23.
- Undvik att klämma puppan med pincett eftersom det kan skada testiklarna, om de finns kvar i puppan. Öka storleken på öppningen med en pincett.
- Håll sedan puppan som mest bakre änden. Stäng andra pincett och försiktigt strimma ut innehållet i puppan från bakre till främre att frigöra testiklarna från puppan.
- Samla testiklarna genom att dra dem till en pre-cut 200 mikroliter pipettspets. Försök att överföra endast en mycket liten mängd medium för att minska antalet fett kroppens celler som överförs med testiklarna. Placera testiklarna till medium i en färsk odlingsskål. Tvätta testiklarna flera gånger med medelhög tills endast kroppscell få fettar kvar.
- För levande avbildning, överföra testiklar till en glasbottnad odlingsplatta med medium och använda en inverterad avbildning mikroskop. För farmakologiska analyser, fortsätt med steg 5.
4 Dissektion av manliga könslinjen Cystor och Live avbildning
- Överför en eller flera PUPP testikel till en glasbottnad odlingsskål.
- Använd en stereomikroskop med fiberoptisk belysning och två nålar av rostfritt stål (se avsnitt 1.3) för dissekering av manliga könsceller linjer cystor.
- Med en nål, försiktigt försök att sätta fingret på en testikel vid sin främre eller bakre änden. Håll den på plats. Sätt i den andra nålen i testiklarna och störa testiklarna manteln genom att flytta nålen i sidled. Många av de cystor kommer att frigöras från testiklarna genom denna rörelse.
- Fortsätt att hålla testiklarna på plats med en nål. Försiktigt strimma ut de återstående cystor från testiklarna med den andra nålen.
- Separata aggregerade cystor antingen efter gently flyttar en nål i sidled genom kluster av cystor eller genom överföring av cystor på en färsk odlingsskål med medium med hjälp av en 200 l pipettspets.
- Flytta kulturen skålen till ett inverterat avbildning mikroskop för levande avbildning av enstaka cystor. Skingra cystor igen med en nål om det behövs.
- Identifiera skede av cystor med hjälp av fas-kontrast och fluorescens mikroskopi.
- Fokus på en cysta av den önskade scenen. Bekräfta fokus och position cysta ofta under längre avbildningsexperiment, eftersom cystorna inte håller sig till botten av kulturen skålen och tenderar därför att flyta ur fokus.
OBSERVERA: Beläggning av skålen med poly-L-lysin för immobilisering är till förfång för utvecklingen av tidiga grodden linjer cystor. Istället kan enskilda cystor isoleras. Med lite träning, är det möjligt att peka ut en viss cysta av mycket försiktigt trycka den med nålen. Detta kommer att möjliggöra överföring av enstaka cystor till separat kulture rätter med ett glas pasteurpipett med en utdragen spets som passar in i synfältet för mikroskopet. De isolerade cystor sedan lätt kan flyttas i odlingsskålama med efter långvarig inkubering.
5. Farmakologisk analys med intakta pupal Testiklar
- Fyll varje brunn i en 24-brunnars cellodlingsplatta med 500 | il medium för ett experiment av 12 replikat. Överför en PUPP testis till varje brunn, med hjälp av en pre-cut 200 l pipettspets.
- Kontrollera med avseende på närvaro av protaminer i de isolerade testiklar med ett inverterat fluorescensmikroskop. Testiklarna ska vara fria från ProtamineB-eGFP signal, vilket indikerar att HP brytaren inte har skett i någon av cystor. Byt testiklar som redan visar ProtamineB-EGFP-positiva cystor.
- För de första 12 brunnar, tillsätt 500 l av medium innehållande utspädd inhibitorförening (anacardic acid) för att nå den önskade slutkoncentrationen(150 ^ M) i 1 ml medium per brunn. Använd de återstående brunnarna som obehandlade kontroller; lägga till 500 pl av mediet med samma mängd lösningsmedel som används som med föreningarna inhibitor. Obs: Om många olika föreningar och lösningsmedel användes, kan det vara mer effektivt att använda enbart medium som kontroll och för att testa påverkan av ökande koncentrationer av lösningsmedel i separata experiment.
- Inkubera plattan vid 25 ° C under 24 h i mörker.
- Kontrollera igen med avseende på närvaro av protaminer i de inkuberade testiklar såsom beskrivet ovan. Kontroll testiklar bör nu visa en eller flera ProtamineB-EGFP-positiva cystor, vilket visar övergången från HP switch.
- Med hjälp av en pipett med en 200 l spets, överföra testiklarna att poly-L-lysin-belagda diabilder, gör squash preparat och fläcken med lämpliga fluorescerande antikroppar som beskrivs på annan plats 12,27,28.
Representative Results
Testiklarna i Drosophila hanar redan bildats i embryot och kvarstår i kroppen hålighet under larvstadier. Tredje stadiet larver visar små, runda testiklar omgivna av ett lager av framtida pigmentceller och inbäddade i fett kroppsvävnad (Figur 2A). Testiklar hos vuxna manliga flugor är långa, rullade rör, som omfattas av ett lager av muskelceller som härrör från underlivet skivan och ett pigmentskikt 24. Intressant, larver testiklar innehåller endast bakterie-linjeceller av pre-meiotiska och meiotiska stadier tills den primära spermatocyte stadiet, vilket motsvarar meiotisk profas (se även figur 1) 23. De första grupper av manliga könsceller passerar genom meios under puparium bildning. Vid ca 24 tim APF har post-meiotiska steg med avlånga flag redan utvecklat och alla kärnor innehåller histone H2AvD-RFP (figur 1 och 2B). Ingen av spermatider har genomgått than HP omkopplare som ingen ProtamineB-EGFP-signalen kan detekteras genom fluorescensmikroskopi (figur 2C). Ofta testiklarna dissekerade i detta skede innehåller en auto-fluorescerande struktur av varierande storlek som påminner om ett agglomerat av fett kroppens celler eller en till flera droppar olja (figur 2C, pilspets). Denna struktur inne i testikeln är också synlig med faskontrastmikroskopi. Hittills har vi inte funnit någon beskrivning av dess karaktär i litteraturen. Testiklar dissekerade vid 36 tim APF verkar långsträckt och i vissa fall redan börjar krypa (figur 2D). De har redan fäst vävnaderna i könsorganen växer ut från underlivet imaginal skivan 23,24. Vidare innehåller de ofta de första spermatider bortom HP switch, såsom indikeras av ProtamineB-EGFP signal (fig 1 och 2D, pil). Vid 48 h APF, testiklarna har ytterligare långsträckt och tydligt börjar curling påproximala änden. Flera grodden linjer cystor med protamin positiva kärnor blir synliga (Figur 2E, pil).
När testiklar dissekerade vid 24 tim APF hålls i odling under 24 h, de inte elongate som i intakt flugan (jämför figur 2D och 2E med figur 6A). Detta är möjligen på grund av brist på positions och tillväxtsignaler som normalt sänds från utvecklingskönsorgan i kontakt testiklarna vid dess bakre spets 23,29. Vidare har muskelskiktet i testiklarna slidan inte utvecklas på grund begynnande myotuber inte kan migrera från underlivet skiva till testikeln 24. The testis mantel-i denna situation enbart det tunna pigmentskiktet-verkar inte växa tillräckligt i kultur för att omsluta det ökande antalet utveckla könsceller inom. Men könsceller växer, delar, och differentiera oberoende av testiklarna slidan. Därför, efter mer än 36 timmarr i kultur, kommer de tidiga testiklar ofta öppnat, och vidareutveckling observeras inte. Men, är inom en kortare tidsram det möjligt att spela in time-lapse ex vivo levande bilder av hela testiklar utvecklas i kultur, vilket framgår av figurerna 3A -3 C (se även kompletterande video 1). En PUPP testikel, dissekeras vid ca 45 tim APF, inkuberades i medium under 6 h och avbildat var 5 min. Inom denna tidsram, flera cystor av spermatider dyker upp från HP switch scenen och visar en ljus ProtamineB-eGFP signal (Figur 3A "-3 C, öppna pilar).
Som nämnts ovan, manliga könsceller i Drosophila testiklar utvecklas som synkroniserade buntar av sammankopplade celler, som heter cystor 1. Figur 4A visar en översikt av cystor dissekerade från en PUPP testikel på runt 24 timmar APF. Pre-meiotiska stadier, Meiotiska stadier, tidiga post-meiotiska stadier, och även cystor i början kanot scenen med avlånga kärnor före HP switch finns (figur 1 och 4B -4 E). De isolerade cystor är mycket bräcklig och bör hanteras varsamt. De två somatiska celler som bildar cysta kuvert lätt kan störas mekaniskt. Germ-line stamceller har förmågan att överleva och fortsätta att dividera efter genetisk ablation av de somatiska cysta celler in vivo 30. Det har rapporterats att in vitro, könsceller från 16-cellstadiet separerad från sin somatisk kuvertet ytterligare utveckla och differentiera 19. I själva verket märkte vi i vår kultur system som förmodligen sent spermatocyter avslutade meiotiska divisioner med sönder cysta celler, om än mycket sällan. Oftast är dessa störda cystor upphörde utveckling. Efter den presenterade protokollet, intakta cystor kanske i vissa fall devElop ex vivo i odlingsmedium under högst 72 timmar. Dock konstaterade vi att ett rimligt antal cystor överleva upp till 48 timmar av inkubation. Inom denna tidsram, de odlade cystor kan utvecklas från den primära spermatocyte scenen förrän efter meiotiska divisioner samt från den runda kärnor scenen med histon baserade kromatin tills sent kanotstadium utanför HP växla 12. Detta möjliggör levande avbildning av vitala processer i spermatogenesen, som exempelvis spermatocyter in meiotiska delningar (Figur 5 och Supple video 2). För detta experiment RFP-märkta histon varianten H2AvD som kromosommarkör. Den primära spermatocyte skede sträcker sig ca 3 dagar in vivo 31. Därför, för att spela in meiotiska divisioner, valde vi cystor med spermatocyter som tydligt hade börjat kromatinkondensation (figur 5A, region 2). Meiotisk division startar i spermatocyterpå ena sidan av cystan och sedan följer i en våg i de återstående spermatocyter (i figur 5A från region 2 till region 1, se även kompletterande video 2). Kondensation av kromatin leder snart till snabbrörliga kromosomer som syns som ljusa fläckar (Figur 5A, region 2). Efter 30 min, de första spermatocyter i denna region är redan i telofas (figur 5B, pilspetsar). Kromosomerna i yngre region 1 ordna på metafas plattan 20 min senare (figur 5C). De kompletta telofas och är redo att genomgå cytokines ca 15 min senare (Figur 5D). Anaphase, telofas och cytokines varade ca 10 min i denna inspelning (Supple video 2).
Hos däggdjur, liksom i Drosophila, markerar en uttalad ökning av histon H4 acetylering uppkomsten av histon borttagning och HP switch under post-meiotiskspermatogenes 6,11. Det har föreslagits att denna epigenetiska modifiering är en viktig komponent eller ens avtryckaren på utvecklingsprogram för HP växla 10,32. Tidigare behandlade vi Drosophila PUPP testiklar i kultur med hämmare riktade hattar och HDAC att påverka acetylering nivån histon H4 under efter meiotiska stadier 12. I dessa farmakologiska analyser, fann vi att histonacetylering är viktigt för utvecklingen av spermatogenesen från steg med histon baserade kromatin till stadier med protamin baserad kromatin.
Figurerna 6 och 7 visar representativa resultat från en farmakologisk analys med användning anacardic syra för att rikta hattar i PUPP testiklar. Testiklar på 24 timmar APF dissekerades från en fluga stam som uttrycker H2AvD-RFP och ProtamineB-eGFP. ProtamineB-eGFP proteinet var frånvarande i dessa tidiga PUPP testiklar (Figur 6A och B). Efter 24 timmarr i kultur, kontroll testiklar visade ProtamineB-EGFP-signaler, vilket indikerade att de första cystor hade utvecklats bortom HP switch (Figur 6A ', öppna pilspetsar). Detta var inte fallet med testiklarna som behandlats med 150 | iM anacardic syra (figur 6B). Testikel squash preparat och immunofluorescens analyser ger mer detaljerad information (Figur 7). I den obehandlade kontrollen, kan kärnorna i de relativt stora primära spermatocyter erkännas av deras karakteristiska mönster av tre regioner i rikt stained DNA, som motsvarar de stora kromosomer (4C nivå) av Drosophila (figur 7A, kolumn 1). Acetylering av histon H4 klart detekterbar i detta skede (figur 7B, kolumn 1). Det första steget efter meiotiska delningar är känd som Nebenkern stadium och kännetecknas av ganska stora, runda kärnor (se figur 4C; inte visas i fig 7). Nästa steg som visas i figur 7 identifieras av flagellar tillväxt och den runda formen på könscellskärnor, som redan är mycket mindre än i tidigare skeden (figur 7A, kolumn 2) och visar mycket lågt till nästan omätbara nivåer av histon H4 acetylering (Figur 7B, kolumn 2). Den runda formen förlänger därefter (figur 7A, kolumn 3) och acetylering av histon H4 är återigen klart detekterbar (figur 7B, kolumn 3). De spermatider sedan nå kanotform stadium där HP bytet sker och histoner ersätts av protaminer (figur 7A - 7 C, kolumn 4 och 5). Efter kanot skede protaminated kärnorna sedan ytterligare långsträckt i en mycket tunn nål form i den mogna spermier (visas inte här).
Testikel squash beredningar av testiklar behandlade med anacardic syra visade olika resultat (figur 7D </ Strong> - 7 F). Den kromatin i könsceller behandlade med anacardic syra verkade mer kondenserad än den för den obehandlade kontrollen (jämför fig 7D, behandlades och 7A, kontroll). Immunfluorescens analyser avslöjade att acetylering av H4 var kraftigt minskat eller till och med frånvarande i kärnan av könsceller behandlade med anacardic syra (figur 7E). Det är känt att starkt acetylerade histoner är associerade med regioner av öppen kromatin medan kromatin regioner som saknar histonacetylering visar ofta en repressiv struktur 33. Därför är det inte förvånande att behandling med anacardic syra påverkat kromatinstruktur av de behandlade könscellskärnor. Viktigt var inga protamin positiva kärnor av sena kanotstadium eller utanför identifierats hos behandlade testiklar (Figur 7F). Således våra data överensstämmer med idén att HAT aktivitet är viktigt för spermiogenesen att gå tillbakam histone baserade kromatin till protaminbaserad kromatin steg.
Figur 1 Översikt av Drosophila spermatogenes. Visar den vänstra panelen sekvensen av stegen i bakteriecellsutveckling från en stamcell till individualiserad spermier. Schematiska ritningar visar den karakteristiska nukleära morfologin hos könsceller. En spermatogonium uppdelar att framställa 16 sammankopplade spermatocyter i en cysta. Under detta skede de flesta av transkripten som behövs för post-meiotisk utveckling produceras, translatoriskt tryckt, och lagras. Merparten av transkriptionsaktivitet slutar med inträde i meiotiska divisionerna. Switchen i kromatin histone till protamin sker mellan tidiga och sena kanotstadium. Stadier med histon baserad kromatin är högaupplyst i rött; stadier med protamin baserad kromatin är markerade i grönt. Staplarna i den högra panelen visar stadier av könsceller som normalt återfinns i utvecklings testikel i larver, puppor vid ca 24 och 36 timmar efter puparium bildning (APF) och vuxna flugor.
Figur 2. Drosophila testiklar i olika stadier av utveckling. (A) fas-kontrastbild av en något hoptryckt hel-mount testikel en tredje stadiet larv (L3). Endast för-meiotiska och meiotiska stadier kan hittas. Spermatogonier är begränsade till den främre spetsen nedanför navet regionen (asterisk). Resterande testikel är fylld med spermatocyter (öppen pil). (B) Fas-kontrast bild av en något hoptryckt testikel vid ca 24 h efter puparium bildning (APF). Förutom spermatocyter (öppen pil) innehåller testiklarna spermatider i Nebenkern stadiet (öppna pilspetsar), med runda kärnor och spermatider i förlängning etapper med ökande flag (dubbla öppna pilspets) (C - E). Whole-mount PUPP testiklar uttrycker H2AvD-RFP och ProtamineB-eGFP (överlägg av fas-kontrast och eGFP och RFP fluorescens bilder). (C) PUPP testiklar dissekerade vid ca 24 tim APF. Arrowhead markerar auto-fluorescens förmodade fett kroppens celler. D) PUPP testikel dissekeras vid ca 36 tim APF visar den första ProtamineB-EGFP-positiva cysta (pil). (E) PUPP testis vid ca 48 h APF med en grupp ProtamineB-EGFP-positiva cystor (pil). I alla figure delar, asterisker indikerar navet regionen. Skalstrecken: 100 | im.ank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 Live avbildning av histon till protamin omkopplare i en PUPP testikel växer ex vivo. (A) fas-kontrastbild av en PUPP testikel uttrycker H2AvD-RFP och ProtamineB-eGFP tas i kulturen vid ca 45 h efter puparium bildning (APF). Den sädesblåsa visas med en fylld pil. En paragonium (dubbel pilspets) förblir fäst till testikeln. (A ') EGFP och RFP fluorescens av testiklarna visas i (A). Den öppna pil visar en ProtamineB-EGFP-positiva cysta. Skala bar:. 100 nm (B) Efter 2 tim 30 min i kultur, flera ytterligare cystor (öppen pil) dyker frOM histon till protamin övergången. (C) Efter ytterligare ca 3 h i kultur, dvs, är totalt 5 tim 29 min i kultur en grupp av cystor (öppen pil) med stark ProtamineB-EGFP signal synlig vid den proximala änden av testiklarna. Se även Kompletterande video 1. I alla figurdelar, asterisker anger navet regionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Isolerade cystor av könsceller i olika stadier av utveckling. (A) Cystor dissekeras från en testikel vid ca 24 h efter puparium bildning (APF). Overlay fas-kontrast och H2AvD-RFP fluorescens (röd) bilder. Skala bar: 100 nm.(B - E) förstoringar av enstaka cystor i olika stadier. Overlay av differential interferens kontrast (DIC) och H2AvD-RFP fluorescens bilder. Skala bar:. 20 pm (B) Cysta 16 spermatocyter (C) Cysta på 64 runda spermatider i Nebenkern stadiet.. Den Nebenkern strukturen utvecklas från smält mitokondrier och är synlig i DIC bilder bredvid kärnan (öppen pilspets). (D) Cysta i spermatider med runda H2AvD-RFP-positiva kärnor och förlängning flag (öppen pil indikerar en förlängning Nebenkern struktur som följer med växande axoneme). (E) Apical spetsen av en cysta i spermatider i tidiga kanotstadium visar en långsträckt kärn form. Den omfattande långsträckta flag är endast delvis synlig. Klicka här för att se en större version av denna fIGUR.
Figur 5 Live avbildning av en enda 16-spermatocyte cysta genomgår meios I ex vivo. Fluorescens bilder av en cysta i kultur uttrycker H2AvD-RFP. Avbildad är karakteristiska stadier av meios I. spermatocyter i cystan passera meiotiska delningar i en våg-liknande sätt. (A) Kromosom kondensation startar i kärnorna vid en sida av cysta (2) och fortskrider genom den cysta (riktningen indikerad av pilen ). Kärnor i motståndarlaget region (1) utgör ett tidigare skede av kromatinkondensation där histon-täta områden som markerar de tre stora kromosomer kan ändå skönjas. Spermatocyter i regionen (2) innehåller fullt kondenserade kromosomer, synliga som ljusa fluorescerande fläckar. (B) Efter 300, min, de första spermatocyter i regionen (2) är i telofas (öppna pilspetsar), medan kromosom kondens fortsätter i region (1) (C) Under de senaste spermatocyter i regionen (1), är kromosomerna (pilspetsar) ordnas. vid metafas plattan 20 min senare. (D) Inom ytterligare 15 min, de sista spermatocyter verkar ha avslutat telofas och är nu redo att genomgå cytokines (öppna pilspetsar). Se även Kompletterande video 2 Skala bar:.. 50 pm klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 Anacardic syra hämmar histon till protamin switch i odlade PUPP testiklar. Pupal testiklar expressi ng H2AvD-RFP och ProtamineB-EGFP och dissekerades vid 24 h efter puparium bildning (APF) inkuberades under 24 h i medium utan inhibitor (kontroll; A, A '; DMSO, dimetylsulfoxid) eller i medium kompletterat med 150 | iM anacardic syra ( B, B '). Hub regioner som anges med asterisker. (A, B) Inga ProtamineB-EGFP-positiva cystor kan observeras efter dissektion. (A ') Efter 24 timmars inkubation, några cystor gick histon till protamin switch och ProtamineB-EGFP-positiva kan observeras. (B ') cystor (öppna pilspetsar) Testiklar behandlade med anacardic syra utvecklar inte ProtamineB-EGFP-positiva cystor. Skala bar:. 100 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
68 / 51868fig7highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 7 Anacardic syra påverkar histon H4 acetylering och kromatinstruktur av spermatider Squash beredningar av spermatid kärnor från PUPP testiklar (24 tim APF) uttrycker ProtamineB-EGFP inkuberades i 24 timmar utan inhibitor (A - C). Eller med 150 iM anacardic syra (D - F). DNA färgades med Hoechst färgämne (A och D). H4 acetylering analyserade immunofluorescently (B och E). Närvaro av protaminer som övervakas med ProtamineB-EGFP signal (C och F). Efter behandling med anacardic syra, visas kromatin starkt packad (D) och H4 acetylering signalen helt nedsatt i alla spermatid stadier (E). Dessutom anacardic-syrabehandladetestiklar visar inga cystor av sena kanotstadium eller utanför och ingen ProtamineB-eGFP signal (F). Skala bar:. 10 mikrometer klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Video 1 Live avbildning via eGFP och RFP fluorescens av histon till protamin omkopplare i en PUPP testikel växer ex vivo. Video 6 tim tidsförloppet avbildning illustrerar histon till protamin övergång av den ökade förekomsten av ProtamineB- EGFP-positiva cystor. Bilder förvärvades var 5 min. För detaljer, se figur 3. (Se "suppl_video_1.MOV" under Downloads).
Kompletterande Video 2 Live avbildning av en enda 16-spermatocyter cysta genomgår meios I ex vivo. Time-lapse fluorescerande avbildning av encysta i kultur uttrycker H2AvD-RFP under loppet av 80 minuter. Denna video visar de karakteristiska stadier av meios I. Bilder förvärvades var 1 min. För detaljer, se figur 5. (Se "suppl_video_2.MOV" under Downloads).
Discussion
Den presenterade protokollet beskriver två olika applikationer baserade både på förmågan att dissekera Drosophila testiklar och enstaka bakterie-linje cystor vid ett givet utvecklingsstadium och på ex vivo utvecklingen av dessa celler och vävnader i en odlingsskål. En ansökan är den farmakologiska manipulation av vitala processer under utvecklingen spermier. Viktigt ger denna tillträde till högre meiotisk spermatogenes som inte är lätt vunnit med hjälp av funktionsanalyser baserade på fluga genetik. Det andra programmet är mikroskopisk observation av levande och utveckla könsceller och testiklar. Speciellt denna applikation nytta förmåga Drosophila celler och organ i kultur att överleva och utvecklas vid RT och under normal atmosfär. Därför är tillräcklig för att erhålla meningsfulla resultat i levande-imaging experiment en inverterad avbildning mikroskop utrustat med en uppvärmd skede (uppvärmning till standard avel temperatur av 25 ° C). Vidarefler, många transgena flyga stammar som uttrycker fluorescerande protein-taggade proteiner för levande avbildning existerar eller kan lätt fastställas.
För att få PUPP testiklar eller bakterie-linje cystor av någon särskild utvecklingsstadium, är det viktigt att man känner till tidpunkten för Drosophila utveckling. Den exakta tidpunkten för varje etapp kan variera mellan laboratorier, odlingsbetingelser och flyga stammar och måste fastställas empiriskt. Som beskrivits ovan är detta särskilt viktigt för farmakologiska analyser som till exempel riktar HP switch. För sådana experiment, är det lämpligt att alltid kontrollera om spermatider med ProtamineB-EGFP signalen innan det verkliga provet hämmaren eftersom tidpunkten kan variera något även inom en population.
Efter protokollet ovan skulle göra det möjligt för försöksledaren att dissekera testiklar från tidiga PUPP stadier som intakta organ fria från vidhängande fett kroppsvävnad. Dessa testiklar och, ännu mer, isolerade GErm-line cystor är mycket bräcklig. Därför är det viktigt att utveckla fingerfärdighet och erfarenhet som krävs för att hantera och överföra testiklar och cystor Använd pincett, nålar och pipetter. Speciellt studier inriktade meiotisk och tidig post meiotisk bakteriefri cell utveckling skulle gynnas av detta. Även om det är förhållandevis lätt att dissekera cystor av sena spermatider med långa flageller från vuxna testiklar, är det svårt att få tidigare skeden. Analysera dessa cystor från tidiga PUPP testiklar efter detta protokoll är mycket effektivare. Tänk på att i en vanlig fluga stam, kommer endast ca 50% av puppor vara man. Därför förbereder sig för att dissekera minst dubbelt så många puppor som antalet testiklarna krävs. Alternativt är det möjligt att identifiera manliga L3 larver med hjälp av ett stereomikroskop, eftersom testiklarna kan identifieras som genomskinliga runda organ inbäddade i de laterala vävnader i intakta larven 23,34 fett kropp, och att samla dem i färskt odlingsflaskor som kananvändas för att plocka pre-puppor för stadieindelning och dissektioner. Det är också möjligt att identifiera manliga pre-puppor 35.
Vi märkte att både de isolerade bakterielinje cystor och de intakta PUPP testiklar i kultur är känsliga för ljus, vilket också har tidigare 18 rapporterats. Denna ljuskänslighet kan också hålla för vissa kemiska föreningar som används i farmakologiska analyser. Därför är det bäst att hålla odlingsskålarna av en assay i mörker under inkubation. Likaså när man planerar tidsförlopp imaging experiment med utvecklings testiklar och, framför allt, isolerade cystor, tänk på att alltför långa exponeringstider och / eller alltför höga samplingsfrekvenser kan hämma ex vivo utveckling. Den lämpliga samplingshastighet bör bestämmas experimentellt.
Bakteriell och / eller svampinfektion och över-tillväxt i odlingsskålarna utgör ett allvarligt problem. Infekterade kultur rätter med för många bakterier stöder inte ex vivo utvecklingen av testiklarna och cystor. Därför innehåller det beskrivna odlingsmediet penicillin och streptomycin (se steg 1.1), men under långvarig inkubering kan dessa antibiotika degraderas och deras aktivitet skulle kunna minska. Detta kan vara en av orsakerna till den begränsade tiden för överlevnad (max. 72 timmar) av odlade cystor observerats vid användning av protokollet ovan. Yet denna tidsram kunde förlängas genom regelbunden ersättning av odlingsmediet i varje skål. Vi drar slutsatsen att andra faktorer kan påverka överlevnaden i odling, till exempel en brist på tillväxtsignaler från andra vävnader i könsorganen. Å andra sidan, är post-meiotisk utveckling snabbare i Drosophila än i däggdjur. I Drosophila, tar spermiogenesen cirka 90 timmar, och HP switch äger rum mellan 50 och 60 timmar efter meios 9,12. Således är den vanliga levnadstid på ca 48 h uppnås med detta protokoll väl lämpad att följa centrala utvecklingsprocesser i spermatogenesis såsom meiotiska divisioner eller HP switch. Även bakteriell eller svampkontamination kan undvikas genom att använda rena verktyg och medier, ser fram protokollet inte använda strikt sterila arbetsförhållanden eftersom flugor och flyga testiklar redan innehåller bakterier när höjas under standardförhållanden. Ändå kan vissa tillämpningar av denna kultur teknik gynnas flugor dissekerade eller till och med höjas under aseptiska förhållanden (till protokoll, se 17,36,37).
Farmakologiska analyser beror på användningen av kemiska föreningar som verkar som hämmare eller aktivatorer av olika enzymer. Föreningarna som vanligtvis används i sådana experiment skiljer sig ofta mycket i deras mål specificitet. Som en fördel, erbjuder detta möjligheter att rikta hela enzymklasser, till exempel med anacardic syrahämmande p300 / CBP, PCAF och MYST familjemedlemmar HATs 38. Nackdelen med detta kan vara potentiellt utanför mål eller cytotoxiska effekter Induced av sådana föreningar. Därför bör varje förening som används i en analys med PUPP testiklar eller cystor testas för dess cytotoxicitet och specifik effekt vid olika koncentrationer. Vidare kan små variationer i odlingsbetingelserna, förening koncentration eller aktivitet, och variationer i cellens permeabilitet leder till variabilitet i de inducerade effekter. Därför är det nödvändigt att övervaka framgången för behandling i varje experiment. Till exempel när vi använde anacardic syra vid 150 iM observerade vi smärre variationer i styrkan i kromatinkondensation fenotyp mellan och ibland inom några testiklar, medan acetylering av histon H4 konsekvent minskat.
Farmakologiska analyser med Drosophila testiklar i kultur har använts för att analysera före och efter meiotiska mekanismer spermatogenes 4,12,14,21. Eftersom det är svårt att få tillgång till post-meiotisk spermatogenes med genetiska verktyg för att rikta spelare med essential för-meiotiska och meiotiska funktioner, utgör denna ex vivo tillvägagångssätt ett alternativ. Vidare, i princip den metod skulle kunna anpassas till puls-chase experiment för att följa utvecklingen av behandlade groddceller över tiden. Vi har dock ännu inte testat denna möjlighet. Att använda sig av tidig pupal testiklarna är en fördel i farmakologiska analyser. För det första kan den tunna yttermantel av de unga PUPP testiklar (cirka 24 tim APF) möjliggör förbättrad permeabilitet av kemiska föreningar. För det andra, när man studerar den post meiotiska HP switch, de PUPP testiklar dissekerade vid 24 h APF från Protamin-GFP-uttryck lina möjliggöra en direkt avläsning av om HP switch påverkades eller inte.
Hittills har flera protokoll för ex vivo odling av Drosophila organ och vävnader inklusive testiklar och grodden-line cystor utvecklats (t.ex. se 4,14,17,20,39,40). Odlingen medium och de allmänna villkor som användsi protokollet presenteras här etablerades 1979 17. Odlingssystemet anpassades senare till in vivo avbildning av individualisering mekanismen i sena post meiotiska cystor isolerade från vuxna testiklar 4. Tidigare har vi rapporterat att dessa villkor stöder också överlevnad och differentiering av meiotisk och tidiga post-meiotiska könsceller i sina cystor för cirka 48 timmar 12. Till skillnad från andra odlingssystem 19 den observerade utvecklings timing i dessa kulturer var ungefär i linje med tidpunkten bestäms av fasta prover (för detaljer, se 12). H2AvD-RFP och Protamin-GFP fluorescens signaler kan användas för att visualisera den nukleära morfologi och kromatin sammansättning könsceller i kultur. Vi fann att för tydlig identifiering av utvecklingsstadier i kultur, det är en fördel jämfört med andra kriterier, såsom ringlande av cystor. Viktigt är den presenterade protokollet inte innebära tillsats av flyg extract eller andra än fetalbovinserum tillväxtfaktorer. Dessutom visar vi här att villkoren är förenliga med fluorescensmikroskopi avbildning av meiotiska divisioner ex vivo i kultur. Bilder kan erhållas med rimlig upplösning i ett lättanvänt medium som stödjer långsiktig utveckling. Detta står i kontrast till protokoll som möjliggör kortsiktiga (ca 3 h) observationer i Voltalef Olja 41,42.
De förfaranden som beskrivs ovan för odling och farmakologisk behandling av PUPP testiklar och enda manliga grodden-line cystor är lätt att anpassa till många genetiska, epigenetiska, cellbiologiska, eller utvecklings frågor som kan undersökas i Drosophila spermatogenes. Detta innefattar särskilt forskning med fokus på grodden linjer stamceller. Det har visat sig att stamcellsutveckling kan följas av levande avbildning av odlade vuxna testiklar 20,43. Emellertid den peristaltiska rörelsen i det mogna testikel mantelh stör bilden förvärvet. Därför är antingen avbildning görs med hjälp av fragmente testiklar 43 eller antalet imaging experiment utförda måste ökas för att ta hänsyn till förlorade datamängder 20. Tidiga PUPP testiklar (24 hr APF) är ännu inte bifogas muskelceller. Även lite äldre testiklar (36-45 tim APF) tycks visa några peristaltiska rörelser (jämför figur 3 och Supple video 1). Därför kan odling av unga PUPP testiklar såsom intakta organ tjäna som ett alternativ.
Dessutom, när behärskar, förmågan att dissekera PUPP testiklar och slutligen isolerade grodden linjer cystor gör att ytterligare ansökningar, använder en cystor som källa till en homogen, om än liten, cellpopulation. Till exempel är det således möjligt att utföra RT-qPCR att analysera transkriptionell reglering av specifika gener under definierade stadier av spermatogenes, såsom redan har visats
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anacardic acid | Merck Millipore | 172050 | brand: Calbiochem (EMD Millipore) |
| Anti-acetyl-Histone H4 | Merck Millipore | 06-598 | brand: Upstate |
| AxioCam MRm | Zeiss | ||
| AxioObserver.Z1 inverted microscope | Zeiss | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Dumont 5-Inox forceps | Dumont | multiple suppliers | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Sigma | F4135 | |
| Fiber optical illuminator | multiple suppliers | ||
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5 | Dianova | 711-175-152 | |
| Hoechst | Sigma | B1155 | |
| Inoculation loop or pin holder | multiple suppliers | ||
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0 | Plano GmbH | N5018 | In our hands both of these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter. |
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm | Plano GmbH | N5014 | |
| Multiwell plates, 24-wells | Becton Dickinson | 351147 | brand: Falcon |
| Pen Strep | invitrogen | 15070 | brand: Gibco |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma | S8398 | |
| Stemi SV6 binocular | Zeiss |
References
- Fuller, M. T. Genetic control of cell proliferation and differentiation in Drosophila spermatogenesis. Semin. Cell Dev. Biol. 9 (4), 433-444 (1998).
- de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138 (14), 2861-2869 (2011).
- Tokuyasu, K. T., Peacock, D. W. J., Hardy, R. W. Dynamics of spermiogenesis in Drosophila melanogaster. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 124 (4), 479-506 (1972).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130 (9), 1805-1816 (2003).
- Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can’t live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14 (8), 980-995 (2009).
- Govin, J., Caron, C., Lestrat, C., Rousseaux, S., Khochbin, S. The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis. Eur. J. Biochem. 271 (17), 3459-3469 (2004).
- Hecht, N., Behr, R., Hild, A., Bergmann, M., Weidner, W., Steger, K. The common marmoset (Callithrix jacchus) as a model for histone and protamine expression during human spermatogenesis. Hum. Reprod. 24 (3), 536-545 (2009).
- Kanippayoor, R. L., Alpern, J. H. M., Moehring, A. J. Protamines and spermatogenesis in Drosophila and Homo sapiens. Spermatogenesis. 3 (2), (2013).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochim. Biophys. Acta. , (2013).
- Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Jayaramaiah-Raja, S., Bartkuhn, M., Renkawitz, R., Renkawitz-Pohl, R. Transition from a nucleosome-based to a protamine-based chromatin configuration during spermiogenesis in Drosophila. J. Cell Sci. 120 (9), 1689-1700 (2007).
- Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Histone H4 acetylation is essential to proceed from a histone- to a protamine-based chromatin structure in spermatid nuclei of Drosophila melanogaster. Syst. Biol. Reprod. Med. 56 (1), 44-61 (2010).
- Olivieri, G., Olivieri, A. Autoradiographic study of nucleic acid synthesis during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Mutat. Res. Fund. Mol. Mech. Mut. 2 (4), 366-380 (1965).
- Gould-Somero, M., Holland, L. The timing of RNA synthesis for spermiogenesis in organ cultures ofDrosophila melanogaster testes. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 174 (2), 133-148 (1974).
- Barreau, C., Benson, E., Gudmannsdottir, E., Newton, F., White-Cooper, H. Post-meiotic transcription in Drosophila testes. Development. 135 (11), 1897-1902 (2008).
- Barckmann, B., Chen, X., et al. Three levels of regulation lead to protamine and Mst77F expression in Drosophila. Dev. Biol. 377 (1), 33-45 (2013).
- Cross, D. P., Shellenbarger, D. L. The dynamics of Drosophila melanogaster spermatogenesis in in vitro cultures. J. Embryol. Exp. Morphol. 53 (1), 345-351 (1979).
- Rebollo, E., González, C. Time-Lapse Imaging of Male Meiosis by Phase-Contrast and Fluorescence Microscopy. Drosophila Cytogenetics Protocols. Henderson, D. S. , Humana Press. 77-87 (2004).
- Kawamoto, T., Kawai, K., Kodama, T., Yokokura, T., Niki, Y. Autonomous differentiation of Drosophila spermatogonia in vitro. Dev. Growth Differ. 50 (7), 623-632 (2008).
- Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138 (16), 3367-3376 (2011).
- Leser, K., Awe, S., Barckmann, B., Renkawitz-Pohl, R., Rathke, C. The bromodomain-containing protein tBRD-1 is specifically expressed in spermatocytes and is essential for male fertility. Biol. Open. 1 (6), 597-606 (2012).
- Jayaramaiah Raja, S., Renkawitz-Pohl, R. Replacement by Drosophila melanogaster Protamines and Mst77F of Histones during Chromatin Condensation in Late Spermatids and Role of Sesame in the Removal of These Proteins from the Male Pronucleus. Mol. Cell. Biol. 25 (14), 6165-6177 (2005).
- Bodenstein, D. The postembryonic development of Drosophila. Biology of Drosophila. Demerec, M. , Wiley and Sons. 275-367 (1950).
- Susic-Jung, L., Hornbruch-Freitag, C., Kuckwa, J., Rexer, K. H., Lammel, U., Renkawitz-Pohl, R. Multinucleated smooth muscles and mononucleated as well as multinucleated striated muscles develop during establishment of the male reproductive organs of Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 370 (1), 86-97 (2012).
- Ashburner, M., Roote, J., et al. Laboratory Culture of Drosophila. Drosophila Protocols. Sullivan, W., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 585-599 (2000).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66 (1), 57-80 (1981).
- Hime, G. R., Brill, J. A., Fuller, M. T. Assembly of ring canals in the male germ line from structural components of the contractile ring. J. Cell Sci. 109, 2779-2788 (1996).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., et al. Cytological analysis of spermatocyte growth and male meiosis in Drosophila melanogaster. Drosophila Protocols. W, S. ullivan, et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).
- Stern, C. The growth of testes in Drosophila. I. The relation between vas deferens and testis within various species. J. Exp. Zool. 87 (1), 113-158 (1941).
- Lim, J. G. Y., Fuller, M. T. Somatic cell lineage is required for differentiation and not maintenance of germline stem cells in Drosophila testes. PNAS. 109 (45), 18477-18481 (2012).
- Fuller, M. T. Spermatogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
- Braun, R. E. Packaging paternal chromosomes with protamine. Nature Genet. 28 (1), 10-12 (2001).
- Görisch, S. M., Wachsmuth, M., Tóth, K. F., Lichter, P., Rippe, K. Histone acetylation increases chromatin accessibility. J. Cell Sci. 118 (24), 5825-5834 (2005).
- Demerec, M., Kaufmann, B. P. Drosophila Guide: Introduction to the Genetics and Cytology of Drosophila melanogaster. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1996).
- Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Sang, J. H. The Quantitative Nutritional Requirements of Drosophila Melanogaster. J. Exp. Biol. 33 (1), 45-72 (1956).
- Meynadier, G. Aseptic rearing of invertebrates for tissue culture. In: Invertebrate tissue culture. Vago, C. 1, Academic Press. New York. (1971).
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Price, B. D. Inhibition of histone acetyltransferase activity by anacardic acid sensitizes tumor cells to ionizing radiation. FEBS Lett. 580 (18), 4353-4356 (2006).
- Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. PNAS. 107 (32), 14217-14222 (2010).
- Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).
- Church, K., Lin, H. P. P. Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope. Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).
- Rebollo, E., González, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).
