Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

مسطحة طوابق منصة رفع الهواء و: طريقة جديدة للجمع بين السلوك مع الميكروسكوب أو الكهربية على استيقظ تتحرك بحرية القوارض

Published: June 29, 2014 doi: 10.3791/51869
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1,2, 2, 2, 1, 3, 4, 1, 1, 1
1Neuroscience Center, University of Helsinki, 2Neurotar LTD, 3A. I. Virtanen Institute for Molecular Sciences, University of Eastern Finland, 4Laboratory Animal Center, University of Helsinki

Summary

هذا الأسلوب يخلق بيئة مألوفة ملموسة للماوس للتنقل واستكشاف أثناء التصوير أو وحيدة الخلية التسجيلات الكهربية المجهرية، التي تتطلب تثبيت الشركة من رأس الحيوان.

Abstract

ومن المعترف به على نطاق واسع أن استخدام التخدير العام يمكن أن تقوض أهمية البيانات الكهربية أو مجهرية تم الحصول عليها من دماغ حيوان حي في. وعلاوة على ذلك، فإن الانتعاش طويلة من التخدير يحد من تواتر نوبات متكررة تسجيل / التصوير في الدراسات الطولية. وبالتالي، يتوقع أساليب جديدة من شأنها أن تسمح التسجيلات مستقرة من الفئران التصرف غير تخدير للمضي قدما في مجالات علوم الأعصاب الخلوية والمعرفية. وتتراوح الحلول القائمة من مجرد التقييد الجسدي إلى نهج أكثر تطورا، مثل المطاحن والخطية كروية تستخدم في تركيبة مع الواقع الافتراضي الحاسوب ولدت. هنا، يتم وصف أسلوب الرواية حيث ماوس الثابتة الرأس يمكن التحرك على homecage المتنقلة رفع الهواء واستكشاف بيئتها في ظل ظروف خالية من الإجهاد. يسمح هذا الأسلوب للباحثين لإجراء اختبارات سلوكية (على سبيل المثال، والتعلم، التعود أو الاعتراف الكائن رواية) في وقت واحد معثنائي الفوتون التصوير المجهري و / أو تسجيلات التصحيح، المشبك، كلها مجتمعة في تجربة واحدة. توضح هذه المقالة الفيديو، استخدام جهاز تثبيت الرأس الحيوان مستيقظا (homecage المحمول)، يوضح إجراءات التعود الحيوان، وتجسد عددا من التطبيقات المحتملة لهذه الطريقة.

Introduction

اتجاها مثيرا الأخيرة في علوم الأعصاب هو تطوير المناهج التجريبية لالجزيئية والخلوية تحقق من الشبكات العصبية في دماغ مستيقظا، يتصرفون القوارض. هذه النهج عقد الوعد لتسليط الضوء من جديد على العمليات العصبية التي تكمن وراء وظيفة الحركة، والتكامل الحسي، والإدراك، والتعلم، والذاكرة، وكذلك تطور الإصابة، تنكس عصبي والأمراض الوراثية. علاوة على ذلك، تسجيل من الدماغ الحيوان مستيقظا ويبشر بالخير في تطوير عوامل علاجية جديدة وعلاجات.

هناك وعي متزايد بأن التخدير، والتي كانت تستخدم عادة في التجارب العصبية، يمكن أن تؤثر على الآليات الأساسية من وظائف المخ، مما قد يؤدي إلى تفسير خاطئ للنتائج التجريبية. وبالتالي، فإن مخدر الكيتامين تستخدم على نطاق واسع يزيد بسرعة تشكيل العمود الفقري شجيري جديدة ويعزز وظيفة متشابك 1؛ anesthet آخر استخداماجيم isoflurane وعلى مستويات التخدير الجراحي يقمع تماما النشاط القشرية عفوية في الفئران حديثي الولادة وكتل التذبذبات المغزل المتفجر في الحيوانات البالغة 2. في الوقت الحاضر، سوى عدد محدود من النهج تمكين التجارب على الفئران غير تخدير عن طريق اثنين من الفوتون التصوير المجهري أو تسجيلات التصحيح، المشبك. ويمكن تقسيم هذه الطرق إلى الاستعدادات تتحرك والثابت الرأس بحرية.

جاذبية فريدة من إعداد الحيوانات تتحرك بحرية هو أنه يتيح تقييم السلوك الطبيعي، بما في ذلك حركات الجسم كله أثناء التنقل. طريقة واحدة لصورة داخل المخ من القوارض تتحرك بحرية هو أن نعلق المجهر رئيس محمولة المنمنمة أو أليافي 3-5. ومع ذلك، الأجهزة المنمنمة تميل إلى أن تكون محدودة في الأداء البصري مقارنة القائم على الهدف اثنين من الفوتون المجهري، ولا يمكن الجمع بسهولة مع خلية كاملة التسجيلات التصحيح، المشبك 6.

وEXIوقد اعتمدت الحلول لدغة التلاعب بنتائج رئيس والقوارض مستيقظا في المقام الأول إما على ضبط النفس الجسدي أو 7،8 على تدريب الحيوانات لعرض الطوعية مساند الرأس 9. نهج شعبي آخر هو السماح للأطراف الحيوان لنقل بوضعه على، على سبيل المثال، حلقة مفرغة كروية 10؛ وغالبا ما الجمع بين هذا النهج مع الواقع الافتراضي الحاسوب ولدت. التجارب على الفئران الكهربية الثابتة الرأس وتستخدم في الغالب تسجيلات خارج الخلية، وكانت تستخدم لدراسة التنظيم المركزي وظيفة القلب والأوعية الدموية 11، آثار التخدير على نشاط الخلايا العصبية 12، الاستجابة السمعية في الدماغ ومعالجة المعلومات 13 14. وأجريت التسجيلات الخلايا الرائد / خلية كاملة في الحيوانات التصرف مستيقظا في 2000s وركزت على النشاط العصبي المتصلة الإدراك والحركة 15-20. في نفس الوقت تقريبا، تم حانة أول دراسات التصوير المجهري على الفئران مستيقظاأسسنا، حيث تم استخدام اثنين من الفوتون المجهري في القشرة الحسية الفئران أمسكوا 7 وعلى الفئران الجري في حلقة مفرغة كروية 21.

أظهرت اللاحقة في الجسم الحي المجهري والكهربية الدراسات أن إعداد رئيس تثبيت ويمكن الجمع بين بنجاح مع النماذج السلوكية على أساس الحركات forelimb، والتعرف على الرائحة، والخفقان، ولعق 8،22-25. وضعت الفئران في حلقة مفرغة كروية يمكن تدريبهم على التنقل في البيئة البصرية الظاهرية التي تم إنشاؤها بواسطة الكمبيوتر 10،26. أظهرت تسجيلات داخل الخلايا / خارج الخلية أنه في الحيوانات ثابتة الرأس التنقل مثل هذه البيئة الافتراضية، وتنشيط خلايا قرن آمون مكان يمكن أن يتم الكشف عن 27. في بيئة افتراضية بصرية، والفئران تثبت العادية المتصلة حركة إيقاع ثيتا في إمكانات الميدانية المحلية وثيتا المرحلة السبق حركة نشطة خلال 27. في الآونة الأخيرة، وactivit المكانية والزمانيةوسجلت أنماط ذ من السكان العصبية في الفئران بصريا أثناء العمل مهام قرار الذاكرة في بيئة افتراضية 28.

على الرغم من تمكين البحوث اختراق، تصميم مفرغه كروية لديها العديد من القيود الملازمة. أولا، يتعين على الحيوان للتحرك على سطح غير محدود من الكرة رفع الهواء بالتناوب، والتي لا تشكل عقبات ملموسة مثل الجدران أو الحواجز. هذا القيد هو في جزء منه فقط تعويض من "الواقع الافتراضي" الحاسوب ولدت، لأن المدخلات البصرية يمكن القول أقل فعالية على الفئران والجرذان بالمقارنة مع المدخلات الحسية عن طريق اللمس (على سبيل المثال، ضئيلة للغاية للمس أو لعق)، والتي تعتمد هذه الأنواع بشكل طبيعي على. الثانية، وانحناء كبيرة من سطح الكرة قد تكون غير مريحة للفئران المختبر تستخدم ليمشي على أرضية مسطحة في أقفاصها. وأخيرا، فإن قطر الهائل على الكرة (200 مم على الأقل بالنسبة للفئران والجرذان 300 ملم ل) يجعل حجم العمودي للكرويةجهاز مفرغة كبيرة نسبيا. وهذا يجعل من الصعب الجمع بين مفرغه كروية مع غالبية الاجهزة المجهر المتاحة تجاريا، وغالبا ما يتطلب بناء الإعداد الجديد حول حلقة مفرغة من خلال المجهر إطارات مصنوعة خصيصا.

هنا، يتم وصف أسلوب الرواية حيث ماوس الثابتة الرأس يمكن التحرك على homecage المتنقلة رفع الهواء التي تحتوي على أرضية مسطحة وجدران ملموسة، واستكشاف البيئة المادية في ظل ظروف خالية من الإجهاد. يوضح هذا المقال إجراءات التدريب الماوس ورئيس التثبيت، ويقدم أمثلة ممثل حيث يتم تنفيذ اثنين من الفوتون المجهري، والتصوير الضوئي الذاتية والتصحيح، المشبك التسجيلات في دماغ الفئران التصرف مستيقظا.

Protocol

تم تنفيذ كافة الإجراءات المعروضة هنا وفقا لتوجيهات المحلية لرعاية الحيوانات (والقانون الفنلندي على التجارب على الحيوانات (62/2006)). تم الحصول على رخصة الحيوان (ESAVI/2857/04.10.03/2012) من السلطة المحلية (ELÄINKOELAUTAKUNTA-إيلا). بقيت الفئران البالغين (سن 1-3 شهور ووزن 20-40 جم) في أقفاص مجموعة السكن في منشأة الحيوان مصدقة من جامعة هلسنكي وتوفير الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية.

1. القحف زرع النافذة

هو مزروع في الجمجمة نافذة وفقا لبروتوكولات نشرت 29-31 مع تعديلات طفيفة، كما هو موضح أدناه بإيجاز:

  1. تعقيم الأدوات قبل البدء في الجمجمة نافذة زرع. الحفاظ على ظروف معقمة أثناء الجراحة لتقليل خطر حدوث مضاعفات ما بعد الجراحة.
  2. إدارة مسكن (كيتوبروفين، 2.5 ملغ / كلغ) 30 دقيقة قبل الجراحة و 24 ساعة بعد الجراحة. وesthetize الماوس باستخدام مزيج من الكيتامين (80 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) حقن الغشاء البريتونى. بانتظام رصد عمق التخدير بواسطة معسر مخلب. استخدام وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان في 37.0 درجة مئوية. للحد من الالتهابات الناجمة عن الجراحة وذمة دماغية، إدارة ديكساميثازون (2 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن شبه الجلدية.
  3. تطبيق مواد التشحيم العين لحماية العينين من الحصول الجافة. حلق الرأس الماوس، وتنظيف المنطقة حليق. قطع الجلد باستخدام ملقط ومقص جراحي على طول الخط من القفا إلى جبهته. إزالة أي نوع من الأنسجة الضامة التي تعلق على الجمجمة.
  4. ببطء وبعناية حفر بئر صغيرة على عظم الجبهي يقم باستخدام الحفر الجراحية بسرعة عالية. المسمار الترباس صغيرة (انظر المواد) في حفر بئر. أداء لا يتحول أكثر من ونصف واحدة كاملة من المسمار.
    ملاحظة: تجنب تلك المناطق التي تقع مباشرة فوق السفن القشرية السطحية. تعطيل هذه فيسSELS يمكن أن يؤدي إلى نزيف حاد.
  5. لأداء حج القحف، حفر نافذة دائرية (3-3.5 ملم في القطر) في العظم الجداري الأيمن. تطبيق قطرة من المخزن المؤقت القشرة (125 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 10 ملي الجلوكوز، 10 ملي HEPES، 2 مم CaCl 2، و 2 ملي MgSO 4 في H 2 O المقطر تستكمل مع البنسلين 100 وحدة / مل الستربتوميسين و100 ميكروغرام / مل)، وإزالة بعناية جزء من العظام الموجودة داخل نافذة دائرية.
    ملاحظة: للتعبير عن بروتين فلوري في جزء من السكان معينة من الخلايا، نفذ الحقن داخل الجمجمة من الغدة المرتبطة الفيروسي (AAV) ناقلات أو ناقلات فيروسية أخرى عند هذه النقطة في الإجراء.
  6. ضع ساترة الزجاج الجولة (# 1.5 رمز سمك) على نافذة الجمجمة. نعلق ساترة في الجمجمة مع الغراء polyacrylic. وضع حامل معدني على رأس ساترة واصلاحها مع خليط من الاسمنت الأسنان والغراء polyacrylic.
    ملاحظة: تم تحسين الإجراء المذكورة أعلاه للنوافذ الجمجمةتستخدم في تجارب التصوير الضوئي. لإعداد "مقلوب" نافذة الجمجمة مناسبة للتجارب الكهربية، استخدم إجراء مختلف. أولا، الغراء حامل معدني في الجمجمة. حفر نافذة دائرية داخل فتح حاملها كما يتضح في الفيديو. بدلا من ذلك، وجعل حج القحف أصغر (أقل من 0.5 ملم في القطر) على المنطقة من الفائدة لمنع أو تقليل حركة الدماغ 32. تحديث عازلة القشرية أو وضع قطرة من سيليكون لاصق على نافذة الجمجمة، ثم إغلاقه مع كوب ساترة الجولة.
  7. بعد الانتهاء من العملية، ووضع الحيوان في قفص تحسنت مع الغذاء والماء يمكن الوصول إليها بسهولة. عودة الحيوان إلى قفص مجموعة السكن إلا بعد أن يتعافى تماما من التخدير. إعادة إدارة مسكن على كشف أي علامات من الألم، بما في ذلك عدم الرغبة في التحرك، وتناول الطعام أو الشراب، وفقدان الوزن، واللعاب، انتصاب الشعر أو أصوات غير طبيعية في الجهاز التنفسي.

2. أنيماالتعامل مع لتر

  1. اتخاذ الماوس من قفصه وببساطة لأنه عقد لمدة 5-10 دقيقة. يكون الهدوء أثناء التعامل مع الحيوانات، وتجنب الوقوع في الحركات متشنج والضوضاء.
  2. بعد المناولة، والعودة الماوس لقفصه.
  3. كرر الإجراء مناولة 2-3X مع فترات غير متكافئة بين الحلقات المناولة، من أجل جعل الماوس مريحة مع التجريبي.
  4. تأخذ قطعة قماش ناعمة صغيرة والتفاف الحيوان 2-3X مع فترات غير متكافئة.
  5. ينبغي أن يظل الحيوان الهدوء والتعود على قيد ملفوفة. إذا كان الماوس هو متحمس والعصبي، وتكرار إجراءات المناولة والتغليف.

3. التدريب الحيوان

  1. بدء تدريب الحيوان في homecage المحمول اكتمال اليوم التالي بعد التعود على التعامل والتغليف.
  2. تسجيل الحيوان تزن يوميا قبل وأثناء التدريب.
    ملاحظة: إذا، أثناء التدريب، ويفقد الحيوان أكثر من 10٪ من وزنه، فإنه ينبغي استبعادها من رانه التجارب.
  3. ضبط الوضع الرأسي للرئيس الذراع تثبيت الجهاز homecage المحمول لتتناسب مع حجم الحيوان المدربين. ربط مدخل الهواء من الجهاز إلى المختبر ضغط منفذ الهواء القياسية (عادة، إما خزان الغاز أو مضخة الهواء الذي يوفر ضغط عالية بما فيه الكفاية ومعدل تدفق الهواء، أي حوالي 5 بار و 300 لتر / دقيقة).
  4. التفاف الحيوان في خرقة.
  5. إدراج حامل معدني، وهو يعلق على رأس الحيوان، إلى رئيس الذراع التثبيت وإصلاحه بقوة من خلال تشديد الخناق. بدوره على تدفق الهواء وتأكد من أن تدفق الهواء هو الأمثل لتعويم خالية من homecage-رفع الهواء. الافراج عن الحيوان في homecage النقالة عن طريق إزالة خرقة.
  6. لروض الحيوان إلى الضوضاء، وتوفير التعرض المستمر للأصوات المحيطة (باستخدام، على سبيل المثال، الراديو أو الموسيقى المسجلة والكلام) خلال جميع الدورات التدريبية وكذلك خلال التجارب.
  7. Dخلال شهر الدورة التدريبية الأولى، والحفاظ على ضوء الغرفة لمدة ساعة الأولى، ثم إيقاف ضوء حتى نهاية الدورة التدريبية.
  8. بعد 2 ساعة من التدريب في homecage المحمول، وإطلاق سراح الحيوان من الرأس التثبيت وإعادته إلى قفصه مع توفير الماء والغذاء. تترك لمدة 2 ساعة على الأقل في ظل ظروف الراحة.
  9. تنظيف homecage المحمول بعد كل دورة تدريبية باستخدام محلول الإيثانول 70٪ وشطفه بماء الصنبور. نقع يصل الماء مع منشفة ورقية يمكن التخلص منها وتجفيف homecage المحمول قبل استخدام المقبل.
  10. تنفيذ دورات تدريبية متتالية لمدة 2 ساعة، مع ضوء الغرفة إيقاف بينما يتم تدريب الحيوان.
  11. تنفيذ دورة تدريبية مرتين يوميا.
  12. بعد دورات تدريبية 8-12، استخدام الحيوان في جلسة تجريبية لمدة تصل إلى 2 ساعة في كل مرة.

ملاحظة: خلال الدورات التدريبية التي تستمر لفترات طويلة أكثر من 1-2 ساعة، والنظر في توفير الماوس ثمياه الشرب إيث، والتي يمكن تسليمها إما يدويا أو باستخدام حامل ماصة تعلق على الإطار homecage المحمول. بدلا من ذلك، يمكن أن يتم توفير المياه للإعلان بالمال وبالشهرة أيضا استخدام الحيوان عن طريق وضع قطرات لزجة من الجل المائي مباشرة على جدران homecage المحمول.

ملاحظة: تذكر لوزن الحيوانات قبل تدريب لاستبعاد أي آثار التوتر المزمن في كل يوم. استبعاد حيوان من التجربة إذا، في أي نقطة زمنية، فإنه يوضح ردود فعل الإجهاد مثل تجميد، النطق، أو التوتر الناجم عن الإسهال.

4. تطبيقات

  1. التصوير ثنائي الفوتون في استيقظ ماوس المتحركة حول Homecage الجوال
    1. تجميع homecage المحمول. تحقق مواقف الجسر ورئيس الذراع التثبيت.
    2. التفاف الحيوانات المدربة في خرقة. وضع الحيوان في homecage المحمول. المشبك حامل معدني في الرأس ذراع التثبيت. إزالة خرقة.
    3. تنظيف الزجاج غطاء مزروع من الغبار باستخدامحل الايثانول 70٪ واتركه حتى يجف.
    4. وضع قطرة من السائل الغمر على الطبقة الغطاء. يفضل استخدام حل لزجة، لأن الماء سوف تتبخر بسرعة.
    5. وضع الجهاز المحمول homecage مع الحيوان مدربين تحت المجهر (إلا إذا كان لديك الثاني، الجهاز متطابقة، والتي هي ثابتة في الإعداد المجهري).
    6. إجراء التصوير باستخدام إما العرف أو نظام ليزر مسح التصوير المجهر المتاحة تجاريا مجهزا بأشعة الليزر تحت الحمراء نابض الفيمتو ثانية.
    7. العثور على المنطقة ذات الاهتمام باستخدام وضع حقل واسع من المجهر مضان. استخدام مرشحات تمرير طويلة لتقييم الأوعية الدموية في الدماغ وتحديد المنطقة المستهدفة المناسبة بعد دراسة نمط الأوعية الدموية.
    8. لصورة الأوعية الدموية القشرية، وضخ محلول 1٪ من 70،000 ميغاواط تكساس ديكستران الأحمر، مترافق (أو التناظرية به)، إما في الوريد الذيل بينما يجمد الحيوان في خرقة، أو الرجعية orbitally في حين أنيتم وضع الحيوان في homecage المحمول. ضبط ليزر ثنائي الفوتون إلى 860 نانومتر، واستخدام مرشح تمرير النطاق (590-650 نانومتر) لجمع الضوء المنبعث. استخدام تصفية الانبعاثات 515-560 نانومتر لتقييم التفاصيل الدقيقة لمورفولوجيا الخلايا العصبية أو نشاط الخلايا العصبية باستخدام، على سبيل المثال، الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن YFP أو كا 2 + - الحساسة الفلورسنت GCaMP3 البروتين في جزء من السكان من الخلايا العصبية تحت المروج Thy1.
    9. استخدام البرمجيات المناسبة لاقتناء الصورة.
    10. بعد التصوير، وإطلاق سراح الحيوان من رئيس الذراع التثبيت عن طريق فك البراغي. عودة الحيوان إلى قفصه والسماح لها راحة لمدة لا تقل عن 2 ساعة قبل بدء دورة التصوير المقبل.
    11. تخزين إحداثيات كل منطقة من الفائدة (ROI) لreimaging اللاحقة. صورة نفس رويس مع مرور الوقت، وضبط الإحداثيات في كل مرة لتحقيق أقصى قدر من التداخل الصورة.
    12. تحليل الصور وجعل إعادة البناء ثلاثي الأبعاد باستخدام تحديثات برامج المزود المناسبهي (على سبيل المثال، يماغيج، الخ).
  2. التصوير الضوئي الجوهرية في استيقظ ماوس المتحركة حول Homecage الجوال
    1. تجميع homecage المحمول تحت الكاميرا التقاط صور لالجوهرية الإعداد التصوير الضوئي.
    2. التفاف الحيوانات المدربة في خرقة. وضع الحيوان في homecage المحمول. المشبك حامل معدني في الرأس ذراع التثبيت.
    3. تنظيف الزجاج غطاء مزروع من الغبار باستخدام محلول الإيثانول 70٪ واتركه حتى يجف.
    4. وضع قطرة من الجلسرين على الزجاج مزروع وتغطية ذلك مع 8 ملم جولة الغطاء زلة.
    5. وضع مناور مع العكس أنبوب الهواء ضربة للشعرة أنفية المقابل.
    6. ضبط الموقف من كاميرا عالية السرعة والتركيز على الأوعية الدموية القشرية.
    7. استخدام الضوء الأخضر (فلتر 546BP30) بدون فلتر الكاميرا للحصول على خريطة السفن.
    8. تركيز أعمق في القشرة، ما يقرب من 400 ميكرومتر تحت سطح القشرية.
    9. لصورة طنانه الأوكسجين في الدم تعتمد على مستوى (BOLD) إشارة ضوئية، ووضع مرشح 590LP أمام الكاميرا وإلقاء الضوء على القشرة مع الضوء الأحمر (فلتر 630BP30).
    10. ضبط إضاءة سطح القشرية بحيث يتم توزيعها بالتساوي من خلال المنطقة من اهتمام، وتجنب التعرض المفرط. ضبط شدة الإضاءة حتى أن المنطقة ذات الاهتمام يندرج ضمن شريحة 70-90٪ من مجموعة الكاميرا الديناميكية.
    11. استخدام البرمجيات LongDaq الحصول على الصور لجمع الصور من الكاميرا.
    12. استخدام الصورة التردد اقتناء 1-10 هرتز (أي بين 1 و 10 لقطة في الثانية) لإجراء التجارب مع التحفيز التردد المنخفض (0.05 هرتز).
    13. إيقاف تشغيل ضوء الغرفة لمنع أي تدخل في إشارة الضوئية الذاتية.
    14. سماح لا يقل عن 30 دقيقة للماوس على التكيف مع homecage المحمول.
    15. صورة النشاط الأساسي خلال الحلقة 6 دقيقة دون التحفيز.
    16. لتسجيل أثار جالنشاط ortical، وتحفيز شعرة أنفية في 10 ثانية ON/10 ثانية OFF واسطة (0.05 التحفيز هرتز) مع ارتفاع وتيرة (25 هرتز) القطار من نفث الهواء للفترة مجموعه 6 دقائق.
    17. بعد الحصول على الصور، والإفراج عن الماوس من رئيس الذراع التثبيت وإعادته إلى قفصه.
    18. لا تستخدم تصفية بيانات إضافية للتردد، وذلك لأن سعة الردود التحفيز تميل إلى أن تكون عالية نسبيا في الحيوانات مستيقظا، مما أدى في إشارة ممتازة إلى نسبة الضوضاء.
    19. تحويل مجموعات من الصور التي تم الحصول عليها إلى *. الملفات مكدس معرض طرابلس وتحليلها باستخدام مزيد، على سبيل المثال، برامج مفتوحة المصدر فيجي (يماغيج). طرح النشاط العفوي خط الأساس من الأطر التي تم الحصول عليها خلال التحفيز شعرة أنفية باستخدام أداة حاسبة صورة. بدلا من ذلك، تصفية البيانات في مجال التردد باستخدام البرمجيات المناسبة.
  3. تسجيلات التصحيح، المشبك في استيقظ ماوس المتحركة حول Homecage الجوال
    1. تجميع homecage المحمول.
    2. التفاف الحيوانات المدربة في خرقة. إدارة trimethoprime (5 ملغ / كلغ) والسولفادوكسين (25 ملغ / كلغ) لمنع العدوى البكتيرية. وضع الحيوان في homecage المحمول. المشبك حامل معدني في الرأس ذراع التثبيت.
    3. نظيفة وتعقيم الأسنان الاسمنت "قبعة" مزروع وغطاء زجاجي باستخدام محلول الإيثانول 70٪ أو 0.5٪ الكلورهيكسيدين digluconate واتركه حتى يجف.
    4. ببطء وبعناية إزالة الزجاج غطاء من حامل معدني.
    5. تحديث عازلة القشرية تستكمل مع البنسلين، الستربتوميسين وتنظيف النافذة في الجمجمة من الحطام مع مرقئ حشا العقيمة.
    6. وضع القطب الأرض في المخزن المؤقت القشرية.
    7. وضع headstage الكهربية في مياداة مجهرية.
    8. افتعال ماصات من الزجاج البورسليكات، تهدف إلى مقاومة غيض تتراوح بين 6.5 إلى 8.5MΩ. ملء ماصة التصحيح مع حل داخل الخلايا. تكوين الحل ماصة التصحيح هوالتالية (مم): 8 بوكل، 111 K-غلوكونات، 0.5 و CaCl 2، 2 هيدروكسيد الصوديوم، 10 الجلوكوز، 10 HEPES، 2 ملغ-ATP، و 5 BAPTA، تم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 مع KOH. يجب تصحيح القيم غشاء المحتملة للسائل المحتملة تقاطع المحسوبة ل-12 بالسيارات 33.
    9. استهداف المنطقة ذات الاهتمام باستخدام الإحداثيات التجسيمي، وسرعان ما نقل الكهربائي في الدماغ مع الحفاظ على ضغط إيجابي قوي على الطرف ماصة. بعد اختراق الأم الجافية وتحديد المواقع ماصة، وقياس مقاومة طرف وتجاهل الأقطاب التي تظهر زيادة في مقاومة أكثر من 10-15٪، وذلك لتحسين نسبة نجاح الخطوات اللاحقة.
    10. تقليل الضغط الايجابي بمقدار النصف لتجنب تورم أنسجة المخ المحيطة بها. خطوات أخرى مشابهة لبروتوكول قياسي "التصحيح أعمى". العثور على الخلايا العصبية لتسجيل من، وانخفاض طرف في الدماغ بطريقة تدريجية حتى يتم الكشف عن الخلايا العصبية في proximit قريبةذ من طرف ماصة، كما يتضح من تسلسل الزمني سمة من التغييرات مقاومة القطب. المؤشر الرئيسي من وجود الخلايا العصبية هو زيادة رتيب في المقاومة الكهربائي عبر عدة خطوات إلى الأمام على التوالي من ماصة (عادة، زيادة بنسبة 20٪ في المقاومة ماصة عبر ثلاث خطوات 2 ميكرون).
    11. لتشكيل gigaseal الاتصال مع الخلايا العصبية المستهدفة، وتطبيق الضغط السلبي وفرط الاستقطاب من ماصة.
    12. تطبيق نبضة قصيرة من الضغط السلبي أكبر إلى الخلية من أجل إنشاء تكوين خلية كاملة. سحب القطب بنسبة 2-3 ميكرون للحفاظ على ختم جيدة.
    13. سجل النشاط العفوي أو أثار خلال فترة من الوقت المطلوب، وتصل إلى 20-40 دقيقة.
    14. بعد التسجيل، إزالة ماصة من الدماغ.
    15. تحديث عازلة القشرية أو وضع قطرة من سيليكون لاصق على نافذة الجمجمة، ثم الغراء الزجاج ساترة الجولة على الجزء العلوي من حامل معدني.
    16. الافراج عن أنيمالقاعدة من الذراع الرأس التثبيت عن طريق فك البراغي. عودة الحيوان إلى قفصه لقبل تسجيل القادمة يوم واحد على الأقل.
    17. تحليل البيانات مع، على سبيل المثال، برنامج FitMaster.
  4. التعود-إزالة التعود الشم في اختبار استيقظ ماوس المتحركة حول Homecage الجوال
    1. نعلق قطعة قطنية نظيفة (2 × 2 سم) مغموسة في ماء الصنبور إلى الجانب الداخلي للجدار homecage المحمول باستخدام الشريط على الوجهين. تقسيم الجدار homecage المحمول إلى أربع مناطق من خلال وضع علامات اللون على الجانب الخارجي للجدار بحيث يقع قطعة من القطن في منتصف "المنطقة المستهدفة". إصلاح الحيوان في الذراع headholder التي تواجه قطاع المعاكس الجدار إلى منطقة "الهدف" والسماح لها للتكيف مع homecage المحمول لمدة 30 دقيقة.
    2. تأخذ قطعة أخرى من القطن نظيفة والرطب مع بضع قطرات من 1٪ مستخلص الفانيليا. استبدال قطنية نظيفة على الجدار homecage المحمول مع واحدة تحمل vanilلا رائحة. تقديم الرائحة لمدة 5 دقائق. تتبع تحركات homecage المحمول خلال الفترة عرض الرائحة. تقدير مستوى الفائدة على رائحة عن طريق قياس الوقت التراكمي الذي ينفق الحيوان التي تواجه المنطقة "الهدف" في ما يتعلق إجمالي الوقت للحركة homecage المحمول.
    3. تكرار الدورة تطبيق 5 دقيقة ثلاث مرات باستخدام رائحة الفانيليا، مع 5 دقائق الفاصلة بين الدورات. استخدام قطعة جديدة من "الفانيليا" القطن في كل دورة.
    4. تقديم الحيوان مع رائحة هامة اجتماعيا خلال الماضي، الدورة الخامسة. تبلل قطعة من القطن نظيفة مع بضع قطرات من البول (التي تم الحصول عليها في اليوم السابق من حيوان من الجنس الآخر) ووضعه في منتصف المنطقة المستهدفة لمدة 5 دقائق.
  5. الاعتراف رائحة الرواية في مستيقظا تحريك الماوس حول homecage المحمول
    1. تقسيم الجدار إلى أربع مناطق من خلال وضع علامات اللون على الجانب الخارجي للجدار homecage المحمول. تى تىمنظمة العمل ضد الجوع قطعتين من القطن نظيفة (2 × 2 سم) مغموسة في ماء الصنبور إلى الجانب الداخلي من الجدار في مناطق وسط معارضة بعضها البعض (تسمى منطقة الهدف والمنطقة المستهدفة 1 2). إصلاح الحيوان في الذراع headholder التي تواجه شريحة الجدار الخارجي للمناطق المستهدفة والسماح لها للتكيف مع homecage المحمول لمدة 30 دقيقة.
    2. تحل محل كل قطعة من القطن مع تلك الطازج: ضع قطعة من القطن مبللة مع 1٪ مستخلص الفانيليا لاستهداف المنطقة 1 وآخر واحد الرطب مع ماء الصنبور لاستهداف المنطقة 2 سجل فيديو لحركات homecage المحمول لمدة 10 دقيقة خلال رائحة جلسة العرض. حساب رائحة حضور كنسبة مئوية من الوقت الذي ينفق الحيوان التي تواجه المنطقة المستهدفة 1 النسبي الوقت التراكمي قضى تواجه مناطق 1 و 2.
    3. بعد فاصل زمني 10 دقيقة، وضع زوج آخر من تطبيقها على الجدار homecage لاحقة فترة 10 دقيقة. وضع "الفانيليا" القطن في المنطقة المستهدفة 1 والقطن الرطب مع قضيب 1٪ الموز هxtract في المنطقة المستهدفة 2. جعل تسجيل الفيديو من الحركات homecage المحمول. حساب الأفضلية للرواية رائحة كنسبة مئوية من الوقت الذي ينفق الحيوان التي تواجه قطاع الجدار مع رائحة رواية (المنطقة المستهدفة 2) نسبة إلى الوقت التراكمي التي تواجه مناطق 1 و 2.

Representative Results

فإن المقصود من الطريقة المعروضة هنا للتصوير مجهرية وحيدة الخلية أو التسجيلات الكهربية في اليقظة، الفئران ثابت رئيس لكن على خلاف ذلك بحرية التحرك والتصرف. الحيوان يمكن ان تتحرك في بعدين في الحقيقية (في مقابل الظاهرية)، والبيئة المادية ومألوفة، في حين يتم إصلاح الجمجمة الحيوانات بقوة الذراع تثبيت الرأس. التعود على الفئران إلى homecage المتنقلة رفع الهواء يتكون من 4-6 أيام من الدورات التدريبية 2 ساعة مرتين يوميا (الشكل 1). ويمكن بعد ذلك أن تستخدم الحيوانات المدربة في التجارب على الفور. يتضمن دراسة نموذجية لعدد من جلسات التصوير أو تسجيل الدورات التصحيح، المشبك التي يتم على فترات متباعدة تتراوح بين بضع ساعات إلى عدة أيام أو أسابيع. الأهم من ذلك، لا يمكن أن يؤديها كل من التسجيلات البصرية والكهربية في وقت واحد مع المثيرات وقراءات المعرفية أو السلوكية، في تجربة واحدة.

لتقييم الاستقرار الميكانيكي للرئيس تثبيت الماوس في homecage المحمول، تم جمع تسلسلات الصور من السفن القشرية المسمى مع ديكستران فلوري، مترافق والتشعبات القشرية معربا عن YFP في حين أن حيوانات التجارب كانت تبحر في homecage المحمول (الشكل 2). لم النزوح القصوى من الدماغ أثناء تنقل الحيوان لا يتجاوز عادة 1-1.5 ميكرومتر. وقعت هذه نزوح في الاتجاهين الأفقي ونادرا جدا ما أدى إلى التحول من اكتشاف الطائرة والتصوير، لا لزوم لها تقديم أي تصحيح الحركة الفنية. مستقرة في الرأس تثبيت homecage المحمول يسمح الكمي من العمود الفقري شجيري الفردية في الحيوانات مستيقظا بنفس الموثوقية كما هو الحال في الفئران تخدير. كثافة العمود الفقري شجيري، مورفولوجيا ودوران يمكن رصدها خلال دراسات طولية مع جلسات التصوير متعددة أجريت على فترات تتراوح بين بضع ساعات إلى عدة أيام أو أسابيع.

قابليتها للاستعمال متم اختبار obile homecage للتصوير الضوئي وظيفية في القشرة الحسية الجسدية من الفئران مستيقظا باستخدام نهجين: ط) اثنين من الفوتون المجهري على الفئران المعدلة وراثيا Thy1-GCaMP3 وب) الجوهرية التصوير إشارة ضوئية في البرية من نوع الفئران. تم إجراء كا 2 + التصوير في طبقة 2/3، والذي يحتوي على أجسام الخلايا للعديد من الخلايا العصبية fluorescently المسمى، فضلا عن التشعبات والمحاوير (الشكل 3). وترد كيد مضان أكثر من مرة من مناطق مختارة من الفائدة (رويس) في الشكل (3)، مما يدل على نشاط الخلايا العصبية عفوية (كما تقاس الزيادات العابرة في GCaMP3 مضان) أثناء التنقل الماوس النشيطة في homecage المحمول. التصوير الضوئي يعتمد على الإشارات الجوهرية يسمح رسم خرائط التوزيع المكاني من المجالات الوظيفية. الشكل 4 يوضح التغييرات مثل موجة في مستوى الأوكسجين في الدم (مما يعكس تفعيل الخلايا العصبية الإقليمية) التي نشرها على طول القشرة الحسية الجسدية في الاستجابة إلى الخامسالتحفيز ibrissa على التردد 0.05 هرتز.

لاختبار جدوى التسجيلات التصحيح، المشبك مع homecage المحمول، استخدمنا الفئران C57BL/6J 2-3 أشهر من العمر. وسجلت طبقة 2/3 الخلايا العصبية في القشرة الحسية الجسدية من في تكوين خلية كاملة باستخدام وضع المشبك الحالي. وكان تسجيل التصحيح، المشبك في دماغ الفئران مستيقظا على homecage المتنقلة ثابتة الرأس مماثلة أساسا لأعمى التصحيح لقط في شرائح الدماغ. أدى ما يقرب من 50٪ من محاولات في تشكيل gigaseal الناجحة، والتي أسفرت عن أكثر من 70٪ مستقرة تسجيل تكوين خلية كاملة. لم يلاحظ أي أحداث فقدان gigaseal الاتصال بسبب النزوح الميكانيكية للخلايا. الشكل 5 يوضح جزء 60 ثانية من ممثل 10 دقيقة طويلة تسجيل المشبك الحالية المترابطة مع حلقات النشط (تشغيل) الفأر والسلبي (يستريح) ولايات.

الشكل 1 SRC = "/ files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg" العرض = "600" />
الشكل 1. طريقة التثبيت رئيس الفئران مستيقظا في homecage المحمول. أ) لمحة عامة عن تصميم homecage المتنقلة رفع الهواء والرسوم التوضيحية لمفهوم عام. ب) رسم تخطيطي لوضع جدول زمني تجريبية نموذجية. تبدأ الدراسة مع غرس النافذة في الجمجمة أسبوعين قبل التعود الماوس لمناولة والتغليف، والتي تبعتها ثماني دورات تدريبية مرتين يوميا. يتضمن دراسة نموذجية لعدد من جلسات التصوير أو تسجيل الدورات المشبك التصحيح التي يتم على فترات متباعدة تتراوح بين بضع ساعات إلى عدة أيام أو أسابيع. كلا القياسات الضوئية والكهربية يمكن أن يتم بالتوازي مع المثيرات وقراءات معرفية أو سلوكية خلال تجربة واحدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

معشوقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الرقم 2
الشكل 2. مثال على اثنين من الفوتون التصوير المجهري على الفئران مستيقظا تتحرك في جميع أنحاء homecage المحمول. A، B) الأوعية الدموية القشرية، وصفت مع 70 كيلو دالتون تكساس ديكستران مترافق الأحمر. يتم قياس القطر من قطاعات سفينة الفردية عن طريق التآمر مع مرور الوقت الشخصى من الخطوط المرسومة عبر التجويف السفينة أثناء فترات الراحة الماوس وتشغيل (A). يتم قياس معدل تدفق الدم في الشرايين والأوردة سطرا المسح على طول الخطوط المرسومة موازية لجدار الوعاء الدموي (B). C، D) التفاصيل الجميلة من مورفولوجيا الخلايا العصبية في الدماغ تصور من الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن YFP في subpopulation من الخلايا العصبية تحت المروج Thy1. إعادة البناء ثلاثي الأبعاد من الخلايا العصبية الهرمية في الماوس، القشرة الحسية الجسدية (C). الصور من ب شجيريمزرعة المكتسبة في اليقظة، يتصرف الماوس مستقرة بما فيه الكفاية لتقدير الفرد شجيري العمود الفقري مورفولوجيا (D). E) الكمي لحركة الدماغ الناجم عن حركات الماوس. نزوح السعة الكبيرة ترتبط فترات تشغيل الفأر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الشكل 3. مثال على النشاط السكاني العصبية في مستيقظا Thy1-GCaMP3 الماوس تتحرك في جميع أنحاء homecage المحمول. أ) صورة ثنائي الفوتون من الطبقة القشرية الثاني / الثالث الخلايا العصبية. رويس، على سبيل المثال تظهر أجسام الخلايا العصبية، والتشعبات المحاور باللون الأصفر. ب) آثار ΔF / F من مضان GCaMP3 من رويس هو مبين في A (ق الوقتeries سجلت في 1.5 ثانية / الإطار). C) المركزة في المنطقة تصويرها في 65 ميللي ثانية / الإطار. D) الإسفار من رويس الصفراء في C تآمر على مر الزمن، ويبين الزيادات العابرة (الحمراء) في مضان GCaMP3 التي تتوافق مع العمل كا 2 + الحلقات المحتملة التي يسببها تدفق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الشكل 4. مثال لرسم خرائط التوزيع المكاني للاستجابات وظيفية في القشرة من الماوس مستيقظا عن طريق تصوير الإشارات الضوئية الذاتية. أ) عرض برايت مجال الأوعية الدموية السطحية من خلال النافذة في الجمجمة. B) خريطة حجم النشاط الأساسي في الهاتف النقال حوmecage خلال الحلقة 6 دقيقة. C) خريطة استشراء نشاط الخلايا العصبية الحسية الجسدية نشر على طول القشرة ردا على التحفيز شعرة أنفية على تردد 0.05 هرتز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. مثال على خلية كاملة التصحيح، المشبك تسجيل في القشرة من الماوس مستيقظا تتحرك في جميع أنحاء homecage المحمول. A) الحالي تسجيل المشبك من الخلايا العصبية في طبقة الماوس القشرية 2/3. 0.5 ثانية، 100-PA الحقن الحالية (المبينة أدناه التتبع) النتائج في موجة من إمكانات العمل. أظهرت الخلية تردد ارتفاع سمة التكيف لالخلايا العصبية الهرمية. B) المستمر تسجيل المشبك الحاليمن نفس الخلايا العصبية المترابطة مع نشاط الماوس 'الحركي (كما هو موضح باللون الوردي فوق التتبع). النشاط العفوي ممثل الخلايا العصبية طبقة 2/3 خلال فترات الماوس، يستريح (C) وتشغيل (D). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 6
الرقم 6. فقدان الوزن الحيوانية والنشاط الحركي من الفئران head-fixed/non-fixed من خلال دورات تدريبية في homecage المحمول. A) وزن الحيوان (يعني + SD،٪) قبل الدورات التدريبية. لاحظ أن يتم عكس خسارة الوزن بشكل كامل من قبل الدورة التدريبية 7-8 ال. ب) مسار تحرك الأفقي النسبية الماوس إلى homecage المحمول،الذي استقراء من حركة مجنزرة من homecage المحمول خلال ال 8 دورة تدريبية. C) الحركات مجنزرة من الماوس ثابتة غير الرأس، استكشاف القفص الجولة ال 8 خلال دورة تدريبية. D) مدة ثابتة الرأس (دائرة) و غير الثابتة (مثلث) حركة الفئران خلال 1-4 اليوم ال التدريب (يعني + SD،٪). نلاحظ أنه، في يوم 4، وعرض الفئران ثابت رئيس لا تجميد (كما في يوم 1) ولا النشاط الحركي المفرط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

من أجل فهم أفضل فسيولوجيا الدماغ وعلم الأمراض، يجب إجراء الأبحاث على مجموعة متنوعة من مستويات التعقيد إعداد، وذلك باستخدام التقنيات الأكثر ملاءمة لكل إعداد. في الوقت الحاضر، مجموعة واسعة من منهجيات علم الأعصاب (من كامل الجسم الرنين المغناطيسي الوظيفي لالمجهري STED الفرعية عضية) يتم تطبيقها بسهولة على الحيوانات مخدرة، في حين أن التجارب على الحيوانات مستيقظا والتصرف قد تمثل تحديا كبيرا المنهجية.

هنا، يوصف نهجا جديدا حيث حيوان المختبر، على الرغم من كونها ثابتة بحزم الرأس، ويمكن التحرك على homecage المتنقلة رفع الهواء واستكشاف بيئتها المادية في ظل ظروف خالية من الإجهاد. إعداد الحيوان يتصرف الثابتة الرأس المقدمة هنا يوفر عددا من المزايا الحاسمة. الأول، البيانات الكهربية أو التصوير تم الحصول عليها مع هذه الطريقة هي كاملة غير منقوصة لا من قبل ولا من التخدير الإجهاد الناجم عن يعوق. تحديد المواقع من الفأرة في منزل متنقلالقفص هو سريع و لا يتطلب التخدير الحيوان حتى عابر. الثانية، وhomecage-رفع الهواء يضمن الاستقرار الميكانيكية اللازمة لقياس التغييرات في مورفولوجية الخلايا العصبية وغرامة لتسجيل وحيدة الخلية الكهربية النشاط في الحيوانات مستيقظا. أخيرا، تصميم homecage المحمول هو أكثر إحكاما بالمقارنة مع مطحنة كروية، مما يتيح تحديد المواقع homecage المحمول تحت المجهر تستقيم القياسية لاثنين من الفوتون التصوير أو تسجيل التصحيح، المشبك في مخ الفأر مستيقظا ل.

شركة رأس التثبيت في homecage النقالة يتطلب غرس حامل معدني أربعة الجناحين المصممة خصيصا، مع افتتاح الجولة في المركز للوصول الضوئية أو الكهربائية إلى منطقة الدماغ الكامنة. وترد هذه المعادن لأصحاب الجمجمة عن طريق مزيج من الغراء، والاسمنت الأسنان والترباس الصغيرة ثمل في عظم الجمجمة. وقد تم تطوير هذا الإجراء الجراحي يعتمد على عدد كبير من سبقنشرت الإجراءات، ووجد أن يؤدي إلى مستقرة وقابلة للتكرار في الجمجمة إعداد النافذة. لفي التجارب المجراة الكهربية، نافذة على شكل قمر 34، حج القحف صغيرة الحجم (أقل من 0.5 ملم) 32، والمغطاة بالزجاج حفر إعداد 35 استخدمت. هنا، تم زرع "مقلوب" نافذة الجمجمة مع إما كبيرة (3.5 مم) أو الصغيرة (أقل من 0.5 مم) حج القحف. تحجيم حركة الدماغ أمر حاسم بالنسبة لاستقرار تسجيلات خلية واحدة، وهذا هو السبب فإنه من المستحسن لأداء craniotomies حجم صغير للتجارب الكهربية. على غرس النافذة في الجمجمة للتجارب التصوير الضوئي، ويسمح للحيوانات لاسترداد لمدة 2 أو 3 أسابيع على الأقل، خلال هذه الفترة النافذة يفقد أول عابر شفافيتها ومن ثم يستعيد ذلك (مع تحقيق عائد 50-70٪، اعتمادا على الخلفية الوراثية للسلالة الماوس). شفافية النافذة في الجمجمة وSTABILإيتي من الاسمنت الأسنان "كاب" التي تعلق على الجمجمة يمكن التحقق عن طريق المجهر مجهر العادية والتفتيش البدني أثناء التعامل مع الحيوانات. في نهاية فترة النقاهة 2-3 الأسبوع، ينبغي استبعاد تلك الحيوانات التي تظهر أي علامات للالتهاب آخر التشغيلية المتبقية أو العيوب الميكانيكية في الاسمنت الأسنان من التجارب وإنهاؤها.

سن الأمثل لبدء تدريب الفئران هو 2-4 أشهر (المقابلة لوزن الجسم من 20-40 غ). في الحيوانات الأصغر سنا، ويمكن من ترسيخ الأسنان الاسمنت "كاب" في الجمجمة تكون غير موثوق بها، والتي قد تقلل مرونته إلى الإجهاد الميكانيكية التي تفرض من قبل تحرك الماوس الثابتة الرأس في homecage المحمول. على الرغم من أن الفئران الذكور والإناث تظهر شاء القدر أن تنقل في homecage المحمول، وهناك اتجاه لتحقيق نسبة أفضل من النوافذ الجمجمة استعادة الشفافية في إناث الفئران (لا تظهر البيانات). وبالتالي، من أجل رس ضمان مزيج متوازن من الجنسين في فوج من الحيوانات اختيارها للتصوير، زرع نوافذ الجمجمة في حوالي 30٪ الفئران الذكور أكثر من الموصى بها. ومن المعروف أن التفاعلات الاجتماعية لتحسين الحيوانات الرفاه والحد من التوتر، وبالتالي فإنه من المستحسن أن تتزاحم يتم تشغيلها وتدريب بالتوازي وأبقى معا في أقفاص مجموعة السكن.

وعلى النقيض من إجراءات نشرت لإعداد حلقة مفرغة كروية 13، لا تتطلب طريقة الاستفادة من homecage المحمول التخدير الماوس في لحظة تثبيت الرأس. هذا الفرق مهم لأنه يسمح لاستبعاد أي آثار متبقية أنه حتى وجيزة و "النور" التخدير حلقة من المرجح أن يكون على القياسات الفسيولوجية التي تم الحصول عليها بعد فترة وجيزة. في الواقع، على الرغم من الدراسات في الرأس حيث تم تثبيت تحت التخدير وكانت بدأت التجارب الفعلية بعد فترة وجيزة الانتظار 13، واحد لا يمكناستبعاد آثار طويلة الأمد المحتملة للتخدير حلقة موجزة عن البيانات التجريبية. وقد اعتمدت الدراسات الأخرى على الحرمان من الماء لالتعود المنهجي للحيوانات لرئاسة تثبيت واستخدام الثواب المياه كوسيلة لتحفيز الحيوان أن تظل قادرة على الحركة 36. ومع ذلك، يحد من الأسلوب القائم على تثبيت رأسه مكافأة اختيار الاختبارات السلوكية المطبقة، والأهم، وتحتل واحدة من الجمعيات التحفيز مكافأة راسخة. في المقابل، وطريقة التعود الماوس لرئاسة التثبيت في homecage المحمول لا تتطلب الحرمان من الماء ومكافأة لاحقة.

المكمل لhomecage المحمول مع نظام توصيل المياه يستحب للتجارب طويلة الأمد. أجريت الدورات التدريبية الحيوانية والتجارب المقدمة هنا خلال النهار (08:00 حتي 18:00)، والتي تتطابق مع الفترة السلبي من الناحية الفسيولوجية لتلك الفئران التي يتم الاحتفاظ بها تحت ال 12 ساعة القياسية جدول ضوء (لىghts على الساعة 6 صباحا وإيقاف الساعة 6 مساء). منذ يرتبط استهلاك المياه مباشرة مع النشاط الماوس، خلال الفترة الفئران السلبي لا تتطلب توصيل المياه إذا كانت مدة الدورة التدريبية / التصوير / تسجيل لا تتجاوز 2 ساعة. بالإضافة إلى توقيت ومدة الدورات التدريبية، ويحتاج المرء لمعالجة قضية العدد الأمثل من الدورات المطلوبة لالتعود الحيوانات لhomecage المحمول. تحقيقا لهذه الغاية، تم استخدام معيارين لتقييم الاجهاد الناجم عن إجراءات تثبيت الرأس: ط) وفقدان الوزن، والثاني) مستوى النشاط الحركي. كما هو مبين في الشكل (6)، وفقدان الوزن يصل إلى مستوى متوسط ​​من 6٪ في يوم التدريب 2، ويتم عكس تماما بعد يوم تدريب 4 (الشكل 6A). باستمرار مع تزن ديناميكية، يتم قمع مستوى النشاط الحركي للحيوانات الثابتة الرأس في اليوم الأول من التدريب ولكن تستقر بعد يوم تدريب 4 (الشكل 6D). بناء على هذه القياسات، ونحن suggesر أن مدة الحد الأدنى من فترة التدريب الماوس على homecage المحمول هو 4 أيام، كما هو موضح في البروتوكول بموجب هذا.

استخدام، homecage المحمول مسطحة ارضيتها-رفع الهواء يسمح بإضافة المهام المعقدة (الحسية، إدراكي، والمعرفية) إلى نماذج لتدريب الفئران ثابتة الرأس. في هذه الدراسة تم عرض بروتوكولين من الاختبارات السلوكية. كلا البروتوكولين استخدام العظة رائحة ويمكن دمجها مع طولية التصوير / التسجيلات في القشرة الماوس. على الرغم من أن homecage المحمول يتم تصنيعها من مواد nonabsorbent، واحدة لا تزال بحاجة إلى أن تأخذ في الاعتبار التداخلات المحتملة بين رائحة الجهاز واختبار رائحة (ق). ومن العوامل الأخرى التي قد تتداخل مع / العظة عن طريق اللمس البصري للتجربة السلوكية هو تقاطع بين الجدار وإدراج، وهي ليست سلس، ويمكن، بالتالي، أن ينظر إليها من قبل الحيوان كمعلم. يجدر بالذكر هنا أنه من أجل تقليل الضائقة الحيوان خلال هذه الأسواق العالمية ضغطهاrventions كما التنسيب من القطن تقديم الرائحة إلى الحائط homecage المحمول، يجب على ممارسة التجريبي لأداء مثل هذه التدخلات في أسرع وقت ممكن وتجنب التعامل مع فترات طويلة من القفص الكربون. استراتيجيات بديلة لعرضها رائحة / وجوه الرواية هي تصور، على سبيل المثال، وضع قطرات حل يستند إلى هيدروجيل أو الكائنات (مثل رقائق الغذاء) على رفوف صغيرة تعلق على السطح الداخلي للجدار القفص الكربون في ذروة متوافقة مع رئيس المواقع الحيوان.

homecage المحمول يسمح الحيوانات ثابتة الرأس لأداء مجموعة واسعة من تحركات ثنائي الأبعاد بما في ذلك تحرك الأفقي، situp، والاستمالة، الخفقان، لعق، الأنف بدس، والحركات مخلب الجبهة المهرة، ولمس الجدار مع الأمامية، كما هو موضح في هذه الدراسة . باستخدام homecage المحمول والبروتوكولات المعروضة هنا، يمكن للباحثين دراسة نظام الخلايا العصبية الحسية مع مستوى عال من السيطرة على كل من حالة التحفيزق والسلوكية للقراءة عموميات. علاوة على ذلك، لا يمكن أن يؤديها دراسات القدرات المعرفية في الفئران مستيقظا خلال تكييف والملاحة المكانية ومهام صنع القرار.

وهناك العديد من القيود العملية لهذا الأسلوب. أولا، هناك حاجة إلى كمية كبيرة من الهواء المضغوط لتحقيق السلطة ورفع homecage لإجراء تجارب طويلة الأمد. الثانية، وhomecage المحمول في تنفيذه الحالي هو 18 سم فقط في قطر، ويوفر مساحة صغيرة نسبيا وبسيطة بالمقارنة مع الواقع الافتراضي، حيث يمكن تصميم بيئة تجريبية معقدة دون أي قيود مكانية بالتالي. الثالث، خلال التحفيز الطولي والتجارب القائمة على مكافأة المعروضة هنا، تم استخدام الجهاز الذي يحد من إمكانية والجدار الاتصال للماوس. أن إضافة قناة التحفيز البصري أو الحسية الخارجية (مثل جهاز عرض الموجه العين ضوء) تتطلب تصميم الجهاز أكثر مريح وصغير بالمقارنة معالشاشة متعددة أو قبة الإسقاط الحلول التي استخدمت في التجارب مفرغه كروية.

وباختصار، فإن استخدام الفئران ثابت رئيس تتحرك في homecage المتنقلة رفع الهواء يسهل كثيرا من الدراسات التي تجمع بين مستويات الخلايا، الجزيئية والسلوكية للمراقبة والتلاعب في تجربة واحدة. وتشمل تطبيقات محددة يتضح هنا اثنين من الفوتون التصوير المجهري، الجوهرية التصوير الإشارات الضوئية والتسجيلات التصحيح، المشبك في الفئران التصرف غير تخدير. ومن المتوقع أن هذا النهج سوف تفتح آفاقا جديدة في التجريب على مستيقظا، يتصرف الماوس، ويكون بمثابة أداة مفيدة لكلا تطوير الأدوية والبحوث الأساسية من وظيفة الدماغ.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

المؤلفين أشكر الأستاذ ييرو كاسترين على تعليقاته القيمة على المخطوطة. ويدعم هذا العمل من المنح المقدمة من أكاديمية فنلندا، مركز الحراك الدولي من فنلندا، وكلية الدراسات العليا الفنلندية العلوم العصبية (الدماغ وبرنامج الدكتوراه العقل).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tweezers, Stainless Steel, 115 mm XYtronic XY-2A-SA
Animal trimmer, shaving machine Aesculap Isis GT420
Binocular Microscope Zeiss Stemi 2000
Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad Supertech TMP-5b
Blunt microsurgical blade BD REF 374769
Borosilicate tube with filament Sutter Instruments BF120-69-10 For patch pipette production
Camera  Foscam FI8903W Night visibility
Carprofen Pfizer Rimadyl vet
Dental cement DrguDent, Dentsply REF 640 200 271
Dexamethasone FaunaPharma Rapidexon vet
Disposable drills Meisinger HP 310104001001008
Dulbeco’s PBS 10x Sigma D1408
Dumont #5 forceps, 110 mm FST 91150-20
Eyes-lubricant Novartis Viscotears For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion 
Foredom drill control Foredom  FM3545
Foredom micro motor handpiece Foredom MH-145
Four-winged metal holder Neurotar
Head Holder for Mice Narishige SG-4N Assembled on stereotaxic instrument
Hemostasis Collagen Sponge Avitene, Ultrafoam BARD Ref 1050050
Imaris Bitplane
Ketamine Intervet Ketaminol vet
Kwik-Sil  WPI
Mai Tai DeepSee laser Spectra-Physics
Micro dressing forceps, 105 mm Aesculap BD302R
Microelectrode puller Narishige PC-10H Vertical puller for glass pipette production
Micromanipulator Sensapex
Mini bolt Centrostyle Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5
Mobile Homecage Neurotar
Multiphoton Laser Scanning Microscope Olympus FV1000MPE
Nonwoven swabs, 5 x 5 Molnlycke Health Care Mesoft Surgical tampons
Polyacrylic glue Henkel Loctite 401
Round glass coverslip Electron Microscopy Sciences 1.5 thickness
Small animal stereotaxic instrument David Kopf Instruments 900
Student iris scissors, straight 11.5 cm FST 91460-11
Xylazine Bayer Health Care Rompun vet

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329, 959-964 (2010).
  2. Sitdikova, G., et al. Isoflurane suppresses early cortical activity. Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2013).
  3. Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903-912 (2001).
  4. Piyawattanametha, W., et al. In vivo brain imaging using a portable 2.9 g two-photon microscope based on a microelectromechanical systems scanning mirror. Optics letters. 34, 2309-2311 (2009).
  5. Sawinski, J., Wallace, D. J., Greenberg, D. S., Grossmann, S., Denk, W., Kerr, J. N. D. Visually evoked activity in cortical cells imaged in freely moving animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19557-19562 (2009).
  6. Fee, M. S. Active stabilization of electrodes for intracellular recording in awake behaving animals. Neuron. 27, 461-468 (2000).
  7. Greenberg, D., Houweling, A., Kerr, J. Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats. Nat Neurosci. 11 (7), 749-751 (2008).
  8. Fujiwara-Tsukamoto, Y., et al. Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents. Journal of Neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).
  9. Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint. Neuron. 80, 371-384 (2013).
  10. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat Neurosci. 13, 1433-1440 (2010).
  11. Parry, T. J., McElligott, J. G. A method for restraining awake rats using head immobilization. Physiolog & behavior. 53 (5), 1011-1015 (1993).
  12. Brecht, M., Schneider, M., Sakmann, B., Margrie, T. W. Whisker movements evoked by stimulation of single pyramidal cells in rat motor cortex. Nature. 427 (6976), 704-710 (2004).
  13. Van Looij, M. A. J., Liem, S. -S., van der Burg, H., van der Wees, J., De Zeeuw, C. I., van Zanten, B. G. A. Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice. Hearing research. 193, 75-82 (2004).
  14. Hentschke, H., Schwarz, C., Antkowiak, B. Neocortex is the major target of sedative concentrations of volatile anaesthetics: strong depression of firing rates and increase of GABAA receptor-mediated inhibition. The European journal of neuroscience. 21, 93-102 (2005).
  15. Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv: European journal of physiology. 444, 491-498 (2002).
  16. Crochet, S., Petersen, C. C. H. Correlating whisker behavior with membrane potential in barrel cortex of awake mice. Nat Neurosci. 9, 608-610 (2006).
  17. Houweling, A. R., Brecht, M. Behavioural report of single neuron stimulation in somatosensory cortex. Nature. 451, 65-68 (2008).
  18. Poulet, J. F. A., Petersen, C. C. H. Internal brain state regulates membrane potential synchrony in barrel cortex of behaving mice. Nature. 454, 881-885 (2008).
  19. Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. Journal of neuroscience methods. 178, 75-79 (2009).
  20. De Kock, C. P. J., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16446-16450 (2009).
  21. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
  22. Hentschke, H., Haiss, F., Schwarz, C. Central signals rapidly switch tactile processing in rat barrel cortex during whisker movements. Cerebral cortex. 16, 1142-1156 (2006).
  23. Stüttgen, M. C., Rüter, J., Schwarz, C. Two psychophysical channels of whisker deflection in rats align with two neuronal classes of primary afferents. J. neuroscience. 26, 7933-7941 (2006).
  24. Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67, 1048-1061 (2010).
  25. Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (20), 8473-8478 (2011).
  26. Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461, 941-946 (2009).
  27. Chen, G., King, J. A., Burgess, N., O’Keefe, J. How vision and movement combine in the hippocampal place code. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 378-383 (2013).
  28. Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7392), 62-68 (2012).
  29. Holtmaat, A., et al. Long-term , high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 19-22 (2009).
  30. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J. Vis. Exp. (12), (2008).
  31. Portera-Cailliau, C., Trachtenberg, J. T., de Paola, V., Svoboda, K., Wilbrecht, L., Holtmaat, A. Imaging Neocortical Neurons through a Chronic Cranial Window. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
  32. Garaschuk, O., Milos, R. -I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1 (1), 380-386 (2006).
  33. Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. Journal of neuroscience methods. 51 (1), 107-116 (1994).
  34. Golshani, P., Gonçalves, J. T., Khoshkhoo, S., Mostany, R., Smirnakis, S., Portera-Cailliau, C. Internally mediated developmental desynchronization of neocortical network activity. The Journal of neuroscience. 29 (35), 10890-10899 (2009).
  35. Polack, P. -O., Friedman, J., Golshani, P. Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex. Nat Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).
  36. Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls. Somatosensor., & motor research. 27, 131-148 (2010).

Tags

القيمة فارغة، العدد 88، مستيقظا،
مسطحة طوابق منصة رفع الهواء و: طريقة جديدة للجمع بين السلوك مع الميكروسكوب أو الكهربية على استيقظ تتحرك بحرية القوارض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kislin, M., Mugantseva, E.,… More

Kislin, M., Mugantseva, E., Molotkov, D., Kulesskaya, N., Khirug, S., Kirilkin, I., Pryazhnikov, E., Kolikova, J., Toptunov, D., Yuryev, M., Giniatullin, R., Voikar, V., Rivera, C., Rauvala, H., Khiroug, L. Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents. J. Vis. Exp. (88), e51869, doi:10.3791/51869 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter