Summary
이 방법은 탐색 및 동물의 머리의 확고한 고정을 필요로 미세한 영상 또는 단일 세포 전기 생리학 녹음하는 동안 탐험하는 마우스 유형, 친숙한 환경을 만듭니다.
Abstract
폭넓게 일반적인 마취제의 사용은 살아있는 동물의 뇌에서 얻은 전기 생리학 또는 현미경 데이터의 관련성을 저해 할 수 있음을 인정한다. 또한, 마취에서 긴 회복은 종 연구에 반복 기록 / 영상 에피소드의 주파수를 제한합니다. 따라서, 비 마취 행동을 한 쥐에서 안정적인 레코딩을 허용하는 새로운 방법은 세포 및인지 신경 과학의 분야를 발전 할 것으로 예상된다. 기존 솔루션은 단순한 물리적 구속으로부터 같은 컴퓨터 생성 가상 현실과 병용 선형 및 구형 트레드밀과 같은 더 정교한 방식으로 배열한다. 머리 고정 마우스 공기 해제 모바일 homecage 주위에 이동하고 스트레스없는 상태에서 그 환경을 탐험 할 수있는 여기, 새로운 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 연구자가 동시에 행동 검사 (예를 들면, 학습 습관이나 새로운 물체 인식)을 수행 할 수 있습니다두 광자 현미경 이미징 및 / 또는 패치 클램프 녹음은 모두 하나의 실험에서 결합. 이 비디오 문서는 깨어있는 동물 머리 고정 장치 (모바일 homecage)의 사용을 설명, 동물 습관화의 과정을 설명하고, 방법의 응용 가능성의 수를 예시한다.
Introduction
신경 과학의 흥미로운 최근의 추세는 분자 및 세포는 설치류 행동, 깨어의 뇌에서 신경 세포 네트워크의 프로빙을위한 실험 방법을 개발하는 것입니다. 이러한 접근 방법은 운동 기능, 감각 통합, 지각, 학습, 기억,뿐만 아니라 부상의 진행, 신경 변성 및 유전 질환의 기초가 신경 생리 학적 과정에 새로운 빛을 발산 할 것을 약속십시오. 또한, 깨어있는 동물의 뇌에서 기록하는 새로운 치료제 및 치료법의 개발에 약속을 보유하고 있습니다.
흔히 신경 생리 학적 실험에 사용 된 마취, 잠재적 실험 결과의 잘못된 해석에 이르는, 뇌 기능의 기본 메커니즘에 영향을 미칠 수 있다는 인식의 증가가있다. 따라서, 널리 사용되는 마취제 케타민이 빠르게 새로운 돌기 쪽의 형성을 증가시키고 시냅스 기능 1을 향상; 또 다른 일반적으로 사용되는 anesthet수술 마취 수준에서 IC의 이소 플루 란이 완전히 성인 동물 2의 새로운 태어난 쥐와 블록 스핀들 버스트 진동에 자연 대뇌 피질의 활동을 억제한다. 현재 접근 방식의 단지 제한된 수의 이광자 현미경 영상 또는 패치 - 클램프 녹음 의해 비 마취 된 쥐 실험을 가능하게한다. 이러한 접근 방법은 자유롭게 이동 및 머리 고정 제제로 나눌 수있다.
자유롭게 이동하는 동물 준비의 독특한 매력은 탐색하는 동안 몸 전체의 움직임을 포함하여, 자연의 행동 평가를 할 수 있다는 것입니다. 자유롭게 이동하는 쥐의 뇌 내부의 이미지에 한 가지 방법은 소형 헤드 마운트 현미경 또는 파이버 스코프 3-5을 연결하는 것입니다. 그러나, 소형화 된 장치는 대물 기반이 광자 현미경에 비해 제한된 광학 성능을 갖는 경향이, 쉽게 전 세포 패치 클램프 기록 (6)와 결합 될 수 없다.
EXI머리 고정 깨어 설치류에 대한 고통 솔루션은 물리적 억제 7,8 또는 자발적 머리 받침대 9 전시 동물을 훈련에 하나 주로 의존합니다. 인기있는 또 다른 방법은 동물의 사지가, 예를 들면, 구형 러닝 머신 (10)를에 배치하여 이동 할 수 있도록하는 것입니다; 이 접근법은 종종 컴퓨터 - 생성 된 가상 현실과 결합된다. 머리 고정 쥐에 전기 생리학 실험은 주로 세포 외 기록을 사용하고 심장 혈관 기능 (11)의 중앙 조절, 신경 세포의 활동을 12에 마취 효과, 뇌간 (13) 정보 처리 (14)의 청각 반응을 연구하는 데 사용되었다. 깨어있는 행동을 한 동물의 선구 세포 / 전체 셀 녹음은 2000 년대에 수행하고, 지각과 운동 15 ~ 20과 관련된 신경 활동에 초점을 맞추고있다. 같은시기에, 깨어 마우스의 첫 번째 현미경 영상 연구는 펍했다두 광자 현미경을 물리적으로 억제 쥐 7의 감각 피질과 구형 러닝 머신 21에서 실행중인 마우스에 사용되었다든지 반드시.
후속 생체 현미경 및 전기 생리학 연구는 헤드 고정 제제 성공적 앞다리 움직임 악취 인식 터는 및 8,22-25 핥는 행동에 근거 패러다임과 결합 될 수 있다는 것을 보여 주었다. 구형 디딜 방아에 배치 마우스는 컴퓨터 (10, 26)에 의해 생성 된 가상 시각적 환경을 탐색하는 훈련을 할 수 있습니다. 세포 내 / 외 기록은 가상 환경을 탐색 머리 고정 동물에서 해마의 장소 세포의 활성화 (27)를 검출 할 수 있다는 것을 보여 주었다. 가상 시각적 환경에서 마우스가 활성화 운동 27시 현지 필드 잠재력과 세타 상 선행 정상 운동 관련 세타 리듬을 보여줍니다. 최근, 시공간 activit신경 인구의 Y 패턴은 가상 환경 (28)에 메모리 의사 결정 작업을 작업하는 동안 마우스에 광학적으로 기록되었다.
획기적인 연구를 활성화하는 데에도 불구하고, 구형의 러닝 머신 디자인은 여러 가지 고유의 제한 사항이 있습니다. 첫째, 동물은 같은 벽이나 장애물 등 어떤 유형의 장애를 제기하지 회전하는 공기 해제 공, 무제한 표면에 이동하는 데 필요합니다. 영상 입력이 종은 자연적으로 의존하는 촉각 감각 입력 (예를 들면, 수염 터치 또는 핥아)에 비해 마우스와 쥐에 틀림없이 덜 효과적이기 때문에이 제한은, 컴퓨터에서 생성 된 "가상 현실"에 의해 보상 부분 만입니다 에. 둘째, 공 표면의 상당한 곡률은 케이지에서 평평한 바닥에 산책하는 데 사용되는 실험 쥐에 대한 불편 수 있습니다. 마지막으로, 공의 깎아 지른듯한 직경 (생쥐와 쥐 300 mm를 위해 최소 200 밀리) 구면의 세로 크기를 렌더링상대적으로 큰 디딜 방아 장치. 이로 인해 시판 현미경 셋업 대다수 구형 트레드밀을 결합 할 수있게, 그리고 종종 주문품 현미경의 범위에 의한 트레드밀 작성된 새로운 설정을 구축 요구한다.
머리 고정 마우스는 평평한 바닥과 벽 유형을 제공 공기 해제 모바일 homecage 주위에 이동하고, 스트레스없는 상황에서 물리적 환경을 탐험 할 수있는 여기, 새로운 방법이 설명되어 있습니다. 이 문서에서는 마우스 훈련과 머리 고정의 절차를 설명하고, 두 광자 현미경, 내장 광학 이미징 및 패치 클램프 녹음이 깨어있는 행동을 한 쥐의 뇌에서 수행하는 대표적인 예를 제공합니다.
Protocol
여기에 제시된 모든 절차는 동물 보호 (동물 실험 (61 / 2006)와에 핀란드 법)에 대한 현지 지침에 따라 수행 하였다. 동물 라이센스 (ESAVI/2857/04.10.03/2012)는 지방 자치 단체 (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA)로부터 얻은 것입니다. 성인 마우스 (나이 1-3개월, 무게 20-40그램)는 헬싱키 대학의 인증 된 동물 시설에서 그룹 주택 케이지에 보관 음식과 물을 임의로 제공 하였다.
1. 두개골 윈도우 주입
간략하게 아래에 설명 된대로 두개골 창, 출판 프로토콜 약간의 수정과 함께 29 ~ 31에 따라 이식 :
- 두개골 창 주입을 시작하기 전에 악기를 소독. 수술 후 합병증의 위험을 최소화하기 위해 수술 중 멸균 조건을 유지한다.
- 30 분 수술 24 시간 후 수술 전에 진통제 (케토 프로 펜, 2.5 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수 있습니다.케타민의 혼합물 (80 ㎎ / kg)과 자일 라진 (10 ㎎ / kg)을 사용하여 마우스를 복강 내 주사 esthetize. 정기적으로 발을 집어 마취의 깊이를 모니터링 할 수 있습니다. 37.0 ℃에서 동물의 체온을 유지하기 위해 가열 패드를 사용 , 수술에 의한 염증과 대뇌 부종을 감소 피하 주사로 덱사메타손 (2 ㎎ / ㎏)을 관리하는.
- 점점 건조에서 눈을 보호하기 위해 눈에 윤활제를 적용합니다. 마우스의 머리를 면도하고 면도 영역을 청소합니다. 이마에 목덜미의 선을 따라 수술 용 가위와 집게를 사용하여 피부를 잘라. 두개골에 부착 된 결합 조직을 제거합니다.
- 차분히 고속 수술 드릴을 사용하여 왼쪽 정면 뼈에 작은 우물을 드릴. 드릴 우물에 미니 볼트 (자료 참조) 고정합니다. 나사의 더 이상 한 반 전체 회전을 수행한다.
참고 : 직접 표면 대뇌 피질의 혈관 위에있는 그 지역을 피하십시오. 이러한 VES의 중단SELS은 출혈로 이어질 수 있습니다. - 개두술을 수행하려면, 오른쪽 정수리 뼈에 원형 창 (직경 3 ~ 3.5 mm)를 드릴. 100 μg 페니실린 100 단위 / ml의 스트렙토 마이신과 보충 증류수 H 2 O의 피질 버퍼의 드롭 (125 mM의 염화나트륨, 5 밀리미터의 KCl, 10 mM의 포도당, 10 mM의 HEPES, 2 MM의 염화칼슘, 2 mM의 망초 적용 / ㎖) 조심스럽게 원형 창 내부에있는 뼈의 일부를 제거합니다.
참고 : 세포의 특정 모집단에 형광 단백질을 발현하는 절차에서이 시점에서 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) 벡터 또는 다른 바이러스 성 벡터의 두개 내 주입을 수행 할 수 있습니다. - 두개골 창에 둥근 유리 커버 슬립 (# 1.5 두께 코드)를 배치합니다. 폴리 아크릴 접착제로 두개골에 커버 슬립을 연결합니다. 커버 슬립 위에 금속 홀더를 배치하고 치과 용 시멘트와 폴리 아크릴 접착제의 혼합물로 고정합니다.
참고 : 위에서 설명한 절차는 두개골 창에 최적화되어 있습니다광학 영상 실험에 사용 하였다. , 전기 생리학 실험에 적합한 "반전"두개골 창을 준비하는 다른 절차를 사용하십시오. 먼저, 두개골에 금속 홀더 접착제. 비디오에 예시 된 바와 같이 홀더의 오프닝에서 원형 창을 뚫습니다. 또한, 뇌 운동 32 방지하거나 최소화하기 위해 관심의 영역에 작은 개두술 (직경 0.5 mm 미만)를 확인합니다. 대뇌 피질의 버퍼를 새로 고치거나 두개골 창에 실리콘 접착제 한 방울을 배치, 다음 라운드 유리 커버 슬립으로 닫습니다. - 작업을 완료 한 후, 쉽게 접근 음식 및 물을 가온 케이지에 동물을 배치. 이 마취에서 완전히 회복 한 후에 만 그룹 주택 케이지에 동물을 반환합니다. 이동 먹거나 마시는 자기 저항, 체중 감소, 타액 분비, 입모 또는 비정상적인 호흡 소리 등의 고통의 흔적을 검출하면 진통제를 다시하는 것은 - 관리 할 수 있습니다.
2. 애니l 취급
- 케이지에서 마우스를 가지고 간단하게 5 ~ 10 분 정도 누르고 있습니다. 동물을 처리하는 동안 진정, 육포의 움직임과 소리를 만드는 것을 피하십시오.
- 처리 후에는 케이지에 마우스를 반환합니다.
- 실험자와 마우스를 편안하게하기 위해, 처리 에피소드 사이의 불평등 간격으로 취급 절차를 2 - 3 회 반복합니다.
- 작은 부드러운 헝겊을 가지고 불평등 간격으로 동물 2 - 3 배를 감싸줍니다.
- 동물은 침착하게 포장되고 익숙해해야합니다. 마우스가 흥분과 긴장 경우, 취급 및 포장 절차를 반복합니다.
3. 동물 교육
- 취급 및 포장을 습관화 후 다음 날이 완료 모바일 homecage에 동물의 훈련을 시작합니다.
- 동물의 이전 및 훈련 기간 동안 매일 무게를 기록한다.
참고 : 훈련 기간 동안, 동물은 그 무게의 10 % 이상 잃는 경우 t에서 제외되어야한다그는 실험. - 훈련 된 동물의 크기와 일치하기 위해 모바일 homecage 장치의 헤드 고정 아암의 수직 위치를 조정한다. 표준 실험실 가압 공기 출구 (통상적으로, 가스 탱크 있거나, 즉 약 5 바 300 l / 분, 충분히 높은 압력 및 공기 흐름의 속도를 제공하는 공기 펌프)에 장치의 공기 입구를 연결한다.
- 걸레에 동물을 감싸십시오.
- 헤드 고정 암에 동물의 머리에 부착 된 금속 홀더를 삽입하고 나사를 단단히 조여 고정합니다. 공기의 흐름을 켜고 공기 흐름이 공기 해제 homecage 무료 부상에 최적입니다 있는지 확인하십시오. 걸레를 제거하여 휴대 homecage에 동물을 놓습니다.
- 소음에 동물을 길들, 주변 소리에 일정한 노출 제공 (예를 들어, 사용하여, 라디오 나 레코드 음악 및 음성) 모든 교육 세션 동안뿐만 아니라 실험 중.
- 디첫 훈련을 uring, 훈련이 끝날 때까지 소등 후, 제 시간에 실내 조명을 유지합니다.
- 모바일 homecage 교육 2 시간 후, 헤드 고정에서 동물을 해제하고 물과 음식의 공급 케이지로 돌아갑니다. 휴식 조건에서 최소 2 시간 동안 그것을 두십시오.
- 70 % 에탄올 용액을 사용하여, 각 트레이닝 세션 후에 모바일 homecage를 청소하고 수돗물로 헹구어. 일회용 종이 타월로 물을 만끽하고 다음 사용하기 전에 모바일 homecage 건조.
- 동물이 훈련을하는 동안 실내 조명과 함께 2 시간 동안 연속 교육 세션을 수행 전원이 꺼집니다.
- 하루에 두 번 훈련을 수행합니다.
- 8 ~ 12 훈련 후, 한 번에 최대 2 시간 동안 실험 세션에서 동물을 사용합니다.
참고 : 이상 1-2 시간 지속 연장 교육 세션 동안 와트 마우스를 제공하는 것을 고려수동으로 또는 이동 homecage 프레임에 부착 된 피펫 홀더를 사용하여 전달 될 수있는 i 번째 마시는 물. 다르게는, 물을 직접 휴대 homecage의 벽에 하이드로 겔의 점성 방울을 배치하여 동물의 무제한 사료 사용을 위해 공급 될 수있다.
참고 : 만성 스트레스의 영향을 배제하기 위해 훈련을하기 전에 매일 동물의 무게를해야합니다. 어떤 시점에서,이 같은 냉동, 발성, 또는 스트레스에 의한 설사 등의 스트레스 반응을 보여, 경우 실험에서 동물을 제외합니다.
4. 응용 프로그램
- 깨어 마우스의 두 광자 이미징 모바일 Homecage 주위에 이동
- 모바일 homecage를 조립합니다. 다리와 머리를 고정 팔의 위치를 확인합니다.
- 걸레에 훈련 된 동물을 감싸십시오. 모바일 homecage에 동물을 배치합니다. 헤드 고정 암에 금속 홀더를 클램프. 걸레를 제거합니다.
- 사용 먼지 이식 커버 유리를 청소70 % 에탄올 용액과 건조시켜야합니다.
- 커버 클래스에 침지 유체의 방울을 배치. 물이 빨리 증발하기 때문에 바람직하게는, 점성 용액을 사용하십시오.
- (당신은 현미경 설정에서 정지 두 번째, 동일한 장치를하지 않는 한) 현미경으로 훈련 된 동물과 함께 모바일 homecage 장치를 놓습니다.
- 주문품 또는 펨토초 펄스 형 적외선 레이저를 탑재 시판 레이저 주사 현미경 이미징 시스템을 사용하여 이미징을 수행한다.
- 형광 현미경의 넓은 필드 모드를 사용하여 관심 영역을 찾을 수 있습니다. 뇌 혈관계를 평가하고 혈관의 패턴을 검사 한 후 적절한 타겟 영역을 선택하는 롱 패스 필터를 사용한다.
- 동물이 걸레에 고정, 또는 역으로 공전하는 동안 동안 이미지 대뇌 피질의 혈관에, 하나 꼬리 정맥에, 70,000 MW 텍사스 레드 - 복합 덱스 트란 (또는 아날로그)의 1 % 용액을 주입동물은 모바일 homecage에 위치한다. 860 ㎚에 대한 튜닝이 광자 레이저와 방출 된 광을 수집하기 위해 대역 통과 필터 (590-650 나노 미터)를 사용한다. Thy1 프로모터에서 뉴런의 모집단에 민감한 형광 단백질 GCaMP3 - 예를 들어, YFP 또는 칼슘 2 +을 표현 형질 전환 마우스를 신경 세포의 형태 나 이용하여 신경 활동의 정밀한 세부 사항을 평가하기 위해 515-560 nm의 방출 필터를 사용합니다.
- 이미지 수집을위한 적절한 소프트웨어를 사용합니다.
- 촬영 후, 나사를 풀어 헤드 고정 암에서 동물을 놓습니다. 케이지에 동물을 반환하고 다음 영상 세션을 시작하기 전에 최소 2 시간 동안 휴식을하실 수 있습니다.
- 이후 재 이미징에 대한 관심 (ROI)의 모든 영역의 좌표를 저장합니다. 이미지 같은 시간에 ROI를, 코디네이터에게 이미지의 중첩을 극대화하기 위해 각 시간을 조정합니다.
- 이미지를 분석하고 적절한 softw를 사용하여 세 가지 차원 복원을(예 ImageJ에 등)이다.
- 깨어있는 마우스에 내장 광학 이미징 모바일 Homecage 주위에 이동
- 고유의 광학 이미징 설정의 이미지 수집 카메라에서 모바일 homecage를 조립합니다.
- 걸레에 훈련 된 동물을 감싸십시오. 모바일 homecage에 동물을 배치합니다. 헤드 고정 아암에 금속 홀더 클램프.
- 70 % 에탄올 용액을 사용하여 먼지 이식 커버 유리를 청소하고 건조 할 수 있습니다.
- 주입 된 유리에 글리세롤 한 방울을 놓고 8mm 라운드 커버 전표로 커버.
- 반대측 vibrissa에 에어 블로우 튜브 반대와 조작을 놓습니다.
- 고속 카메라의 위치를 조정하고 대뇌 혈관계에 초점.
- 혈관의지도를 얻기 위해 카메라 필터없이 녹색 빛 (필터 546BP30)를 사용합니다.
- 약 400 마이크로 미터 대뇌 피질의 표면 아래에, 피질에 깊이 초점을 맞 춥니 다.
- 이미지 t에그는 혈액의 산소 수준에 의존 (BOLD) 광 신호는 카메라 앞에 590LP 필터를 배치하고 붉은 빛 (필터 630BP30)와 피질을 조명.
- 이 균등하게 과다 노출을 피하고, 관심 영역을 통해 배포 될 수 있도록 대뇌 피질 표면의 조명을 조정합니다. 관심 영역은 카메라의 다이나믹 레인지의 70~90% 세그먼트 내에 있도록 조명의 강도를 조절합니다.
- 카메라에서 이미지를 수집하는 LongDaq 이미지 수집 소프트웨어를 사용합니다.
- 저주파 자극 (0.05 Hz에서)과 실험 (초당 10 프레임 사이, 즉) 10 Hz로 1 영상 획득 주파수를 사용합니다.
- 고유 광 신호와 모든 간섭을 방지하기 위해 실내 조명을 끕니다.
- 마우스 이동 homecage에 적응하도록 적어도 30 분을 허용한다.
- 자극없이 6 분 에피소드 동안 이미지 기준선 활동.
- 유발 C를 기록하려면ortical 활동은 높은 주파수 (25 Hz에서) 6 분의 전체 기간 동안 공기 퍼프의 기차로 10 초 ON/10 초 OFF 모드 (0.05 Hz에서 자극)에 vibrissa 자극한다.
- 이미지 수집 한 후, 머리를 고정 팔에서 마우스를 해제하고 케이지로 돌아갑니다.
- 자극 반응의 진폭 잡음비 좋음 신호의 결과로, 깨어 동물에서 비교적 높은 경향이 있기 때문에, 주파수에 대한 추가 데이터 필터링을 사용하지 않는다.
- 이미지에 *. TIF 스택 파일 얻어진 세트를 변환 예를 들어, 사용하여 그들을 더 분석, 오픈 소스 피지 소프트웨어 (ImageJ에). 이미지 계산기 도구를 사용하여 vibrissa 자극하는 동안 얻은 프레임에서 기준 자발적인 활동을 뺍니다. 대안 적으로, 적절한 소프트웨어를 사용하여 주파수 도메인에서 데이터 필터링.
- 깨어 마우스의 패치 클램프 녹음은 모바일 Homecage 주위에 이동
- 모바일 homecage를 조립합니다.
- 걸레에 훈련 된 동물을 감싸십시오. 세균 감염을 방지하기 위해 trimethoprime (5 ㎎ / ㎏)과 sulfadoxine (25 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수 있습니다. 모바일 homecage에 동물을 배치합니다. 헤드 고정 아암에 금속 홀더 클램프.
- 깨끗하고 70 % 에탄올 용액 또는 0.5 % 클로르헥시딘 디 글루코 네이트를 사용하여 이식 치과 시멘트 "캡"과 커버 유리를 소독하고 건조 할 수 있습니다.
- 천천히 조심스럽게 금속 홀더에서 커버 유리를 제거합니다.
- 페니실린, 스트렙토 마이신과 보충 대뇌 피질의 버퍼를 새로 고침 및 멸균 지혈 혈전과 파편의 두개골 창을 청소합니다.
- 대뇌 피질의 버퍼에 접지 전극을 배치합니다.
- 미세 조작기의 전기 생리학 headstage를 놓습니다.
- 6.5에서 8.5MΩ에 이르기까지 다양한 팁 저항을 목표로, 붕 규산염 유리에서 피펫을 제작합니다. 세포 내 용액으로 패치 피펫을 입력합니다. 패치 피펫 용액의 조성은(mm 단위) 다음 8의 KCl, 111 K-글루코 네이트, 0.5 염화칼슘, 2의 NaOH, 10 포도당, 10 HEPES, 2 밀리그램 - ATP, 5 BAPTA를, pH는 KOH와 7.2로 조정 하였다. 막 전위 값은 -12 MV (33)의 계산 된 액체 접합 가능성에 대해 수정해야합니다.
- 정위 좌표를 사용하여 관심 영역을 대상으로하고, 신속하게 피펫 팁에 대한 강한 긍정적 인 압력을 유지하면서 뇌에 전극을 이동합니다. 뇌경막 침투 및 피펫 위치 결정 후, 팁 저항을 측정 및 후속 단계의 성공률을 향상시키기 위해보다 15 %의 저항의 증가를, 표시 전극을 버린다.
- 주변 뇌 조직의 부종을 방지하기 위해 반으로 긍정적 인 압력을 줄일 수 있습니다. 또한 단계는 표준 "장님 패치"프로토콜과 유사하다. 에서 기록하는 신경을 찾아 신경 세포가 가까운 proximit에서 검출 될 때까지 단계적으로 뇌에 팁을 낮추려면피펫 팁의 Y 전극의 임피던스 변화의 특성 시간적 시퀀스로 나타낸 바와 같이. 신경 세포의 존재의 주요 지표가 피펫의 몇개의 연속 된 단계 앞으로 건너 전극 저항에서 단조 증가 (2 μm의 세 단계에 걸쳐 피펫 저항이 일반적으로 20 % 증가)이다.
- 표적 신경 세포와 함께 기가 시일 접촉을 형성하기 위해, 피펫의 부압과 과분극을 적용한다.
- 전체 - 세포 구성을 설정하기 위해 셀에 큰 부압의 짧은 펄스를인가. 좋은 물개를 유지하기 위해 2 ~ 3 μm의에 의해 전극을 집어.
- 소망의 시간 동안 기록 또는 자발적인 유발 활성, 최대 20 ~ 40 분.
- 녹화 후, 뇌에서 피펫을 제거합니다.
- 대뇌 피질의 버퍼를 새로 고치거나 두개골 창에 실리콘 접착제 한 방울을 배치 한 다음 금속 홀더의 상단에 둥근 유리 커버 슬립을 붙입니다.
- ANIM 릴리스나사를 풀어 헤드 고정 암에서 알. 다음 촬영 전에 최소한 하루 동안의 케이지에 동물을 반환합니다.
- 예를 들어, FitMaster 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석 할 수 있습니다.
- 습관 - dishabituation 후각 테스트 깨어 마우스의 모바일 Homecage 주위에 이동
- 깨끗한면 조각 (2 × 2cm)를 부착은 양면 테이프를 사용하여 모바일 homecage의 벽의 안쪽에 수돗물에 떨어졌다. 면 조각은 "타겟 영역"의 중간에 위치하도록 벽의 외측에 컬러 마커를 배치하여 네 개의 존으로 이동 homecage 벽 나눈다. "대상"영역에 벽 세그먼트의 반대에 직면 headholder 암의 동물을 수정하고 30 분 동안 이동 homecage에 적응 할 수 있습니다.
- 깨끗한면의 또 다른 조각을 가지고 1 % 바닐라 추출액 몇 방울로 적시고. vanil를 전달하는 하나 모바일 homecage 벽에 깨끗한면을 대체라 냄새. 5 분 냄새를 제시한다. 냄새 프레젠테이션 기간 동안 모바일 homecage의 움직임을 추적 할 수 있습니다. 동물이 이동 homecage 운동의 전체 시간과 관련된 "표적"영역 대향 보낸다 누적 시간을 계측하여 냄새가 관심의 레벨을 추정한다.
- 5 분 간 세션 간격으로, 바닐라의 냄새를 이용하여 5 분의 응용 프로그램 세션을 세 번 반복합니다. 모든 세션에서 "바닐라"면의 새로운 조각을 사용합니다.
- 마지막으로, 다섯 번째 세션에서 사회적으로 중요한 냄새 동물을 제시한다. (반대 성별의 동물에서 그 전날에 획득) 소변 몇 방울면의 깨끗한 부분을 적시고 5 분의 대상 영역의 중앙에 배치합니다.
- 모바일 homecage 주위에 깨어 마우스 이동의 소설 냄새 인식
- 모바일 homecage 벽의 외측에 컬러 마커를 배치하여 네 구역으로 벽을 나눈다. AT & T는ACH 두 깨끗한면 조각 (2 × 2cm) (대상 영역 1 및 대상 구역 2로 지정) 서로 반대 영역의 중간에 벽의 안쪽에 수돗물에 떨어졌다. 대상 영역의 외부 벽 세그먼트에 직면 headholder 암의 동물을 수정하고 30 분 동안 이동 homecage에 적응 할 수 있습니다.
- 두면 신선한 사람과 조각 대체합니다. 장소 존을 대상으로 1 %의 바닐라 추출물 젖은면 조각 및 영역 2를 대상으로 수돗물 또 다른 하나 젖은 냄새시 10 분을위한 모바일 homecage 운동의 비디오를 기록 프레젠테이션 세션. 동물이 대상 영역 1 직면 소비하는 시간의 백분율로 참석 냄새를 계산 기준으로 누적 시간 영역 1과 2에 직면 보냈다.
- 10 분 간격 후, 이후 10 분 동안 homecage 벽에 도포 또 한 쌍을 배치합니다. 대상 영역 1과 1 %의 바나나 전자 젖은면 도포에 "바닐라"면 배치대상 영역 2 xtract. 모바일 homecage 운동의 비디오 녹화를합니다. 동물이 영역 1과 2가 직면 한 누적 시간에 소설 냄새 (대상 영역 2) 상대적으로 벽 세그먼트에 직면 소요 시간의 비율로 새로운 냄새에 대한 기본 설정을 계산합니다.
Representative Results
여기에 제시된 방법은 깨어있는, 머리를 고정하지만, 그렇지 않으면 자유롭게 움직이는과 행동 생쥐의 현미경 영상 또는 단일 세포 전기 생리학 녹화를위한 것입니다. 동물의 두개골이 헤드 고정 아암에 단단히 고정하고 동물은 진정한 (가상 반대), 유형 및 친숙한 환경에서 두 개의 차원으로 이동할 수있다. 공기 해제 모바일 homecage에 마우스를 익숙하게하는 것은 두 번 매일 2 시간의 교육 세션 4 ~ 6 일 (그림 1)으로 구성되어 있습니다. 훈련 된 동물은 그 후에 즉시 실험에 사용될 수있다. 일반적인 연구는 몇 시간에서 몇 일 또는 몇 주에 이르기까지 간격으로 이격되어있다 이미징 세션이나 패치 클램프 녹음 세션을 포함하고 있습니다. 중요한 것은, 모두 광학 및 전기 생리학 기록은 하나의 실험에서,인지 또는 행동의 자극과 판독을 동시에 수행 할 수 있습니다.
의 기계적 안정성을 평가하기 위해실험 동물은 이동 homecage (그림 2)를 탐색하는 동안 모바일 homecage에서 마우스의 머리 고정은, 형광 - 복합 덱스 트란과 및 YFP을 표현하는 대뇌 피질의 수상 돌기의 표시 대뇌 피질의 혈관의 이미지 시퀀스를 수집 하였다. 동물의 운동시 뇌의 최대 변위는 일반적으로 1.5 마이크로 미터를 초과하지 않았다. 이러한 변위는 수평 방향에 발생한 아주 드물게 모션 아티팩트 불필요한 어떠한 보정 렌더링, 결상면의 시프트 검출 결과 없다. 모바일 homecage 안정 헤드 고정은 마취 된 쥐에서와 같은 신뢰성 깨어 동물의 개별 돌기 쪽의 정량화 할 수 있습니다. 돌기 척추 밀도, 형태 및 회전율은 몇 시간에서 몇 일 또는 몇 주에 이르기까지 간격으로 수행 여러 이미지 세션과 세로 공부하는 동안 모니터링 할 수 있습니다.
m의 사용감Thy1-GCaMP3 형질 전환 마우스의 I) 두 광자 현미경과 야생형 생쥐 II) 고유 광 신호 영상 : 기능성 광학 이미징 OBILE의 homecage는 두 가지 방법을 사용하여 깨어 마우스의 체성 감각 피질에서 테스트되었습니다. 칼슘 2 + 이미징 셀 많은 뉴런의 형광 표지 체,뿐만 아니라 수상 돌기 및 축색 돌기 (도 3)를 포함 레이어 2 / 3에서 수행 하였다. 이자 (로아)의 선택된 영역에서 형광을 통해 시간의 플롯은 모바일 homecage에서 마우스의 활성 탐색 중 (GCaMP3 형광 일시적 증가로 측정) 자연의 연결 활동을 보여주는 그림 3에 나타낸다. 고유의 신호에 따라 광학 이미징 기능 영역의 공간적 분포를 매핑 할 수 있습니다. 그림 4는 V에 대한 응답으로 체성 감각 피질을 따라 전파 (지역 신경 활성화를 반영) 혈액의 산소 수준에 물결 모양의 변화를 보여줍니다0.05 Hz에서의 주파수에서 ibrissa 자극.
모바일 homecage와 패치 클램프 녹음의 가능성을 테스트하기 위해 2 ~ 3 개월 된 C57BL/6J 마우스를 사용했습니다. 체성 감각 피질에서 레이어 2 / 3 뉴런은 현재 클램프 모드를 사용하여 전체 세포의 구성에서 기록되었다. 깨어있는 생쥐의 두뇌에있는 패치 클램프 녹음 머리 유무선 homecage에 뇌 조각에 패치 클램핑 눈을 멀게 할 본질적으로 유사했다. 시도의 약 50 %는 70 % 이상이 안정 전체 셀 구성 기록을 수득 그중 성공적인 기가 시일 형성 결과. 때문에 세포의 기계적인 변위 기가 시일의 접촉을 잃을 이벤트는 관찰되지 않았다. 5 마우스의 활성화 (실행)의 에피소드 및 수동 (휴식) 상태와 상관 대표 10 분 긴 전류 클램프 기록 60 초 조각을 보여줍니다 그림.
그림 1. 모바일 homecage 깨어 마우스의 머리를 고정하는 방법. A) 공기 해제 모바일 homecage 디자인과 일반적인 실험 타임 라인의 일반적인 개념. B) 다이어그램의 그림 개요. 이 연구는 2 주 전에 처리 여덟 매일 두 번 훈련에 의해 다음에 포장에 마우스를 익숙하게하는 두개골 윈도우의 주입으로 시작한다. 일반적인 연구는 몇 시간에서 몇 일 또는 몇 주에 이르기까지 간격으로 이격되어있다 이미징 세션이나 패치 클램프 녹음 세션을 포함하고 있습니다. 모두 광학 및 전기 생리학 측정 한 실험 내인지 또는 행동 자극 및 판독과 병렬로 수행 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
모바일 homecage를 이동하는 깨어있는 생쥐에 두 광자 현미경 영상의 그림 2. 예. 70 kDa의 텍사스 레드 - 복합 덱스 트란으로 표시 A, B) 두피 혈관. 개별 용기 세그먼트의 직경은 시간이 지남에 따라 마우스의 휴식과 실행 (A)의 기간에 걸쳐 혈관 내강 그려진 라인의 프로파일을 플롯에 의해 측정된다. 동맥과 정맥의 혈액 흐름의 속도는 혈관 벽 (B)의 모집단에 YFP을 표현 형질 전환 생쥐의 뇌에서 시각 신경 세포의 형태 학적. C, D) 정밀한 세부 사항에 평행하게 그려진 선을 따라 선 검사에 의해 측정된다 Thy1 프로모터에서 신경. 마우스의 체성 감각 피질 (C)의 피라미드 신경 세포의 3 차원 재구성. 돌기 (B)의 이미지깨어있는, 행동 마우스에 인수 목장 개별 돌기 척추의 형태 (D) 마우스의 움직임으로 인해 발생할 수있는 뇌의 움직임. E) 정량의 정량화 충분히 안정적이다. 큰 진폭 변위가 마우스의 실행 기간과 상관 관계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
깨어 Thy1-GCaMP3 마우스가 이동 homecage 주위에 이동에있는 신경 세포의 집단 활동의 그림 3. 예. 대뇌 피질의 층 II / III 신경의) 두 광자 이미지. 로아는, 예를 들면 신경 세포 기관, 수상 돌기 및 축삭은 (시간의) 노란색. B에에 도시 로아에서 GCaMP3 형광 ΔF / F의 흔적을 표시됩니다C 노란색 로아에서 .26) 1.5 초 / 프레임 기록. C) 줌 인 65 밀리 초 / 프레임에서 몇 군데 지역. D) 형광이 시간에 플롯 작업에 해당하는 GCaMP3 형광의 일시적 증가 (적색)를 보여줍니다 잠재적 유도 칼슘 2 + 유입 에피소드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
고유 광 신호를 촬상 수단에 의해 깨어 마우스의 피질 기능 반응 공간 분포를 매핑하는도 4. 예. 모바일 호에서 기본 활동의 두개골 창을 통해 피상적 인 혈관의) 밝은 필드보기. B) 진도지도6 분 에피소드 0.05 Hz의 주파수에서 vibrissa 자극에 대한 응답으로 체성 감각 피질을 따라 전파되는 신경 세포의 활동. C) 진도지도 동안 mecage는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
모바일 homecage 주위를 이동 깨어 마우스의 피질 전체 세포 패치 - 클램프 녹음의 그림 5. 예. 마우스 대뇌 피질의 층 2 / 3에있는 신경 세포에서) 전류 클램프 기록. 0.5 초 (추적 아래에 표시) 100-PA 전류 주입은 활동 전위의 버스트가 발생합니다. 셀은 피라미드 뉴런 위해 주파수 스파이크 적응 특성을 보였다. B) 연속 전류 - 클램프 녹음(추적 위의 분홍색으로 표시) 마우스 '운동 활성과 상관 같은 신경 세포에서. 마우스의 (C)을 휴식과 (D)를 실행의 기간 동안 레이어 2 / 3의 신경 세포의 대표 자발적인 활동. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
모바일 homecage에서 훈련하는 동안 그림 6. 동물의 체중 감소와 head-fixed/non-fixed 쥐의 운동 활성. 훈련 전에 A) 동물의 무게 (+ SD, %를 의미). 그 체중 감소가 완전히 7-8 일 훈련 세션 모바일 homecage에 마우스의 수평 운동의 상대. B) 탄도로 반전 참고8 번째 훈련 8 번째 훈련 머리 고정 (원. D) 기간) 동안 라운드 케이지를 탐험이 아닌 머리 고정 마우스. C) 트랙 이동 중에 모바일 homecage의 추적 움직임으로 추정하고 한 훈련의 1-4 일 하루 동안 비 고정 (삼각형) 마우스의 움직임은 (+ SD, % 평균)를. 하루 4, 머리를 고정 마우스도 (1 일째)을 동결하거나 과도한 운동 활성을 표시하는 참고. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
나은 뇌 생리학 및 병리학을 이해하기 위해 연구는 각 제조에 가장 적합한 기술을 이용하여, 제조 복잡성 수준의 다양한 수행되어야한다. 깨어 있고 행동하는 동물 실험은 중요한 방법 론적 문제를 나타내는 반면 현재, 신경 과학 방법론의 넓은 범위 (전신의 fMRI에서 하위 세포 기관 STED 현미경에) 쉽게, 마취 동물에 적용됩니다.
여기에, 새로운 접근 방식은 실험실 동물, 단단히 머리 고정 임에도 불구하고, 공기가 들어 올려 이동 homecage을 이동하고 스트레스없는 상태에서의 가시적 인 환경을 탐구 곳을 설명합니다. 여기에 제시된 헤드 고정 행동 동물 제제는 중요한 장점을 제공한다. 첫째,이 방법으로 얻은 전기 생리학 또는 영상 데이터는 마취도 구속에 의한 스트레스도 타협이다. 이동 주택에 마우스의 위치케이지는 빠르게, 심지어 일시적으로 동물을 마취가 필요하지 않습니다. 둘째, 공기 해제 homecage 잘 신경 세포 형태의 변화를 정량화하고 깨어있는 동물에서 단일 세포 전기 생리학 활동을 기록하는 데 필요한 기계적 안정성을 보장합니다. 마지막으로, 모바일 homecage의 디자인은, 따라서 웨이크 마우스의 뇌에서 두 개의 광자 이미징 또는 패치 클램프 기록을위한 표준 직립 현미경 모바일 homecage 포지셔닝 있도록 구면 트레드밀에 비해 더욱 컴팩트.
모바일 homecage의 기업 헤드 고정은 기본 뇌 영역에 광학 또는 전기 액세스를위한 중앙에 둥근 구멍으로 특별히 디자인 된 네 개의 날개 금속 홀더의 주입이 필요합니다. 이러한 금속 홀더는 접착제, 치과 용 시멘트 및 두개골 뼈에 나사 결합 작은 볼트의 조합에 의해 두개골에 부착된다. 이 수술은 이전의 많은 수를 기반으로 개발 된절차를 발표하고, 안정적이고 재현 가능한 두개골 창 준비의 결과로 발견되었다. 생체 전기 생리학 실험, 달 모양의 창 (34), 작은 크기의 개두술 (0.5 mm 미만) (32) 및 드릴 유리 덮인 준비 35에 활용되었다. 여기에, "반전"두개골 창은 대형 (직경 3.5 mm) 또는 작은 (이하 0.5 mm 직경) 개두술 중 하나를 이식했다. 뇌의 움직임을 최소화하는 것은 전기 생리학 실험을 위해 작은 크기의 craniotomies을 수행하는 것이 좋습니다 이유입니다, 안정적인 단일 세포 레코딩을위한 중요합니다. 광학 영상 실험의 두개골 윈도우의 주입되면, 동물은 윈도우가 처음 일시적으로 투명성을 잃고 다음에 따라 50~70% 수익률 (그것을 회복하는 기간 동안 적어도 2 ~ 3 주에 복구 할 수 있습니다 마우스 균주의 유전 적 배경). 두개골 창 및 안정성이의 투명성두개골에 부착 된 치과 용 시멘트 "캡"의 ITY 동물 취급 중 정규 쌍안 현미경과 신체 검사에 의해 검증 될 수있다. 2-3 주 회복 기간의 끝에서, 치과 용 시멘트에 잔류 사후 동작 염증 또는 기계적 결함의 징후를 나타내지 그 동물은 실험에서 제외하고 종료한다.
쥐를 훈련을 시작하기위한 최적의 연령 2-4 개월 (20-40그램의 체중에 해당)입니다. 젊은 동물의 두개골에 치과 시멘트 "모자"의 고정은 모바일 homecage에 머리 고정 마우스의 운동에서 부과하는 기계적 스트레스의 탄력성을 감소시킬 수있는, 신뢰할 수 있습니다. 수컷과 암컷 생쥐 모바일 homecage에서 이동 동등 기꺼이 나타나지만, (데이터 미도시) 암컷 마우스에서 그들의 투명성 회복 두개 창 나은 비율을 달성하는 경향이있다. 따라서, 주문 티셔츠O 약 30 % 더 많은 수컷 마우스의 두개골 창을 주입, 영상 선택 동물의 코호트 연구에서 성별 균형있게 배합을 확인하는 것이 좋습니다. 사회적 상호 작용에 따라서는 한배 새끼가 운영하고 훈련 병렬 및 그룹 주택 새장에 함께 보관하는 것이 좋습니다, 동물의 복지를 향상시키고 스트레스를 감소하는 것으로 알려져있다.
구형 디딜 방아 준비 13 일 발표 된 절차와는 달리, 모바일 homecage을 이용하는 방법은 머리를 고정하는 순간에 마우스를 마취가 필요하지 않습니다. 그것도 간단한과 "빛"마취 에피소드 직후 얻은 생리 학적 측정에 미칠 가능성이 있다고 잔여 효과를 배제 할 수 있기 때문에이 차이는 중요하다. 사실, 비록 헤드 고정이 마취하에 이루어졌다 실제 실험이 하나가 할 수없는, 짧은 대기 기간 13 일 이후 시작된 연구실험 데이터에 대한 간단한 마취 에피소드 가능한 오래 지속되는 효과를 제외. 다른 연구는 고정을 머리에 동물의 체계적인 습관화 물 부족에 의존하고 36 움직 남아 동물을 동기 부여의 수단으로 물 보상을 사용했습니다. 그러나, 보상 기반 헤드 고정 방법은 해당 행동 검사의 선택을 제한하고, 중요한 것은, 잘 확립 된 자극 - 보상 협회 중 하나를 차지한다. 반면, 모바일 homecage에 고정을 머리에 마우스 습관의 방법은 물 부족과 이후의 보상을 필요로하지 않습니다.
물 배달 시스템과 모바일 homecage을 보충하는 것은 오랫동안 실험을 권장합니다. 여기에 제시된 동물 훈련과 실험은 표준 12 시간 빛 일정 (리에서 보관하는 마우스에 대한 생리 학적으로 수동 기간에 해당하는, (오전 8시부터 오후 6시까지) 낮 동안 수행 하였다) 오후 6시 오전 6시에 오프에 ghts. 취수 직접 마우스의 활동과 연관되어 있기 때문에 트레이닝 / 이미징 / 기록 세션의 지속 시간이 2 시간을 초과하지 않는 경우, 마우스 수동적 기간 동안 물 전달을 필요로하지 않는다. 트레이닝 세션의 타이밍 및 지속 기간뿐만 아니라, 하나의 모바일에 homecage 동물 익숙하게 필요한 세션의 최적의 수의 문제를 해결할 필요가있다. ⅰ) 체중 감소, 및 ⅱ) 운동 활성의 수준이 때문에,이 기준은 헤드 고정 절차에 의해 유도 된 응력을 평가하는 데 사용 하였다. 도 6에 도시 된 바와 같이, 체중 감소는 훈련 일에이 6 %의 평균 수준에 도달하고, 완전히 훈련 일 4 (도 6A)에 의해 반전된다. 지속적으로 무게 역학, 머리 고정 동물의 운동 활성 수준은 교육의 첫 번째 날에 억제되어 있지만, 훈련 4 일째 (그림 6D)에 의해 안정화. 이러한 측정을 바탕으로, 우리는 제언이에 프로토콜에 설명 된대로 이동 homecage에 마우스 연수 기간의 최소 기간은 4 일 t.
공기 해제, 평면 바닥의 모바일 homecage의 사용은 머리를 고정 마우스의 교육 패러다임에 복잡한 작업 (감각, 지각,인지)를 추가 할 수 있습니다. 본 연구에서는 행동 검사의 두 가지 프로토콜이 제공됩니다. 두 프로토콜 냄새 신호를 이용하고 마우스 피질 세로 영상 / 녹음과 결합 될 수있다. 모바일 homecage는 비 흡수성 물질로 제조되어 있지만, 하나는 여전히 계정에 장치 및 시험 냄새 (들)의 냄새 사이의 가능한 간섭을 할 필요가있다. 행동 실험의 시각 / 촉각 신호를 방해 할 수있는 또 다른 요인은 완벽하지 않으며, 따라서, 랜드 마크로서 동물에 의해 인식 될 수있는 벽과 인서트 사이의 접합이다. 그것은 여기에 몰래 가치가있다, 그 같은 INTE시 동물의 고통을 최소화하기 위해모바일 homecage 벽에 냄새 제시면의 배치 등 rventions은 실험자 가능한 한 빨리 이러한 개입을 수행하고 탄소 케이지의 연장 처리를 방지하기 위해 연습을해야합니다. 소설 냄새 / 객체의 프레 젠 테이션을위한 대체 전략은 하이드로 겔 기반 솔루션은 동물의 머리 위치와 호환 높이에서 탄소 케이지 벽의 내부 표면에 부착 된 작은 선반에 떨어지거나 (예 : 식품 칩과 같은) 오브젝트 배치, 예를 들면, 생각할 수 있습니다.
모바일 homecage 머리 고정 동물 수평 운동, situp,, 정리 터는 본 연구에 도시 된 바와 같이 앞다리와, 코 파고, 숙련 된 전면 발 움직임, 그리고 벽에 감동을 핥는 등의 두 가지 차원 운동의 넓은 범위를 수행 할 수 있습니다 . 모바일 homecage과 여기에 제시된 프로토콜을 사용하여, 연구자들은 자극 조건을 모두 제어 높은 수준의 감각 신경 시스템을 연구 할 수s와 행동 판독을. 또한, 깨어있는 생쥐의인지 능력에 대한 연구는 에어컨, 공간 탐색과 의사 결정 작업 중에 수행 할 수 있습니다.
이 방법의 몇 가지 실제적인 제한이 있습니다. 먼저, 압축 공기의 상당량은 homecage 드는 전력을 달성하고 오래 지속되는 실험을 수행하기 위해 필요하다. 둘째로, 현재의 구현에서 이동 homecage 직경 만 18cm이며, 따라서 복잡한 실험 환경은 공간적 제한없이 설계 될 수있는 가상 현실에 비해 상대적으로 작고 간단한 공간을 제공한다. 셋째, 수염 자극과 여기에 제시된 보상 기반의 실험을하는 동안, 장치는 가능성에게 마우스 벽 접촉을 제한하는 데 사용되었다. (예 : 눈의 지시 빛 프로젝터와 같은) 외부에서 시각적 또는 감각 자극 채널의 첨가에 비해 더 인체 공학적 컴팩트 한 장치를 설계 필요구형 디딜 방아 실험에 사용 된 여러 화면이나 돔 프로젝션 솔루션을 제공합니다.
요약하면, 공기 - 리프트 모바일 homecage 움직이는 헤드 고정 마우스의 사용은 크게 단일 실험 내 관찰과 조작, 세포 분자 및 행동 수준을 배합 연구를 용이하게한다. 여기에 예시 된 특정 응용 프로그램은 두 광자 현미경 이미징, 고유 광 신호 이미징 및 비 마취 행동을 한 쥐의 패치 클램프 녹음이 (가) 있습니다. 그것은이 방법은 깨어있는, 행동 마우스 실험에서 새로운 지평을 열고 약물 개발과 뇌 기능의 기초 연구 모두를위한 유용한 도구 역할을 할 것으로 예상된다.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 원고에 대한 자신의 소중한 의견에 대한 교수의 Eero Castren 감사합니다. 작품은 핀란드의 국제 이동성 및 신경 과학의 핀란드어 대학원 (두뇌와 마음 박사 과정)에 대한 핀란드의 아카데미 센터에서 교부금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tweezers, Stainless Steel, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For patch pipette production |
| Camera | Foscam | FI8903W | Night visibility |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310104001001008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Eyes-lubricant | Novartis | Viscotears | For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Four-winged metal holder | Neurotar | ||
| Head Holder for Mice | Narishige | SG-4N | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Kwik-Sil | WPI | ||
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microelectrode puller | Narishige | PC-10H | Vertical puller for glass pipette production |
| Micromanipulator | Sensapex | ||
| Mini bolt | Centrostyle | Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5 | |
| Mobile Homecage | Neurotar | ||
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| Nonwoven swabs, 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 1.5 thickness | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
- Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329, 959-964 (2010).
- Sitdikova, G., et al. Isoflurane suppresses early cortical activity. Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2013).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903-912 (2001).
- Piyawattanametha, W., et al. In vivo brain imaging using a portable 2.9 g two-photon microscope based on a microelectromechanical systems scanning mirror. Optics letters. 34, 2309-2311 (2009).
- Sawinski, J., Wallace, D. J., Greenberg, D. S., Grossmann, S., Denk, W., Kerr, J. N. D. Visually evoked activity in cortical cells imaged in freely moving animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19557-19562 (2009).
- Fee, M. S. Active stabilization of electrodes for intracellular recording in awake behaving animals. Neuron. 27, 461-468 (2000).
- Greenberg, D., Houweling, A., Kerr, J. Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats. Nat Neurosci. 11 (7), 749-751 (2008).
- Fujiwara-Tsukamoto, Y., et al. Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents. Journal of Neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).
- Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint. Neuron. 80, 371-384 (2013).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat Neurosci. 13, 1433-1440 (2010).
- Parry, T. J., McElligott, J. G. A method for restraining awake rats using head immobilization. Physiolog & behavior. 53 (5), 1011-1015 (1993).
- Brecht, M., Schneider, M., Sakmann, B., Margrie, T. W. Whisker movements evoked by stimulation of single pyramidal cells in rat motor cortex. Nature. 427 (6976), 704-710 (2004).
- Van Looij, M. A. J., Liem, S. -S., van der Burg, H., van der Wees, J., De Zeeuw, C. I., van Zanten, B. G. A. Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice. Hearing research. 193, 75-82 (2004).
- Hentschke, H., Schwarz, C., Antkowiak, B. Neocortex is the major target of sedative concentrations of volatile anaesthetics: strong depression of firing rates and increase of GABAA receptor-mediated inhibition. The European journal of neuroscience. 21, 93-102 (2005).
- Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv: European journal of physiology. 444, 491-498 (2002).
- Crochet, S., Petersen, C. C. H. Correlating whisker behavior with membrane potential in barrel cortex of awake mice. Nat Neurosci. 9, 608-610 (2006).
- Houweling, A. R., Brecht, M. Behavioural report of single neuron stimulation in somatosensory cortex. Nature. 451, 65-68 (2008).
- Poulet, J. F. A., Petersen, C. C. H. Internal brain state regulates membrane potential synchrony in barrel cortex of behaving mice. Nature. 454, 881-885 (2008).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. Journal of neuroscience methods. 178, 75-79 (2009).
- De Kock, C. P. J., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16446-16450 (2009).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Hentschke, H., Haiss, F., Schwarz, C. Central signals rapidly switch tactile processing in rat barrel cortex during whisker movements. Cerebral cortex. 16, 1142-1156 (2006).
- Stüttgen, M. C., Rüter, J., Schwarz, C. Two psychophysical channels of whisker deflection in rats align with two neuronal classes of primary afferents. J. neuroscience. 26, 7933-7941 (2006).
- Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67, 1048-1061 (2010).
- Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (20), 8473-8478 (2011).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461, 941-946 (2009).
- Chen, G., King, J. A., Burgess, N., O’Keefe, J. How vision and movement combine in the hippocampal place code. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 378-383 (2013).
- Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7392), 62-68 (2012).
- Holtmaat, A., et al. Long-term , high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 19-22 (2009).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Portera-Cailliau, C., Trachtenberg, J. T., de Paola, V., Svoboda, K., Wilbrecht, L., Holtmaat, A. Imaging Neocortical Neurons through a Chronic Cranial Window. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
- Garaschuk, O., Milos, R. -I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1 (1), 380-386 (2006).
- Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. Journal of neuroscience methods. 51 (1), 107-116 (1994).
- Golshani, P., Gonçalves, J. T., Khoshkhoo, S., Mostany, R., Smirnakis, S., Portera-Cailliau, C. Internally mediated developmental desynchronization of neocortical network activity. The Journal of neuroscience. 29 (35), 10890-10899 (2009).
- Polack, P. -O., Friedman, J., Golshani, P. Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex. Nat Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls. Somatosensor., & motor research. 27, 131-148 (2010).
