Summary
Este método cria um ambiente tangível, familiar para o mouse para navegar e explorar durante o exame ou unicelulares microscópicos registros eletrofisiológicos, que exigem a fixação firme da cabeça do animal.
Abstract
É amplamente reconhecido que o uso de anestésicos gerais pode minar a relevância dos dados eletrofisiológicos ou microscópicos obtidos com o cérebro de um animal vivo. Além disso, a longa recuperação da anestesia limita a freqüência de episódios de gravação / imagens repetidas em estudos longitudinais. Assim, novos métodos que permitam gravações estáveis a partir de ratinhos não anestesiados, comportando são esperados para o avanço dos campos de ciências neurológicas e cognitivas celulares. As soluções existentes variam de mera contenção física para abordagens mais sofisticadas, tais como esteiras lineares e esféricos usados em combinação com realidade virtual gerado por computador. Aqui, um novo método é descrito em que um mouse fixo-cabeça podem se mover em torno de um homecage móvel levantada ao ar e explorar seu ambiente em condições livres de estresse. Este método permite que os pesquisadores para realizar testes comportamentais (por exemplo, de aprendizagem, de habituação ou novela de reconhecimento de objeto) em simultâneo comdois fótons de imagem microscópica e / ou gravações de patch-clamp, todos combinados em um único experimento. Este vídeo-artigo descreve o uso do dispositivo de fixação da cabeça dos animais acordados (homecage móvel), demonstra os procedimentos de habituação dos animais, e exemplifica um número de possíveis aplicações do método.
Introduction
Uma tendência recente emocionante nas Neurociências é desenvolver abordagens experimentais para celular e molecular sondagem de redes neuronais no cérebro de acordado, comportando roedores. Tais abordagens promissoras para lançar uma nova luz sobre os processos neurofisiológicos subjacentes a função motora, a integração sensório-motora, percepção, aprendizagem, memória, bem como progressão lesão, neurodegeneração e doenças genéticas. Além disso, a gravação do cérebro acordado do animal é uma promessa para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos e tratamentos.
Há uma consciência crescente de que a anestesia, o que tem sido comumente utilizados em experimentos neurofisiológicos, pode afetar os mecanismos básicos de funcionamento do cérebro, podendo levar a uma interpretação errônea dos resultados experimentais. Assim, o anestésico cetamina amplamente utilizado aumenta rapidamente a formação de novas espinhas dendríticas e melhora a função sináptica 1; outro anestésicos utilizadaic isoflurano em níveis anestesia cirúrgica suprime completamente a atividade cortical espontânea em ratos recém-nascidos e bloqueia oscilações do eixo-burst em animais adultos 2. Actualmente, apenas um número limitado de abordagens permitir experimentos em camundongos não anestesiados por meio de dois fótons de imagem microscópica ou gravações de patch-clamp. Estas abordagens podem ser divididas em preparações livremente móveis e fixas de cabeça.
A atracção única de uma preparação de animais movimento livre é que ele permite a avaliação do comportamento natural, incluindo os movimentos do corpo inteiro durante a navegação. Uma forma de imagem dentro do cérebro de um roedor movendo-se livremente é anexar um microscópio montado na cabeça miniaturizada ou fiberscope 3-5. No entanto, os dispositivos miniaturizados tendem a ter um desempenho óptico limitada em comparação com a microscopia à base objectivo de dois fotões, e não pode ser facilmente combinado com as gravações de células inteiras de patch-clamp 6.
A exisoluções picada para fixação de cabeça um roedor acordado têm se baseou principalmente na contenção física ou 7,8 ou em treinar o animal para exibir apoio de cabeça voluntária 9. Outra abordagem popular é o de permitir que membros do animal para se mover, colocando-o em, por exemplo, um tapete rolante esférica 10; esta abordagem é muitas vezes combinado com a realidade virtual gerado por computador. Experimentos eletrofisiológicos em ratos fixo-cabeça têm usado principalmente gravações extracelular e foram usados para estudar regulação central da função cardiovascular 11, os efeitos da anestesia sobre a atividade neuronal 12, a resposta auditiva no tronco encefálico 13 e processamento de informação 14. As gravações pioneiras intracelulares / celulares totais em animais se comportando acordado foram realizados na década de 2000 e têm-se centrado sobre a atividade neural relacionada à percepção e movimento 15-20. Ao mesmo tempo, os primeiros estudos de imagem microscópica em ratos acordados foram pubcido, onde a microscopia de dois fótons foi usado no córtex sensorial de ratos fisicamente contido 7 e em ratos correndo em uma esteira esférica 21.
Estudos in vivo de microscopia e de eletrofisiologia posteriores demonstraram que uma preparação de fixação da cabeça podem ser combinados com sucesso com paradigmas comportamentais baseados em movimentos de membros anteriores, o reconhecimento odor, mexendo, e lambendo 8,22-25. Ratos colocados na esteira esférica podem ser treinados para navegar no ambiente virtual visual gerada por um computador 10,26. Gravações intracelulares / extracelulares demonstraram que, em um animal fixo-cabeça navegar nesse ambiente virtual, a ativação de células lugar do hipocampo pode ser detectado 27. Em um ambiente virtual visual, ratos demonstram ritmo normal teta relacionados com o movimento no potencial de campo local e precessão da fase theta durante o movimento ativo 27. Recentemente, o activit espacial e temporalpadrões y de populações neuronais foram registrados opticamente em ratos durante as tarefas de decisão memória de trabalho em um ambiente virtual 28.
Apesar de ter habilitado pesquisa da descoberta, o projeto esteira esférica tem várias limitações inerentes. Primeiro, o animal é necessária para mover sobre uma superfície ilimitada de uma bola levantada ao ar rotativo, que não coloca obstáculos tangíveis, tais como paredes ou barreiras. Essa limitação é apenas em parte compensada pela "realidade virtual" gerado por computador, porque input visual é sem dúvida menos eficaz em camundongos e ratos, em comparação com a entrada sensorial tátil (por exemplo, bigode de toque ou lamber), que estas espécies naturalmente confiar na. Em segundo lugar, a curvatura considerável da superfície da bola pode ser desconfortável para os ratos de laboratório usados para caminhar sobre um piso liso em suas gaiolas. Finalmente, o diâmetro da esfera pura (pelo menos 200 mm para os ratos e 300 mm para os ratos) processa o tamanho vertical do esféricadispositivo esteira relativamente grande. Isso torna difícil para combinar esteira esférico com a maioria das configurações de microscopia disponíveis no mercado, e muitas vezes requer a construção de uma nova configuração em torno da esteira por meio de quadros de microscópio feitos sob medida.
Aqui, um novo método é descrito em que um mouse fixo-cabeça podem se mover em torno de um homecage móvel levantou-ar que dispõe de um piso plano e paredes tangíveis, e explorar o ambiente físico em condições livres de estresse. Este artigo demonstra os procedimentos de treinamento do mouse e fixação cabeça, e fornece exemplos representativos onde as gravações de microscopia de dois fótons, de imagem óptico intrínseco e patch-clamp são realizadas no cérebro de ratos comportando acordado.
Protocol
Todos os procedimentos aqui apresentados foram realizados de acordo com a orientação local para cuidar dos animais (A lei finlandesa de Experimentação Animal (62/2006)). A licença de animais (ESAVI/2857/04.10.03/2012) foi obtida a partir de autoridade local (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Camundongos adultos (idade 1-3 meses, peso de 20-40 g) foram mantidos em gaiolas de estabulação no biotério certificado da Universidade de Helsinki e desde que com comida e água ad libitum.
1. Implantação Janela Cranial
Janela craniana é implantado de acordo com protocolos publicados 29-31, com pequenas modificações, como descritos abaixo:
- Esterilizar os instrumentos antes de iniciar a implantação janela craniana. Manter condições estéreis durante a cirurgia para reduzir o risco de complicações pós-operatórias.
- Administrar um analgésico (cetoprofeno, 2,5 mg / kg) 30 minutos antes da cirurgia e 24 horas pós-cirurgia. Umaesthetize do rato, utilizando uma mistura de cetamina (80 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg), injectada intraperitonealmente. Monitore regularmente a profundidade da anestesia por pata beliscar. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo do animal a 37,0 ° C. Para reduzir a inflamação induzida por cirurgia e edema cerebral, administrar dexametasona (2 mg / kg) por injecção sub-cutânea.
- Aplique lubrificante ocular para proteger os olhos de ficar seco. Raspar a cabeça do rato e limpe a área raspada. Corte a pele usando uma tesoura cirúrgica e uma pinça ao longo da linha a partir da nuca até a testa. Remova qualquer tecido conjuntivo anexado ao crânio.
- Lenta e cuidadosamente faça um pequeno bem no osso frontal esquerdo usando uma broca cirúrgica de alta velocidade. Aperte um mini parafuso (ver Materiais) para o poço perfurado. Executar não mais de um-e-um-metade voltas completas do parafuso.
NOTA: Evite as áreas que estão localizados diretamente acima dos vasos corticais superficiais. O rompimento desses vessels pode levar a hemorragia maciça. - Para realizar craniotomia, faça uma janela circular (3-3,5 mm de diâmetro) no osso parietal direito. Aplicar uma gota de tampão de córtex (NaCl 125 mM, KCl 5 mM, glicose 10 mM, HEPES 10 mM, 2 mM CaCl 2, e 2 mM de MgSO4 em H2O destilada, suplementado com penicilina 100 unidades / ml e estreptomicina 100 ug / ml) e remover cuidadosamente a parte do osso situado no interior da janela circular.
NOTA: Para expressar uma proteína fluorescente em uma subpopulação específica de células, realização da injecção intracraniana do vírus adeno-associado (AAV) ou outros vectores virais neste ponto do procedimento. - Coloque uma lamela de vidro redondo (# 1.5 código de espessura) na janela craniana. Prenda a lamela ao crânio com cola poliacrílico. Coloque um suporte de metal na parte superior da lamela e corrigi-lo com a mistura de cimento e cola dental poliacrílico.
NOTA: O procedimento descrito acima é otimizado para janelas cranianasusado em experimentos com imagens ópticas. Para preparar uma "invertida" janela craniano adequado para experimentos eletrofisiológicos, use um procedimento diferente. Em primeiro lugar, colar o suporte do metal para o crânio. Fure uma janela circular no interior de abertura do titular, como exemplificado no vídeo. Alternativamente, fazer uma craniotomia menor (menos do que 0,5 mm de diâmetro) na região de interesse para evitar ou minimizar o movimento do cérebro 32. Atualizar o buffer cortical ou coloque uma gota de cola de silicone na janela craniana, depois fechá-lo com uma lamela de vidro redondo. - Depois de concluir a operação, coloque o animal em uma gaiola aquecido com comida e água de fácil acesso. Devolver o animal para a gaiola grupo habitação somente depois que ele se recupera totalmente da anestesia. Re-administrar analgésico ao detectar qualquer sinal de dor, incluindo a relutância em se movimentar, comer ou beber, perda de peso, salivação, piloereção ou sons respiratórios anormais.
2. Animal Manipulação
- Leve o mouse de sua gaiola e simplesmente prendê-lo por 5-10 min. Tenha calma durante o manuseio do animal, evitar fazer movimentos bruscos e ruídos.
- Após o manuseio, devolva o mouse para sua gaiola.
- Repita o procedimento de manipulação 2-3x com intervalos desiguais entre episódios de manipulação, a fim de tornar o mouse confortável com o experimentalista.
- Tome um pequeno pano macio e enrole o animal 2-3x com intervalos desiguais.
- Animais devem manter a calma e se acostumar a ser envolvido. Se o mouse é animado e nervoso, repita os procedimentos de manuseio e acondicionamento.
3. Formação Animais
- Comece o treinamento do animal no homecage móvel no dia seguinte após a habituação ao manuseio e embalagem estiver concluída.
- Grave o animal pesar diariamente antes e durante o treino.
NOTA: Se, durante o treinamento, o animal perde mais de 10% do seu peso, ele deve ser excluído do tele experimenta. - Ajustar a posição vertical do braço de fixação da cabeça do dispositivo homecage móvel, a fim de coincidir com o tamanho do animal treinado. Ligue a entrada de ar do dispositivo para o laboratório de saída de ar pressurizado padrão (tipicamente, ou um tanque de gás ou uma bomba de ar, que fornece uma pressão suficientemente alta e a taxa de fluxo de ar, ou seja, cerca de 5 bar e 300 l / min).
- Enrole o animal em um pano.
- Insira o suporte de metal, que é anexado à cabeça do animal, no braço de fixação da cabeça e fixá-lo com firmeza, apertando os parafusos. Ligue o fluxo de ar e se certificar de que o fluxo de ar é o ideal para a flutuação livre do homecage levantou-ar. Solte o animal para o homecage móvel, removendo o pano.
- Para habituar o animal ao ruído, proporcionar uma exposição constante ao som ambiente (utilizando, por exemplo, o rádio ou a música gravada e discurso) durante todas as sessões de treino, bem como durante as experiências.
- Durante a primeira sessão de treinamento, manter a luz da sala pela primeira hora, em seguida, desligue a luz até o final da sessão de treinamento.
- Depois de 2 horas de treinamento no homecage móvel, solte o animal de fixação da cabeça e coloque-o na gaiola com um suprimento de água e comida. Deixe-o por pelo menos 2 horas em repouso.
- Limpe o homecage móvel depois de cada sessão de treinamento usando uma solução de etanol 70% e lave-o com água da torneira. Mergulhe-se a água com papel toalha descartável e secar o homecage móvel antes do próximo uso.
- Realizar sessões de formação consecutivos por 2 horas, com a luz do quarto desligada enquanto o animal está sendo treinado.
- Execute o treino duas vezes por dia.
- Após 8 a 12 sessões de treino, o animal utilizar numa sessão experimental de até 2 horas de cada vez.
NOTA: Durante as sessões de treinamento prolongados que duram mais do que 1-2 horas, considerar a possibilidade de o mouse wom água potável, que pode ser fornecido manualmente ou através de um suporte de pipetas anexada ao quadro homecage móvel. Alternativamente, a água pode ser fornecida para uso ad libitum do animal, colocando gotas viscosas de hidro-gel directamente sobre as paredes do homecage móvel.
NOTA: Lembre-se de pesar os animais todos os dias antes de treinar para descartar quaisquer efeitos de estresse crônico. Excluir um animal a partir da experiência que, em nenhum momento, demonstra reações de estresse, tais como o congelamento, vocalização, ou diarréia induzida pelo estresse.
4. Aplicações
- Imagem de dois fótons em Despertai mouse movendo em torno do Homecage móvel
- Monte o homecage móvel. Verifique as posições da ponte e fixação da cabeça do braço.
- Enrole o animal treinado em um pano. Colocar o animal no homecage móvel. Braçadeira suporte metálico no braço de fixação da cabeça. Retire o pano.
- Limpe o vidro da tampa implantado a partir de poeira usandouma solução de etanol 70% e deixe-a secar.
- Colocar uma gota de fluido de imersão sobre a classe de cobertura. De preferência, utilizar uma solução viscosa, porque a água irá evaporar-se rapidamente.
- Coloque o dispositivo homecage móvel com o animal treinado sob o microscópio (a menos que você tiver um segundo, dispositivo idêntico, que está parado na configuração microscopia).
- Realize a imagem usando uma custom made ou um sistema de varredura a laser microscópio de imagem disponível no mercado equipado com um laser infravermelho pulsado de femtossegundos.
- Encontre a região de interesse utilizando o modo wide-campo do microscópio de fluorescência. Utilize filtros passa longos para avaliar a vasculatura cerebral e selecione uma área de destino apropriado depois de examinar o padrão dos vasos sanguíneos.
- Para imagem vasculatura cortical, injectar uma solução de 1% de dextrano conjugado com vermelho do Texas 70000 MW (ou o seu análogo), tanto na veia da cauda, enquanto que o animal é imobilizado no pano, ou retro-orbital, enquanto oanimal é posicionado no homecage móvel. Sintonize o laser de dois fótons de 860 nm e usar o filtro passa-banda (590-650 nm) para coletar a luz emitida. Usar o filtro de emissão de 515-560 nm para avaliar os detalhes da morfologia neuronal ou actividade neuronal, utilizando, por exemplo, ratos transgénicos que expressam YFP ou o Ca 2 + - GCaMP3 proteína fluorescente sensível numa subpopulação dos neurónios sob o promotor Thy1.
- Use um software apropriado para aquisição de imagem.
- Depois de imagem, solte o animal do braço de fixação da cabeça soltando os parafusos. Devolver o animal para sua gaiola e deixe-a descansar por pelo menos 2 horas antes de iniciar a próxima sessão de imagem.
- Guarde as coordenadas de cada região de interesse (ROI) para recriação subseqüente. Imagem da mesma ao longo do tempo as ROI, e ajustar as coordenadas de cada vez para maximizar a sobreposição de imagem.
- Analisar as imagens e fazer reconstruções tridimensionais usando um softw apropriadosão (por exemplo, o ImageJ, etc.)
- Imagem Optical intrínseca em Despertai mouse movendo em torno do Homecage móvel
- Monte o homecage móvel sob a câmera de aquisição de imagem de uma instalação de imagem óptico intrínseco.
- Enrole o animal treinado em um pano. Colocar o animal no homecage móvel. Prenda o suporte de metal no braço de fixação cabeça.
- Limpe o vidro da tampa implantado a partir de pó usando uma solução de etanol 70% e deixe-a secar.
- Coloque uma gota de glicerol no vidro implantado e cobri-lo com um 8 mm redondo tampa de deslizamento.
- Coloque um manipulador com o oposto do tubo de ar-golpe na vibrissa contralateral.
- Ajuste a posição da câmera de alta velocidade e orientá-la para a vasculatura cortical.
- Use luz verde (filtro 546BP30) sem um filtro da câmera para adquirir o mapa embarcações.
- Concentre-se mais profundamente no córtex, a cerca de 400 micrômetros abaixo da superfície cortical.
- Para imagem tele oxigenação do sangue dependentes de nível de sinal óptico (BOLD), coloque o filtro 590LP na frente da câmera e iluminar o córtex com luz vermelha (filtro 630BP30).
- Ajustar a iluminação da superfície cortical de modo que ele é distribuído uniformemente através da região de interesse, evitando a exposição excessiva. Ajustar a intensidade da iluminação de modo que a região de interesse insere-se no segmento de 70-90% da gama dinâmica da câmara.
- Use LongDaq software de aquisição de imagem para coletar imagens da câmera.
- Use imagem freqüência de aquisição de 1 a 10 Hz (ou seja, entre 1 e 10 quadros por segundo) para experimentos com baixa freqüência de estimulação (0,05 Hz).
- Desligue a luz da sala para evitar qualquer interferência com o sinal óptico intrínseco.
- Permitir que pelo menos, 30 minutos para o rato para se adaptar ao homecage móvel.
- Imagem da atividade da linha de base durante um episódio de 6 minutos, sem estimulação.
- Para gravar c evocadoortical atividade, estimular vibrissas em 10 seg ON/10 sec OFF mode (0,05 estimulação Hz) com uma alta freqüência (25 Hz) trem de sopros de ar para o período total de 6 min.
- Após a aquisição da imagem, solte o mouse a partir do braço de fixação da cabeça e coloque-o na gaiola.
- Não usar a filtragem de dados adicionais para a freqüência, porque as amplitudes das respostas de estimulação tendem a ser relativamente alta em animais acordados, o que resulta em excelente relação sinal-ruído.
- Converter os conjuntos obtidos de imagens para arquivos *. Pilha tif e analisá-los ainda mais usando, por exemplo, o software FIJI (ImageJ) open source. Subtraia a atividade espontânea da linha de base a partir dos quadros obtidos durante vibrissa estimulação usando a ferramenta Image Calculator. Alternativamente, filtrar dados no domínio da freqüência usando software apropriado.
- Gravações patch-clamp em Awake mouse movendo em torno do Homecage móvel
- Monte o homecage móvel.
- Enrole o animal treinado em um pano. Administrar o trimetoprim (5 mg / kg) e sulfadoxina (25 mg / kg) para prevenir a infecção bacteriana. Colocar o animal no homecage móvel. Prenda o suporte de metal no braço de fixação cabeça.
- Limpar e esterilizar o cimento dental "cap" implantado e tampa de vidro usando uma solução de etanol a 70% ou 0,5% de digluconato de clorexidina e deixe-a secar.
- Devagar e com cuidado, retire a tampa de vidro do porta-metal.
- Atualizar o buffer cortical suplementado com penicilina, estreptomicina e limpar a janela do crânio de detritos com um tampão hemostático estéril.
- Coloque o eletrodo de aterramento para o buffer cortical.
- Coloque o headstage eletrofisiologia em um micromanipulador.
- Fabricar pipetas de vidro de borosilicato, visando a resistência de ponta que varia de 6,5 a 8.5MΩ. Encha a pipeta patch com uma solução intracelular. A composição da solução de remendo pipeta é oseguinte (em mM): 8 de KCl, 111 de K-gluconato, 0,5 CaCl2, NaOH a 2, 10 de glucose, 10 de HEPES, 2 de Mg-ATP e 5 BAPTA, o pH foi ajustado para 7,2 com KOH. Os valores de potencial de membrana deve ser corrigida para um potencial de junção líquida calculada de -12 mV 33.
- Alvo da região de interesse através de coordenadas estereotáxica, e rapidamente mover o eletrodo dentro do cérebro, mantendo forte pressão positiva sobre a ponta da pipeta. Após a penetração da dura-máter e o posicionamento da pipeta, medir a resistência de ponta e descartar os eléctrodos que mostram um aumento na resistência de mais do que 10-15%, de modo a melhorar a taxa de sucesso dos passos subsequentes.
- Reduzir a pressão positiva por meio para evitar o edema do tecido cerebral circundante. Outros passos são semelhantes às do protocolo padrão "remendo cego". Para encontrar um neurônio para gravar a partir de, abaixe a ponta para dentro do cérebro de forma gradual, até que um neurônio é detectado em um proximit pertoy da ponta da pipeta, como indicado por uma sequência temporal característica das mudanças de impedância do eléctrodo. O indicador chave da presença de um neurónio é um aumento contínuo da resistência do eléctrodo através de vários passos para a frente seguidos de pipeta (tipicamente, um aumento de 20% na resistência a pipeta através de três etapas de 2 mm).
- Para formar um contacto gigaseal com o neurónio alvo, aplicam uma pressão negativa e hiperpolarização da pipeta.
- Aplicar um breve pulso de uma pressão negativa maior do que a das células, a fim de estabelecer a configuração de célula inteira. Recolha o eletrodo por 2-3 mM para manter uma boa vedação.
- Actividade espontânea ou evocada ficha durante um período de tempo desejado, até 20-40 min.
- Após a gravação, retire a pipeta do cérebro.
- Atualizar o buffer cortical ou coloque uma gota de cola de silicone na janela cranial, em seguida, cole uma lamela de vidro redonda em cima do suporte do metal.
- Solte o animal do braço de fixação da cabeça soltando os parafusos. Retornar o animal na sua gaiola durante pelo menos um dia antes da gravação seguinte.
- Analisar os dados com, por exemplo, o software FitMaster.
- Habituação-dishabituation Olfativa Teste em Despertai mouse movendo em torno do Homecage móvel
- Anexar um pedaço de algodão limpo (2 x 2 cm) mergulhados em água da torneira para o lado interior da parede do homecage móvel utilizando uma fita de dois lados. Dividir a parede homecage móvel em quatro zonas, colocando marcadores de cor no lado exterior da parede de modo que o pedaço de algodão está localizado no meio da "zona alvo". Corrigir o animal no braço headholder voltado para o segmento de parede de frente para a zona "alvo" e permitem que ele se adapte à homecage celular durante 30 min.
- Pegue outro pedaço de algodão limpo e molhe-a com algumas gotas de extrato de baunilha 1%. Substitua o algodão limpo na parede homecage móvel com um carregando o Vanilla cheiro. Apresentar o cheiro por 5 min. Acompanhe os movimentos do homecage móvel durante o período de apresentação cheiro. Estimar o nível de interesse para o cheiro medindo o tempo acumulado que o animal passa de frente para a zona "alvo", em relação ao tempo total de movimento homecage móvel.
- Repita a sessão de aplicação de 5 minutos três vezes usando o cheiro de baunilha, com um intervalo entre as sessões 5 min. Use um pedaço de algodão doce "vanilla" em cada sessão.
- Apresentar o animal com um cheiro socialmente significativa durante o último, a quinta sessão. Umedeça um pedaço de algodão limpo com algumas gotas de urina (obtidos no dia anterior de um animal do sexo oposto) e colocá-lo no meio da zona alvo por 5 min.
- Reconhecimento cheiro Novel em movimento acordado mouse pela homecage móvel
- Dividir a parede em quatro zonas, colocando marcadores de cor no lado exterior da parede homecage móvel. Attach duas peças de algodão limpas (2 x 2 cm) mergulhadas em água da torneira para o lado interior da parede no meio das zonas opostas entre si (designada como zona de alvo e uma zona de alvo 2). Corrigir o animal no braço headholder virado um segmento da parede do lado de fora das zonas de alvo e permitir que esta se adapte à homecage celular durante 30 min.
- Substitua os dois pedaços de algodão com os frescos:. Coloque um pedaço de algodão molhado com o extrato de baunilha 1% para atingir a zona 1 e outra molhada com água da torneira para atingir a zona 2 gravar o vídeo dos movimentos homecage móveis para 10 min durante o cheiro sessão de apresentação. Calcular o cheiro participando como a percentagem de tempo que o animal passa de frente para uma zona de alvo em relação ao tempo gasto cumulativo de frente para as zonas 1 e 2.
- Depois de um intervalo de 10 min, coloque um outro par de aplicadores na parede do homecage para o posterior período de 10 min. Coloque o algodão "vanilla" na zona alvo 1 e aplicador de algodão molhado com 1% de banana extrair na zona-alvo 2. Faça uma gravação de vídeo dos movimentos homecage móveis. Calcula-se a preferência a novel cheiro como a percentagem de tempo que o animal gasta voltado para o segmento de parede com o novo cheiro (zona alvo 2) em relação ao tempo cumulativo de frente para as zonas 1 e 2.
Representative Results
O método aqui apresentado destina-se a imagens microscópicas ou unicelulares registros eletrofisiológicos em ratos, fixo-cabeça, mas de outra forma livremente em movimento e se comportando acordado. O animal pode mover-se em duas dimensões em uma real (em oposição a virtual), meio tangível e familiar, enquanto crânio dos animais é fixada firmemente ao braço de fixação da cabeça. Habituar a ratinhos para o homecage móvel levantado ao ar é constituída por 4-6 dias de sessões de treino de 2 horas duas vezes por dia (Figura 1). Os animais treinados pode então ser utilizado nas experiências de imediato. Um estudo típico inclui uma série de sessões de imagem ou sessões de gravação de patch-clamp que estão espaçados a intervalos que vão de algumas horas até vários dias ou semanas. É importante ressaltar que ambas as gravações ópticas e eletrofisiológicos podem ser realizadas simultaneamente com os estímulos e leituras cognitivas ou comportamentais, dentro de um único experimento.
Para avaliar a estabilidade mecânica defixação do rato cabeça na homecage móvel, as sequências de imagens de vasos corticais marcados com dextrano fluorescente conjugado e de dendritos corticais expressando YFP foram coletadas enquanto os animais experimentais foram navegar no homecage móvel (Figura 2). Os deslocamentos máximos do cérebro durante a locomoção do animal não exceder normalmente 1-1,5 micrômetros. Estes deslocamentos ocorridos nas direções horizontal e muito raramente resultou em uma mudança detectável do plano de imagem, tornando desnecessário qualquer correção de artefatos de movimento. Fixação estável cabeça em homecage móvel permite a quantificação das espinhas dendríticas individuais em animais acordados com a mesma confiabilidade como em ratos anestesiados. Densidade das espinhas dendríticas, morfologia e volume de negócios podem ser monitorados durante os estudos longitudinais com várias sessões de imagem realizados em intervalos que variam de algumas horas a vários dias ou semanas.
A usabilidade do móvel homecage para imagiologia óptica funcional foi testada no córtex somatossensorial de ratos acordados utilizando duas abordagens: i) microscopia de dois fotões nos ratinhos transgénicos Thy1-GCaMP3 e ii) intrínseca de imagem do sinal óptico em murganhos de tipo selvagem. Ca 2 + de imagem foi realizado na camada 2/3, que contém os corpos celulares de muitos neurónios marcados com fluorescência, bem como as suas dendrites e axónios (Figura 3). As parcelas de fluorescência-over-time de regiões selecionadas de interesse (ROI) são mostrados na Figura 3, o que demonstra a atividade neuronal espontânea (medido como aumentos transitórios da GCaMP3 fluorescência) durante a navegação ativa do mouse na homecage móvel. Imageamento óptico baseado em sinais intrínsecos permite o mapeamento da distribuição espacial dos domínios funcionais. Figura 4 ilustra mudanças wave-like no nível de oxigenação do sangue (que refletem a ativação neuronal regionais) que se propagam ao longo de córtex somatosensorial em resposta à vibrissa estimulação na freqüência de 0,05 Hz.
Para testar a viabilidade de gravações de patch-clamp com homecage móvel, foram utilizados camundongos 2-3 meses de idade C57Bl/6J. Camada 2/3 neurônios do córtex somatossensorial foram registrados a partir de configuração de célula inteira usando o modo de fixação atual. Gravação de patch-clamp no cérebro de ratos acordados em homecage móvel fixo-cabeça era essencialmente similar a cegar patch-fixação em fatias de cérebro. Aproximadamente 50% das tentativas resultou na formação gigaseal bem sucedida, em que mais de 70% originou estável gravação configuração de célula inteira. Não foram observados eventos de perder contato gigaseal devido ao deslocamento mecânico de células. Figura 5 ilustra um fragmento de 60 segundos de um representante de 10 min gravação longa corrente-clamp correlacionados com episódios de camundongo ativa (em execução) e (repouso) estados passivos.
Figura 1. O método de fixação de cabeça de ratos acordados no homecage móvel. A) Visão geral do projeto homecage móvel levantada ao ar e ilustrações do conceito geral. B) Diagrama de um cronograma experimental típico. O estudo começa com a implantação da janela craniana duas semanas antes habituar o rato para manuseio e empacotamento, a qual é seguida por oito sessões de treino duas vezes por dia. O estudo típico inclui uma série de sessões de imagem ou sessões de gravação de fixação de membranas que estão espaçados a intervalos que vão de algumas horas até vários dias ou semanas. Ambas as medições ópticas e eletrofisiológicos pode ser feito em paralelo com estímulos e leituras cognitivos ou comportamentais em um único experimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Exemplo de dois fótons de imagem microscópica em ratos acordados em movimento ao redor do homecage móvel. A, B) a vasculatura cortical, marcado com o de 70 kDa de Texas Red-dextrano conjugado. O diâmetro dos segmentos individuais de navios é medida ao longo do tempo, traçando o perfil das linhas traçadas através do lúmen do vaso durante os períodos de descanso de rato e em execução (A). A taxa de fluxo sanguíneo nas artérias e veias é medido por linha de varredura ao longo das linhas traçadas paralelamente à parede do vaso (B). C, d) detalhes de morfologia neuronal visualizado no cérebro de camundongos transgênicos que expressam YFP na subpopulação de neurônios sob o promotor Thy1. Reconstrução tridimensional de neurônios piramidais no córtex somatossensorial do rato (C). As imagens de uma b dendríticafazenda adquirida em uma vigília, rato comportando são suficientemente estáveis para quantificação de indivíduo dendrítica morfologia da coluna (D) E) A quantificação de movimento do cérebro causada por movimentos do mouse.. Maiores deslocamentos de amplitude correlacionar com períodos de funcionamento do mouse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Exemplo de atividade população neuronal em acordada Thy1-GCaMP3 rato mover-se ao redor do homecage móvel. A) imagem de dois fótons de camada cortical II / III neurônios. ROI, por exemplo neuronais corpos celulares, dendritos e axônios são mostrados em amarelo. B) Af / F traços da fluorescência GCaMP3 de ROIs mostrados em A (tempo de sD) Fluorescência de ROIs amarelos em C eries gravado em 1,5 seg / frame). C) zoom-in região fotografada a 65 ms / frame. plotados ao longo do tempo, mostra os aumentos transitórios (vermelhas) na fluorescência GCaMP3 que correspondem à ação Ca 2 episódios de potencial induzida + influxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Exemplo de mapeamento da distribuição espacial das respostas funcionais no córtex de um rato desperto, por meio de imagiologia os sinais ópticos intrínsecas. A) vista Bright-campo dos vasos sanguíneos superficiais através da janela craniana. B) mapa magnitude da atividade da linha de base em móveis homecage durante um episódio de 6 min. C) mapa Magnitude da atividade neuronal propaga ao longo córtex somatosensorial, em resposta à estimulação vibrissa a uma freqüência de 0,05 Hz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Exemplo de célula inteira de gravação de patch-clamp no córtex de um rato desperto em movimento ao redor do homecage móvel. A) de gravação actual-clamp de um neurônio na camada cortical do rato 2/3. A 0,5 seg, 100-pA injeção de corrente (indicado abaixo do traço) resulta em uma explosão de potenciais de ação. A célula mostrou característica de adaptação à freqüência de pico para os neurônios piramidais. B) contínua gravação atual-clampdo mesmo neurônio correlacionada com a atividade de mouse locomotor "(mostrado na rosa acima do traço). Atividade espontânea Representante do neurônio da camada 2/3 durante períodos do mouse do repouso (C) e corrida (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Perda de peso animal e atividade locomotora de camundongos head-fixed/non-fixed durante as sessões de treinamento no homecage móvel. A) O peso do animal (média + SD,%) antes das sessões de treinamento. Note-se que a perda de peso é totalmente revertida pela sessão de treinamento 7-8 ª. B) Trajetória do rato locomoção horizontal relativa ao homecage móvel,que foi extrapolado a partir do movimento rastreado do homecage móvel durante 8 ª sessão de treinamento. c) A circulação de lagartas de um mouse não-cabeça-fixada explorar a gaiola redonda durante 8 ª sessão de treinamento. D) Duração do fixo-cabeça (círculo) e não fixa (triângulo) movimento camundongos durante 1-4 º dia de treinamento (média + SD,%). Note-se que, no dia 4, os ratos fixo-cabeça exibir nem congelamento (como no 1 º dia), nem atividade locomotora excessiva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Para entender melhor a fisiologia do cérebro e da patologia, a pesquisa deve ser realizada em uma variedade de níveis de complexidade de preparação, utilizando as técnicas mais adequadas para cada preparação. Neste momento, uma grande variedade de metodologias de neurociência (de corpo inteiro fMRI para microscopia STED sub-organela) são facilmente aplicada aos animais anestesiados, enquanto experiências em animais acordados e se comportando ter representado um desafio metodológico significativo.
Aqui, uma nova abordagem é descrita em um animal de laboratório, apesar de ser firmemente cabeça-fixados, pode mover-se em torno de um homecage móvel levantada ao ar e explorar seu ambiente tangível em condições livres de estresse. A preparação de animais se comportando fixo-cabeça apresentado aqui fornece uma série de vantagens cruciais. Primeiro, os dados eletrofisiológicos ou de imagem obtidos com este método são descomprometido nem pela anestesia nem por estresse induzido por constrangimento. Posicionamento do mouse para a casa móvelgaiola é rápido e não requer anestesia do animal, mesmo transitoriamente. Em segundo lugar, o homecage levantou-air garante a estabilidade mecânica necessária para quantificar alterações na morfologia neuronal bem e para gravar a atividade eletrofisiológica de uma única célula em animais acordados. Finalmente, o design do homecage móvel é mais compacta em comparação com a esteira esférica, permitindo assim o posicionamento da homecage móvel sob um microscópio vertical padrão para imagens de dois fótons ou gravação de patch-clamp no cérebro acordado do mouse.
Fixação Firm cabeça na homecage móvel requer a implantação de um suporte de metal de quatro asas especialmente projetado, com uma rodada de abertura no centro para acesso óptico ou elétrico para a região cerebral subjacente. Estes suportes metálicos são ligados ao crânio por meio de uma combinação de cola, cimento dentário e um pequeno parafuso aparafusado no osso do crânio. Este procedimento cirúrgico foi desenvolvido com base em um grande número de anteriormenteprocedimentos publicados, e verificou-se resultar em uma janela craniana preparação estável e reprodutível. Para experimentos in vivo eletrofisiológicos, uma janela em forma de lua 34, uma pequena craniotomia tamanho (menos de 0,5 mm) 32, e uma preparação coberto de vidro perfurado 35 têm sido utilizados. Aqui, a janela craniana "invertido" foi implantado com qualquer uma grande (3.5 mm de diâmetro) ou pequena (menos de 0,5 mm de diâmetro) a craniotomia. Minimizando movimento cérebro é fundamental para gravações unicelulares estáveis, o que é por isso que é aconselhável realizar pequenas craniotomias tamanho para experimentos eletrofisiológicos. Após a implantação da janela craniana para experiências de imagiologia óptica, os animais são deixados a recuperar durante pelo menos 2 ou 3 semanas, durante o qual período a janela primeiro transitoriamente perde a sua transparência e, em seguida, recupera-lo (com um rendimento de 50-70%, dependendo o fundo genético da estirpe do rato). Transparência da janela craniana e stabildade do cimento dental "cap" anexado ao crânio pode ser verificada por meio de um microscópio binocular regular e inspeção física durante o manuseio do animal. No final do período de recuperação de 2-3 semanas, os animais que apresentam sinais de inflamação pós-operatório residual ou defeitos mecânicos na cimento dental deve ser excluída dos experimentos e terminada.
A idade ideal para iniciar o treinamento dos ratos é de 2-4 meses (correspondentes ao peso corporal de 20-40 g). Em animais jovens, a ancoragem do cimento dental "cap" no crânio podem não ser confiáveis, o que pode diminuir a sua resistência ao estresse mecânico que é imposta pela locomoção do mouse fixo-cabeça na homecage móvel. Embora os ratos machos e fêmeas parecem igualmente dispostos para navegar em homecage móvel, há uma tendência para atingir melhor percentagem de janelas cranianos recuperar a sua transparência nos ratinhos fêmea (dados não mostrados). Assim, a fim to assegurar uma combinação equilibrada de gêneros no grupo de animais selecionados para a imagem latente, implantando janelas cranianas em aproximadamente 30% os ratos mais macho é recomendado. As interações sociais são conhecidos por melhorar o bem-estar dos animais e reduzir o estresse, por isso é aconselhável que ninhada são operados e treinados em paralelo e mantidos juntos em gaiolas de estabulação.
Em contraste com os processos publicados para a preparação esteira esférica 13, o método que utiliza o homecage móvel não requer anestesia no ratinho, no momento da fixação da cabeça. Esta diferença é importante porque permite a descartar quaisquer efeitos residuais que mesmo uma breve e "light" episódio anestesia é provável que tenha nas medições fisiológicas obtidas logo após. Na verdade, mesmo que nos estudos onde a fixação cabeça foi feito sob anestesia e os experimentos reais foram iniciados após um breve período de espera 13, não se podeexcluir possíveis efeitos de longa duração do episódio breve anestesia sobre os dados experimentais. Outros estudos têm contado com privação de água para habituação sistemática dos animais a cabeça de fixação e usado recompensa água como meio de motivar o animal a permanecer imóvel 36. No entanto, o método de fixação de cabeça à base de recompensa limita a escolha dos testes comportamentais aplicáveis e, mais importante, ocupa uma das associações estímulo-recompensa bem estabelecidos. Em contraste, o método de rato habituação a cabeça fixação em homecage móvel não exige a privação de água e recompensa subseqüente.
Completando o homecage móvel com um sistema de distribuição de água é recomendado para experimentos de longa duração. As sessões de treinamento de animais e experimentos apresentados aqui foram feitas durante o dia (oito horas - seis horas), o que corresponde ao período fisiologicamente passiva para aqueles ratos que são mantidos sob a luz padrão horário de 12 horas (liGHTS on às 6 da manhã e desligar às 6 da tarde). Uma vez que a ingestão de água está diretamente associada com a atividade do mouse, durante os ratos período passivo não necessitam de fornecimento de água, se a duração de uma sessão de formação / imagem / gravação não exceda 2 horas. Além do tempo e duração das sessões de treinamento, é preciso resolver a questão do número ideal de sessões necessárias para habituar os animais para homecage móvel. Para este fim, foram utilizados dois critérios para avaliar a tensão induzida por processos de fixação de cabeça: i) perda de peso, e ii) a nível da actividade locomotora. Como mostrado na Figura 6, a perda de peso atinge o nível médio de 6% no dia 2 de formação, e é completamente invertido por dia de formação 4 (Figura 6A). De forma consistente com a dinâmica de pesagem, o nível de animais fixo de cabeça actividade locomotora é suprimida no primeiro dia de treino, mas estabiliza por dia de formação 4 (Figura 6D). Com base nestas medições, sugestõest que a duração mínima do período de formação do rato em homecage móvel é de 4 dias, como descrito no protocolo ora.
O uso do, homecage móvel plana com piso levantado ao ar permite adicionar tarefas complexas (sensório-motoras, de percepção, e cognitivos) para os paradigmas de formação para os ratos fixo-cabeça. No presente estudo, dois protocolos de testes comportamentais são apresentados. Ambos os protocolos utilizar pistas de odor e pode ser combinado com longitudinais de imagem / gravações no córtex mouse. Embora o homecage móvel é fabricado a partir de materiais não absorventes, ainda precisa levar em conta possíveis interferências entre o cheiro do dispositivo e odor (s) de teste. Outro fator que pode interferir com / dicas táteis visuais de um experimento comportamental é a junção entre a parede ea inserção, o que não é perfeita e pode, portanto, ser percebido pelo animal como um marco. É importante notar aqui que, a fim de minimizar o sofrimento do animal durante tal interventions como a colocação de um algodão que apresenta odor à parede homecage móvel, o experimentalista deve praticar para realizar este tipo de intervenções, tão rapidamente quanto possível e evitar manipulação prolongada da gaiola de carbono. As estratégias alternativas para nova apresentação cheiro / objecto são concebíveis, por exemplo, colocação de uma solução à base de hidrogel de gotas ou objectos (tais como chips de alimento) em pequenas prateleiras fixados à superfície interna da parede da gaiola de carbono na altura compatível com o posicionamento da cabeça do animal.
Homecage Mobile permite animais fixo-cabeça para executar uma ampla gama de movimentos bidimensionais incluindo locomoção horizontal, situp, higiene, mexendo, lambendo, nariz-cutucando, os movimentos das patas dianteiras qualificados, e tocar parede com membros anteriores, como ilustrado no presente estudo . Usando homecage móvel e os protocolos aqui apresentados, os pesquisadores podem estudar o sistema sensório-motor neuronal com um alto nível de controle sobre tanto a condição estimulaçãos e as comportamentais de leitura-outs. Além disso, estudos de habilidades cognitivas em camundongos despertos pode ser realizada durante condicionado, navegação espacial e as tarefas de tomada de decisão.
Existem várias limitações práticas deste método. Em primeiro lugar, uma quantidade significativa de ar pressurizado é necessário para atingir o poder de elevação homecage e para realizar experiências de longa duração. Em segundo lugar, o homecage móvel na sua actual aplicação é de apenas 18 cm de diâmetro, e, por conseguinte, fornece um relativamente pequeno e simples, em comparação com o espaço de realidade virtual, onde um ambiente experimental complexo pode ser concebido sem quaisquer restrições espaciais. Em terceiro lugar, durante a estimulação bigode e experimentos baseados em recompensa aqui apresentados, um dispositivo foi utilizado, que limita a possibilidade do contato de parede para o mouse. A adição de um canal de estimulação visual ou sensorial externo (como um projetor de luz olho-dirigida) exigiria a concepção de um dispositivo mais ergonômico e compacto em comparação comas soluções de ecrã múltiplo ou cúpula de projeção que foram utilizados nos experimentos de esteira esféricas.
Em resumo, a utilização dos ratinhos fixo de cabeça que se deslocam no homecage móvel levantado ao ar facilita grandemente os estudos que combinam os níveis celulares, moleculares e comportamentais de observação e manipulação numa única experiência. As aplicações específicas ilustradas aqui incluem dois fótons de imagem microscópica, intrínseca sinal óptico de imagem e gravação de patch-clamp em camundongos comportando não anestesiados. Espera-se que esta abordagem irá abrir novos horizontes em experimentação sobre acordado, rato comportar e servir como uma ferramenta útil tanto para o desenvolvimento de medicamentos e pesquisa básica da função cerebral.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Prof Eero Castren por seus valiosos comentários sobre o manuscrito. O trabalho é apoiado por subsídios da Academia da Finlândia, Centro de Mobilidade Internacional da Finlândia, eo finlandês Graduate School of Neuroscience (Mente Cérebro e Programa de Doutorado).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tweezers, Stainless Steel, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For patch pipette production |
| Camera | Foscam | FI8903W | Night visibility |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310104001001008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Eyes-lubricant | Novartis | Viscotears | For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Four-winged metal holder | Neurotar | ||
| Head Holder for Mice | Narishige | SG-4N | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Kwik-Sil | WPI | ||
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microelectrode puller | Narishige | PC-10H | Vertical puller for glass pipette production |
| Micromanipulator | Sensapex | ||
| Mini bolt | Centrostyle | Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5 | |
| Mobile Homecage | Neurotar | ||
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| Nonwoven swabs, 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 1.5 thickness | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
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