Summary
Bu yöntem, gezinmek ve hayvanın başının sağlam tespiti gerektiren mikroskobik görüntüleme veya tek hücreli elektrofizyolojik kayıtlar sırasında keşfetmek fare için somut, tanıdık bir ortam yaratır.
Abstract
Bu yaygın genel anestezik kullanımı yaşayan bir hayvanın beyin elde edilen elektrofizyolojik veya mikroskobik verilerin alaka sarsar kabul edilmektedir. Ayrıca, anestezi uzun iyileşme uzunlamasına çalışmalarda tekrarlanan kayıt / görüntüleme bölüm frekansını sınırlar. Dolayısıyla, olmayan anestezi davranıyor farelerin istikrarlı kayıtları sağlayacak yeni yöntemler hücresel ve bilişsel nörobilimlerdeki alanları ilerlemek bekleniyor. Mevcut çözümler sadece fiziksel kısıtlama bu tür bilgisayar tarafından oluşturulan sanal gerçeklik ile kombinasyon halinde kullanılan lineer ve küresel koşu bandı gibi daha karmaşık yaklaşımlar arasında değişir. Bir baş-sabit fare bir hava kaldırdı mobil homecage hareket ve stressiz koşullarda çevresini keşfetmek nerede, burada, yeni bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, araştırmacılar ile eş zamanlı davranış testleri (örneğin, öğrenme, alışkanlık veya roman nesne tanıma) gerçekleştirmek için olanak sağlariki foton mikroskobik görüntüleme ve / veya patch-clamp kayıtları tek bir deneyde bir araya. Bu video-makalede, uyanık hayvan kafa sabitleme aracı (mobil homecage) kullanımını tarif hayvan alışkanlık prosedürleri gösterir, ve yöntemin olası uygulamalar bir dizi örnek teşkil etmektedir.
Introduction
Nörobilim heyecan verici bir son eğilim, moleküler ve hücresel kemirgenler davranmak, uyanık ve beyindeki nöronal ağların incelenmesi için deneysel yaklaşımlar geliştirmektir. Bu tür yaklaşımlar, motor fonksiyon, sensorimotor entegrasyon, algı, öğrenme, bellek, hem de yaralanma ilerlemesini, nörodejenerasyonu ve genetik hastalıkların altında yatan nörofizyolojik süreçler üzerine yeni bir ışık tutacak söz tutun. Ayrıca, uyanık hayvanın beyninden kayıt yeni terapötik ajanlar ve tedavilerin geliştirilmesinde sözünü tutar.
Yaygın nörofizyolojik deneylerde kullanılan olmuştur anestezi, potansiyel deneysel bulguların yanlış yorumlanması neden, beyin fonksiyonlarının temel mekanizmaları etkileyebilir dair artan bir farkındalık var. Böylece, yaygın olarak kullanılan anestezik ketamin hızla yeni dendritik dikenler oluşumunu artırır ve sinaptik fonksiyon 1 artırır; Başka bir yaygın olarak kullanılan anesthetcerrahi anestezi düzeyde ic izofluran tamamen yetişkin hayvanlarda 2 yeni doğmuş farelerin ve bloklar iğ patlama osilasyonlarda spontan kortikal aktiviteyi bastırır. Şu anda, yaklaşımlar sadece sınırlı sayıda iki foton mikroskobik görüntüleri veya patch-clamp kayıtları vasıtasıyla olmayan, anestezi uygulanmış farelerde deneyler sağlar. Bu yaklaşımlar serbestçe hareket eden ve yüksekliği sabit preparatlar ayrılabilir.
Serbestçe hareket eden bir hayvan hazırlanması eşsiz çekiciliği navigasyon sırasında bir bütün vücut hareketleri dahil olmak üzere, doğal davranışı değerlendirme izin vermektedir. Serbestçe hareket eden bir kemirgen beyninde görüntü bir yolu minyatür kafa monte mikroskop ya Fiberscope 3-5 takmak için. Ancak, minyatür cihazlar nesnel tabanlı iki foton mikroskopi kıyasla sınırlı optik performansa sahip eğilimindedir ve kolayca tüm hücre patch-kelepçe kayıtları 6 ile kombine edilemez.
Exikafa sabitleme bir uyanık kemirgen için acı çözümler fiziksel kısıtlama 7,8 veya gönüllü koltuk başlığı 9 sergilemek için hayvan eğitimi üzerinde ya öncelikle yararlanmıştır. Bir başka popüler bir yaklaşım hayvanın uzuvları, örneğin, küresel bir koşu bandı 10 onu yerleştirerek taşımak için izin vermek; Bu yaklaşım, genellikle, bilgisayar tarafından üretilen bir sanal gerçeklik ile birleştirilir. Head-sabit fareler üzerinde elektrofizyolojik çalışmalar çoğunlukla ekstraselüler kayıtları kullanmış ve kardiyovasküler fonksiyon 11 merkez düzenleme, nöronal aktivitenin 12 anestezi etkileri, beyin sapı 13 ve bilgi işleme 14 işitsel yanıtını incelemek için kullanılmıştır. Uyanık davranmak hayvanlarda öncü hücre içi / tüm hücre kayıtları 2000'li yıllarda yapıldı ve algı ve hareket 15-20 ilişkin sinirsel aktivite odaklanmıştır. Aynı zaman zarfında, uyanık fareler üzerinde ilk mikroskobik görüntüleme çalışmaları pub edildiiki-foton mikroskopi fiziksel olarak zapt sıçanların 7 duyusal kortekste ve küresel bir koşu bandı 21 üzerinde çalışan fareler kullanıldı yayınlanmış.
Müteakip in vivo mikroskopi ve elektrofizyoloji çalışmaları bir kafa sabitleme hazırlık başarıyla ön ayakları hareketleri, koku tanıma, çırpma ve 8,22-25 yalama dayalı davranış paradigmaları ile kombine edilebilir olduğunu göstermiştir. Küresel koşu bandı üzerinde yerleştirilen fareler bir bilgisayara 10,26 tarafından oluşturulan sanal bir görsel ortam gezinmek için eğitilmiş olabilir. Hücre içi / hücre dışı kayıtları gibi sanal bir ortam seyreden bir baş-sabit bir hayvanda, hipokampal yer hücrelerinin aktivasyonu 27, tespit edilebilir, gösterdi. Sanal bir görsel ortamda, fareler aktif hareket sırasında 27 yerel alan potansiyeli ve teta-fazlı devinim normal hareket-ilişkili teta ritmi göstermektedir. Son zamanlarda, mekansal ve zamansal faaliyetenöron popülasyonları y desenler sanal ortamda 28 hafıza karar görevleri çalışma sırasında fareler optik kaydedildi.
Atılım araştırma etkin olmasına rağmen, küresel koşu bandı tasarımı çeşitli içsel sınırlamalar vardır. Birincisi, hayvan, duvarlar veya engelleri olarak hiçbir somut engel teşkil dönen bir hava topu kaldırdı, sınırsız yüzey üzerinde taşımak için gereklidir. Görsel girdi bu türlerin doğal güveniyor dokunsal duyusal girdi (örneğin, bıyık-touch veya yalamak), ile karşılaştırıldığında fareler ve sıçanlar üzerinde tartışmasız daha az etkili olduğu için bu sınırlama, bilgisayar tarafından oluşturulan "sanal gerçeklik" ile telafi kısmen sadece üzerinde. İkincisi, top yüzeyi önemli eğrilik kendi kafeslerine düz bir zemine yürüyüş için kullanılan laboratuvar fareleri için rahatsız olabilir. Son olarak, topun saf çapı (fare ve sıçanlar için 300 mm için en az 200 mm) küresel dikey boyutu oluştururnispeten büyük koşu bandı cihazı. Bu da ticari olarak temin edilebilir mikroskopi düzeneklerinin çoğunluğu ile küresel koşu bandı birleştirmeyi kolaylaştırır ve genellikle ısmarlama mikroskop çerçeveler vasıtasıyla bandı etrafında yeni bir kurulum yapı gerektirir.
Bir kafa sabit fare, düz bir zemin ve somut duvarlar özellikleri bir hava kaldırdı mobil homecage hareket ve stressiz koşullarda fiziksel çevreyi keşfetmek nerede, burada, yeni bir yöntem tarif edilmektedir. Bu makalede fare eğitim ve baş tespitin prosedürleri gösterir ve iki-foton mikroskopi, içsel optik görüntüleme ve patch-kelepçe kayıtları uyanık davranmak farelerin beyninde gerçekleştirilen temsili örnekler sağlar.
Protocol
Burada sunulan tüm prosedürleri hayvan bakımı (Hayvan Deneyleri (62/2006) Fin Yasası) için yerel rehberlik göre yapılmıştır. Hayvan lisans (ESAVI/2857/04.10.03/2012) yerel otorite (ELÄINKOELAUTAKUNTA-Ella) elde edilmiştir. Yetişkin fareler (yaş 1-3 ay, ağırlık 20-40 g) Helsinki Üniversitesi sertifikalı hayvan barınağında grup konut kafeslerde tutulan ve gıda ve su ad temin edilmiştir.
1.. Kranial Pencere İmplantasyonu
Aşağıda kısaca tarif edildiği gibi kranyal pencere, yayınlanmış protokollere küçük değişikliklerle 29-31 göre implante edilir:
- Kafatası pencere implantasyonu başlamadan önce aletleri sterilize. Postoperatif komplikasyon riskini en aza indirmek için ameliyat sırasında steril koşullarda muhafaza.
- 30 dk ameliyat ve 24 saat sonrası, ameliyattan önce, bir analjezik (Ketoprofen, 2.5 mg / kg) yönetmek. Birketamin oluşan bir karışım (80 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile intraperitoneal olarak enjekte edilen fare esthetize. Düzenli pençe sıkıştığı tarafından anestezi derinliği izlemek. 37.0 ° C'de hayvanın vücut sıcaklığını korumak için bir ısıtma pedi kullanın , Ameliyat kaynaklı inflamasyon ve beyin ödemi azaltmak subküten enjeksiyonla deksametazon (2 mg / kg) yönetmek için.
- Kuru getting gözleri korumak için göz yağ sürün. Farenin kafasını tıraş ve tıraş bölgeyi temizleyin. Alnına ense gelen hattı boyunca cerrahi makas ve forseps kullanarak keseceksiniz. Kafatasına bağlı herhangi bir bağ doku çıkarın.
- Yavaş ve dikkatli bir yüksek hız cerrahi matkap kullanarak sol frontal kemik küçük bir kuyu açilmasina. Delinmiş kuyuya mini cıvatasını (Malzeme) vidalayın. Vidanın fazla bir-ve-bir-buçuk tam tur yapın.
NOT: Doğrudan yüzeyel kortikal damarları üzerinde bulunan bu alanlardan kaçının. Bu Ves bozulmasısels masif kanamaya yol açabilir. - Kraniotomiye gerçekleştirmek için, sağ parietal kemikte yuvarlak pencere (çapı 3-3,5 mm) matkap. 100 ug penisilin 100 birim / mL ve streptomisin ile takviye edilmiş damıtılmış H2O içinde korteks tampon bir damla (125 mM NaCl, 5 mM KCI, 10 mM glükoz, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2 ve 2 mM MgSO 4 uygula / ml) ve dikkatli bir şekilde dairesel pencere içinde bulunan kemik parçası kaldırmak.
NOT: belirli bir hücre alt grubunda bir floresan proteini ifade edilen prosedüre bu noktada adeno-ilişkili viral (AW) vektörü ya da diğer viral vektörleri intrakranial enjeksiyon yapmak. - Kranial pencerede bir yuvarlak cam lamel (# 1.5 kalınlık kodu) yerleştirin. Poliakrilik yapıştırıcı ile kafatasına lamel takın. Lamel üstüne bir metal tutucu yerleştirin ve diş çimento ve poliakrilik tutkal karışımı ile sabitleyin.
Not: Yukarıdaki prosedür kafatası pencereler için optimize edilmiştiroptik görüntüleme deneylerinde kullanılmıştır. , Elektrofizyolojik deneyler için uygun bir "ters" kranial penceresi hazırlamak, farklı bir yordamı kullanın. Birincisi, kafatasına metal tutucu tutkal. Video örneklendiği gibi sahibinin açıklık içinde dairesel bir pencere delin. Seçenek olarak ise, 32 beyin hareketi önlemek veya en aza indirmek için ilgili bölgenin üzerinde daha küçük bir kranyotomi (çapı en az 0.5 mm) olun. Kortikal tampon yenilemek veya kafatası pencere silikon yapıştırıcı bir damla koyun, sonra yuvarlak cam lamel ile kapatın. - Işlem tamamlandıktan sonra, kolay erişilebilir gıda ve su ile ısıtılmış bir kafeste hayvan. Bu anestezi tamamen kurtarır sonra grup konut kafesine hayvan dönün. , Hareket yemek veya içmek için isteksizlik, kilo kaybı, salya, poliereksiyon veya anormal solunum sesleri de dahil olmak üzere ağrı herhangi bir işaret, tespit üzerine analjezik yeniden yönetmek.
2. Animal Taşıma
- Kafesinden fareyi alın ve sadece 5-10 dakika tutun. Hayvan taşıma sırasında sakin olun, ani hareketler ve sesler yapma kaçının.
- Kullandıktan sonra, kendi kafesine fareyi dönmek.
- Deneye ile fare rahat ettirmek için, elleçleme bölüm arasındaki eşitsiz aralıklarla taşıma işlemi 2-3x tekrarlayın.
- Küçük bir yumuşak bir bez alın ve eşit aralıklarla hayvan 2-3x sarın.
- Hayvan sakin olmaya ve sarılarak alışması gerekir. Fare heyecanlı ve sinirli ise, taşıma ve paketleme işlemleri tekrarlayın.
3.. Hayvan Eğitimi
- Işleme ve paketleme için alışkanlık sonraki gün tamamlandıktan mobil homecage hayvanın eğitim başlatın.
- Hayvanın öncesi ve eğitim boyunca günlük tartmak kaydedin.
NOT: eğitim sırasında, hayvan kendi ağırlığının% 10 üzerinde kaybeder, bu t dışında tutulmalıdıro deneyler. - Eğitilmiş hayvanın büyüklüğünü maç için mobil homecage cihazın kafa sabitleme kolunun dikey konumunu ayarlayın. Standart laboratuar basınçlı hava çıkışının (tipik olarak, bir gaz deposu ya da örneğin, yaklaşık olarak 5 bar ile 300 l / dakika, yeterince yüksek bir basınç ve hava akımının hızı sağlayan bir hava pompası) için cihazın hava girişi takın.
- Bir bez içinde hayvan sarın.
- Kafa sabitleme koluna hayvanın başının bağlı olduğu metal tutucu, yerleştirin ve sıkıca vidaları sıkarak sabitleyin. Hava akışını açın ve hava akımı hava kaldırdı homecage ücretsiz flotasyon için uygun olduğundan emin olun. Bez kaldırarak mobil homecage içine hayvanı serbest bırakın.
- Gürültü hayvan alışmakta, ortam sesleri sabit bir poz vermek (örneğin, kullanarak, radyo ya da kayıtlı müzik ve konuşma) tüm eğitim oturumları sırasında yanı sıra deneyler sırasında.
- Dİlk eğitim oturumu uring, antrenman seansının sonuna kadar ışığı kapatmak, sonra ilk saat için oda ışık tutmak.
- Mobil homecage eğitim 2 saat sonra, baş sabitliklerinden hayvanı serbest bırakmak ve su ve yiyecek kaynağı ile kendi kafesine geri. Durgunluk koşulları altında en az 2 saat boyunca bekletin.
- % 70 etanol solüsyonu kullanarak her antrenmandan sonra mobil homecage temizleyin ve musluk suyu ile durulayın. Tek kullanımlık kağıt havlu ile su-içinize çekin ve bir sonraki kullanımdan önce mobil homecage kurulayın.
- Hayvan eğitimli edilirken oda ışığı ile, 2 saat boyunca ardışık eğitim oturumları gerçekleştirin kapatılır.
- Günde iki kez antrenman oturumu gerçekleştirmek.
- 8-12 eğitim sonra, her seferinde en fazla 2 saat için deneysel oturumda hayvan kullanımı.
NOT: Birden fazla 1-2 saat son uzun süreli eğitim oturumları sırasında, w fareyi sağlayan düşününya elle ya da mobil homecage çerçeveye bağlı bir pipet tutucusu kullanılarak teslim edilebilir ith içme suyu,. Seçenek olarak ise, su doğrudan mobil homecage duvarlarında hidro jel yapışkan damla yerleştirerek hayvanın ad libitum kullanım için temin edilebilir.
NOT: Herhangi bir kronik stres etkilerini ekarte etmek için eğitim her gün önce hayvanları tartmak unutmayın. Herhangi bir zaman noktasında, bu tür donma, seslendirme, ya da stres kaynaklı ishal gibi stres tepkileri gösterir, eğer deneyde bir hayvan dışla.
4. Uygulamaları
- Uyanık Fare İki foton Görüntüleme Mobil homecage Çevresi Hareketli
- Mobil homecage birleştirin. Köprü ve kafa sabitleme kol konumlarını kontrol edin.
- Bir bez içinde eğitimli hayvan sarın. Mobil homecage hayvan yerleştirin. Baş tespit kolunda metal tutucu kelepçe. Bez çıkarın.
- Kullanarak tozdan implante kapak camını% 70 etanol çözeltisi ve kurumasını bekleyin.
- Kapak sınıf daldırma sıvı bir damla yerleştirin. Su çabuk buharlaşır çünkü Tercihen, viskoz bir çözüm kullanın.
- (Eğer mikroskopi kurulumunda sabit olan bir ikinci, aynı cihaz, yoksa) mikroskop altında eğitimli hayvan ile mobil homecage cihazı yerleştirin.
- Bir ölçüye ya da bir femtosaniye darbeli kızılötesi lazer ile donatılmış bir piyasada mevcut lazer tarama mikroskobu görüntüleme sistemi kullanarak görüntüleme gerçekleştirin.
- Floresan mikroskop geniş alan modu kullanılarak, ilgili bölgeyi bulun. Beyin damarlarını değerlendirmek ve kan damarlarının desen inceledikten sonra uygun bir hedef alanı seçmek için uzun bir pas filtreleri kullanın.
- Hayvan bez immobilize, ya da retro-orbital sırasında ise görüntü kortikal damar için, ya kuyruk damarına, 70,000 MW Texas Red-konjüge dekstran (veya analog) bir% 1 çözeltisi enjekteHayvan mobil homecage içinde konumlandırılmıştır. 860 nm Ayarlama iki foton lazer ile yayılan ışığı toplamak için bant geçiş filtresi (590-650 nm) kullanılır. Thy1 promotörün kontrolü altında nöronların bir alt grubunda duyarlı floresan protein GCaMP3 - örneğin YFP veya Ca 2 + ifade eden transjenik farelerin, nöronal morfoloji veya kullanan nöronal aktivitenin ince ayrıntıları değerlendirmek için 515-560 nm emisyon filtre kullanın.
- Görüntü alımı için uygun bir yazılım kullanın.
- Görüntüleme sonra vidaları gevşeterek baş sabitleme kolundan hayvanı serbest bırakmak. Kendi kafesine hayvan dönün ve bir sonraki görüntüleme oturumu başlamadan önce en az 2 saat dinlendirilir.
- Sonraki tekrar görüntü için ilgi (ROI) her bölgenin koordinatlarını saklayın. Görüntü aynı zamanla ROI'ler ve Koordinatları görüntü örtüşme maksimize etmek için her zaman ayarlayın.
- Görüntüleri analiz etmek ve uygun bir yazılımı kullanarak üç boyutlu rekonstrüksiyon yapmak(örneğin, ImageJ, vb).
- Uyanık Fare ıntrinsic Optik Görüntüleme Mobil homecage Çevresi Hareketli
- Içsel bir optik görüntüleme kurulum görüntü elde etme kamera altında cep homecage birleştirin.
- Bir bez içinde eğitimli hayvan sarın. Mobil homecage hayvan yerleştirin. Kafa sabitleme koluna metal tutucu kelepçe.
- % 70 etanol solüsyonu kullanarak tozdan implante kapak camını ve kurumasını bekleyin.
- Implante camına gliserol bir damla koyun ve 8 mm yuvarlak kapak kayma ile örtün.
- Kontralateral bıyık için hava üfleme borusu tam tersi olan bir manipülatör yerleştirin.
- Yüksek hızlı kamera konumunu ayarlayın ve kortikal damarsal üzerinde odaklanır.
- Gemiler haritayı elde etmek için bir kamera filtresi olmadan yeşil ışık (filtre 546BP30) kullanın.
- Yaklaşık olarak 400 mikrometre kortikal yüzeyinin altında, korteks içine daha derin Odak.
- Görüntü tO kan oksijenlenme seviyesi bağımlı (BOLD) optik sinyal, kamera önünde 590LP filtreyi yerleştirin ve kırmızı ışık (filtre 630BP30) ile korteks aydınlatmak.
- Eşit olarak aşırı maruz kaçınarak, ilgi bölge ile dağıtılan böylece kortikal yüzeyin aydınlatma ayarlayın. Ilgi bölgesi kameranın dinamik aralık% 70-90 segmenti içinde düşer, böylece aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın.
- Kameradan görüntüleri toplamak için LongDaq görüntü alma yazılımı kullanın.
- Düşük frekanslı stimülasyon (0.05 Hz) ile deneyler için (saniyede 1 ile 10 kare arasında yani) 10 Hz 1 görüntü elde etme sıklığını kullanın.
- Içsel optik sinyal ile herhangi bir girişimi önlemek için oda ışığını kapatın.
- Fare mobil homecage uyum için en az 30 dakika bekleyin.
- Stimülasyon olmadan 6-dk atak sırasında görüntü bazal aktivite.
- Uyarılmış c kaydetmek içinortical etkinlik, bir yüksek frekans (25 Hz) 6 dakika toplam süre hava ponponları tren ile 10 sn ON/10 sn OFF moduna (0,05 Hz stimülasyon) de bıyık uyarır.
- Görüntü alındıktan sonra, baş sabitleme kolundan fareyi bırakın ve kendi kafesine geri.
- Stimülasyon yanıtlarının genlik gürültü oranı, mükemmel sinyal sonuçlanan uyanık hayvanlarda nispeten yüksek olma eğilimindedir, çünkü frekans için ek veri filtreleme kullanmayın.
- Görüntülere *. Tif yığın dosyaları elde setleri dönüştürmek ve örneğin kullanarak daha fazla analiz, açık kaynak yazılım FIJI (İmageJ). Görüntü Hesaplama aracını kullanarak bıyık uyarılması sırasında elde çerçeveleri bazal spontan aktivitesini çıkarmak. Alternatif olarak, uygun yazılım kullanarak frekans alanında filtre veri.
- Uyanık Mouse Patch-kelepçe Kayıtlar Mobil homecage Çevresi Hareketli
- Mobil homecage birleştirin.
- Bir bez içinde eğitimli hayvan sarın. Bakteriyel enfeksiyonu önlemek için trimetoprim (5 mg / kg) ve sülfadoksin (25 mg / kg) uygulayın. Mobil homecage hayvan yerleştirin. Kafa sabitleme koluna metal tutucu kelepçe.
- Temiz ve% 70 etanol solüsyonu veya% 0.5 klorheksidin diglukonat kullanılarak implante diş çimento "kap" ve cam kapak sterilize ve kurumasını bekleyin.
- Yavaş ve dikkatlice metal sahibinden cam kapak çıkarın.
- Penisilin, streptomisin ile desteklenmiş kortikal tampon yenilemek ve steril hemostatik tampon ile enkaz kranial pencereyi temizleyin.
- Kortikal tampona toprak elektrotu yerleştirin.
- Bir micromanipulator elektrofizyoloji headstage yerleştirin.
- 6.5 8.5MΩ değişen uç direnci amaçlayan, borosilikat cam pipetler Üretiyor. Bir hücre içi çözelti ile yama pipet doldurun. Yama pipet çözeltisinin bileşimi(mM olarak) şu: 8 KCI, 111 K-glukonat, 0.5 CaCl2, 2 NaOH, 10 glukoz, 10 HEPES, 2 Mg-ATP ve 5 BAPTA, pH, KOH ile 7.2 'e ayarlandı. Zar potansiyeli -12 mV'ye 33 değerleri hesaplanmış bir sıvı bileşke potansiyeli için düzeltilmelidir.
- Stereotaksik koordinatlar kullanılarak, ilgi konusu hedef bölge ve hızlı bir şekilde pipet ucu üzerinde güçlü bir pozitif basıncı muhafaza ederken, beyin içine elektrot hareket ettirin. Dura mater penetrasyonu ve pipet konumlandırma sonra, ucu direncini ölçmek ve sonraki adımların başarı oranını artırmak amacıyla fazla% 10-15 direnç bir artış göstermektedir elektrotları atın.
- Çevredeki beyin dokusu şişmesini önlemek için yarı yarıya pozitif basıncı azaltır. İleri aşamalar standart "kör yama" protokolüne benzer. , Kayıt için bir nöron bulmak bir nöron yakın mesaf tespit edilinceye kadar kademeli bir şekilde beyin içine ucu düşürmek içinPipet ucunun y, empedans değişikliklerin bir karakteristik geçici sekansı ile gösterildiği gibi. Bir nöronun mevcudiyetinde en önemli göstergesi pipet birkaç ardışık ileri adımlar arasında elektrot direncinde tekdüze bir artış (üç 2-um adımlar arasında pipet direnç tipik olarak,% 20'lik bir artış) 'dir.
- Hedeflenen nöron ile bir gigaseal temas oluşturmak için, pipet negatif bir basınç ve hiperpolarizasyon uygulanır.
- Bütün hücre konfigürasyonunu kurmak için hücreye daha büyük bir negatif basınç kısa bir darbe uygulanır. Iyi bir sızdırmazlık tutmak için, 2-3 mikron tarafından elektrot geri çekin.
- Arzu edilen bir zaman süresi boyunca kayıt spontan ya da uyarılmış aktivitesi, en fazla 20-40 dakika.
- Kaydettikten sonra, beyin pipet çıkarın.
- Kortikal tampon yenilemek veya kafatası pencere silikon yapıştırıcı bir damla koyun, sonra metal tutucu üstüne bir yuvarlak cam lamel tutkal.
- Anim bırakınvidaları gevşeterek baş sabitleme kolundan al. Sonraki kayıt önce en az bir gün için kendi kafesine hayvan dönün.
- Örneğin, FitMaster yazılımı ile verileri analiz.
- Alışma-dishabituation Koku Testi Uyanık Mouse Mobil homecage Çevresi Hareketli
- Temiz bir pamuk parçasını (2 x 2 cm) takın, iki taraflı bir bantı kullanarak mobil homecage duvarının iç tarafına musluk suyu batırılmış. Pamuk parçası "hedef bölge" nin ortasında yer alır ve böylece duvarın dış tarafında renk işaretleri yerleştirerek dört bölgeye mobil homecage duvar bölün. "Hedef" bölgesi için duvar bölümü ters bakan çivili başlıkta kolunda hayvan saptamak ve 30 dakika için mobil homecage uyum sağlar.
- Temiz bir pamuk başka bir parça alın ve% 1 vanilya özü birkaç damla ile ıslatın. Vanil taşıyan biri ile mobil homecage duvara temiz pamuk yerinela koku. 5 dakika için koku mevcut. Koku sunum döneminde mobil homecage hareketlerini takip edin. Hayvan cep homecage hareketinin toplam zamanına göre "hedef" bölge bakan harcadığı toplam süre ölçülerek koku ilgi düzeyini tahmin.
- 5 dk arası oturum arayla, vanilya kokusu kullanılarak 5-dk uygulama oturumuna üç kez tekrarlayın. Her oturumda "vanilya" pamuk taze bir parça kullanın.
- Beşinci ve son oturumu sırasında bir sosyal anlamlı kokusu ile hayvan mevcut. (Zıt bir cinsiyet, bir hayvandan elde edilen bir önceki gün) idrar birkaç damla ile pamuk temiz bir parça ıslatın ve 5 dakika için hedef bölgesinin ortasına yerleştirin.
- Mobil homecage etrafında uyanık fare hareket eden Roman koku tanıma
- Mobil homecage duvarının dış tarafında renk işaretleri yerleştirerek dört bölgeye duvarı bölün. AttACH iki temiz pamuk parçası (2 x 2 cm) (hedef bölge 1 ve hedef bölge 2 olarak adlandırılır) birbirine karşı gelen bölgeler ortasında duvarın iç tarafına musluk suyu batırılmış. Hedef bölgeleri dışındaki bir duvar parçasının bakan çivili başlıkta kolunda hayvan saptamak ve 30 dakika için mobil homecage uyum sağlar.
- Hem pamuk taze olanlarla parçaları değiştirin:. Place dilimini 1. hedef% 1 vanilya özü ile ıslak bir pamuk parçası ve bölgeyi 2 hedef musluk suyu ile başka bir ıslak kokusu sırasında 10 dakika boyunca cep homecage hareketlerin video kaydedin sunum oturumu. Hayvan hedef bölgesini 1 bakan harcadığı zamanın yüzdesi olarak katılan koku hesaplamak göreceli kümülatif zaman dilimleri 1 ve 2 bakan geçirdi.
- 10 dakikalık bir aradan sonra, takip eden 10 dakikalık bir süre için homecage duvara aplikatörlerin başka bir çift yerleştirin. Hedef bölge 1 ve% 1 muz e ıslak pamuk aplikatör "vanilya" pamuk yerleştirinHedef bölgede 2 Xtract. mobil homecage hareketlerin bir video kaydı yapın. Hayvan bölgeleri 1 ve 2 bakan kümülatif zaman yeni koku (hedef bölge 2) göreli ile duvar parçasının bakan harcadığı zamanın yüzdesi olarak yeni koku tercihini hesaplayın.
Representative Results
Yöntem, burada sunulan uyanık, baş sabit ama aksi halde serbestçe hareket eden ve davranış farelerde mikroskobik görüntüleme ya da tek hücreli elektrofizyolojik kayıtları için tasarlanmıştır. Hayvanların kafatası kafa sabitleme koluna sıkıca sabitlenir iken hayvan bir gerçek (sanal aksine), maddi ve tanıdık bir ortamda, iki boyutta hareket edebilir. Hava kaldırdı mobil homecage için fareler habituating günde iki kez 2-hr eğitim seanslarının 4-6 gün (Şekil 1) oluşur. Eğitimli Hayvanlar daha sonra hemen deneylerde kullanılabilir. Tipik bir çalışma birkaç saat ile birkaç gün veya hafta arasında değişen aralıklarla aralıklı görüntüleme oturumları veya yama kelepçe kayıt oturumları bir dizi içerir. Önemli bir şekilde, hem de optik ve elektrofizyolojik kayıtları tek bir deney içinde, bilişsel ve davranışsal uyaranlara ve okumalar ile aynı anda gerçekleştirilebilir.
Mekanik stabilitesini değerlendirmekDeney hayvanları mobil homecage (Şekil 2) navigasyon iken mobil homecage içinde mouse kafası tespit, floresan-konjuge dekstran ve YFP ifade kortikal dendritlerin etiketli kortikal damarların görüntü dizileri toplanmıştır. Hayvanın hareket sırasında beyin maksimum yer değiştirme genellikle 1-1.5 mikrometre geçmemiştir. Bu yer değiştirmeler, yatay yönde meydana gelen ve çok nadir olarak hareket eserler gereksiz herhangi bir düzeltme işleme, görüntü düzlemi içinde tespit edilebilir bir değişime yol açtı. Mobil homecage stabil kafa sabitleme, anestezi uygulanmış farelerde aynı güvenilirliği ile uyanık hayvanlarda tek dendritik dikenler ölçümü sağlar. Dendritik omurga yoğunluk, morfolojisi ve ciro birkaç saat ile birkaç gün veya hafta arasında değişen aralıklarla gerçekleştirilen çoklu görüntüleme oturumları ile uzunlamasına çalışmaları sırasında izlenebilir.
M kullanılabilirlikThy1-GCaMP3 transgenik fareler üzerinde i) iki foton mikroskopi ve vahşi tip farelerde ii) iç optik sinyal görüntüleme: Fonksiyonel optik görüntüleme için obile homecage iki yaklaşım kullanılarak uyanık farelerin somatosensory korteksinde test edilmiştir. Ca 2 + görüntüleme hücre birçok floresan etiketli nöronların organları, yanı sıra dendrit ve aksonlar (Şekil 3) içeren bir tabaka 2/3, gerçekleştirilmiştir. İlgi (ROI) seçilmiş bölgelerinden floresan-over-zaman grafikleri mobil homecage de fare aktif navigasyon esnasında (GCaMP3 floresansta geçici artış olarak ölçülmüştür) spontan nöronal etkinlik gösteren, Şekil 3 'de gösterilmiştir. Içsel sinyallerine dayanan optik görüntüleme fonksiyonel etki uzamsal dağılımı haritalama sağlar. Şekil 4 v cevaben somatosensory korteks boyunca yayılır (bölgesel nöronal aktivasyon yansıtan) kan oksijenlenme düzeyinde dalga benzeri değişiklik göstermektedir0.05 Hz frekansta ibrissa uyarılması.
Mobil homecage ile patch-kelepçe kayıtların fizibilitesini test etmek için, biz 2-3 ay eski C57Bl/6J fareler kullanıldı. Somatosensori kortekste Katman 2/3 nöronlar akım kelepçe modu kullanılarak, tam hücre konfigürasyonunda kaydedildi. Uyanık farelerin beyninde Patch-clamp kayıt kafası ile sabitlenmiş mobil homecage beyin dilimleri patch-kelepçeleme kör esas benzerdi. Girişimi yaklaşık 50% 'den fazla% 70 stabil tam hücre konfigürasyonu kayıt vermiştir ki bölgesinin başarılı gigaseal oluşumu ile sonuçlanmıştır. Nedeniyle hücrelerin mekanik değiştirmesinden gigaseal kişiyi kaybetme hiçbir olay gözlenmemiştir. 5 mouse aktif (çalışan) atakları ve pasif (dinlenme) devletler ile ilişkili bir temsilci 10 dk uzun akım kelepçe kaydın 60 saniye parçasını göstermektedir Şekil.
Şekil 1. Mobil homecage uyanık farelerin baş fiksasyon yöntemi. A) hava kaldırdı mobil homecage tasarım ve tipik bir deneysel çizelgesi genel kavram. B) Diyagram resimlerinden bakış. Çalışma iki hafta önce kullanım ve sekiz günde iki kez eğitim oturumları takip sarma, fare habituating için kafatası pencere implantasyonu ile başlar. Tipik çalışma birkaç saat ile birkaç gün veya hafta arasında değişen aralıklarla aralıklı görüntüleme oturumları veya yama kelepçe kayıt seansları bir dizi içerir. Hem optik ve elektrofizyolojik ölçümleri tek bir deney içinde bilişsel veya davranışsal uyaranlara ve okumalar ile paralel olarak yapılabilir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Mobil homecage dolaşırım uyanık fareler üzerinde iki-foton mikroskopik görüntüleme Şekil 2.. Örneği. 70 kDa Texas Red-konjüge edilmiş dekstran ile etiketlenmiş A, B) Kortikal damar. Bireysel damar segmentinin çapı zaman içinde fare ve dinlenme çalışan (A) dönemlerinde damar lümeni boyunca çizilen çizgilerin profili çizilerek ölçülür. Arterler ve venler kan akışının hızı, damar duvarı (B) bölgesinin alt grubunda YFP ifade eden transjenik farelerin beyninde görüntülenmiştir nöronal morfoloji. C, D) ince ayrıntıları paralel çizilen çizgiler boyunca satır tarama ile ölçülür Thy1 promotörün kontrolü altında nöronlar. Farenizin Somatosensory korteks (C) piramidal nöronların üç boyutlu rekonstrüksiyon. Bir dendritik b görselBir uyanık davranıyor fare edinilen çiftlik bireysel dendritik omurga morfolojisi (D) fare hareketlerinin neden olduğu beyin hareket. E) Kantitasyonu ölçümü için yeterince stabil. Büyük genlik değiştirmeler fare çalışan dönemleri ile ilişkili. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Uyanık Thy1-GCaMP3 fare mobil homecage dolaşırım nöronal nüfus aktivitenin Şekil 3.. Örneği. Kortikal tabaka II / III nöronlar içinde A) İki foton görüntüsü. ROI, örneğin nöronal hücre gövdeleri, dendritler ve akson (zaman ler) sarı. B A'da gösterilen ROI'ler gelen GCaMP3 floresan mesafe kadar taşınmış / F izlerini gösterilirC sarı ROI'ler itibaren eries) 1.5 sn / kare hızında kaydedilir. C) Zoomed-65 msn / karede görüntülendi bölge. D) Flüoresan zamanla çizilen, eyleme karşılık GCaMP3 flüoresandaki geçici artışlar (kırmızı) gösterir Potansiyel kaynaklı Ca 2 + akını bölüm. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Iç optik sinyalleri görüntüleme vasıtasıyla bir uyanık fare kortekste fonksiyonel tepkiler uzamsal dağılımı haritalama Şekil 4.. Örneği. Mobil ho temel faaliyet kranial pencereden yüzeysel kan damarlarının A) Parlak alan görünümü. B) Büyüklük haritası6-dk bölüm 0.05 Hz frekansta bıyık uyarılmasına tepki somatosensoriyel korteks boyunca yayılan nöronal aktivitenin. C) Büyüklük haritası sırasında mecage. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Mobil homecage çevresinde hareket eden bir uyanık fare kortekste tam hücre parça sıkıştırma sayımı Şekil 5. Örneği. Fare kortikal tabakanın 2/3 'te bir nöron A) Akım-kelepçe kayıt. A 0.5 sn, (iz aşağıda belirtilmiştir) 100-PA akım enjeksiyon aksiyon potansiyelleri bir patlama ile sonuçlanır. Hücre piramidal nöronlar için başak frekans adaptasyon özelliği gösterdi. B) Sürekli akım kelepçe kayıt(iz yukarıdaki pembe gösterilen) mouse 'lokomotor aktivite ile ilişkili aynı nöron. Fare bulunuyor (C) dinlenme ve (D) çalışan dönemlerinde katman 2/3 nöron Temsilcisi spontan aktivite. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Mobil homecage eğitim seansları sırasında Şekil 6.. Hayvan kilo kaybı ve head-fixed/non-fixed farelerin lokomotor aktivitesi. Eğitim oturumları öncesi A) Hayvan ağırlığı (+ SD, ortalama%). Kilo kaybı tam 7-8 inci antrenman mobil homecage için farenin yatay hareket göreceli. B) Yörünge tarafından tersine Not,8 inci antrenmandan 8 inci antrenmandan kafa sabit (çemberin. D) Süre) esnasında yuvarlak kafesi keşfetmek olmayan bir kafa sabit fare. C) Paletli hareketleri sırasında mobil homecage ve izlenen hareketi ekstrapolasyondan edildi Eğitimin 1-4 inci gün boyunca sabit olmayan (üçgen) fareler hareketi (+ SD,% demek). 4. günde, baş-sabit fareler ne (1. gün olarak) suyun ne de aşırı lokomotor faaliyet göstermek, unutmayın. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Discussion
Iyi beyin fizyolojisi ve patolojisi anlamak için, araştırma, her hazırlanması için en uygun teknikleri kullanarak, hazırlık karmaşıklık düzeylerinde çeşitli yapılmalıdır. Uyanık ve davranışlar hayvanlar üzerinde deneyler önemli bir metodolojik sorun temsil varken Şu anda, nörobilim metodolojileri geniş bir yelpazede (tam vücut fMRI alt-organel STED'in mikroskopi) kolayca, anestezi hayvanlara uygulanır.
Burada, yeni bir yaklaşım, bir laboratuvar hayvan, sıkıca kafa sabit olmasına rağmen, bir hava-kaldırdı mobil homecage etrafında hareket edebilir ve stressiz koşullarda maddi ortamı keşfetmek nerede açıklanmıştır. Burada sunulan kafa sabit davranıyor hayvan hazırlık çok önemli bir dizi avantaj sağlar. İlk olarak, bu yöntem ile elde edilen elektrofizyolojik veya görüntüleme verileri anestezi ne de sınırla-kaynaklı stres tarafından ne ödün vardır. Mobil ev içine fare Konumlandırmakafes hızlı ve hatta geçici olarak hayvan anestezi gerektirmez. İkincisi, hava kaldırdı homecage ince nöronal morfoloji değişiklikleri ölçmek için ve uyanık hayvanlarda tek hücreli elektrofizyolojik aktiviteyi kaydetmek için gerekli olan mekanik kararlılığı sağlar. Son olarak, mobil homecage tasarım böylece uyanık fare beyninin iki foton görüntüleme veya yama kelepçe kayıt için standart bir dik mikroskop altında cep homecage konumlandırma sağlayan, küresel koşu bandı kıyasla daha kompakt.
Mobil homecage sağlam kafa sabitleme altta yatan bir beyin bölgesinde optik veya elektriksel erişim için merkezi bir yuvarlak açıklığı bulunan, özel olarak tasarlanmış dört kanatlı metal tutucu implantasyonu gerektirir. Bu metal tutucular yapıştırıcı, diş çimentosu ve kemik kafatası içine vidalanan bir cıvata küçük bir kombinasyonu vasıtası ile kafatasına bağlıdırlar. Bu cerrahi işlem, daha önce çok sayıda dayalı geliştirilmiştirprosedürleri yayınlanan ve istikrarlı ve tekrar üretilebilir kafatası pencere hazırlanması ile sonuçlandığı bulunmuştur. In vivo elektrofizyolojik deneyler, bir ay şeklinde bir pencere 34, bir küçük boyutlu kranyotomi (en az 0,5 mm) 32, ve bir delikli cam kaplı 35 hazırlanması için kullanılmıştır. Burada, "ters" kafatası pencere büyük bir (3.5 mm çap) ve küçük (az 0.5 mm çapında) kranyotomi ya ile implante edildi. Beyin hareketi en aza indirerek bu elektrofizyolojik deneyler için küçük boyut Kraniyotomi gerçekleştirmek için tavsiye neden olan, istikrarlı tek hücre kayıtları için önemlidir. Optik görüntüleme deneyler için kafatası pencere implantasyonundan sonra, hayvanlar pencere birinci geçici saydamlığını kaybeder ve daha sonra bağlı olarak,% 50-70 verimle (o geri kazanır ve bu süre boyunca en az 2 ya da 3 hafta boyunca geri izin verilir fare soyu genetik kökenli). Kranial pencere ve Stabil Şeffaflığıkafatasına bağlı dental çimento "kapak" of ity hayvan kullanımı sırasında düzenli binoküler mikroskop ve fiziksel muayene ile doğrulanabilir. 2-3 haftalık iyileşme döneminin sonunda, dental çimento kalıntı ameliyat sonrası enflamasyon ya da mekanik kusurları belirtisi sergileyen hayvanlar hariç tutulur ve deney sonlandırılır.
Fareler eğitim başlangıç için uygun yaş 2-4 ay (20-40 g vücut ağırlığına karşılık gelen) 'dir. Genç hayvanlarda, kafatasına dental çimento "kapak" ankraj mobil homecage baş sabit fare hareket yeteneği tarafından uygulanan mekanik strese karşı dayanıklılığını azaltabilir ki, güvenilir olabilir. Erkek ve dişi farenin mobil homecage gezinmek için aynı ölçüde istekli görünse de, (veriler gösterilmemiştir) dişi farelerde saydamlıklarını kazanmak kafatası pencerelerin yüzdesini elde etmek için daha iyi bir eğilim vardır. Bu nedenle, sipariş to yaklaşık% 30 daha fazla erkek farelerde kafa pencereleri implante, görüntüleme için seçilen hayvanların kohort cinsiyetler dengeli bir karışımını sağlamak tavsiye edilir. Sosyal etkileşimler bu nedenle yavrular işletilen ve eğitimli paralel ve grup konut kafeslerde bir arada tutulmasını tavsiye edilir, hayvanların refahını artırmak ve stresi azaltmak için bilinmektedir.
Küresel yürüme bandı 13 hazırlanması için yayınlanan prosedürlere aksine, mobil homecage kullanan yöntem, baş tespitin an fare anestezi gerektirmez. Hatta kısa ve "light" anestezi bölüm kısa bir süre sonra elde fizyolojik ölçümler üzerinde olması muhtemel olduğunu herhangi bir kalıntı etkisi ekarte etmek için izin verir, çünkü bu fark önemlidir. Gerçekten de, olsa bile kafa sabitleme anestezi altında yapıldığını ve gerçek deneyler biri olamaz, kısa bir bekleme süresinden sonra 13 başlanmıştır çalışmalardadeneysel verilerle kısa anestezi bölüm olası uzun süreli etkileri hariç. Diğer çalışmalar tespit baş hayvanların sistematik alışkanlık için su kısıtlaması dayanıyordu ve 36 hareketsiz kalması hayvan motive aracı olarak su ödül kullandık. Ancak, ödül merkezli kafa tespit yöntemi uygulanabilir davranışsal testlerin seçim sınırlar ve daha da önemlisi, köklü uyaran-ödül derneklerin birini kaplar. Buna karşılık olarak, mobil homecage fiksasyon baş fare alışkanlık gibi bir yöntem, su ve daha sonra yoksunluk ödül gerektirmez.
Bir su dağıtım sistemi ile cep homecage tamamlayan uzun süreli deneyler için tavsiye edilir. Burada sunulan hayvan eğitim oturumları ve deneyler standart 12 saat ışık takvimi (li altında tutulur bu fareler için fizyolojik pasif dönemine karşılık gelir (08:00-18:00) gündüz sırasında yapıldı) 06:00 de 06:00 de ve kapalı ghts. Su alımı doğrudan fare aktivitesi ile ilişkili olduğundan bir eğitim / görüntüleme / kayıt oturumunun süresi 2 saat aşmaması halinde, pasif dönem farelerin sırasında su dağıtımını gerekmez. Eğitim seanslarının zamanlaması ve süresi ek olarak, bir mobil homecage hayvanları habituating için seans optimum sayısının sorunu gidermek için gereklidir. I) kilo kaybı, ve ii) lokomotor aktivite seviyesi: Bu amaçla, iki kriter kafa sabitleme işlemleri neden olduğu stres değerlendirmek için kullanıldı. Şekil 6'da gösterildiği gibi, kilo kaybı eğitim 2. günde% 6 arasında ortalama seviyesine ulaşır ve tamamen eğitim 4. günde (Şekil 6) tarafından tersine çevrilir. Sürekli tartmak dinamikleri ile, kafa-sabit hayvanların lokomotor aktivite düzeyi eğitimin ilk gününde bastırıldı, ancak eğitim gün 4 (Şekil 6D) ile dengeler. Bu ölçümlere dayanarak, biz önerilmezburada protokolde tarif edildiği gibi mobil homecage fare eğitim süresi en az süresi, 4 gün, t.
Hava kaldırdı, düz zeminli mobil homecage kullanımı baş sabit fareler için eğitim paradigmaları karmaşık görevleri (duyumsal, algısal ve bilişsel) ekleyerek sağlar. Bu çalışmada, davranış testleri iki protokol sunulmuştur. Her iki protokol koku ipuçları kullanmak ve fare kortekste uzunlamasına görüntüleme / kayıtları ile kombine edilebilir. Mobil homecage emici olmayan malzemelerden imal edilir, ancak hala dikkate cihazı ve test koku (lar) ın bir koku arasındaki olası müdahaleler almak gerekir. Bir davranışsal deney görsel / dokunsal ipuçları engel olabilecek bir diğer faktör sorunsuz değildir ve bu nedenle, bir dönüm noktası olarak hayvan tarafından algılanabilir duvar ve ekleme arasındaki kavşak noktasıdır. Burada fark değer bu, böyle bir entegrasyon sırasında hayvanın sıkıntıyı minimuma indirmek içinmobil homecage duvara bir koku sunan pamuk yerleştirilmesi gibi rventions, Deneyciler mümkün olduğunca çabuk bu tür müdahaleleri yapmak ve karbon kafesin uzun süreli kullanımı önlemek için çalışmanız gerekir. Yeni koku / object sunum için alternatif stratejiler hidrojel bazlı solüsyon hayvanın kafası konumlandırma ile uygun yükseklikte karbon kafes duvarının iç yüzeyine bağlı küçük raflar üzerine damlalar ya da (örneğin, gıda cips gibi) nesnelerin yerleştirilmesi, örneğin, düşünülebilir.
Mobil homecage kafa sabit hayvanlar yatay hareketlilik, situp, tımar çırpma, bu çalışmada gösterildiği gibi ön ayakları ile, burun-alay, vasıflı ön pençe hareketleri ve duvar dokunmadan, yalama gibi iki boyutlu hareketlerin geniş bir yelpazede gerçekleştirmek için olanak sağlar . Mobil homecage ve burada sunulan protokolleri kullanarak, araştırmacılar uyarım durumu hem de üzerinde kontrol yüksek düzeyde Sensorimotor nöronal sistemini incelemek olabilirs ve davranışsal okuma-çıkışları. Ayrıca, uyanık farelerde bilişsel yetenekleri çalışmalar klima, navigasyon ve mekansal karar verme görevleri sırasında yapılabilir.
Bu yöntemin çeşitli pratik sınırlamalar vardır. İlk olarak, bir basınçlı hava önemli miktarda homecage kaldırma gücü elde etmek için ve uzun süreli deneyler gerçekleştirmek için gereklidir. İkinci olarak, bugünkü uygulamada, mobil homecage çapında sadece 18 cm olduğu ve bu nedenle karmaşık bir deney ortamında bir mekansal kısıtlama olmadan tasarlanabilir sanal gerçeklik ile karşılaştırıldığında nispeten küçük ve basit bir alan sağlar. Üçüncü olarak, bıyık uyarılması ve burada sunulan ödül-tabanlı deneyler sırasında bir aygıt olanağını fare için duvar temasını sınırlandırır kullanıldı. (Örneğin, bir göz-yönlendirilmiş ışık projektörü olarak) harici bir görsel veya duysal uyarı kanalın eklenmesi ile karşılaştırıldığında daha ergonomik ve kompakt bir cihaz tasarımı gerektirmektedirküresel koşu bandı deneylerde kullanılmış olan çoklu-ekran veya kubbe-projeksiyon çözümleri.
Özet olarak, hava-kaldırılmış mobil homecage hareket baş sabit farelerin kullanımı büyük ölçüde tek bir deney içinde gözlem ve manipülasyon hücresel, moleküler ve davranışsal düzeyde birleştiren çalışmaları kolaylaştırır. Burada gösterilen spesifik uygulamaları iki-foton mikroskopik görüntüleme, içsel optik sinyal görüntüleme ve non-anestezi davranıyor farelerde yama-kelepçe kayıtları bulunmaktadır. Bu yaklaşımın uyanık davranıyor fare üzerinde deney yeni ufuklar açmak ve ilaç geliştirme ve beyin fonksiyonlarında temel araştırma için yararlı bir araç olarak hizmet edeceği beklenmektedir.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar yazının onun değerli yorumlarınız için Prof Eero Castren teşekkür ederim. Iş Finlandiya Uluslararası Hareketlilik ve Nörobilim Fin Enstitüsü (Beyin ve Zihin Doktora Programı) için Finlandiya Akademisi, Merkezi'ne hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tweezers, Stainless Steel, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For patch pipette production |
| Camera | Foscam | FI8903W | Night visibility |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310104001001008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Eyes-lubricant | Novartis | Viscotears | For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Four-winged metal holder | Neurotar | ||
| Head Holder for Mice | Narishige | SG-4N | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Kwik-Sil | WPI | ||
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microelectrode puller | Narishige | PC-10H | Vertical puller for glass pipette production |
| Micromanipulator | Sensapex | ||
| Mini bolt | Centrostyle | Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5 | |
| Mobile Homecage | Neurotar | ||
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| Nonwoven swabs, 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 1.5 thickness | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
- Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329, 959-964 (2010).
- Sitdikova, G., et al. Isoflurane suppresses early cortical activity. Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2013).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903-912 (2001).
- Piyawattanametha, W., et al. In vivo brain imaging using a portable 2.9 g two-photon microscope based on a microelectromechanical systems scanning mirror. Optics letters. 34, 2309-2311 (2009).
- Sawinski, J., Wallace, D. J., Greenberg, D. S., Grossmann, S., Denk, W., Kerr, J. N. D. Visually evoked activity in cortical cells imaged in freely moving animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19557-19562 (2009).
- Fee, M. S. Active stabilization of electrodes for intracellular recording in awake behaving animals. Neuron. 27, 461-468 (2000).
- Greenberg, D., Houweling, A., Kerr, J. Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats. Nat Neurosci. 11 (7), 749-751 (2008).
- Fujiwara-Tsukamoto, Y., et al. Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents. Journal of Neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).
- Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint. Neuron. 80, 371-384 (2013).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat Neurosci. 13, 1433-1440 (2010).
- Parry, T. J., McElligott, J. G. A method for restraining awake rats using head immobilization. Physiolog & behavior. 53 (5), 1011-1015 (1993).
- Brecht, M., Schneider, M., Sakmann, B., Margrie, T. W. Whisker movements evoked by stimulation of single pyramidal cells in rat motor cortex. Nature. 427 (6976), 704-710 (2004).
- Van Looij, M. A. J., Liem, S. -S., van der Burg, H., van der Wees, J., De Zeeuw, C. I., van Zanten, B. G. A. Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice. Hearing research. 193, 75-82 (2004).
- Hentschke, H., Schwarz, C., Antkowiak, B. Neocortex is the major target of sedative concentrations of volatile anaesthetics: strong depression of firing rates and increase of GABAA receptor-mediated inhibition. The European journal of neuroscience. 21, 93-102 (2005).
- Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv: European journal of physiology. 444, 491-498 (2002).
- Crochet, S., Petersen, C. C. H. Correlating whisker behavior with membrane potential in barrel cortex of awake mice. Nat Neurosci. 9, 608-610 (2006).
- Houweling, A. R., Brecht, M. Behavioural report of single neuron stimulation in somatosensory cortex. Nature. 451, 65-68 (2008).
- Poulet, J. F. A., Petersen, C. C. H. Internal brain state regulates membrane potential synchrony in barrel cortex of behaving mice. Nature. 454, 881-885 (2008).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. Journal of neuroscience methods. 178, 75-79 (2009).
- De Kock, C. P. J., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16446-16450 (2009).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Hentschke, H., Haiss, F., Schwarz, C. Central signals rapidly switch tactile processing in rat barrel cortex during whisker movements. Cerebral cortex. 16, 1142-1156 (2006).
- Stüttgen, M. C., Rüter, J., Schwarz, C. Two psychophysical channels of whisker deflection in rats align with two neuronal classes of primary afferents. J. neuroscience. 26, 7933-7941 (2006).
- Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67, 1048-1061 (2010).
- Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (20), 8473-8478 (2011).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461, 941-946 (2009).
- Chen, G., King, J. A., Burgess, N., O’Keefe, J. How vision and movement combine in the hippocampal place code. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 378-383 (2013).
- Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7392), 62-68 (2012).
- Holtmaat, A., et al. Long-term , high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 19-22 (2009).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Portera-Cailliau, C., Trachtenberg, J. T., de Paola, V., Svoboda, K., Wilbrecht, L., Holtmaat, A. Imaging Neocortical Neurons through a Chronic Cranial Window. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
- Garaschuk, O., Milos, R. -I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1 (1), 380-386 (2006).
- Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. Journal of neuroscience methods. 51 (1), 107-116 (1994).
- Golshani, P., Gonçalves, J. T., Khoshkhoo, S., Mostany, R., Smirnakis, S., Portera-Cailliau, C. Internally mediated developmental desynchronization of neocortical network activity. The Journal of neuroscience. 29 (35), 10890-10899 (2009).
- Polack, P. -O., Friedman, J., Golshani, P. Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex. Nat Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls. Somatosensor., & motor research. 27, 131-148 (2010).
