Summary
אנחנו כאן מתארים כיצד לבצע הקלטות מערך רב-אלקטרודה של רקמת קליפת המוח אפילפסיה אנושית. כריתת אפילפסיה רקמה, הכנת פרוסה ומערך רב-אלקטרודה הקלטות של אירועי interictal וictal הם הפגינו בפירוט.
Abstract
אפילפסיה, המשפיעה על כ -1% מהאוכלוסייה, כוללת קבוצה של הפרעות נוירולוגיות המתאפיינות בהופעה התקופתית של התקפים, אשר מפריעות לתפקוד תקין של מוח. למרות טיפול בתרופות אנטי אפילפטיות זמינות כרגע מיקוד פונקציות עצביות, שליש מהחולים עם אפילפסיה הוא pharmacoresistant. במצב זה, כריתה כירורגית של האזור במוח שהניבו התקפים נשארת הטיפול האלטרנטיבי בלבד. לומד רקמות אפילפטי אנושיות תרם להבנת מנגנוני epileptogenic החדשים במהלך 10 השנים האחרונות. ואכן, רקמות אלה יוצרים פריקות ספונטניות interictal אפילפסיה, כמו גם אירועים ictal מושרה פרמקולוגית שניתן להקליט עם טכניקות אלקטרופיזיולוגיה קלאסיות. למרבה הפלא, מערכים רב-אלקטרודה (MEAs), שהם מכשירי microfabricated הטבעת מערך של microelectrodes מסודר מרחבית, מספקים הזדמנות הייחודית כדי לעורר בו זמנית וpote שדה השיאntials, כמו גם פוטנציאל פעולה של נוירונים מרובים מאזורים השונים של הרקמות. כך הקלטות MEAs מציעות גישה מצוינת ללמוד את דפוסי מרחב ובזמן של interictal הספונטני ואירועים כמו תפיסה עוררת ומנגנונים העומדים בבסיס התפרצות התקף והתפשטות. כאן אנו מתארים כיצד להכין פרוסות קליפת המוח אנושיות מרקמות שעברו כריתה בניתוח, ולהקליט עם אירועי interictal MEAs וכמו ictal-ex vivo.
Introduction
אפילפסיה היא הפרעה כרונית שבו התקפים אפילפטיים, אשר פריקות בדוגמת לסירוגין שנמשכות כמה שניות עד עשרות שניות על הקלטות electroencephalographic (EEG) הקשורים בביטויים קליניים, להפריע מדינת interictal, מאופיינת על ידי הנוכחות של הפרשות עצביות סינכרוני עשרות אלפיות שנייה נמשכות וקרא אירועי interictal 1. האוכלוסייה של כ 1% עולם זה משפיע ואף התקפים נשלטים ברוב המכריע של החולים, כשליש מאנשים עם אפילפסיה לא מראה מענה הולם לתרופות אנטי אפילפטיות 2. במצב זה, הנקרא אפילפסיה pharmacoresistant ומנגנונים שעדיין צריך להיות מזוהים בבירור, הכריתה כירורגית של חלק המסוים של המוח שזוהה כאזור תפיסת הופעה נשארה הטיפול האלטרנטיבי רק נותן תוצאה חיובית לחולים. כך, הדגימות שעברו כריתה מהניתוח להניב opportunity כדי לחקור את המנגנונים של פריקות interictal ודור תפיסה והפצה, כמו גם pharmacoresistance על רקמת עצבים מרכזית אנושית בר-קיימא ex vivo.
רב-אלקטרודה מערכים (MEAs), בהיקף של הסדר של microelectrodes מופצת במרחב, לאפשר גירוי והקלטה בו זמנית של פעילות אלקטרו בכמה אתרים של הרקמה, ובכך לספק גישה מצוינת ללמוד את דפוסי מרחב ובזמן של פעילות ספונטנית ועוררה . טכניקה זו, יושם לראשונה לעקוב אחר השינויים התפתחותיים של פעילות תרבות תאים עצביים 3 ולאחר מכן הותאם למוח חריף וorganotypic ופרוסות חוט השדרה 4 - 6, נחשב לכלי אלקטרו יקר כיום.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להכין פרוסות קליפת המוח אנושיות מרקמות שעברו כריתה בניתוח, ולהקליט עם MEAs vi לשעבר אמיןinterictal VO ואירועים כמו התקף-מהפרוסות האלה. טכניקה זו ובכך מספקת דרך לטיפול במנגנונים העומדים בבסיס פעילות אפילפסיה ייזום, התפשטות והשפעות של תרופות אנטי אפילפטיות בשתי הרמות הסלולריות ורשת. כל הנהלים המשמשים להשגה, להכין, לשמור ולהקליט פרוסות אדם שתוארו כאן בפירוט.
Protocol
הערה: הפרוטוקול שתואר כאן בהתאם ל ההנחיות "Comité Consultatif הלאומי d'Ethique" הצרפתי והוא מוכרז כפעילות איסוף על ידי INSERM.
1. כריתה של רקמות אפילפטיים אדם
- חולים
- להשיג רקמת המוח של חולים הסובלים מאפילפסיה עיקשת. להשיג בכתב הסכמה מדעת לפני הניתוח.
- לכל המופעל על חולי אפילפסיה לבצע בירור presurgical נרחב הכוללים בדיקת נוירולוגית, הערכת נוירו-פסיכולוגית, EEG משטח, והדמייה (MRI ולעתים 18 FDG-PET סריקה; איור 1 א), ואחריו בדיקה היסטולוגית לאחר ניתוח של רקמת resected (איור 1) . הערה: ניתוח מצויינים כאשר החקירות המגוונות למקם באופן דומה לאזור תחילת ההתקף וכאשר התועלת של ההסרה שלה עולה על הסיכונים הניתוחיים.
- ניתוח
- מאיתרופות אנטי אפילפטיות ntain מראש ניתוח. לבצע ניתוח בהרדמה כללית: אינדוקציה עם sevoflurane שאיפה (6% יחס נמסר 100% חלק בשאיפה של O 2), sufentanyl ורידי התוך (0.3 מיקרוגרם / קילוגרם) וantracurium (0.5 מ"ג / קילוגרם), ואחריו תחזוקה עם sufentanyl ורידי התוך (0.5 מיקרוגרם / קילוגרם / שעה) וsevoflurane שאיפה (1 MAC).
- השתמש במערכת neuronavigation לאפשר לוקליזציה מדויקת של קליפת lesioned (איור 1 ג '). לאחר חתך בעור, לבצע חור בר בעצמות ואחרי פתיחת גולגולת עם מקדח לשפוך גבוה. בעדינות להעלות את דש העצם, ולפתוח את הדורה עם מספריים (1D איור).
- השתמש באולטרה סאונד תוך-ניתוחי כדי להקל על זיהוי של קליפת המוח נורמלי, ומכשירי מייקרו וaspirator קולי תחת מיקרוסקופ.
- להקריש ולחתוך את מטוס Pio-arachnoidal בהתאם למגבלות sulcal. השתמש בנתיחת subpial לימיןelease הקליפה מפיא מסביב לאזור lesioned.
- חותך את החומר הלבן מתחת לקליפת המוח נורמלי לבצע חתיכה אחת "כמקשה אחת" כריתה, חוסך ככל האפשר בכלי הדם. הימנע ממניפולציה טראומטית של קליפת המוח.
- לחתוך פרוסה בעובי 1 סנטימטר מרקמת resected לאורך מאונך לכיוון אל פני השטח pial, כולל תחתית מענית ומעבר קליפת המוח.
2. נוזל המוח והשדרה המלאכותי (ACSF) לSlice הכנה, דגירה והקלטה
- ACSF להכנת פרוסה
- הכן 1 ליטר של ACSF מבוסס סוכרוז 7,8, המכיל (במ"מ): 250 סוכרוז, 3 KCl, 25 NaHCO 3, 10 D-גלוקוז, 1 CaCl 2, 10 MgCl 2; לפזר מלחים האלו במים ללא יוני חמצן על הפתרון עם carbogen לפחות 10 דקות.
- שים ~ 700 מיליליטר של ACSF סוכרוז ב -80 מעלות צלזיוס במשך 50-60 דקות (או -150 מעלות צלזיוס במשך 15-20 דקות). לשמור את שארפתרון תחת חמצון בקרח. הערה: ACSF להכנת פרוסה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס; במקרה זה, להוסיף CaCl 2 וMgCl 2 היום של הניסוי, לפני קירורו.
- ACSF לדגירה פרוסה והקלטה
- להכין לפחות 3 L של ACSF ההקלטה 7,8, המכיל (במ"מ): 124 NaCl, KCl 3, 26 NaHCO 3, 10 D-גלוקוז, 1.6 CaCl 2, 1.3 MgCl 2; לפזר מלחים האלו במים ללא יוני חמצן על הפתרון עם carbogen. לפני הוספת MgCl 2, לשמור על כמה ACSF לבצע הקלטות ב0 ACSF Mg 2 +. הערה: ACSF דגירה / ההקלטה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס; במקרה זה, להוסיף CaCl 2 וMgCl 2 היום של הניסוי.
3. ציוד לSlice דגירה והקלטה
- קאמרי ממשק לדגירה פרוסה
- השתמש קאמרי פרוסת המוח כדי לשמור על החיים פרוסות ex vivo </ Em> במצב ממשק. הערה: התא מורכב מחלק תחתון, המכיל את החימום ואלמנטים החיישן וbubbler קרמיקה, והוא מלא במים מזוקקים, וחלק עליון, שבו פרוסות לנוח על גיליון של רקמת עדשה באזור השטוח ב מרכז החדר (איור 2 א - ב).
- השתמש בשני צינורות נפרדים בסדר PTFE, שדרכו ACSF preoxygenated נכנס לתא. הערה: צינורות ספירלה במים מחוממים ולהגיע לחלק העליון של החדר; אז הפתרון יוצא באמצעות פעולת נימים עם רקמות עדשה, שמעבירה את הפתרון לתוך בארות יציאה.
- חבר את צינורות PTFE של חדר הממשק למשאבת peristaltic, כדי לאפשר זלוף הרציף של פרוסות עם מדיום preoxygenated.
- לשמור על מתח החמצן הגבוה על ידי חמצון עם carbogen (95% O 2, 5% CO 2) דרך bubbler הקרמיקה. הערה: תערובת גז שחוממה והרטיבה זה מגיעהפרוסות בחלק העליון של החדר דרך חורים מתאימים.
- לשמור על הטמפרטורה בחלק העליון של החדר על ידי חיבור התא לבקר טמפרטורה, באמצעות כבל שהסתיימו כפול מיוחד, שיש מחבר לאלמנט תא החימום וחיישן טמפרטורה חיצוני בקצה אחד. הנח את החיישן ליד הפרוסות כדי לבדוק את הטמפרטורה בכל הדגירה (איור 2 ג).
- הקלטות מערך רב-אלקטרודה
- השתמש במערכים רב-אלקטרודה מישוריים עם 120 אלקטרודות ניטריד טיטניום (30 מיקרומטר קוטר) מבודדים עם סיליקון ניטריד ואלקטרודת ייחוס פנימי, מסודרות במטריצת 12 x 12 עם 200 מיקרומטר מרווח מרכז למרכז. הערה: תצורות אחרות עם קוטר אלקטרודה שונה וריווח אפשריות. בפרט, שבב MEA ניתן להרחיב לדגום פרוסות גדולות יותר של רקמות אנושיות.
- לרכוש אותות חשמליים ב -10 kHz באמצעות מערכת MEA2100-120 (לפני ובדיונימגבר לניטור ארוך טווח עם רכישת נתונים משולבת וממיר אנלוגי-דיגיטלי, רזולוציה נתונים 16 ביט, טווח מתח כניסה ורוחב פס להתאמה באמצעות תוכנה) באמצעות תוכנה ייעודית (MC_Rack). הערה: headstage MEA2100 ניחן של לוחית מתכת לתיקון אלמנט זלוף heatable באמצעות בעלים מגנטיים, לתנקב ברציפות פרוסות לאורך כל פגישת ההקלטה.
- החזק את הרקמה על MEA על ידי עוגן קטן תוצרת בית פלטינה, אשר מבטיח צימוד חשמלי טוב בין פרוסה ואלקטרודות.
4. הכנת ממשק הקאמרית וכלים לניתוח וחיתוך
- קאמרי ממשק
- מלא את חלקו התחתון של חדר הממשק עם מים מזוקקים. ודא שמפלס מים טובלים לחלוטין גוף החימום והוא 2 עד 4 מ"מ מתחת לצומת בין החלק התחתון והעליון של החדר. בדוק רמה זו ביום לפני המעבר על החימום,על מנת להימנע מניזק של גוף החימום.
- חבר את התא למקור carbogen, ניחן בזרימת וסת משנית להתאמות קנס של לחץ גז.
- לחתוך פיסה של אריג עדשה כדי שיתאימו לשטח השטוח של החדר הפרוסה, ומקם אותו קרוב לצינורות פתרון קלט, כדי לאפשר לכל בריחת בועה משורת הקלט לפני שהגיע לפרוסות.
- חותך שתי חתיכות של חוט כותנה תקוע כל עוד פיסת רקמת עדשה, ולמקם אותם בצדי הראשיים באזור השטוח של החדר. הערה: זה עוזר להעלות את רמת פתרון זלוף בתא מעט.
- הגדר את קצב הזרימה של משאבת peristaltic ב 1 מיליליטר / דקה ולהפעיל את המשאבה.
- התחל חמצון של המים בחלק התחתון של החדר.
- הגדר את הטמפרטורה של בקר הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס ולהפעיל אותו. מכסה את החלק העליון של חדר הממשק עם חתיכת parafilm ולהמתין לפחות 30 דקות לטמפרטורותיור להגדיל ולייצב.
- כלים לניתוח וחיתוך
- הכן ערכה לנתיחה בהיקף של שני מלקחיים בסדר, מרית, כפית קטנה ולהב; שני כלים מזכוכית פטרי, שתי מברשות כמו גם דבק cyanoacrylate.
- הגדר את הפרמטרים של vibratome: העובי, 400 מיקרומטר; תדירות, 70-90 הרץ; משרעת, 0.9-1 מ"מ, מהירות: 0.1 מ"מ / שנייה.
5. אדם בקליפת מוח Slice הכנה
- הסר את ACSF מבוסס סוכרוז ממקפיא -80 מעלות צלזיוס ולערבב אותו על מנת לקבל סוג של רפש. חמצן אותו עם carbogen, לשים ~ 250 מיליליטר בבקבוק זכוכית ולשמור אותו בבקבוק דיואר מלא קרח, תוך כדי ללכת לניתוח החדר של בית החולים כדי לקבל את הרקמה. בינתיים, לשמור את שאר ב -20 מעלות צלזיוס.
הערה: במהלך הניתוח, מנתח המוח מנתח גוש קטן של רקמת קליפת המוח. מייד מניח את המדגם בACSF סוכרוז קר כקרח להעברה למעבדה. - שמור את הזמן הדרוש להעברה מבית החולים למעבדה למקסימום של 30 דקות. במעבדה, לקחת ACSF מחומצן מבוסס סוכרוז ממקפיא -20 מעלות צלזיוס, מערבב אותו יש רפש, למלא צלחת פטרי ומגש חיץ vibratome ולהתחיל מחמצנים גם עם carbogen. לקחת בזהירות את פיסת הרקמה אנושית מהבקבוק עם כפית והניח אותו בצלחת פטרי (איור 2 ד).
- שימוש במלקחיים, להסיר בזהירות קרישי דם, כלי דם וקרומי מוח, כדי למנוע התנגדות במהלך חיתוך. הסר את קרומי המוח, מורכב בפיא-עניין, החל מהצדדים של בלוק הרקמה, לשים לב שלא לפגוע במשטח קליפת המוח. עם להב, לחתוך בצד של הרקמות כדי לקבל משטח שטוח, אשר מודבקות על צלחת דגימת vibratome. הערה: קרומי המוח, המורכב בפיא-עניין, יוסרו החל מהצדדים של בלוק הרקמה, לשים לב שלא לפגוע במשטח קליפת המוח.
- אם הבלוק של tissue גדול יותר מתא MEA, לחתוך חתיכה של מידות מתאימות לפני הדבקתו בצלחת הדגימה (2E איור).
- דבק הרקמות על מנת לקבל פרוסות בקליפת המוח רוחבית, לשים אותו במגש החיץ ולחתוך 400 מיקרומטר פרוסות עבות במהירות נמוכה (0.1 מ"מ / שנייה) (איור 2F).
- לחתוך לחתיכות של רקמת עדשה עם ממדי פרוסה; עם מרית ומברשת, להעביר את הפרוסות על רקמות עדשה אלה דגירה אותם בתא הממשק על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1 לפני תחילת הקלטות (איור 2G - I). ברציפות לאחסן את הפרוסות באותם תנאים עד לשימוש. הערה: הצבת פרוסות על נייר עדשה היא צעד חשוב כדי להקל על שני זלוף של צד התחתון של פרוסות והסרת של פרוסות מחדר הממשק לפני ההקלטה.
- בעת העברת פרוסות על רקמת העדשה, לנהל אותם בזהירות רבה, הימנעות לגעת אזור השכבה של קליפת המוח עםהמברשת.
- הכן את הפרוסות אחד בכל פעם, ומייד להעביר כל אחד מהם לתא הממשק, על מנת להבטיח אספקת חמצן נאותה וטמפרטורה; פורס את הגוש של רקמת resected מהר ככל האפשר.
6. הכנת תוכנית ההתקנה MEA להקלטות
- חבר את מערכת זלוף למערכת MEA משאבת peristaltic ולמחשב. חמצן ACSF ההקלטה. הנח שבב MEA ריק בתוך המגבר.
- הגדר את בקר הטמפרטורה לאלמנט צינורית חימום להגיע 37 מעלות צלזיוס בתא MEA ולהתחיל זלוף ב5-6 מיליליטר / דקה. הערה: זה בדרך כלל צורך להגדיר את הטמפרטורה 3-4 מעלות צלזיוס מעל אחד רצוי, בהתאם לטמפרטורת החדר ואת קצב הזרימה.
- בדוק את הטמפרטורה בתא MEA עם מדחום בסדר, הצבתו הקרובה ביותר אפשרית למרכז, בלי לגעת באזור האלקטרודה.
- התחלת הקלטת softwarדואר ולבדוק שכל האלקטרודות MEA מחוברות היטב ושאין רעש בשל זלוף.
- התחל MEA_Monitor כדי לבדוק את תפקודו של שולחן המצלמה.
7. העברת Slice מממשק הלשכה לשבב MEA להקלטה
- יוצק מעט חימם הקלטת ACSF בצלחת פטרי מזכוכית; עם מלקחיים, לקחת פרוסה מתא הממשק, על ידי גרירתו באמצעות רקמת העדשה, ושם אותו בצלחת פטרי. לנתק בזהירות את הפרוסה מהרקמות. אם הרמה של הפתרון בתא הממשק מותאם בזהירות בזמן דגירה, הפרוסה להתנתק מרקמת העדשה רק על ידי והשקעת אותה בפתרון; אחרת, להשתמש במברשת קטנה כדי להקל על הניתוק.
- מלא שבב MEA עם כמה ACSF ועם מרית, להעביר את הפרוסה לתוכו. עם טפטפת פסטר מפלסטיק, בעדינות להסיר את הפתרון כדי להפוך את הפרוסה לדבוק באזור האלקטרודה ולשמור אותו במקום עם ANCH פלטינהאו. הוסף 1 מיליליטר של ACSF הקלטה, למקם את שבב MEA לתוך המגבר ולהתחיל זלוף ב5-6 מיליליטר / דקה (איור 'י 2 - L).
- בדוק את המצב הפרוסה באזור MEA ההקלטה באמצעות MEA_Monitor, להתאים אותו במידת צורך על מנת לרשום מהשכבות בקליפת המוח ולצלם תמונה. התחלת ההקלטה.
Representative Results
ההקלטה של פעילות פרוסה בקליפת המוח אנושית מתחילה בזמן מרוסס הרקמה עם ACSF הקלטה הרגיל (כפי שתואר לעיל) 7,8. במצב זה, כאשר הרקמה נשמרה היטב במהלך ניתוח ובהמשך במהלך העברת רקמות מהכנת בית החולים ופרוסה, ניתן לראות פעילות ספונטנית, בצורה של אירועים כמו interictal-קטנים, שאותרו מקבוצות קטנות של אלקטרודות MEA. הפרשות כמו Interictal-כלל בפוטנציאל שדה, בדרך כלל פאזית, כוללת סטייה שלילית חדה ראשונית, להגיע לעשרות מייקרו-וולטים, ואחריו גל השני כבר נמשך כמה עשרות אלפיות השניה. פעילויות רבות יחידה מהירה בדרך כלל מוטבעות בפוטנציאל השדה בעיקר בחלק הראשון. דוגמא מייצגת של פעילות כמו interictal-מתוארת באיור 3Aii, שבו זכר שנרשם על ידי אלקטרודה MEA מוצג.
כדי להקליט התקפים אפילפטיים במבחנה פרוסות קליפת המוח אנושית, יש צורך תנקב אותם עם ACSF "epileptogenic", שבו Mg 2 + נעדר וK + עולה עד 6 מ"מ, כדי להגביר את רגישות רקמות 1 (הגידול של K + 3-6 מ"מ הוא לבד לא מספיק כדי לגרום להתקפים; מידע לא מוצג). ברגע שזלוף עם 0 Mg 2 + 6 מ"מ K + ACSF החל, הפעילות של פרוסות קליפת המוח מגדילה בהדרגה וההתקף הראשון מופיע בתוך 15-20 דקות (15.4 ± 1.7 דקות, n = 10, מ -5 חולים; איור 3 Ai ). אנחנו עוררתי פעילות כמו ictal-, כפי שמוצג באיור 3, ב -75% מהחולים שנבדקו וב66.7% מכלל פרוסות נרשמו.
פעילויות אפילפסיה נרשמות מאלקטרודות סמוכות של שבב MEA, והשוואה של דינמיקת תחילת אירועי פוטנציאל בתחום, מאפשרת לחקור את האתר שלהם בספר בראשית והתפשטות. תפיסת נציג שנרשמה מפרוסת הזמזוםקליפת מוח עם מערכת MEA מוצגת באיור 3 ב (עקבות נציג של תפיסה נרשמה על ידי אלקטרודה MEA אחת מוצג ברזולוציה זמנית גבוהה יותר באיור 3 Aiii). שים לב כי התפיסה נרשמה כמעט מכל האלקטרודות של שבב MEA, ובכך מצביעה על כך שהוא מסוגל להפיץ לאזור בקליפת המוח גדול. יתר על כן, מסתכלים על העקבות היחידה שנרשמו מכל אלקטרודה, ניתן לצפות בהתקדמות ההדרגתית של התפיסה על פני הרקמה: אכן, זה מתחיל ראשון באזור בקליפת המוח המכסה את המחצית הימנית של מערך אלקטרודות, וזה מתפשט בהדרגה ל האזור כיסה את הצד השמאלי (.. אני דואר, להשוות עקבות מL6 אלקטרודה וB6; איור 3 ב).
איור 1: דיספלזיה קליפת המוח. ד הסרה כירורגית שלה דיספלזיה סוג טיילור מוקד בקליפת המוח (חץ לבן) משובצת במענית אונה הפרונטלית שמאלית היא מדמיין על MRI לפני הניתוח (), ולאחר מכן אושר על ידי תיוג קינאז בדיקה היסטולוגית MAP (ב); סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר) מראה dyslamination קליפת המוח, תאי עצב נורמלים ומסלול על נוירונים עם הגירה בלתי שלמה בחומר הלבן הנמוך. במהלך ניתוח, דיספלזיה היא מקומית על פי נתוני MRI עם מערכת neuronavigation (C). ויזואליזציה של gyrus המכיל דיספלזיה במהלך ניתוח (ד ').
איור 2:. ציוד והליך להכנת פרוסה של קליפת המוח אנושית קאמרי ממשק משמש כדי לשמור על פרוסות קליפת המוח אנושיות ex vivo (); שאר פרוסות על גיליון של רקמת עדשה באזור השטוח בחלקו העליון של החדר (ב '), שבו חיישן טמפרטורה (C, משמאל), מחובר לבקר טמפרטורה (C, ימינה, למעלה) דרך כפול כבל הסתיימה (C, ימינה, מטה), ממוקם לשמור על 37 מעלות צלזיוס לאורך זמן דגירה פרוסה. ברגע שהושג, את הגוש שעבר כריתה של רקמה בצלחת פטרי מלאה בקרח קר ACSF מבוסס סוכרוז (D) ולהסיר קרישי דם, כלי דם וקרומי מוח, כדי להקל על החיתוך. אם גוש הרקמה גדול יותר מתאי MEA, לבודד פיסת המידות מתאימות עם להב (E) ולהדביק אותו בצלחת דגימת vibratome (F). חותך 400 מיקרומטר פרוסות עבות ובעזרת מרית (G) להעביר אותם על פיסות רקמת עדשה (H) ומדגיר אותן בתא הממשק (I). לפני הקלטה, רמוve רקמת העדשה על ידי השריית הפרוסה בצלחת פטרי המלא בACSF ולהעביר אותו לשבב MEA ACSF המלא במרית (J). הסר את הפתרון שיניח את הפרוסה לדבוק בMEA (K) ולשמור אותו במצב על ידי שימוש בעוגן פלטינה. הנח את MEA במגבר (L), להתחיל זלוף והקלטה.
איור 3: הקלטות MEA של התקפים אפילפטיים בפרוסות בקליפת המוח אנושיות () עקבות נציג של פעילות פרוסה בקליפת המוח אנושית שתועדה על ידי אלקטרודה MEA מוצגת בלוח i.. בנוכחות של ACSF הרגיל, ניתן לצפות בפעולות כמו interictal-ספונטניות (מלבן אפור קטן, הגדלה בלוח ii); אז,, seizu הראשון כאשר זלוף עם 0 Mg 2 + 6 מ"מ K + ACSF החלמחדש מופיע באיחור דקות ~ 15 ואחריו אירועים אחרים ב2-3 מרווח דקות. מושב שלישי מציג את התפיסה במלבן האפור הגדול בלוח קלט עם קנה מידה מוגדלת. העקבות הכחולות ממחישות זום של הפעילות, כפי שעולים מהקו והחץ הכחולים. לוח iv) מציג את הנתונים שמודגם בפנל iii) גבוה לעבור סינון ב 250 הרץ, המגלים פעילות יחידות רבת כאשר תצוגה מוקטנת (זכר כחול). (הקלטת נציג של תפיסה בנוכחות של 0 Mg 2 + 6 מ"מ K B) + ACSF מכל אלקטרודות MEA. כל ריבוע מייצג אלקטרודה של מערך MEA 12 x 12 ומראה חלון זמן 80 שניות; הקו המקווקו מציין את המיקום של פני השטח של קליפת המוח יחסית למערך MEA.
Discussion
אפילפסיה Pharmacoresistant היא מצב נדיר, שניתן לחקור ברקמה אנושית במבחנה. זה מאפשר לימוד אפילפסיה קליפת אדם, המציגה את פגמים ספציפיים שהועתקו באופן חלקי בלבד במודלים של בעלי חיים. השיטה שתוארה כאן מאפשרת הכנה והקלטת רקמות לאחר ניתוח אנושיים vivo לשעבר עם כדאיות סלולרית השתמרה ורשתות, כך שהם באופן ספונטני לייצר פעילויות אפילפטי. שמירה על פעילויות דומות מאלו שנרשמו בvivo היא חיונית כדי ללמוד מנגנונים של ראשיתה של פעילות פתולוגית. יתר על כן, שיטות אלה מאפשרות לחקור רקמות אדם ולהימנע ממודלים של בעלי חיים מושלמים שאינם של המחלה. עם זאת, לומד רקמה אנושית דורש סנכרון בין נוירוכירורגים ומעבדת הניסויים. תחבורה רקמה דורשת טיפול ספציפי לא להיות טראומטי. בנוסף, הן בכמות של דגימה והרקמות היא מוגבלת. לבסוף, גישה לרקמות בקרה נאותות הוא maiהדאגה n. עם הכנה זו, הרקמות לאחר הניתוח באופן ספונטני לייצר הפרשות כמו interictal-בACSF הנורמלי 7,8. יכולים גם להיות שהושרו על אירועים כמו Ictal-בACSF שונה, proconvulsive כדי שניתן יהיו לחקור את המנגנונים של חניכת תפיסה והמעבר ממדינת interictal להתקפים.
רקמה אנושית יכולה להישמר קיימא עבור עד 10 שעות בתנאי ממשק. פרוסות היו נחשבות כבר קיימא כאשר פוטנציאל פעילות או שדה יחידה רב נצפו באופן ספונטני וכאשר מעשים כאלה עוררו על ידי הגדלת רגישות דרך עליות אשלגן תאית ו / או ירידת מגנזיום. למרות שונות בפעילות מתרחשת, סביר להניח משקפות הבדלים בפתולוגיות ואזורים בקליפת המוח, בדקנו מאפייני epileptogenic של רקמה רק בפרוסות בריאים מראים interictal הספונטני ועוררנו פריקות ictal. על מנת לשמור על חיוניות ופעילות רקמה, תא ממשק לא משמש לאחסוןהוא חותך בC ° 36-37 להתאוששות לפני ההקלטה עם מערכת MEA. ואכן, מספר קבוצות הראו בבירור את היתרונות של מערכת אחסון מבוססת ממשק בהשוואה לאחסון כוס סטנדרטי ואת החשיבות של טמפרטורה לשימור פעילות רשת, כגון גל-גלים חדים ספונטניים או תנודות הנגרמת כולינרגית 9,10. אחסון ממשק של פרוסות כבר השתמש בעבר כדי לתעד את הפעילות אפילפטית מהיפוקמפוס אדם ופרוסות subicular 1,11. בעזרת טכניקת MEA הנוכחית, לאחר תקופת ההחלמה מחיתוך בתנאי ממשק, פעילות הרשת נרשמת בתנאים מתחת למים, בנוכחותו של קצב זרימה גבוה (5-6 מיליליטר / דקה) על 37 מעלות צלזיוס, עם מערכת MEA. הקוטר המופחת (1.8 סנטימטרים) של שבב MEA, התוחם חדר קטן נפח (<1.5 מיליליטר), יחד עם קצב הזרימה המוגבר, משפר את אספקת חמצן של הפרוסה, שהוכח כגורם קריטי לספונטני וPHArmacologically-induced פעילויות רשת 9,10. יתר על כן, הכמות המופחתת של ACSF במחזור מאפשרת בדיקות פרמקולוגיות.
הליך החיתוך עם זאת traumatism לרקמות 12. מופיעים גם בארכיטקטורה עצבית והומאוסטזיס כלוריד להיות מוטרדות על פני השטח הרקמה (50 מיקרומטר). מקורו של הפעילויות שנרשמו על ידי שבבי MEA, שמדגם הרקמות בעיקר שטחית ללא חדירה עמוקה, יכולות לנבוע מאזורים בטראומה. עם זאת, הנתונים שלנו מראים כי הפוטנציאל בתחום תאי זוהה באופן מקומי נרשמים ברוב אלקטרודות MEA ותכנית עבודה קודמת שהם משולבים על 100-200 מרחק מיקרומטר מרישום האתר 13, המצביעים על כך ההתקפים נרשמו בהכנה שלנו צפויים להיות המיוצר על ידי אזורים בטראומה. יתר על כן, במחקרים שבוצעו עם אלקטרודות טונגסטן המאפשרת חדיר עמוק, פעילויות אפילפסיה נרשמו ברקמות אנושיות הן דומותלאלה שנצפו בחולי אפילפסיה 1,7,8.
מגבלה נוספת של ex vivo הקלטת רקמה היא השיבוש של הקשרים בין אזורי המוח השונים, ובכך מגביל את neuromodulations הדינמי. זה עשוי להסביר מדוע ברקמה כגון שום מקרה לא כמו ictal-הוא הוקלט באופן ספונטני, אך דורש להיות מופעל על ידי מניפולציה יונית או רגישות גירוי שיפור תרופתית. בהתאם לכך, בפרוטוקול זה, אירועים כמו התקף-מושרים על ידי שילוב של שינוי בK תאי + 3-6 מ"מ והפחתה של Mg 2 + החיצוני מ -1.3 מ"מ ועד Mg 2 + ACSF -חינם, על מנת להגביר את רגישות רקמות ולהסיר Mg לחסום קולטן ה- NMDA + התלוי 2 +. ואכן, זה כבר בעבר הוכיח כי פעילות epileptiform מושרה בפרוסות neocortical והיפוקמפוס אנושיות באמצעות Mg 2 + ACSF -חינם דומה התקפי electrographic נרשמו in vivo 14. חוץ מזה,הוכח כי פריקות epileptiform שהתקבלו בפרוסות אונה הטמפורלית הופכות עמידות לתרופות הנוגדות פרכוסים בשימוש קליני לאחר חשיפה ממושכת לMg 2 + ACSF -חינם 15,16, ובכך לספק מודל לחקירת אירועים כמו התקף-pharmacoresistant במבחנה.
MEAs לאפשר הקלטה של שניהם, פוטנציאל בתחום ופעילות רב-יחידה המורכבת בפוטנציאל פעולה עצבי ex vivo. כך, MEAs הוא כלי רב עוצמה אלקטרו בהשוואה לתרשים אק"ג, אשר לחקור פוטנציאלים בתחום שנוצרו על ידי פעילות סינכרוני של הרכבים עצביים in vivo, אבל לא נותן לי גישה לתא עצב אחד התנהגויות 17. למרות שיותר microelectrodes האחרונה יכולה להקליט את פעילות יחידות רבות in vivo המורכב בפוטנציאל פעולה עצבי, שהם פולשנית, ולכן השימוש בם הוא בעיקר מוגבל למטרת מחקר במהלך הקלטות תוך גולגולתי. בפרט, הקלטות MEAs מייצגות טכניקה של בחירהללמוד את דפוסי מרחב ובזמן של אירועים אפילפטיים, מנגנוני שליטה תחילת התקף והתפשטות והפעולה של תרופות אנטי אפילפטיות קלאסיות וחדשים. למרבה הפלא, לפענח את סוגי התאים ובסיס האיתות של פריקות אפילפסיה, ספייק טכניקות מיון ובדיקה תרופתית צריכה להיות משולבת עם טכניקות MEA. למרות MEAs יכול לתת גישה לקוצים בודדים, הם אינם מספקים מידע על נכסים הסינפטי וbiophysical. בעתיד, צריכים להיות בשילוב טכניקות אחרות להקלטות MEA כדי מדגם התנהגות טובה יותר סלולרית, פעילויות רשת ואיתות הסינפטי. לדוגמא, דימות פלואורסצנטי לפענח נוירונים או התנהגות תאי גלייה, כמו גם דינמיקת יון, עשוי להיות משולבת עם הקלטות MEAs. פוסט הוק ניתוח היסטולוגית נוסף יכול גם לחשוף את השינויים ספציפיים של תאי סוגים, חלבונים או קולטנים כך שהמיקום של פעילויות אפילפסיה יכול להיות מתואם עם שחלופים ספציפיים שלמבנה עצבים. מערכת MEAs גם יכולה להיות מוטבעת בהגדרת תיקון- clamp לתאם תאים או conductances יחידים עם פעילויות אוכלוסייה. בעתיד, יוכלו גם להשתמש בכלי optogenetic, ובלבד שיכולות להיות מתורבת פרוסות אנושיות בטווח הארוך, כפי שבוצעו לפרוסות organotypic, כך ניתן לבצע שtransfection או זיהום של סוגי תאים ספציפיים.
Disclosures
חסות על ידי מערכות רבות-ערוצים סופקה לייצור פרסום וידאו וגישה פתוחה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מANR (תכנית בלאן Neurosciences), FRC (פדרצית pour la משוכלל ונדיר sur le Cerveau), העיר של פריז (הופעת Programme), INSERM וLa Pitié סלפטרייר בית חולים (חוזה מחקר Translational) לע"נ, מNeuropôle דה משוכלל ונדיר Francilien (nerf) לED, מהאוניברסיטה לפירית et מארי קירי UPMC (תכנית ההתכנסות) ומInstitut du Cerveau et e la Moelle epiniere (פריז) לGH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Slice Chamber-2: Interface | AutoMate Scientific, Inc. | S-BSC2 | It requires separate temperature controller |
| 2-channel Temperature Controller | Multichannel Systems, Germany | TC02 | It allows to plug in and use 2 interface chambers. |
| Special cable for connection of TC01 to S-BSC2 with external reference PT100 | Multichannel Systems, Germany | CA3 | The reference PT100 is placed near the slices |
| 6pin plug-connector with PT100 | Multichannel Systems, Germany | TS-PT100 | External reference for CA3 cable |
| MEA workstation for recording data from 120-electrode MEAs | Multichannel Systems, Germany | MEA2100-120 | It includes MEA2100-120 headstage and MEA2100 interface board. www.multichannelsystems.com |
| Microelectrode array for MEA2100-120 | Multichannel Systems, Germany | 120MEA200/30 | Electrode spacing: 200 µm; electrode diameter: 30 µm; glass ring: 6 mm high. Different configurations (spacing, diameter, ring) possible. |
| Video Microscope Table | Multichannel Systems, Germany | MEA-VMT-1 | Table with a video microscope underneath to image the electrode field of the MEAs in an amplifier placed on top of the table and transfer the image to a computer. |
| Perfusion cannula | Multichannel Systems, Germany | PH01 | Heatable perfusion cannula with temperature sensor; temperature can be programmed with TC02 controller |
| MC_Rack | Multichannel Systems, Germany | Software for data acquisition and recordings | |
| Magnetic Perfusion Holder | Multichannel Systems, Germany | MPH | Magnetic perfusion holder for PH01 element to fix the perfusion cannula and connect the perfusion system to the amplifier's ground |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | Software for data analysis; info@neuroexplorer.com | |
| Peristaltic pump (drive unit) | Gilson | F155001 | 0,01 to 48 rp |
| Peristaltic pump (pump head) | Gilson | F117800 | R2 two channel |
| Ultrasonic aspirator | Integra Life sciences, USA | Cusa Excel + | It allows blunt subpial dissection of the cortex |
| Neuronavigation | Isis Solutions, France | Surgiscope | It allows real time identification of the brain structure on the preoperative MRI |
| Vibratome HM 650 V | Microm | Block slicing into 400 μm thick slices |
References
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).
- Kwan, P., Brodie, M. J. Early identification of refractory epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
- Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Longterm stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multielectrode arrays. Neuroscience Letters. 361 (1-3), 86-89 (2004).
- Sun, J. -J., Luhmann, H. J. Spatio-temporal dynamics of oscillatory network activity in the neonatal mouse cerebral cortex: Network oscillations in neonatal cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1995-2004 (2007).
- Dossi, E., et al. Functional Regeneration of the ex-vivo Reconstructed Mesocorticolimbic Dopaminergic System. Cerebral cortex. 23 (12), New York, N.Y. 2905-2922 (1991).
- Darbon, P., Scicluna, L., Tscherter, A., Streit, J. Mechanisms controlling bursting activity induced by disinhibition in spinal cord networks. The European journal of neuroscience. 15 (4), 671-683 (2002).
- Cohen, I., et al. On the Origin of Interictal Activity in Human Temporal Lobe Epilepsy in Vitro. Science. 298 (5597), 1418-1421 (1126).
- Huberfeld, G., et al. Perturbed chloride homeostasis and GABAergic signaling in human temporal lobe epilepsy. The Journal of neuroscience. 27 (37), 9866-9873 (2007).
- Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An Approach for Reliably Investigating Hippocampal Sharp Wave-Ripples In Vitro. PLoS ONE. 4 (9), (2009).
- Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29 (2), 319-327 (2009).
- Wittner, L., et al. The epileptic human hippocampal cornu ammonis 2 region generates spontaneous interictal-like activity in vitro. Brain. 132 (11), 3032-3046 (2009).
- Dzhala, V., Valeeva, G., Glykys, J., Khazipov, R., Staley, K. Traumatic alterations in GABA signaling disrupt hippocampal network activity in the developing brain. The Journal of neuroscience. 32 (12), 4017-4031 (2012).
- Menendezdela de la Prida, L., Huberfeld, G., Cohen, I., Miles, R. Threshold Behavior in the Initiation of Hippocampal Population Bursts. Neuron. 49 (1), 131-142 (2006).
- Avoli, M., Drapeau, C., Louvel, J., Pumain, R., Olivier, A., Villemure, J. -G. Epileptiform activity induced by low extracellular magnesium in the human cortex maintained in vitro. Annals of neurology. 30 (4), 589-596 (1991).
- Heinemann, U., Dreier, J., Leschinger, A., Stabel, J., Draguhn, A., Zhang, C. Effects of anticonvulsant drugs on hippocampal neurons. Hippocampus. 4 (3), 291-296 (1994).
- Li Zhang, C., Dreier, J. P., Heinemann, U. Paroxysmal epileptiform discharges in temporal lobe slices after prolonged exposure to low magnesium are resistant to clinically used anticonvulsants. Epilepsy research. 20 (2), 105-111 (1995).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents - EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
