Multi-elektrodeformation Optagelser af menneskelige Epileptiske Postoperativ cortexvæv

Summary

Vi her beskriver, hvordan man udfører multi-elektrode-array optagelser af human epileptiske cortexvæv. Epileptisk væv resektion skive forberedelse og multi-elektrode-array optagelser af interictal og iktal begivenheder demonstreret i detaljer.

Abstract

Epilepsi, der påvirker omkring 1% af befolkningen, består af en gruppe af neurologiske sygdomme kendetegnet ved periodisk forekomst af anfald, som forstyrrer normal hjernefunktion. Trods behandling med tiden tilgængelige antiepileptika rettet neuronale funktioner, en tredjedel af patienter med epilepsi er pharmacoresistant. I denne tilstand, kirurgisk resektion af hjernen område genererer anfald er det eneste alternativ behandling. Studere humane epileptiske væv har bidraget til at forstå nye krampefremkaldende mekanismer i løbet af de sidste 10 år. Faktisk er disse væv generere spontane interictal epileptiske udladninger samt farmakologisk induceret iktal begivenheder, der kan optages med klassiske elektrofysiologi teknikker. Bemærkelsesværdigt, multi-elektrode arrays (MEA), som er mikrofabrikerede enheder indlejring en vifte af rumligt arrangeret mikroelektroder, giver en enestående mulighed for samtidig at stimulere og registrere felt potentials samt virkningspotentialer af flere neuroner fra forskellige områder af væv. Således MEA optagelser tilbyder en fremragende metode til at studere de spatio-temporale mønstre af spontan interictal og fremkaldes beslaglæggelse-lignende begivenheder og de mekanismer, der ligger til grund beslaglæggelse debut og formering. Her beskriver vi, hvordan du forbereder de menneskelige kortikale skiver fra kirurgisk reseceret væv og til at optage med multilaterale miljøaftaler interictal og iktal-lignende hændelser ex vivo.

Introduction

Epilepsi er en kronisk lidelse, hvor epileptiske anfald, som intermitterende mønstrede udledninger varer flere sekunder til tiere af sekunder elektroencefalografiske (EEG) optagelser, der er forbundet med kliniske manifestationer, afbryde en interictal tilstand, kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​synkrone neuronale udledninger varige snese millisekunder og kaldte interictal begivenheder ^1. Det påvirker cirka 1% af verdens befolkning, og selvom anfald kontrolleres hos størstedelen af patienterne, må cirka en tredjedel af personer med epilepsi ikke vise passende svar på antiepileptika ^2. I denne tilstand, der kaldes pharmacoresistant epilepsi og hvis mekanismer stadig skal være klart identificeret, kirurgisk resektion af den specifikke del af hjernen identificeret som beslaglæggelse debuterende zone forbliver det eneste alternativ behandling, som giver et positivt resultat for patienterne. Således resekterede prøver fra kirurgi opnåelse af opporlejlighed til at studere de mekanismer interictal udledninger og beslaglæggelse generering og udbredelse samt pharmacoresistance på levedygtige menneskelige centralnervesystem væv ex vivo.

Multi-elektrode arrays (MEA), som består af et arrangement af rumligt fordelte mikroelektroder, muliggøre samtidig stimulering og registrering af elektrofysiologisk aktivitet fra flere steder i vævet, hvilket giver en fremragende metode til at studere de spatio-temporale mønstre af spontan og fremkaldte aktivitet . Denne teknik, først anvendes til at overvåge de udviklingsmæssige ændringer i neuronal cellekultur aktivitet ³ og derefter tilpasset til akut og organotypisk hjerne og rygmarv skiver ^{4 - 6,} er i øjeblikket betragtes som en værdifuld elektrofysiologisk værktøj.

Den nuværende protokol beskriver, hvordan man tilberede humane kortikale skiver fra kirurgisk reseceret væv og til at optage med multilaterale miljøaftaler pålidelig ex VIvo interictal og beslaglæggelse-lignende begivenheder fra disse skiver. Denne teknik giver således en måde at løse de grundlæggende mekanismer bag epileptiske aktiviteter indvielse, spredning og følger af antiepileptika på både de trådløse og netværk niveauer. Alle de procedurer, der anvendes til at opnå, forberede, vedligeholde og registrere menneskelige skiver her beskrevet i detaljer.

Protocol

BEMÆRK: Protokollen er beskrevet her følger retningslinjerne i den franske "Comité Consultatif National d'Ethique", og er erklæret som en samling aktivitet ved INSERM.

1. Resektion of Human Epileptiske Tissue

1. Patienter
   1. Opnå hjernevæv fra patienter der lider af epilepsi. Anskaf en skriftligt informeret samtykke før operation.
   2. For alle drives epileptiske patienter udføre en omfattende presurgical oparbejdning herunder neurologisk undersøgelse, neuropsykologisk vurdering overflade EEG og neuroimaging (MRI og undertiden ¹⁸ FDG-PET-scanning, figur 1A) efterfulgt af post-kirurgisk histologisk undersøgelse af opereret væv (figur 1B) . BEMÆRK: Kirurgi er indiceret, når de forskellige udforskninger lokalisere tilsvarende beslaglæggelse debut zone, og når fordelen ved dets fjernelse overstiger de kirurgiske risici.
2. Kirurgi
   1. Maintain antiepileptika præ-operativt. Udføre kirurgi under generel anæstesi: induktion med inhaleret sevofluran (6% leveret ratio og 100% inhaleret brøkdel af O _2), intra venøs sufentanyl (0,3 ug / kg) og antracurium (0,5 mg / kg) efterfulgt af vedligeholdelse med intra venøs sufentanyl (0,5 ug / kg / time) og inhaleret sevofluran (1 MAC).
   2. Brug en neuronavigation til at muliggøre en præcis lokalisering af læderede cortex (figur 1C). Efter incision i huden, udføre et borehul i knoglen, efterfulgt af en kraniotomi med en høj spill boremaskine. Forsigtigt løfte knoglen klap, og åbn dura med en saks (Figur 1D).
   3. Brug intra-operative ultralyd for at lette identifikationen af ​​unormal cortex, og mikrokirurgiske instrumenter og en ultralyds aspirator under operationsmikroskopet.
   4. Koagulere og skære pio-arachnoidal plan i henhold til de sulcal grænser. Brug subpial dissektion til release cortex fra pia omkring det læderede område.
   5. Skær den hvide substans under den unormale cortex til at udføre et stykke "en bloc" resektion, skånes så meget som muligt kar. Undgå traumatisk manipulation af cortex.
   6. Skær en 1 cm tyk skive af det resekterede væv langs en retning vinkelret på pial overflade, herunder sulcus bunden og overgangs- cortex.

2. Kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) for Slice Forberedelse, Inkubation og recording

1. ACSF for skive forberedelse
   1. Forbered 1 L saccharose-baserede ACSF ^7,8, indeholdende (i mM): 250 saccharose, 3 KCI, 25 _NaHCO3, 10 D-glucose, 1 _CaCl2, 10 _MgCI2; opløses disse salte i deioniseret vand og oxygenat opløsningen med carbogen i mindst 10 min.
   2. Sætte ~ 700 ml saccharose ACSF ved -80 ° C i 50-60 min (eller -150 ° C for 15-20 min). Holde resten afopløsning under iltning i is. BEMÆRK: ACSF for skive præparat kan opbevares ved 4 ° C; i dette tilfælde tilsættes _CaCl2 og _MgCl2 på dagen for eksperimentet, før afkøling.
2. ACSF for skive inkubation og optagelse
   1. Fremstilles mindst 3 l optagelse ACSF ^7,8, indeholdende (i mM): 124 NaCl, 3 KCI, 26 _NaHCO3, 10 D-glucose, 1,6 _CaCl2, 1,3 _MgCl2; opløses disse salte i deioniseret vand og oxygenat opløsningen med carbogen. Før du tilføjer _MgCl2, holde nogle ACSF at udføre optagelser i 0 Mg2 ⁺ ACSF. BEMÆRK: inkubation / optagelse ACSF kan opbevares ved 4 ° C; i dette tilfælde tilsættes _CaCl2 og _MgCl2 dagen for eksperimentet.

3. Udstyr til Slice Incubation og recording

1. Grænseflade kammer til skive inkubation
   1. Brug en hjerne skive kammer til at opretholde levende skiver ex vivo </ Em> interface mode. BEMÆRK: Kammeret er sammensat af en nedre sektion, som indeholder varme og sensorelementerne og en keramisk bobleapparat og er fyldt med destilleret vand, og en øvre del, hvor skiverne hviler på et ark linsepapir i det flade område i midten af kammeret (figur 2A - B).
   2. Brug to separate fine rør PTFE, hvorigennem preoxygenated ACSF træder ind i kammeret. BEMÆRK: Rørene spiral i det opvarmede vand og nå den øvre del af kammeret; så løsningen kommer ud ved hjælp af kapillarvirkning med linse væv, der formidler opløsningen i exit brønde.
   3. Forbinde rørene i grænsefladen kammer PTFE til en peristaltisk pumpe, til at tillade kontinuerlig perfusion af skiverne med preoxygenated medium.
   4. Opretholde den høje oxygenspænding ved iltning med carbogen (95% O ₂ og 5% CO ₂₎ gennem den keramiske absorptionskolben. BEMÆRK: Denne varmet og fugtet gas blanding nårskiver i den øvre del af kammeret gennem passende huller.
   5. Opretholde temperaturen i den øvre del af kammeret ved at forbinde kammeret til en temperaturregulator ved hjælp af en speciel dobbelt-endet kabel, der har en konnektor til kammeret varmeelement og en ekstern temperaturføler i den ene ende. Anbring sensoren i nærheden af skiver til at kontrollere temperaturen i hele inkubation (figur 2C).
2. Multi-elektrode-array optagelser
   1. Brug plane multi-elektrodesæt med 120 titannitrid elektroder (30 um diameter) isoleret med siliciumnitrid og intern reference elektrode, der er anbragt i en 12 x 12 matrix med 200 um center-til-center afstand. BEMÆRK: Det er muligt at andre konfigurationer med forskellige elektrode diameter og afstand. Navnlig kan MEA chip blive udvidet til at prøve større udsnit af humane væv.
   2. Anskaf elektriske signaler på 10 kHz ved hjælp af et MEA2100-120-system (præ- og filter forstærker med integreret datafangst og analog-digital konverter, 16 bit data opløsning, input spændingsområde og justerbar via software båndbredde) gennem en dedikeret software (MC_Rack). BEMÆRK: MEA2100 hovedtrin er udstyret med en metalplade til fastgørelse af opvarmeligt perfusion element gennem magnetiske holdere til løbende perfundere skiver hele indspilningen.
   3. Hold væv ned på MEA med en lille hjemmelavet platin anker, hvilket sikrer en god elektrisk kobling mellem skive og elektroderne.

4. Fremstilling af Interface Afdeling og værktøjer til Dissektion og tilskæring

1. Grænsefladekammer
   1. Fyld den nederste del af grænsefladen kammer med destilleret vand. Sikre, at niveauet af vand fuldstændig fanger varmelegemet og er 2 til 4 mm under overgangen mellem den nedre og øvre del af kammeret. Check dette niveau dagligt før der tændes for opvarmning,For at undgå beskadigelse af varmeelementet.
   2. Slut kammeret til en carbogen kilde, udstyret med en sekundær flow regulator til fine justeringer af gastryk.
   3. Skær et ark linse væv for at passe det flade område af skive kammeret, og placere det tæt på input løsning rør, at lade nogen boble flygte fra input linje, før nå skiver.
   4. Skær to stykker af strandede bomuldstråd så længe stykke linsepapir, og placere dem langs de vigtigste sider af det flade område af kammeret. BEMÆRK: Dette hjælper til lidt hæve perfusionsopløsningen niveau i kammeret.
   5. Indstille strømningshastigheden af ​​den peristaltiske pumpe ved 1 ml / min og aktivere pumpen.
   6. Start iltning af vand i den nederste del af kammeret.
   7. Indstil temperaturen af ​​temperatur regulatoren ved 37 ° C og tænde den. Dække den øverste del af grænsefladen kammer med et stykke parafilm og vente i mindst 30 minutter for temperature til at øge og stabilisere.
2. Værktøjer til dissektion og udskæring
   1. Forbered en dissektion kit bestående af to fine tænger, en spatel, en lille ske og en kniv; to glaspetriskåle, to børster samt cyanoacrylat lim.
   2. Indstil parametrene for vibratome: tykkelse, 400 um; frekvens, 70-90 Hz; amplitude, 0,9 mm - 1 mm, hastighed: 0,1 mm / sek.

5. Menneskelige Cortical Slice Forberedelse

1. Fjern saccharose-baserede ACSF fra -80 ° C fryser og bland det med henblik på at opnå en slags sjap. Ilte det med carbogen, sætte ~ 250 ml i en glasflaske og holde det i en Dewar flaske fyldt med is, samtidig med at gå til kirurgi værelse på hospitalet for at få vævet. I mellemtiden holde resten ved -20 ° C.
   BEMÆRK: Under operationen, neurokirurgen dissekerer en lille blok af cortexvæv. Straks placere prøven i iskold saccharose ACSF til overførsel til laboratoriet.
2. Hold den nødvendige tid til overførsel fra hospitalet til laboratoriet til et maksimum på 30 minutter. I laboratoriet, tage saccharose-baserede iltet ACSF ud på -20 ° C fryser, bland det at have en slush, udfylde en petriskål og vibratome buffer bakke og begynde oxygenating både med carbogen. Forsigtigt tage ud stykke menneskeligt væv fra flasken med en ske og læg dem i petriskålen (figur 2D).
3. Ved hjælp af pincet, forsigtigt fjerne blodpropper, fartøjer og meninges at undgå modstand under udskæring. Fjern meninges, som består i pia-sagen, startende fra siderne af vævsblokken, opmærksomhed på ikke at beskadige kortikale overflade. Med en kniv, skæres en side af vævet til opnåelse af en flad overflade, som skal limes på Vibratome modellen plade. BEMÆRK: meninges, som består i pia-anliggende, er fjernet ud fra siderne af vævsblokken, opmærksomhed på ikke at beskadige kortikale overflade.
4. Hvis blokken af ​​tissue er større end MEA kammer, skære et stykke af passende dimensioner før limning det på prøven plade (Figur 2E).
5. Lim væv med henblik på at opnå tværgående kortikale skiver, sætte det ind i bufferen bakke og skære 400 um tykke skiver ved lav hastighed (0,1 mm / sek) (figur 2F).
6. Klip stykker linsevæv med slice dimensioner; med en spatel og en børste, overføre skiver på disse linse væv og inkubere dem i grænsefladen kammer ved 37 ° C i mindst 1 time før start optagelser (figur 2G - I). Løbende gemme skiver i de samme betingelser indtil brug. BEMÆRK: Placering af skiver på linse papir er et vigtigt skridt for at lette både perfusionen af ​​bunden af ​​skiver og fjernelse af skiver fra grænsefladen kammer før optagelse.
   1. Mens overføre skiver på linsen væv, håndtere dem meget omhyggeligt, så man undgår at røre ved kortikale lag medbørsten.
   2. Forbered skiverne en ad gangen og straks overføre hver af dem til grænsefladen kammer med henblik på at sikre en korrekt iltforsyning og temperatur; skive blok opereret væv så hurtigt som muligt.

6. Fremstilling af MEA Setup til optagelser

1. Sæt perfusionssystemet til en peristaltisk pumpe, og MEA systemet til en computer. Ilte optagelsen ACSF. Placer en tom MEA chip inde i forstærkeren.
2. Indstil temperaturen termostat til opvarmning kanyle element til at nå 37 ° C i MEA kammeret og start perfusion på 5-6 ml / min. BEMÆRK: Det er sædvanligvis nødvendigt at indstille temperaturen 3-4 ° C højere end den ønskede, afhængigt af rumtemperaturen og strømningshastigheden.
   1. Kontrollere temperaturen i MEA kammer med en fin termometer, placere den tættest muligt på midten, uden at røre elektroden område.
3. Start optagelse Software og kontrollere, at alle MEA elektroder er godt forbundet, og at der ikke er støj på grund af perfusion.
4. Start MEA_Monitor at kontrollere, at kameraets tabel.

7. Overførsel af en Slice Fra interface Chamber til MEA Chip til Optagelse

1. Hæld nogle varmede optagelse ACSF i et glas petriskål; med en pincet, tage et udsnit fra grænsefladen kammeret, ved at snuppe den gennem linsen væv, og sætte det i en petriskål. Frigør forsigtigt skive fra vævet. Hvis niveauet af opløsningen i grænsefladen kammer omhyggeligt justeres under inkubationstid vil skive løsnes fra linsen væv kun ved at nedsænke det i opløsningen; ellers skal du bruge en lille pensel til at lette løsrivelse.
2. Fyld en MEA chip med nogle ACSF og med en spatel, overføre skive ind i det. Med en plastik Pasteur pipette forsigtigt fjerne løsningen at gøre skive klæbe på elektroden området og holde det på plads med en platin ANCHeller. Tilsæt 1 ml optagelse ACSF placere MEA chip i forstærkeren og begynde perfusion på 5-6 ml / min (Figur 2J - L).
3. Kontroller skive position på MEA optagelse område ved hjælp MEA_Monitor, justere det, hvis nødvendigt for at optage fra den kortikale lag og tage et billede. Start optagelsen.

Representative Results

Optagelsen af human cortical skive aktivitet begynder mens perfusion af væv med normal optagelse ACSF (som tidligere beskrevet) ^7,8. I denne tilstand, når vævet er velbevaret under kirurgi og senere under væv overførsel fra hospitalet og skive forberedelse, kan man iagttage spontane aktivitet i form af små interictale-lignende begivenheder detekteret fra små klynger af MEA elektroder. Interictale-lignende udledninger bestod i et felt potentiale sædvanligvis bifasisk omfatter en indledende kraftig negativ deformation, nå snesevis af mikrovolt, efterfulgt af en længere modsat bølge varer flere snese millisekunder. Hurtig multi-unit aktiviteter er indstøbt i det potentielle område hovedsageligt i den indledende del. Et repræsentativt eksempel på interictal-lignende aktivitet er illustreret i fig 3Aii, hvor spor optaget af en MEA elektrode er vist.

Hvis du vil optage epileptiske anfald fra ivitro humane corticale udsnit, er det nødvendigt at perfundere dem med en "epileptogen" ACSF, hvor Mg2 ⁺ er fraværende, og K ⁺ øges til 6 mM, for at øge væv ophidselse ¹ (stigning i K ⁺ fra 3. til 6. mM alene er ikke nok til at fremkalde anfald, data ikke vist). Når perfusionen med 0 Mg ²⁺ 6 mM K ⁺ ACSF er startet, aktiviteten af kortikale skiver øges gradvist, og det første anfald forekommer inden for 15 til 20 min (15,4 ± 1,7 min, n = 10, fra 5 patienter, figur 3 Ai ). Vi fremkaldte iktal-lignende aktivitet, som vist i figur 3, i 75% af testede patienter og i 66,7% af alle registrerede skiver.

Epileptiske aktiviteter registreres fra tilstødende elektroder MEA chippen, og sammenligning af de debut dynamik Feltspænding begivenheder tillader studere deres hjemmeside af tilblivelse og udbredelse. En repræsentativ beslaglæggelse optaget fra et udsnit af brummenen cerebral cortex med MEA er vist i figur 3B (en repræsentativ spor af et anfald registreres af en enkelt MEA elektrode er vist ved højere tidsopløsning i figur 3 AIII). Bemærk, at beslaglæggelsen er optaget fra næsten alle elektroderne i MEA chip, hvilket viser, at det er i stand til at udbrede sig til en stor cortical område. Endvidere ser på de enkelte spor optaget fra hver elektrode, er det muligt at observere en gradvis udbredelse af anfaldet tværs af væv: ja, det begynder først i det kortikale område, der dækker den højre halvdel af elektroden array, og det gradvist spreder sig til det område, der dækker den venstre halvdel (.. Jeg e, sammenligne spor fra elektrode L6 og B6, figur 3B).

Figur 1: En cortical dysplasi end. sin kirurgisk fjernelse A Taylor typen fokal kortikal dysplasi (hvid pil) indlejret i en venstre frontallappen sulcus visualiseres på præoperativ MR (A), og senere bekræftet ved histologisk undersøgelse (B) MAP kinase mærkning; skala bar: 200 um), der viser en kortikal dyslamination, abnorme neuroner og et spor på neuroner med en ufuldstændig migration i den nederste hvide substans. Under kirurgi er dysplasi lokaliseret ifølge MRI data med en neuronavigation systemet (C). Visualisering af gyrus indeholdende dysplasi under kirurgi (D).

Figur 2:. Udstyr og procedure for human cortical skive forberedelse Et interface kammer anvendes til at opretholde humane corticale skiver ex vivo (A); skiverne hvile på et ark linsepapir i det flade område i den øvre del af kammeret (B), hvor en temperaturføler (C, til venstre), forbundet til en temperaturregulator (C, højre, op) gennem en dobbelt ended kabel (C, højre, ned), er placeret for at opretholde 37 ° C i hele skive inkubationstid. Efter opnåelse placere resekterede blok af væv i en petriskål fyldt med iskold saccharose-baserede ACSF (D) og fjern blodpropper, fartøjer og meninges, for at lette udskæring. Hvis vævsblokken er større end MEA kamre, isolere et stykke af passende dimensioner med en klinge (E) og lim det på Vibratome prøve plade (F). Skær 400 um tykke skiver og med hjælp af en spatel (G) overføre dem på stykker af linsen væv (H) og inkubere dem i grænsefladen kammer (I). Før optagelse remove linsevævet ved at nedsænke den skive i en petriskål fyldt med ACSF og overføre det til en ACSF fyldt MEA chip med en spatel (J). Fjern løsning at lade skive klæbe på MEA (K) og holde det på plads ved hjælp af en platin anker. Placer MEA i forstærkeren (L), start perfusion og optagelse.

Figur 3: MEA optagelser af epileptiske anfald i humane corticale udsnit (A) Et repræsentativt spor af human cortical skive aktivitet registreres af en MEA elektrode er vist i panel i.. I nærvær af normal ACSF, er det muligt at observere interictal-lignende spontan aktivitet (lille grå rektangel, zoomet ind panel ii); derefter, når perfusion med 0 Mg ²⁺ 6 mM K ⁺ ACSF er startet, den første seizure kommer efter et ~ 15 min forsinkelse og følges af andre begivenheder på 2-3 min interval. Panel III viser beslaglæggelsen i den store grå rektangel i panelet i med et zoomet skala. Den blå spor illustrerer en zoom af aktiviteten, som angivet af den blå linie og pil. Panel iv) viser dataene illustreret i panel III) high pass filtreret ved 250 Hz, som afslører flere enheder aktivitet, når zoomet (blå spor). (B) Repræsentant optagelse af en beslaglæggelse i nærværelse af 0 Mg ²⁺ 6 mM K ⁺ ACSF fra alle MEA elektroder. Hvert felt repræsenterer en elektrode på 12 x 12 MEA array og viser en 80 sek tidsvindue; den stiplede linje angiver placeringen af ​​den kortikale overflade i forhold til MEA array.

Discussion

Pharmacoresistant epilepsi er en sjælden tilstand, som kan udforskes i humant væv in vitro. Dette gør det muligt at studere epileptiske human cortex, som viser specifikke defekter, der kun delvis gengivet i dyremodeller. Metoden beskrevet her tillader forberede og optagelse humane postoperative væv ex vivo med bevaret cellulær levedygtighed og netværk, så de spontant epileptiske aktiviteter. Fastholdelse lignende aktiviteter end dem, der er optaget in vivo er afgørende at undersøge mekanismerne for tilblivelsen af patologiske aktiviteter. Endvidere tillader sådanne metoder at udforske den menneskelige væv og undgå ikke-perfekte dyremodeller af sygdommen. Men forskning i menneskers væv kræver synkronisering mellem neurokirurger og eksperimenterende laboratorium. Tissue transport kræver særlig omhu for ikke at være traumatisk. Desuden er både mængden af ​​prøven og væv er begrænset. Endelig adgang til ordentlige kontrolforanstaltninger væv er det main bekymring. Med denne forberedelse, de postoperative væv spontant producere interictal-lignende udledninger i normal ACSF ^7,8. Iktal-lignende begivenheder kan også fremkaldes i modificeret, prokonvulsive ACSF så mekanismerne for beslaglæggelse initiering og overgang fra interictal- tilstand til anfald kan undersøges.

Humant væv kan holdes levedygtige i op til 10 timer i grænseflader. Skiver blev anset for levedygtig, når multi-enheds aktivitet eller feltpotentialer blev observeret spontant og når disse aktiviteter blev fremkaldt af stigende ophidselse gennem ekstracellulære kalium- stigninger og / eller magnesium fald. Selv om variabilitet i aktiviteten sker, sandsynligvis afspejler forskelle i patologier og kortikale områder, vi udforsket krampefremkaldende karakteristika for et væv kun raske skiver viser spontan interictal og fremkaldte iktal udladninger. For at bevare væv vitalitet og aktivitet, er en grænseflade, som benyttes til at lagre than skærer ved 36-37 ° C til nyttiggørelse, før du optager med MEA-systemet. Faktisk har adskillige grupper tydeligt demonstreret fordelene ved brugerflade baseret lagersystem i forhold til standard bæger opbevaring og betydningen af temperaturen for bevarelsen af nettet aktivitet såsom spontane skarpe wave-krusninger eller kolinerge-inducerede svingninger ^9,10. Grænseflade opbevaring af skiver er tidligere blevet anvendt til at optage epileptisk aktivitet fra humant hippocampus og subicular skiver ^1,11. Med den nuværende MEA teknik, efter tilbagebetalingsperioden fra udskæring i grænseflader, er netværket aktivitet registreret i nedsænkede betingelser, tilstedeværelse af høj strømningshastighed (5-6 ml / min) ved 37 ° C, med MEA-systemet. Den reducerede diameter (1,8 cm) af MEA chip, som afgrænser et lille volumen kammer (<1,5 ml), sammen med den øgede strømningshastighed, øger iltforsyning af skive, som har vist sig at være en kritisk faktor for spontan og pharmacologically induceret netværksaktiviteter ^9,10. Endvidere reduceres mængden af ​​cirkulerende ACSF letter farmakologisk testning.

Udskæring procedure er imidlertid en traumer til vævet ^12. Både neuronal arkitektur og chlorid homeostase synes at være forstyrret på vævsoverfladen (50 um). Oprindelsen af ​​de aktiviteter, der registreres af MEA chips, som prøve vævet meste overfladisk uden dyb penetration, der kan opstå fra traumatiserede områder. Imidlertid viser vores data, at de ekstracellulære feltpotentialer lokalt detekteret registreres i de fleste MEA elektroder og tidligere arbejde viser, at de er integreret over en 100 til 200 um afstand fra optagelse webstedet ^13, hvilket tyder på, at beslaglæggelserne er optaget i vores forberedelse er usandsynligt, at være produceret af traumatiserede områder. Endvidere i studier med wolframelektroder muliggør dyb indtrængen, de epileptiske aktiviteter, der registreres i humant væv er enstil dem observeret til epileptiske patienter ^1,7,8.

En anden begrænsning af ex vivo væv optagelse er afbrydelse af forbindelserne mellem de forskellige områder i hjernen, hvilket begrænser dynamiske neuromodulations. Dette kan forklare, hvorfor i sådant væv ikke iktal-lignende begivenhed spontant indspillet, men kræver at blive udløst af ionisk manipulation eller farmakologisk stimulation øge ophidselse. Følgelig, i denne protokol, er beslaglæggelse-lignende begivenheder induceret ved at kombinere en ændring i ekstracellulær K ⁺ fra 3. til 6. mM og en reduktion af ekstern Mg2 ⁺ fra 1,3 mM til Mg2 ⁺ -fri ACSF, for at øge væv ophidselse og fjerne Mg2 ⁺ -afhængig NMDA receptor blok. Faktisk har det tidligere blevet vist, at epileptiform aktivitet induceret i humane neocorticale og hippocampusskiver anvender Mg ²⁺ -fri ACSF ligner elektrografiske anfald optaget in vivo ^14. Udover,det har vist sig, at udtømning epilepsilignende opnået i FLE skiver bliver resistente over for klinisk anvendte antikonvulsiva efter langvarig udsættelse for Mg ²⁺ -fri ACSF ^15,16, hvilket giver en model til undersøgelse pharmacoresistant beslaglæggelse-lignende hændelser in vitro.

MEA tillade optagelse af begge, feltpotentialer og multi-unit aktiviteter, der består i neuronale virkningspotentialer ex vivo. Således multilaterale miljøaftaler er et kraftfuldt elektrofysiologisk værktøj i forhold til EEG, som udforsker feltpotentialer genereret af synkrone aktiviteter af neuronale ensembler in vivo, men ikke giver adgang til en enkelt neuron behaviors ^17. Selv nyere mikroelektroder kan optage in vivo aktiviteter multi-Enhed bestående i neuronale virkningspotentialer, de er invasive, så deres anvendelse er for det meste begrænset til forskning formål under intrakranielle optagelser. Navnlig er MEA optagelser en teknik til valgat studere spatio-temporale mønstre af epileptiske begivenheder, de mekanismer, der styrer beslaglæggelse debut og formering og virkningen af ​​klassiske og nye antiepileptika. Bemærkelsesværdigt, at optrævle celletyper og signalering basis af epileptiske udladninger, spike sortering teknikker og farmakologiske undersøgelser bør kombineres med MEA teknikker. Selvom MEA kan give adgang til individuelle pigge, de ikke give oplysninger om synaptiske og biofysiske egenskaber. I fremtiden bør andre teknikker kobles til MEA optagelser for bedre at prøve cellulær adfærd, netværksaktiviteter og synaptisk signalering. For eksempel til fluorescensimagografi udrede neuroner eller gliaceller adfærd samt ion dynamik, kan kombineres med MEA optagelser. Yderligere post-hoc histologisk analyse kan også afsløre specifikke ændringer af celletyper, proteiner eller receptorer, således at placeringen af epileptiske aktiviteter kan korreleres med specifikke omlejringer afnervøs struktur. Den MEA-systemet kan også være indlejret i en patch-clamp set-up til at korrelere enkelte celler eller konduktanser med befolkningsaktiviteter. I fremtiden kunne optogenetic værktøjer også anvendes, forudsat at de menneskelige skiver kan dyrkes på lang sigt, som udføres for organotypiske skiver, således at transfektion eller infektion af specifikke celletyper kan udføres.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain Slice Chamber-2: Interface	AutoMate Scientific, Inc.	S-BSC2	It requires separate temperature controller
2-channel Temperature Controller	Multichannel Systems, Germany	TC02	It allows to plug in and use 2 interface chambers.
Special cable for connection of TC01 to S-BSC2 with external reference PT100	Multichannel Systems, Germany	CA3	The reference PT100 is placed near the slices
6pin plug-connector with PT100	Multichannel Systems, Germany	TS-PT100	External reference for CA3 cable
MEA workstation for recording data from 120-electrode MEAs	Multichannel Systems, Germany	MEA2100-120	It includes MEA2100-120 headstage and MEA2100 interface board. www.multichannelsystems.com
Microelectrode array for MEA2100-120	Multichannel Systems, Germany	120MEA200/30	Electrode spacing: 200 µm; electrode diameter: 30 µm; glass ring: 6 mm high. Different configurations (spacing, diameter, ring) possible.
Video Microscope Table	Multichannel Systems, Germany	MEA-VMT-1	Table with a video microscope underneath to image the electrode field of the MEAs in an amplifier placed on top of the table and transfer the image to a computer.
Perfusion cannula	Multichannel Systems, Germany	PH01	Heatable perfusion cannula with temperature sensor; temperature can be programmed with TC02 controller
MC_Rack	Multichannel Systems, Germany		Software for data acquisition and recordings
Magnetic Perfusion Holder	Multichannel Systems, Germany	MPH	Magnetic perfusion holder for PH01 element to fix the perfusion cannula and connect the perfusion system to the amplifier's ground
Neuroexplorer	Nex Technologies		Software for data analysis; info@neuroexplorer.com
Peristaltic pump (drive unit)	Gilson	F155001	0,01 to 48 rp
Peristaltic pump (pump head)	Gilson	F117800	R2 two channel
Ultrasonic aspirator	Integra Life sciences, USA	Cusa Excel +	It allows blunt subpial dissection of the cortex
Neuronavigation	Isis Solutions, France	Surgiscope	It allows real time identification of the brain structure on the preoperative MRI
Vibratome HM 650 V	Microm		Block slicing into 400 μm thick slices