Summary
Nous décrivons ici comment effectuer des enregistrements multi-électrodes de réseaux de tissu cortical humain épileptique. Résection de tissu épileptique, préparation de tranche et de matrices multi-électrode enregistrements d'événements intercritiques et ictales sont démontrés en détail.
Abstract
L'épilepsie, qui touche environ 1% de la population, comprend un groupe de troubles neurologiques caractérisés par l'apparition périodique des crises qui perturbent le fonctionnement du cerveau normal. Malgré un traitement avec des médicaments antiépileptiques actuellement disponibles ciblant les fonctions neuronales, un tiers des patients atteints d'épilepsie pharmacorésistante sont. Dans cette condition, la résection chirurgicale de la zone du cerveau à générer des convulsions reste le seul traitement alternatif. L'étude des tissus épileptiques humains a contribué à comprendre les nouveaux mécanismes épileptogènes au cours des 10 dernières années. En effet, ces tissus générer des décharges épileptiques intercritiques spontanées ainsi que des événements ictales induite pharmacologiquement qui peuvent être enregistrés avec des techniques d'électrophysiologie classiques. Remarquablement, les tableaux multi-électrodes (AME), qui sont des dispositifs micro-usinés intégration d'un ensemble de micro-électrodes disposés dans l'espace, offrent l'occasion unique de stimuler simultanément et d'enregistrer pote de domainentials, ainsi que les potentiels d'action des neurones à partir de plusieurs zones différentes du tissu. Ainsi AME enregistrements offrent une excellente approche pour étudier les schémas spatio-temporelles de interictal spontanée et événements de crises comme évoqués et les mécanismes sous-jacents saisie apparition et la propagation. Nous décrivons ici comment préparer tranches corticales humaines de tissu subi une résection chirurgicale et d'enregistrer avec AME intercritiques et ictales comme événements ex vivo.
Introduction
L'épilepsie est une maladie chronique dans laquelle les crises d'épilepsie, qui sont des décharges intermittentes à motifs d'une durée de quelques secondes à quelques dizaines de secondes sur (EEG) électroencéphalographiques associés à des manifestations cliniques, interrompent un état intercritique, caractérisé par la présence de décharges neuronales synchrones dizaines de millisecondes durables et a appelé les événements intercritiques 1. Elle affecte la population de 1% environ monde et bien que les saisies sont contrôlées dans la plupart des patients, environ un tiers des personnes atteintes d'épilepsie ne montrent pas une réponse adéquate aux médicaments antiépileptiques 2. Dans cette condition, appelée épilepsie pharmacorésistante et dont les mécanismes doivent encore être clairement identifié, la résection chirurgicale de la partie spécifique du cerveau identifiée comme la zone de saisie d'apparition reste le seul traitement alternatif donnant un résultat positif pour les patients. Ainsi, les pièces de résection chirurgicale de la chirurgie donnent l'occaoc- d'étudier les mécanismes de rejets intercritiques et la génération de la saisie et de la propagation, ainsi que la pharmacorésistance sur les tissus nerveux central humain viable ex vivo.
Multi-électrode tableaux (AME), constitué d'un arrangement de microélectrodes réparties dans l'espace, permettent la stimulation et l'enregistrement simultanés de l'activité électrophysiologique de plusieurs sites du tissu, offrant ainsi une excellente approche pour étudier les schémas spatio-temporelle de l'activité spontanée et évoquée . Cette technique, d'abord appliqué à suivre l'évolution du développement de l'activité neuronale de la culture 3, puis adapté pour le cerveau aiguë et organotypique et tranches de la moelle épinière 4 - 6, est actuellement considéré comme un outil précieux électrophysiologique.
Le protocole actuel décrit comment préparer des tranches corticales humaines de tissu subi une résection chirurgicale et d'enregistrer avec AME fiable ex vivo intercritiques et événements de crises comme de ces tranches. Cette technique permet donc une façon d'aborder les mécanismes de base qui sous-tendent les activités épileptiques initiation, la propagation et les effets des médicaments antiépileptiques à la fois aux niveaux cellulaire et réseau. Toutes les procédures utilisées pour obtenir, préparer, conserver et enregistrer tranches humains sont ici décrits en détail.
Protocol
REMARQUE: Le protocole décrit ici suit les directives des Français "Comité consultatif national d'éthique» et est déclaré comme une activité de collecte par l'INSERM.
1. La résection des tissus épileptique humain
- Les patients
- Obtenir des tissus cérébraux de patients souffrant d'épilepsie réfractaire. Obtenir un consentement éclairé avant la chirurgie.
- Pour tous les patients opérés d'épilepsie effectuer un vaste bilan préopératoire y compris l'examen neurologique, évaluation neuropsychologique, EEG de surface, et la neuro-imagerie (IRM et parfois 18 FDG-PET scan, figure 1A), suivie d'un examen histologique post-chirurgicale du tissu réséqué (figure 1B) . NOTE: La chirurgie est indiquée lorsque les diverses explorations localiser la zone de même l'apparition de la crise et si le bénéfice de son enlèvement dépasse les risques chirurgicaux.
- Chirurgie
- Maiantiépileptiques ntain pré-opératoire. Effectuer une intervention chirurgicale sous anesthésie générale: induction avec le sévoflurane inhalé (6% Ratio livrés et 100% fraction inhalation d'O 2), sufentanyl intra veineuse (0,3 pg / kg) et antracurium (0,5 mg / kg), suivie par un entretien avec sufentanyl intra veineuse (0,5 mg / kg / h) et le sévoflurane inhalé (1 MAC).
- Utiliser un système de neuronavigation pour permettre une localisation précise du cortex lésé (figure 1C). Après incision de la peau, effectuer un trou de trépan dans l'os suivie par une craniotomie avec une perceuse haute déversement. Élever doucement le volet osseux, et ouvrir la dure-mère avec des ciseaux (figure 1D).
- Utilisez son intra-opératoire ultra pour faciliter l'identification du cortex anormal, et les instruments de microchirurgie et un aspirateur ultrasonique sous le microscope opératoire.
- Coaguler et couper le plan de pio-arachnoïdienne selon les limites sulcales. Utilisez dissection subpial à release le cortex de la pie autour de la zone lésée.
- Couper la substance blanche sous le cortex anormal à effectuer une seule pièce "en bloc" résection, en épargnant autant que possible le système vasculaire. Éviter la manipulation traumatique du cortex.
- Couper une tranche de 1 cm d'épaisseur sur le tissu réséqué le long d'une direction orthogonale à la surface piale, y compris le fond du sillon et le cortex de transition.
2. céphalo-rachidien artificiel fluide (ACSF) pour Slice préparation, incubation et d'enregistrement
- ACSF pour la préparation de tranche
- Préparer 1 litre d'ACSF à base de saccharose 7,8, contenant (en mM): 250 saccharose, KCl 3, NaHCO 3 25, 10 D-glucose, 1 de CaCl2, MgCl2 10; dissoudre ces sels dans de l'eau désionisée et oxygéner la solution avec du carbogène pendant au moins 10 min.
- Mettre ~ 700 ml de saccharose ACSF à -80 ° C pendant 50 à 60 min (ou -150 ° C pendant 15 à 20 min). Gardez le reste de lasolution sous oxygénation dans la glace. REMARQUE: L'ACSF pour la préparation de tranche peut être conservé à 4 ° C; dans ce cas, ajouter CaCl 2 et MgCl 2, le jour de l'expérience, avant de le refroidir.
- ACSF pour tranche incubation et enregistrement
- Préparer au moins trois litres d'enregistrement ACSF 7,8, contenant (en mM): NaCl 124, KCl 3, NaHCO 3 26, D-Glucose 10, CaCl 2 1,6, MgCl 2 1,3; dissoudre ces sels dans de l'eau désionisée et oxygéner la solution avec du carbogène. Avant d'ajouter MgCl 2, garder une certaine ACSF à effectuer des enregistrements à 0 Mg 2+ ACSF. REMARQUE: L'ACSF incubation / enregistrement peut être conservé à 4 ° C; dans ce cas, ajouter CaCl 2 et MgCl 2, le jour de l'expérience.
3. équipements pour Slice incubation et d'enregistrement
- chambre d'interface pour tranche incubation
- Utilisez une chambre de tranches de cerveau de maintenir tranches ex vivo vie </ Em> en mode d'interface. REMARQUE: La chambre se compose d'une partie inférieure, qui contient le chauffage et les éléments capteurs et un dispositif de barbotage de céramique et est rempli avec de l'eau distillée, et une partie supérieure, où les lamelles reposent sur une feuille de tissu de verre dans la zone plane dans le centre de la chambre (Figure 2A - B).
- Utilisation de deux tubes en PTFE fines séparées, à travers laquelle le ACSF préoxygéné pénètre dans la chambre. REMARQUE: Les tubes en spirale dans l'eau chaude pour atteindre la partie supérieure de la chambre; puis sort de la solution au moyen d'une action capillaire avec un tissu de verre, qui achemine la solution dans les puits de sortie.
- Connecter les tubes de PTFE de la chambre d'interface à une pompe péristaltique, pour permettre la perfusion continue des tranches avec le milieu préoxygéné.
- Maintenir la tension élevée d'oxygène par l'oxygénation de carbogène (95% O 2 et 5% CO 2) à travers le barboteur céramique. NOTE: Ce mélange de gaz réchauffé et humidifié atteint latranches dans la partie supérieure de la chambre à travers des trous appropriés.
- Maintenir la température dans la partie supérieure de la chambre de raccordement de la chambre à un contrôleur de température, par l'intermédiaire d'un câble à double extrémité particulière, comportant un connecteur pour l'élément de chauffage de la chambre et un capteur de température externe à une extrémité. Placez le capteur près les tranches de vérifier la température tout au long de l'incubation (figure 2C).
- Enregistrements d'un tableau multi-électrodes
- Utilisation planes réseau d'électrodes multiples 120 avec des électrodes de nitrure de titane (30 um de diamètre) isolés par du nitrure de silicium et l'électrode de référence interne, disposées en une matrice de 12 x 12 à 200 um espacement centre-à-centre. NOTE: D'autres configurations avec diamètre de l'électrode différente et l'espacement sont possibles. En particulier, la puce de MEA peut être élargi à déguster grandes tranches de tissus humains.
- Acquérir des signaux électriques à 10 kHz en utilisant un système MEA2100-120 (avant et fiamplificateur de filtre avec acquisition de données intégré et convertisseur analogique-numérique, résolution de données de 16 bits, la plage de tension d'entrée et la bande passante ajustable via logiciel) grâce à un logiciel dédié (MC_Rack). REMARQUE: La headstage de MEA2100 est doté d'une plaque de métal pour la fixation de l'élément de perfusion pouvant être chauffé par l'intermédiaire de dispositifs porteurs magnétiques, pour perfuser en continu les tranches pendant toute la session d'enregistrement.
- Maintenir le tissu vers le bas sur la MEA par une petite ancre de platine maison, ce qui assure un bon couplage électrique entre la tranche et les électrodes.
4. Préparation de la Chambre Interface et Outils pour la dissection et tranchage
- chambre d'interface
- Remplir la section inférieure de la chambre d'interface avec de l'eau distillée. Assurez-vous que le niveau de l'eau immerge complètement l'élément chauffant et est de 2 à 4 mm en dessous de la jonction entre la partie inférieure et supérieure de la chambre. Vérifiez ce niveau tous les jours avant d'allumer le chauffage,afin d'éviter d'endommager l'élément chauffant.
- Connectez la chambre à une source de carbogène, doté d'un régulateur de débit secondaire pour des ajustements précis de la pression de gaz.
- Coupez une feuille de papier optique afin d'adapter la surface plane de la chambre de tranche, et le placer à proximité de tubes de solution d'entrée, pour laisser toute fuite de la bulle de la ligne d'entrée avant d'atteindre les tranches.
- Coupez deux morceaux de fil de coton brin tant que le morceau de tissu de verre, et les positionner le long des faces principales de la surface plane de la chambre. NOTE: Cela permet d'augmenter légèrement le niveau de la solution de perfusion dans la chambre.
- Régler le débit de la pompe péristaltique à 1 ml / min et activer la pompe.
- Lancer l'oxygénation de l'eau dans la partie inférieure de la chambre.
- Régler la température du régulateur de température à 37 ° C et l'activer. Recouvrir la partie supérieure de la chambre de l'interface avec un morceau de parafilm et attendre au moins 30 minutes pour la temperature pour augmenter et stabiliser.
- Outils pour la dissection et tranchage
- Préparer une trousse de dissection composé de deux pinces fines, une spatule, une petite cuillère et un couteau; deux boîtes de Pétri en verre, deux brosses ainsi que de la colle cyanoacrylate.
- Définissez les paramètres de la vibratome: épaisseur, 400 um; fréquence, de 70 à 90 Hz; amplitude, de 0,9 à 1 mm, vitesse: 0,1 mm / sec.
5. humaine corticale Slice Préparation
- Retirez le ACSF à base de saccharose à partir de -80 ° C congélateur et mélanger afin d'obtenir une sorte de neige fondante. Oxygéner carbogène, mettre ~ 250 ml dans un flacon en verre et conserver dans une bouteille Dewar rempli de glace, tout en allant à la salle de chirurgie de l'hôpital pour obtenir le tissu. Dans le même temps, garder le reste à -20 ° C.
REMARQUE: Au cours de la chirurgie, le neurochirurgien dissèque un petit bloc de tissu cortical. Placer l'échantillon dans glacée saccharose ACSF pour transfert au laboratoire. - Conserver le temps nécessaire pour le transfert de l'hôpital au laboratoire à un maximum de 30 min. Dans le laboratoire, prendre la ACSF oxygénée à base de saccharose de -20 ° C congélateur, mélanger pour avoir une bouillie, remplir une boîte de Pétri et le bac tampon vibratome et commencer à oxygéner la fois avec carbogène. Sortez soigneusement le morceau de tissu humain de la bouteille avec une cuillère et la mettre dans la boîte de Pétri (figure 2D).
- Utilisation de la pince, retirer délicatement les caillots sanguins, les vaisseaux et les méninges pour éviter la résistance pendant la coupe. Retirez les méninges, consistant à pie-matière, à partir des côtés du bloc de tissu, en accordant une attention à ne pas endommager la surface corticale. Avec une lame, couper un côté du tissu pour obtenir une surface plane, qui sera collée sur la plaque spécimen vibratome. NOTE: Les méninges, consistant à pie-matière, sont supprimés à partir du côté du bloc de tissu, en accordant une attention à ne pas endommager la surface corticale.
- Si le bloc de tiquest est plus grande que la chambre de MEA, couper un morceau de dimensions appropriées avant de coller sur la plaque de l'échantillon (figure 2E).
- Collez le tissu afin d'obtenir des tranches corticales transversaux, le mettre dans le bac tampon et couper 400 um tranches épaisses à basse vitesse (0,1 mm / s) (figure 2F).
- Coupez des morceaux de tissu de verre avec des dimensions de tranche; avec une spatule et d'une brosse, transférer les tranches de ces tissus de lentille et les incuber dans la chambre d'interface à 37 ° C pendant au moins 1 heure avant le début des enregistrements (figure 2G - I). Stocker en permanence des tranches dans les mêmes conditions jusqu'à l'emploi. REMARQUE: Placer les tranches sur du papier de verre est une étape importante pour faciliter à la fois la perfusion de côté fond de tranches et la suppression des tranches de la chambre de l'interface avant l'enregistrement.
- Lors du transfert des tranches sur le tissu de lentille, de gérer très soigneusement, en évitant de toucher la zone de la couche corticale avecla brosse.
- Préparer les tranches une à une et de les transférer immédiatement à chacun d'eux la chambre d'interface, afin d'assurer une bonne alimentation en oxygène et de la température; découper le bloc de tissu prélevé le plus rapidement possible.
6. Préparation de l'installation de la MEA pour les enregistrements
- Brancher le système de perfusion pour une pompe péristaltique et le système de MEA à un ordinateur. Oxygéner le ACSF d'enregistrement. Passer une puce de MEA vide à l'intérieur de l'amplificateur.
- Régler le régulateur de température pour l'élément de canule de chauffage pour atteindre 37 ° C dans la chambre de MEA et de commencer la perfusion à 6.5 ml / min. NOTE: Il est généralement nécessaire de régler la température de 3 à 4 ° C supérieure à celle souhaitée, en fonction de la température ambiante et la vitesse d'écoulement.
- Vérifier la température dans la chambre de MEA avec une amende thermomètre, le placement, il le plus proche possible du centre sans toucher la surface de l'électrode.
- Démarrez l'enregistrement software et vérifier que toutes les électrodes de la MEA sont bien connectés et qu'il n'y a pas de bruit à cause de la perfusion.
- Lancer MEA_Monitor pour vérifier le fonctionnement de la table de la caméra.
7. Le transfert d'une tranche de la chambre Interface de MEA Chip pour l'enregistrement
- Versez un peu réchauffé l'enregistrement ACSF dans une boîte de Pétri en verre; avec une pince, prendre une tranche de la chambre de l'interface, en le saisissant à travers le tissu de lentille, et le mettre dans la boîte de Pétri. Détacher délicatement la tranche du tissu. Si le niveau de la solution dans la chambre d'interface est soigneusement ajustée pendant un temps d'incubation, la tranche se détache du tissu de lentille uniquement en la plongeant dans la solution; autrement, utilisez une petite brosse pour faciliter le détachement.
- Remplir une puce de MEA avec certains ACSF et avec une spatule, transférer la tranche en elle. Avec une pipette Pasteur en plastique, retirez délicatement la solution pour faire adhérer la tranche sur la surface de l'électrode et le maintenir en place avec une partie ent de platineou. Ajouter 1 ml d'enregistrement ACSF, placer la puce de MEA dans l'amplificateur et commencer la perfusion à 5-6 ml / min (Figure 2J - L).
- Vérifiez la position de la tranche sur la zone d'enregistrement de MEA en utilisant MEA_Monitor, ajuster si nécessaire pour enregistrer des couches corticales et prendre une photo. Lancer l'enregistrement.
Representative Results
L'enregistrement de l'activité de la tranche cortical humain commence alors que la perfusion du tissu avec ACSF d'enregistrement normal (comme décrit précédemment) 7,8. Dans ces conditions, lorsque le tissu est bien conservée pendant la chirurgie et plus tard pendant le transfert de tissu de la préparation de l'hôpital et tranche, on peut observer l'activité spontanée, sous la forme de petits événements intercritiques-comme, détectées à partir de petits groupes d'électrodes de MEA. décharges intercritiques comme consisté à un potentiel de champ, généralement biphasique, comportant une déviation négative forte initial, atteignant des dizaines de microvolts, suivis par une vague plus en regard de plusieurs dizaines de millisecondes. Activités multi-unités rapides sont généralement intégrés dans le potentiel de champ principalement dans la partie initiale. Un exemple représentatif de l'activité intercritique semblable est illustré dans la Figure 3Aii, où la trace enregistrée par une électrode de la MEA est représenté.
Pour enregistrer des crises d'épilepsie de dansvitro tranches de cortex de l'homme, il est nécessaire de les perfuser à un ACSF "épileptogène", dans lequel Mg 2+ est absent et K + est porté à 6 mM, à augmenter l'excitabilité du tissu 1 (l'augmentation de K + à partir de 3 à 6 mm seul ne suffit pas à provoquer des crises; données non présentées). Une fois la perfusion avec 0 mM de Mg2 + 6 K + ACSF a commencé, l'activité de tranches corticales et augmente progressivement de la première saisie apparaît à l'intérieur de 15 à 20 min (15,4 ± 1,7 min, n = 10, à partir de 5 patients; Figure 3 Ai ). Nous avons évoqué activité d'ictus analogue, comme représenté sur la Figure 3, dans 75% des patients testés et dans 66,7% de toutes les tranches enregistrées.
Activités épileptiques sont enregistrés par des électrodes adjacentes de la puce de MEA, et la comparaison de la dynamique d'apparition de certains événements potentiels sur le terrain permet d'étudier leur site de la genèse et de la propagation. Une saisie représentant enregistré à partir d'une tranche de bourdonnementun cortex cérébral avec le système de MEA est représenté sur la Figure 3B (une trace représentative d'une saisie enregistrée par une seule électrode de la MEA est représentée avec une résolution temporelle plus élevée dans la figure 3 Aiii). A noter que la saisie est enregistrée à partir de la quasi-totalité des électrodes de la puce de MEA, ce qui indique qu'il est capable de se propager dans une large zone corticale. De plus, en regardant les traces individuelles enregistrées de chaque électrode, il est possible d'observer la propagation progressive de la saisie de l'autre côté du tissu: en effet, il commence d'abord dans la zone corticale qui couvre la moitié droite de la rangée d'électrodes, et il se propage progressivement à la région couvrant la moitié gauche (.. i e, de comparer les traces électrode L6 et B6; Figure 3B).
Figure 1: A une dysplasie corticale. d son ablation chirurgicale de type A Taylor dysplasie corticale focale (flèche blanche) noyé dans un lobe sillon frontal gauche est visualisée sur l'IRM préopératoire (A), et plus tard confirmé par l'examen histologique (B) MAP kinase étiquetage; barre d'échelle: 200 um) montrant un dyslamination corticale, les neurones anormaux et une piste sur les neurones avec une migration incomplète dans la substance blanche inférieure. Pendant la chirurgie, la dysplasie est localisée en fonction des données d'IRM avec un système de neuronavigation (C). La visualisation du gyrus contenant la dysplasie pendant la chirurgie (D).
Figure 2:. Équipement et procédure pour la préparation de tranche cortical humain Une chambre d'interface est utilisée pour maintenir les tranches corticales humaines ex vivo (A); les tranches de repos sur une feuille de tissu de verre dans la zone plate dans la partie supérieure de la chambre (B), où un capteur de température (C, à gauche), connecté à un régulateur de température (C, à droite, vers le haut) à travers un double câble asymétrique (C, droite, bas), est placé pour maintenir 37 ° C tout au long de la tranche de temps d'incubation. Une fois obtenue, placer le bloc de résection de tissu dans une boîte de Pétri remplie de glace froid ACSF à base de saccharose (D) et retirer les caillots sanguins, les vaisseaux et les méninges, afin de faciliter le découpage. Si le bloc de tissu est plus grande que les chambres de l'AEM, isoler un morceau de dimensions appropriées avec une lame (E) et le coller sur la plaque spécimen vibratome (F). Couper 400 um d'épaisseur des tranches et à l'aide d'une spatule (G) de les transférer sur des morceaux de tissu de lentille (H) et les incuber dans la chambre d'interface (I). Avant l'enregistrement, remove le tissu de verre par immersion de la tranche dans une boîte de Pétri remplie de ACSF et le transférer à une puce de MEA ACSF rempli avec une spatule (J). Retirer la solution de laisser la tranche adhérer à l'AEM (K) et la maintenir en position à l'aide d'une ancre de platine. Placez la MEA dans l'amplificateur (L), commencer la perfusion et l'enregistrement.
Figure 3: enregistrements des AME de crises d'épilepsie en tranches corticales humaines (A) Une trace représentatif de l'activité de la tranche cortical humain enregistré par une électrode de MEA figure dans le panneau i.. En présence de l'ACSF normale, il est possible d'observer l'activité de interictal comme spontanée (petit rectangle gris, zoom dans le panneau ii); puis, lorsque la perfusion de 6 0 mM de Mg2 + K + ACSF a commencé, la première seizure apparaît après un délai min ~ 15 et sera suivie par d'autres événements à 2-3 intervalle min. Panel III montre la saisie dans le grand rectangle gris dans le panneau i avec une échelle agrandie. La trace bleue illustre un zoom de l'activité, comme indiqué par la ligne bleue et la flèche. Panneau iv) montre les données illustrées dans le panneau iii) filtré passe-haut à 250 Hz, qui révèlent l'activité de plusieurs unité lors d'un zoom (courbe bleue). (B) d'enregistrement Représentant d'une saisie en présence de 0 Mg 2+ 6 mM K + ACSF de toutes les électrodes de la MEA. Chaque carré représente une électrode de 12 x 12 MEA tableau et montre une fenêtre de temps de 80 sec; la ligne en pointillés indique la position de la surface corticale relativement à réseau de MEA.
Discussion
Épilepsie pharmacorésistante est une affection rare, qui peut être explorée dans les tissus humains in vitro. Ceci permet l'étude de cortex humain épileptique, qui présente des défauts spécifiques qui ne sont que partiellement reproduites dans des modèles animaux. La méthode décrite ici permet la préparation et l'enregistrement de tissus humains post-opératoires ex vivo avec la viabilité et réseaux afin qu'ils produisent spontanément des activités épileptiques cellulaire conservée. Conserver des activités similaires à ceux enregistrés in vivo est essentiel d'étudier les mécanismes de genèse des activités pathologiques. En outre, ces méthodes permettent d'explorer les tissus humains et d'éviter les modèles non-animal parfait de la maladie. Cependant, l'étude de tissus humains nécessite une synchronisation entre neurochirurgiens et le laboratoire expérimental. transport des tissus nécessite des soins spécifiques de ne pas être traumatisant. En outre, à la fois la quantité de l'échantillon et le tissu est limité. Enfin, l'accès aux tissus de contrôle appropriées est la main préoccupation. Avec cette préparation, les tissus post-opératoires produisent spontanément des décharges intercritiques comme dans ACSF normale 7,8. événements ictal comme peuvent également être obtenue chez modifié, ACSF proconvulsive de sorte que les mécanismes de saisie initiation et la transition de l'état intercritique à des saisies peuvent être étudiés.
Le tissu humain peut être maintenu viable pour un maximum de 10 heures dans des conditions d'interface. Les coupes ont été considérées comme viables lorsque l'activité ou sur le terrain multi-unités potentiels ont été observés spontanément et lorsque ces activités ont été évoquées par l'augmentation de l'excitabilité par des augmentations de potassium extracellulaire et / ou diminution de magnésium. Bien que la variabilité de l'activité se produit, ce qui reflète probablement des différences dans les pathologies et les aires corticales, nous avons exploré les caractéristiques d'un tissu épileptogène seulement en tranches sains montrant interictal spontanée et évoqué décharges critiques. Afin de préserver la vitalité et de l'activité des tissus, une chambre d'interface est utilisé pour stocker til tranche à 36-37 ° C pour la récupération avant d'enregistrer avec le système de MEA. En effet, plusieurs groupes ont clairement démontré les avantages de système de stockage sur la base de l'interface par rapport au stockage de gobelet standard et l'importance de la température pour la conservation de l'activité du réseau tels que les ondes ou ondulations aiguë spontanée oscillations induites-cholinergiques 9,10. stockage de l'interface de tranches a déjà été utilisé pour enregistrer l'activité épileptique de l'hippocampe humain et tranches subicular 1,11. Avec la technique de la MEA courant, après la période de découpage dans des conditions d'interface de recouvrement, l'activité du réseau est enregistré dans des conditions submergées, en présence de fort débit (5-6 ml / min) à 37 ° C, avec le système de MEA. Le diamètre réduit (1,8 cm) de la puce de MEA, qui délimite une chambre de faible volume (<1,5 ml), en même temps que le débit accru, augmente l'apport d'oxygène de la tranche, qui a été démontrée être un facteur critique pour spontanée et phaactivités de réseau 9,10 rmacologically-induite. En outre, la quantité réduite de l'ACSF circulant facilite les tests pharmacologiques.
La procédure de découpage est cependant un traumatisme pour les tissus 12. Les deux architecture neuronale et l'homéostasie chlorure semblent être perturbée à la surface du tissu (50 um). L'origine des activités enregistrées par les puces des AME, qui échantillon du tissu principalement superficiellement sans pénétration profonde, peut survenir dans les zones traumatisées. Cependant, nos données montrent que les potentiels de champ extracellulaires détectées localement sont enregistrées dans la plupart des électrodes des AEM et précédent travail montrent qu'ils sont intégrés sur une distance de 100 à 200 um à partir du site d'enregistrement 13, ce qui suggère que les saisies enregistrées dans notre préparation sont peu susceptibles d'être produite par les zones traumatisées. En outre, dans les études réalisées avec des électrodes de tungstène permettant une pénétration profonde, les activités épileptiques enregistrées dans les tissus humains sont semblablesà celles observées chez les patients épileptiques 1,7,8.
Une autre limite de l'enregistrement ex vivo du tissu est la rupture des liaisons entre les différentes zones du cerveau, limitant ainsi neuromodulations dynamiques. Cela peut expliquer pourquoi dans un tel tissu aucun cas de ictal comme est enregistré spontanément, mais doit être déclenchée par la manipulation pharmacologique ou ionique stimulation améliorer l'excitabilité. En conséquence, dans ce protocole, les événements de saisie-comme sont induites par la combinaison d'un changement de K + extracellulaire du 3 au 6 mm et une réduction de Mg 2+ externe de 1,3 mM de Mg 2+ exempt ACSF, afin d'augmenter l'excitabilité du tissu et supprimer Mg 2+ bloc récepteur NMDA dépendante. En effet, il a déjà été démontré que l'activité épileptique induite en tranches néocortex et l'hippocampe humains en utilisant Mg 2+ exempt ACSF ressemble aux crises électrographiques enregistrées in vivo 14. En outre,il a été montré que les décharges épileptiformes obtenus dans des tranches de lobe temporal deviennent résistants aux anticonvulsivants utilisés en clinique après une exposition prolongée à Mg 2+ exempt ACSF 15,16, offrant ainsi un modèle pour étudier pharmacorésistantes événements de crises comme in vitro.
AEM permettent l'enregistrement de deux, les potentialités éducatives et des activités multi-unitaires composées de potentiels d'action neuronaux ex vivo. Ainsi, les AME sont un outil électrophysiologique puissant par rapport à l'EEG, qui explorent les potentiels de champ générées par les activités synchrones ensembles de neurones in vivo, mais ne donnent pas accès à seul neurone comportements 17. Bien microélectrodes plus récentes peuvent enregistrer les activités multi-unitaires in vivo consistant à potentiels d'action neuronaux, ils sont envahissantes, de sorte que leur utilisation se limite essentiellement à des fins de recherche pendant les enregistrements intracrâniens. En particulier, les enregistrements AME représentent une technique de choixpour étudier les schémas spatio-temporelle des événements épileptiques, les mécanismes de contrôle de saisie apparition et la propagation et l'action des médicaments antiépileptiques classiques et nouveaux. Remarquablement, de démêler les types de cellules et la base de la signalisation des décharges épileptiques, pointe des techniques de tri et de test pharmacologique doit être combinée avec les techniques de l'AEM. Bien AME peuvent donner accès à des pointes individuelles, ils ne fournissent pas d'informations sur les propriétés synaptiques et biophysiques. Dans l'avenir, d'autres techniques doivent être couplés à des enregistrements de l'AEM afin de mieux le comportement cellulaire de l'échantillon, les activités de réseau et de signalisation synaptique. Par exemple, l'imagerie de fluorescence à démêler les neurones ou de cellules gliales comportement, ainsi que la dynamique des ions, peuvent être combinées avec les AME enregistrements. En outre l'analyse histologique post hoc peut aussi révéler des altérations spécifiques de types de cellules, les protéines ou récepteurs ainsi que l'emplacement des activités d'épilepsie peut être corrélée à des réarrangements spécifiques de lastructure nerveuse. Le système AME peut également être intégré dans un patch-clamp mis en place pour établir une corrélation entre les cellules ou conductances individuelles avec les activités de la population. Dans le futur, les outils optogénétiques pourraient également être utilisés, à condition que les tranches humains peuvent être cultivés à long terme, comme pour les tranches organotypiques effectuée, de sorte que la transfection ou infection des types de cellules spécifiques peuvent être effectuées.
Disclosures
Parrainage par les systèmes multicanaux a été fourni pour la production de la vidéo et publication en libre accès.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par des subventions de l'ANR (Programme Blanc neurosciences), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), la ville de Paris (Emergence Programme), l'INSERM et l'Hôpital de la Pitié Salpêtrière (contrat de recherche translationnelle) de NR, de Neuropôle de Recherche Francilien (NeRF) à ED, de l'Université Pierre et Marie Curie UPMC (programme de convergence) et de l'Institut du Cerveau et la Moelle epiniere e (Paris) pour GH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Slice Chamber-2: Interface | AutoMate Scientific, Inc. | S-BSC2 | It requires separate temperature controller |
| 2-channel Temperature Controller | Multichannel Systems, Germany | TC02 | It allows to plug in and use 2 interface chambers. |
| Special cable for connection of TC01 to S-BSC2 with external reference PT100 | Multichannel Systems, Germany | CA3 | The reference PT100 is placed near the slices |
| 6pin plug-connector with PT100 | Multichannel Systems, Germany | TS-PT100 | External reference for CA3 cable |
| MEA workstation for recording data from 120-electrode MEAs | Multichannel Systems, Germany | MEA2100-120 | It includes MEA2100-120 headstage and MEA2100 interface board. www.multichannelsystems.com |
| Microelectrode array for MEA2100-120 | Multichannel Systems, Germany | 120MEA200/30 | Electrode spacing: 200 µm; electrode diameter: 30 µm; glass ring: 6 mm high. Different configurations (spacing, diameter, ring) possible. |
| Video Microscope Table | Multichannel Systems, Germany | MEA-VMT-1 | Table with a video microscope underneath to image the electrode field of the MEAs in an amplifier placed on top of the table and transfer the image to a computer. |
| Perfusion cannula | Multichannel Systems, Germany | PH01 | Heatable perfusion cannula with temperature sensor; temperature can be programmed with TC02 controller |
| MC_Rack | Multichannel Systems, Germany | Software for data acquisition and recordings | |
| Magnetic Perfusion Holder | Multichannel Systems, Germany | MPH | Magnetic perfusion holder for PH01 element to fix the perfusion cannula and connect the perfusion system to the amplifier's ground |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | Software for data analysis; info@neuroexplorer.com | |
| Peristaltic pump (drive unit) | Gilson | F155001 | 0,01 to 48 rp |
| Peristaltic pump (pump head) | Gilson | F117800 | R2 two channel |
| Ultrasonic aspirator | Integra Life sciences, USA | Cusa Excel + | It allows blunt subpial dissection of the cortex |
| Neuronavigation | Isis Solutions, France | Surgiscope | It allows real time identification of the brain structure on the preoperative MRI |
| Vibratome HM 650 V | Microm | Block slicing into 400 μm thick slices |
References
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