Summary
نحن هنا تصف كيفية إجراء التسجيلات مجموعة متعدد القطب الأنسجة القشرية صرع الإنسان. وأظهرت استئصال الأنسجة الصرع، إعداد شريحة ومجموعة متعدد القطب تسجيلات لأحداث النشبات ونشبي بالتفصيل.
Abstract
الصرع، مما يؤثر على حوالي 1٪ من السكان، وتضم مجموعة من الاضطرابات العصبية التي تتميز بحدوث نوبات من الدوري، والتي تعرقل وظيفة المخ المعتادة. على الرغم من العلاج بالأدوية المضادة للصرع المتوفرة حاليا تستهدف الوظائف العصبية، وثلث المرضى الذين يعانون من الصرع pharmacoresistant. في هذه الحالة، استئصال الجراحي للمنطقة الدماغ توليد النوبات يبقى العلاج البديل الوحيد. ساهم دراسة الأنسجة صرع الإنسان لفهم الآليات المولدة للصرع جديدة خلال السنوات ال 10 الماضية. في الواقع، هذه الأنسجة ينتج الصرع النشبات التصريف عفوية وكذلك الأحداث نشبي التي يسببها دواء التي يمكن تسجيلها مع تقنيات الكهربية الكلاسيكية. بشكل ملحوظ، صفائف متعدد القطب (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف)، والتي هي أجهزة microfabricated تضمين مجموعة من الميكروية ترتيب مكانيا، توفر فرصة فريدة لتحفيز في وقت واحد وتسجيل بوتيه الحقلntials، فضلا عن إمكانات العمل من الخلايا العصبية متعددة من مناطق مختلفة من الأنسجة. هكذا الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف التسجيلات توفر نهجا ممتازا لدراسة الأنماط المكانية والزمانية لالنشبات عفوية وأحداث تشبه أثار استيلاء ومصادرة الآليات الكامنة وراء ظهور والانتشار. نحن هنا تصف كيفية تحضير شرائح القشرية الإنسان من الأنسجة مقطوعة جراحيا وتسجيل مع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف النشبات وتشبه نشبي أحداث خارج الحي.
Introduction
الصرع هو اضطراب مزمن في ونوبات الصرع، والتي هي منقوشة التصريف متقطعة استمرت عدة ثوان لعشرات ثانية على الكهربي (EEG) التسجيلات المرتبطة المظاهر السريرية، يقطع دولة النشبات، والتي تتميز بوجود التصريف العصبية المتزامنة عشرات الالف دائم ودعا أحداث النشبات 1. أنه يؤثر على السكان حوالي 1٪ العالم، وعلى الرغم من أن يتم التحكم في نوبات لغالبية المرضى، ما يقرب من ثلث المصابين بالصرع لا تظهر استجابة كافية للأدوية المضادة للصرع 2. في هذه الحالة، يسمى الصرع pharmacoresistant والآليات التي لا يزال يتعين تحديدها بوضوح، والاستئصال الجراحي لجزء محدد من الدماغ يدعى منطقة للمصادرة يصيب يبقى العلاج البديل الوحيد إعطاء نتائج إيجابية للمرضى. وبالتالي، فإن العينات مقطوعة من جراحة تسفر عن opportunity لدراسة آليات التصريف النشبات وتوليد الحجز ونشر، وكذلك pharmacoresistance على النسيج العصبي المركزي البشرية قابلة للحياة خارج الحي.
متعدد القطب صفائف (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف)، تتكون من ترتيب الميكروية موزعة مكانيا، والسماح التحفيز في وقت واحد وتسجيل النشاط الكهربية من عدة مواقع من الأنسجة، مما يوفر طريقة ممتازة لدراسة الأنماط المكانية والزمانية من النشاط العفوي ومنبهات المسموعة . هذه التقنية، أول تطبيق لرصد التغيرات التنموية للنشاط زراعة الخلايا العصبية 3 ثم تكييفها لالدماغ الحاد وعضوي النمط وشرائح الحبل الشوكي 6 - 4، وتعتبر في الوقت الحاضر أداة الكهربية قيمة.
يصف البروتوكول الحالي كيفية تحضير شرائح القشرية الإنسان من الأنسجة مقطوعة جراحيا وتسجيل مع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف السادس موثوق السابقفو النشبات وأحداث تشبه مصادرة من هذه الشرائح. وبالتالي هذا الأسلوب يوفر وسيلة لمعالجة الآليات الأساسية الكامنة وراء الصرع بدء الأنشطة، ونشر آثار العقاقير المضادة للصرع على المستويين الخلوي والشبكة. ويتم هنا وصف كافة الإجراءات المتبعة للحصول على وإعداد وصيانة وتسجيل شرائح الإنسان في التفاصيل.
Protocol
ملاحظة: بروتوكول هنا وصف يتبع المبادئ التوجيهية للفرنسيين "COMITE الاستشاري لEthique الوطني لل"، وأعلنت كنشاط جمع من قبل INSERM.
1. استئصال داء الصرع الأنسجة البشرية
- المرضى
- الحصول على أنسجة المخ من المرضى الذين يعانون من الصرع المستعصي. الحصول على الموافقة المسبقة الخطية قبل الجراحة.
- تعمل لجميع مرضى الصرع تؤدي إلى workup قبل الجراحة واسعة النطاق بما في ذلك الفحص العصبي، وتقييم العصبية، EEG السطح، وتصوير الأعصاب (MRI وأحيانا 18 FDG-PET المسح الضوئي، الشكل 1A)، يليه الفحص النسيجي بعد العمليات الجراحية من الأنسجة مقطوعة (الشكل 1B) . يشار إلى جراحة عند توطين الاستكشافات المتنوعة بالمثل منطقة الظهور الحجز وعندما صالح زواله تجاوزت المخاطر الجراحية: ملاحظة.
- جراحة
- ميالأدوية المضادة للصرع ntain ما قبل الجراحة. إجراء عمليات جراحية تحت التخدير العام: الحث مع سيفوفلوران استنشاقه (6٪ نسبة تسليمها و 100٪ نسبة استنشاقه من O 2)، sufentanyl داخل وريدي (0.3 ميكروغرام / كغ) وantracurium (0.5 ملغ / كلغ)، تليها الصيانة مع sufentanyl داخل وريدي (0.5 ميكروغرام / كغ / ساعة) وسيفوفلوران استنشاقه (1 MAC).
- استخدام نظام neuronavigation السماح لتوطين دقيقة من القشرة lesioned (الشكل 1C). بعد شق الجلد، وإجراء ثقب لدغ في العظام تليها حج القحف مع تدريبات تسرب عالية. رفع بلطف رفرف العظام، وفتح الجافية مع مقص (الشكل 1D).
- استخدام داخل المنطوق الموجات فوق الصوتية لتسهيل التعرف على القشرة غير طبيعية، والأدوات المجهرية والشافطة بالموجات فوق الصوتية تحت المجهر التشغيل.
- تخثر وقطع الطائرة-المكتب الإعلامي عنكبوتي وفقا للحدود sulcal. استخدام تشريح تحت الحنون لصelease القشرة من الحنون حول منطقة lesioned.
- قطع المادة البيضاء تحت القشرة غير طبيعية لأداء قطعة واحدة "ككل" استئصال، تقتصد قدر المستطاع الأوعية الدموية. تجنب التلاعب الصدمة من القشرة.
- تقطع شريحة سميكة 1 سم من النسيج مقطوعة على طول متعامد الاتجاه إلى سطح حنوني، بما في ذلك قاع التلم والقشرة الانتقالية.
2. السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) لإعداد شريحة، الحضانة وتسجيل
- ACSF لإعداد شريحة
- تحضير 1 لتر من القائم السكروز ACSF 7،8، تحتوي على (مم): 250 السكروز، 3 بوكل، 25 NaHCO 3 و 10 مد الجلوكوز، 1 CaCl 2، 10 MgCl 2. تذوب هذه الأملاح في الماء منزوع الأيونات والأوكسجين الحل مع كربوجين لمدة 10 دقيقة على الأقل.
- وضع ~ 700 مل من السكروز ACSF في -80 درجة مئوية لمدة 50-60 دقيقة (أو -150 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة). الحفاظ على ما تبقى منالحل تحت الأوكسجين في الجليد. ملاحظة: يمكن تخزين ACSF لإعداد شريحة في 4 درجات مئوية. في هذه الحالة، إضافة CaCl 2 و MgCl 2 في يوم من التجربة، قبل تبريده.
- ACSF لاحتضان شريحة والتسجيل
- تحضير لا يقل عن 3 لتر من تسجيل ACSF 7،8، تحتوي على (مم): 124 كلوريد الصوديوم، 3 بوكل، 26 NaHCO 3 و 10 مد الجلوكوز، 1.6 CaCl 2، 1.3 MgCl 2. تذوب هذه الأملاح في الماء منزوع الأيونات والأوكسجين الحل مع كربوجين. قبل إضافة MgCl 2، والحفاظ على بعض ACSF لأداء التسجيلات في 0 المغنيسيوم 2+ ACSF. ملاحظة: يمكن تخزين ACSF حضانة / تسجيل على 4 درجات مئوية. في هذه الحالة، إضافة CaCl 2 و MgCl 2 في يوم من التجربة.
3. معدات لشريحة الحضانة وتسجيل
- غرفة اجهة لشريحة الحضانة
- استخدام غرفة شريحة الدماغ للحفاظ على شرائح فيفو السابقين الذين يعيشون </ em> في وضع واجهة. ملاحظة: وتتكون الغرفة من القسم السفلي، الذي يحتوي على عناصر التدفئة وأجهزة الاستشعار والفوار السيراميك ومملوءة بالماء المقطر، والجزء العلوي، حيث بقية شرائح على ورقة من نسيج العدسة في منطقة مسطحة في مركز الغرفة (الشكل 2A - B).
- استخدام اثنين من أنابيب PTFE غرامة منفصلة، من خلالها ACSF preoxygenated يدخل الغرفة. ملاحظة: أنابيب دوامة في الماء الساخن، وتصل الجزء العلوي من الغرفة. ثم يخرج الحل عن طريق عمل شعري مع الأنسجة عدسة، أن ينقل الحل في آبار الخروج.
- ربط أنابيب PTFE الغرفة اجهة لمضخة تحوي، للسماح نضح المستمر لشرائح متوسطة مع preoxygenated.
- الحفاظ على توتر الأكسجين عالية من قبل بالاكسجين مع كربوجين (95٪ O 2 و 5٪ CO 2) من خلال الفوار السيراميك. ملاحظة: هذا الخليط غاز تحسنت وترطيبها يصلشرائح في الجزء العلوي من الغرفة من خلال فتحات مناسبة.
- الحفاظ على درجة الحرارة في الجزء العلوي من الغرفة من خلال ربط الغرفة إلى وحدة تحكم في درجة الحرارة، من خلال كابل مزدوج العضوية خاص، وجود موصل للعنصر التدفئة الغرفة وجهاز استشعار درجة الحرارة الخارجية في نهاية واحدة. وضع جهاز استشعار قرب شرائح للتحقق من درجة الحرارة في جميع أنحاء الحضانة (الشكل 2C).
- متعدد القطب التسجيلات مجموعة
- استخدام مستو المصفوفات متعددة القطب-120 مع أقطاب نيتريد التيتانيوم (30 ميكرون القطر) معزولة مع نيتريد السيليكون والإلكترود المرجعي الداخلي، مرتبة في مصفوفة 12 × 12 مع 200 ميكرون مركز إلى مركز تباعد. ملاحظة: تكوينات أخرى مع قطر القطب مختلف وتباعد ممكنة. على وجه الخصوص، ورقاقة MEA يمكن اتسعت لتذوق شرائح أكبر من الأنسجة البشرية.
- الحصول على إشارات كهربائية عند 10 كيلو هرتز باستخدام نظام MEA2100-120 (قبل وفايمكبر للصوت lter مع اكتساب متكامل البيانات وتحويل التناظرية الرقمية، القرار بيانات 16 بت، نطاق الإدخال الجهد قابل للتعديل وعرض النطاق الترددي عبر البرامج) من خلال برنامج مخصص (MC_Rack). ملاحظة: وهبت وheadstage MEA2100 من لوحة معدنية لإصلاح عنصر نضح heatable من خلال أصحاب المغناطيسي، ليروي باستمرار شرائح طوال الدورة التسجيل.
- عقد الأنسجة أسفل على MEA بواسطة مرساة البلاتين صغيرة محلية الصنع، والتي تضمن الربط الكهربائي جيدة بين شريحة والأقطاب.
4. إعداد غرفة اجهة وأدوات تشريح وتقطيع
- غرفة اجهة
- ملء الجزء السفلي من واجهة الغرفة مع الماء المقطر. تأكد من أن مستوى المياه يغطس تماما عنصر التدفئة وغير 2 إلى 4 ملم دون تقاطع بين الجزء السفلي والعلوي من الغرفة. تحقق هذا المستوى يوميا قبل التحول على التدفئة،من أجل تجنب الضرر من عنصر التدفئة.
- ربط الغرفة لمصدر كربوجين، وهبوا منظم التدفق الثانوي للتعديلات دقيقة لضغط الغاز.
- قطع ورقة من النسيج عدسة لتناسب مساحة الشقة من غرفة شريحة وضعه قريبا من أنابيب حل المدخلات، والسماح لأية فقاعة الهروب من سطر الإدخال قبل الوصول إلى شرائح.
- قطع قطعتين من خيط القطن الذين تقطعت بهم السبل طالما أن قطعة من نسيج العدسة، والموقف منها على طول الجانبين الرئيسية للمنطقة مسطحة من الغرفة. ملاحظة: هذا يساعد على زيادة طفيفة في مستوى حل نضح في الغرفة.
- ضبط معدل تدفق المضخة تحوي في 1 مل / دقيقة وتفعيل مضخة.
- بدء الأوكسجين من الماء في الجزء السفلي من الغرفة.
- ضبط درجة الحرارة وحدة تحكم في درجة الحرارة على 37 درجة مئوية وتشغيله. تغطية الجزء العلوي من الغرفة مع واجهة قطعة من parafilm والانتظار على الأقل 30 دقيقة لtemperatلدى عودتهم إلى زيادة واستقرار.
- أدوات لتشريح وتقطيع
- إعداد عدة تشريح تتكون من اثنين من ملقط غرامة، ملعقة، ملعقة صغيرة والنصل. اثنين من الزجاج أطباق بتري، وهما الفرش وكذلك الغراء cyanoacrylate.
- تعيين المعلمات من vibratome: سمك 400 ميكرون. التردد 70-90 هرتز. السعة، 0،9-1 ملم، والسرعة: 0.1 ملم / ثانية.
5. الإنسان القشرية شريحة التحضير
- إزالة ACSF القائم على السكروز من -80 درجة مئوية الفريزر ومزجها للحصول على نوع من طين. الأوكسجين مع كربوجين، وطرح ~ 250 مل في زجاجة والحفاظ عليه في زجاجة ديوار مليئة الجليد، في حين يذهب إلى غرفة الجراحة في المستشفى للحصول على الأنسجة. في هذه الأثناء، والحفاظ على ما تبقى عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
ملاحظة: أثناء الجراحة والاعصاب يشرح كتلة صغيرة من الأنسجة القشرية. وضع على الفور العينة في الجليد الباردة السكروز ACSF لنقلها إلى المختبر. - الحفاظ على الوقت اللازم لنقل من المستشفى إلى المختبر لمدة أقصاها 30 دقيقة. في المختبر، واتخاذ ACSF الاوكسيجين القائم على السكروز من -20 درجة مئوية الفريزر، ومزجها لديك طين، وملء طبق بتري وعلبة عازلة vibratome والبدء بالاكسجين سواء مع كربوجين. تأخذ بعناية قطعة من الأنسجة البشرية من الزجاجة مع ملعقة ووضعها في طبق بتري (الشكل 2D).
- باستخدام ملقط، بعناية إزالة الجلطات الدموية والأوعية والسحايا لتجنب المقاومة أثناء تشريح. إزالة السحايا، التي تتألف في الحنون المسألة، بدءا من الجانبين من كتلة الأنسجة، مع إيلاء اهتمام لا يلحق الضرر السطح القشري. مع شفرة، وقطع الجانب من النسيج للحصول على سطح مستو، والتي سيتم لصقها على لوحة العينة vibratome. ملاحظة: السحايا، التي تتألف في الحنون المسألة، تتم إزالة بدءا من الجانبين من كتلة الأنسجة، مع إيلاء اهتمام لا يلحق الضرر السطح القشري.
- إذا كانت كتلة من منظمة الشفافية الدوليةssue أكبر من غرفة MEA، وقطع قطعة من أبعاد المناسبة قبل الإلتصاق على لوحة عينة (الشكل 2E).
- الغراء الأنسجة من أجل الحصول على شرائح القشرية عرضية، ووضعها في علبة عازلة وقطع 400 ميكرون شرائح سميكة على سرعة منخفضة (0.1 ملم / ثانية) (الشكل 2F).
- قطع قطعة من النسيج عدسة ذات أبعاد شريحة. مع ملعقة وفرشاة، ونقل شرائح على هذه الأنسجة عدسة واحتضان لهم في غرفة واجهة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل قبل بدء التسجيلات (الشكل 2G - I). باستمرار تخزين الشرائح في نفس الظروف حتى الاستخدام. ملاحظة: وضع شرائح على ورقة عدسة هو خطوة هامة لتسهيل كل من نضح من الجانب السفلي من شرائح وإزالة شرائح من الغرفة واجهة قبل التسجيل.
- في حين نقل الشرائح على النسيج العدسة، وإدارتها بعناية فائقة، وتجنب لمس منطقة الطبقة القشرية معالفرشاة.
- إعداد الشرائح في وقت واحد ونقل على الفور كل منهم إلى غرفة اجهة، من أجل ضمان امدادات الاوكسجين السليم ودرجة الحرارة؛ شريحة كتلة من الأنسجة مقطوعة في أسرع وقت ممكن.
6. إعداد إعداد MEA للتسجيلات
- توصيل نظام نضح لمضخة تحوي ونظام MEA إلى جهاز كمبيوتر. الأوكسجين تسجيل ACSF. وضع رقاقة MEA فارغة داخل مكبر للصوت.
- تعيين تحكم في درجة الحرارة لتسخين عنصر قنية لتصل إلى 37 درجة مئوية في غرفة MEA ويبدأ نضح في 5-6 مل / دقيقة. ملاحظة: عادة ما يكون ضروريا لضبط درجة حرارة 3-4 درجة مئوية أعلى من المطلوب واحد، اعتمادا على درجة حرارة الغرفة ومعدل التدفق.
- تحقق من درجة الحرارة في غرفة MEA مع ميزان حرارة غرامة، ووضعها أقرب إلى مركز ممكن، دون لمس منطقة القطب.
- بدء التسجيل سوفتواريالبريد والتحقق من أن جميع الأقطاب MEA ترتبط بشكل جيد وأنه لا يوجد أي ضوضاء بسبب التروية.
- بدء MEA_Monitor للتحقق من سير العمل في الجدول الكاميرا.
7. نقل أن شريحة من الغرفة واجهة لMEA رقاقة لتسجيل
- صب بعض تحسنت تسجيل ACSF في طبق بتري الزجاج؛ مع ملقط، وتأخذ شريحة من الغرفة واجهة، عن طريق الاستيلاء عليها من خلال نسيج العدسة، ووضعها في طبق بتري. فصل بعناية شريحة من النسيج. إذا تم تعديل بعناية المستوى من الحل في غرفة واجهة خلال فترة الحضانة، فإن شريحة فصل من الأنسجة إلا من خلال عدسة غمر في الحل. خلاف ذلك، واستخدام فرشاة صغيرة لتسهيل انفصال.
- ملء رقاقة MEA مع بعض ACSF ومع ملعقة، ونقل شريحة فيه. مع البلاستيك باستور ماصة، وإزالة بلطف الحل لجعل شريحة تلتزم على منطقة القطب والاحتفاظ بها في مكان مع ANCH البلاتينأو. إضافة 1 مل من تسجيل ACSF، ضع شريحة MEA في مكبر للصوت والبدء نضح في 5-6 مل / دقيقة (الشكل 2J - L).
- التحقق من موقف شريحة على منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا تسجيل باستخدام MEA_Monitor، تعديله إذا لزم الأمر من أجل تسجيل من الطبقات القشرية والتقاط صورة. بدء التسجيل.
Representative Results
تسجيل النشاط البشري شريحة القشرية يبدأ حين perfusing الأنسجة مع التسجيل العادي ACSF (كما هو موضح سابقا) 7،8. في هذه الحالة، عندما يتم الحفاظ على الأنسجة أثناء الجراحة، وكذلك في وقت لاحق خلال نقل الأنسجة من إعداد المستشفى وشريحة، ويمكن للمرء أن يلاحظ النشاط العفوي، في شكل أحداث شبيهة النشبات الصغيرة، والكشف عن مجموعات صغيرة من أقطاب الشرق الأوسط وأفريقيا. وتألفت التصريف مثل النشبات في إمكانيات الحقل، عادة ثنائية الطور، تتألف من انحراف سلبي حاد الأولي، حيث بلغ عشرات microvolts، تليها موجة معاكسة تعد تستغرق عدة عشرات من ميلي ثانية. وعادة ما تكون جزءا لا يتجزأ من أنشطة متعددة الوحدات السريعة في إمكانيات الحقل أساسا في الجزء الأول. ويتضح من الأمثلة التمثيلية النشاط مثل النشبات في الشكل 3Aii، حيث يظهر أثر سجلتها قطب الشرق الأوسط وأفريقيا.
لتسجيل نوبات الصرع من فيالمختبر شرائح القشرية الإنسان، فمن الضروري أن يروي لهم مع "مولدة للصرع" ACSF، التي المغنيسيوم 2+ غائب ويتم رفع K + إلى 6 ملم، لتعزيز الأنسجة استثارة 1 (زيادة K + من 3 إلى 6 ملم وحده لا يكفي للحث على المضبوطات، والبيانات لا تظهر). مرة نضح مع 0 المغنيسيوم 2+ 6 ملي K + ACSF بدأت، ونشاط شرائح القشرية يزيد تدريجيا ويبدو الاستيلاء الأول في غضون 15 إلى 20 دقيقة (15.4 ± 1.7 دقيقة، ن = 10، 5 من المرضى، الشكل (3) منظمة العفو الدولية ). نحن أثار النشاط مثل نشبي، كما هو مبين في الشكل (3)، في 75٪ من المرضى اختبار و66.7٪ من جميع شرائح المسجلة.
تسجل نشاطات الصرع من الأقطاب الكهربائية المجاورة للرقاقة الشرق الأوسط وأفريقيا، ومقارنة ديناميات بداية الأحداث المحتملة المجال يسمح يدرسون موقعهم من سفر التكوين والانتشار. والاستيلاء تمثيلي المسجلة من شريحة من همهمةويرد على قشرة الدماغ مع نظام MEA في الشكل 3B (أثر الممثلين الاستيلاء سجلت من قبل القطب MEA واحد هو مبين في القرار الزماني العالي في الشكل 3 AIII). لاحظ أن مصادرة يسجل تقريبا من جميع الأقطاب من الشريحة الشرق الأوسط وأفريقيا، مما يشير إلى أنه قادر على نشر إلى منطقة القشرية كبيرة. وعلاوة على ذلك، والنظر في آثار واحدة سجلت كل من القطب، فمن الممكن لمراقبة انتشار التدريجي للاستيلاء عبر النسيج: في الواقع، ويبدأ لأول مرة في المنطقة القشرية التي تغطي النصف الأيمن من مجموعة القطب، وينتشر تدريجيا ل المنطقة التي تغطي النصف الأيسر (. ط ه، ومقارنة آثار من L6 القطب وB6، الشكل 3B).
الشكل 1: أ النمو الشاذ لالقشريةهو تصور د زواله الجراحية نوع أ تايلور التنسج القشري البؤري (السهم الأبيض) جزءا لا يتجزأ من الفص الجبهي الأيسر التلم على التصوير بالرنين المغناطيسي قبل الجراحة (A)، وأكد في وقت لاحق من خلال وضع العلامات كيناز الفحص النسيجي (ب) خريطة؛ شريط مقياس: 200 ميكرون) مما يدل على dyslamination القشرية، الخلايا العصبية غير الطبيعية والمسار على الخلايا العصبية مع الهجرة غير مكتملة في المادة البيضاء أقل. أثناء الجراحة، المترجمة إلى النمو الشاذ وفقا لبيانات التصوير بالرنين المغناطيسي مع نظام neuronavigation (C). تصور التلفيف التي تحتوي على التنسج أثناء الجراحة (D).
الشكل 2: معدات وإجراءات إعداد شريحة القشرية البشري يتم استخدام غرفة اجهة للحفاظ على شرائح القشرية الإنسان فيفو السابقين (A). بقية شرائح على ورقة من النسيج عدسة في منطقة مسطحة في الجزء العلوي من غرفة (B)، حيث استشعار درجة الحرارة (C، اليسار)، متصلا إلى وحدة تحكم في درجة الحرارة (C، الحق، حتى) من خلال مزدوج كابل العضوية (C، حق، أسفل)، يتم وضعها للحفاظ على 37 درجة مئوية طوال الوقت شريحة الحضانة. وبمجرد الحصول عليها، ضع مقطوعة كتلة من الأنسجة في طبق بتري مليئة الجليد الباردة ACSF القائم على السكروز (D) وإزالة الجلطات الدموية والأوعية والسحايا، لتسهيل التقطيع. إذا كانت كتلة الأنسجة أكبر من غرف MEA، عزل قطعة من أبعاد مناسبة بشفرة (E) والغراء على لوحة العينة vibratome (F). قطع 400 ميكرون شرائح سميكة وبمساعدة ملعقة (G) نقلها على قطع من الأنسجة عدسة (H)، واحتضان لهم في غرفة واجهة (I). قبل التسجيل، ريمولقد أنسجة عدسة من قبل غمر الشريحة في طبق بتري مليئة ACSF وتحويلها إلى ACSF شغل MEA رقاقة مع ملعقة (J). إزالة الحل للسماح للشريحة تلتزم في الشرق الأوسط وأفريقيا (K) ويبقيه في المركز باستخدام مرساة البلاتين. وضع MEA في مكبر للصوت (L)، وبدء نضح والتسجيل.
الرقم 3: التسجيلات MEA من نوبات الصرع في شرائح القشرية الإنسان (A) يظهر تتبع ممثل من النشاط البشري شريحة القشرية التي سجلتها قطب الشرق الأوسط وأفريقيا في لوحة ط. بحضور ACSF طبيعي، فمن الممكن لمراقبة النشاط مثل النشبات العفوي (مستطيل رمادي صغير، التكبير في لوحة الثاني)؛ ثم، عندما نضح مع 0 المغنيسيوم 2+ 6 ملي K + ACSF قد بدأ، وseizu الأولإعادة يظهر بعد ~ 15 دقيقة تأخير وتبعتها أحداث أخرى في فترة 2-3 دقائق. لوحة الثالث يظهر الحجز في المستطيل الرمادي الكبير في الفريق الأول مع نطاق التكبير. ويوضح تتبع الأزرق التكبير من النشاط، كما يتبين من الخط الأزرق والسهم. الجلسة الرابعة) تظهر البيانات المصورة في لوحة III) تمريرة عالية تصفيتها في 250 هرتز، والتي تكشف متعددة وحدة النشاط عند التكبير (تتبع الأزرق). (ب) تسجيل ممثلا لمصادرة بحضور 0 المغنيسيوم 2+ 6 ملي K + ACSF من جميع أقطاب الشرق الأوسط وأفريقيا. يمثل كل مربع إلكترود 12 × 12 MEA مجموعة ويظهر نافذة الوقت 80 ثانية؛ خط منقط يشير إلى موضع السطح القشري نسبيا لمجموعة الشرق الأوسط وأفريقيا.
Discussion
Pharmacoresistant الصرع هو حالة نادرة، والتي يمكن استكشافها في الأنسجة البشرية في المختبر. وهذا يسمح بدراسة القشرة الإنسان الصرع، والذي يعرض العيوب المحددة التي استنسخت جزئيا فقط في النماذج الحيوانية. طريقة وصفها هنا يسمح بإعداد وتسجيل الأنسجة البشرية ما بعد الجراحة المجراة سابقا مع الحفاظ على سلامة والشبكات بحيث تنتج بشكل عفوي الصرع الأنشطة الخلوية. الاحتفاظ بأنشطة مماثلة من تلك المسجلة في الجسم الحي لا بد من دراسة آليات نشأة الأنشطة المرضية. وعلاوة على ذلك، تسمح هذه الطرق استكشاف الأنسجة البشرية والحيوانية تجنب نماذج مثالية غير المرض. ومع ذلك، ودراسة الأنسجة البشرية يتطلب التزامن بين جراحي الأعصاب والمختبر التجريبي. يتطلب نقل الأنسجة الرعاية الخاصة لا تكون مؤلمة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن كلا من كمية العينات والأنسجة محدودة. أخيرا، والوصول إلى الأنسجة الرقابة السليمة هي ماين القلق. مع هذا المستحضر، الأنسجة بعد العملية تنتج بشكل عفوي التصريف مثل النشبات في العادي ACSF 7،8. كما يمكن استخلاصها أحداث شبيهة نشبي في تعديلها، ACSF proconvulsive بحيث يمكن التحقيق في آليات بدء الحجز والانتقال من دولة إلى النشبات المضبوطات.
الأنسجة البشرية يمكن أن تظل قابلة للحياة لمدة تصل إلى 10 ساعة في ظروف واجهة. واعتبرت شرائح قابلة للحياة عندما لوحظ نشاط أو مجال وحدة متعددة الإمكانات بشكل عفوي وعندما أثار هذه الأنشطة عن طريق زيادة استثارة من خلال زيادة البوتاسيوم خارج الخلية و / أو نقص المغنيسيوم. على الرغم من التقلبات في النشاط ويحدث، من المرجح أن تعكس الاختلافات في الأمراض والمناطق القشرية، اكتشفنا خصائص المولدة للصرع من الأنسجة فقط في شرائح صحية تظهر عفوية وأثار النشبات التصريف نشبي. من أجل الحفاظ على حيوية الأنسجة والنشاط، يتم استخدام واجهة غرفة لتخزين ركان شرائح في 36-37 درجة مئوية لمدة التعافي قبل التسجيل مع نظام MEA. في الواقع، العديد من الجماعات قد أظهرت بوضوح مزايا نظام التخزين القائمة على واجهة مقابل تخزين دورق قياسي وأهمية درجة الحرارة للحفاظ على نشاط الشبكة مثل عفوية حادة موجة التموجات أو الذبذبات التي يسببها الكوليني 9،10. تخزين واجهة من شرائح تم استخدامها سابقا لتسجيل النشاط الصرع من قرن آمون البشري وشرائح مرفدي 1،11. مع تقنية MEA الحالية، بعد فترة النقاهة تشريح في ظروف من واجهة، يتم تسجيل نشاط الشبكة في ظروف المغمورة، في حضور ارتفاع معدل التدفق (5-6 مل / دقيقة) عند 37 درجة مئوية، مع نظام MEA. انخفاض قطرها (1.8 سم) من رقاقة MEA، ما يخفف من حجم غرفة صغيرة (<1.5 مل)، مع زيادة معدل التدفق، ويعزز امدادات الاوكسجين للشريحة التي ثبت أن تكون عاملا حاسما لعفوية وفاrmacologically الناجم عن أنشطة الشبكة 9،10. وعلاوة على ذلك، فإن المبلغ المخفض تعميم ACSF يسهل الاختبار الدوائي.
إجراء تشريح هو إلا وصدمة للأنسجة 12. ويبدو أن كلا العمارة العصبية وكلوريد التوازن أن مضطرب على سطح الأنسجة (50 ميكرون). أصل الأنشطة التي سجلتها رقائق MEA، الذي عينة الأنسجة في معظمها سطحية دون اختراق عميق، قد تنشأ من المناطق المصابة. ومع ذلك، تظهر بياناتنا أن إمكانات حقل خارج الخلية المكتشفة محليا يتم تسجيلها في معظم أقطاب الشرق الأوسط وأفريقيا وإظهار الأعمال السابقة التي تتكامل أنهم على مسافة من 100 الى 200 ميكرون من موقع تسجيل 13، مما يشير إلى أن المضبوطات المسجلة في إعداد دينا من غير المرجح أن يكون التي تنتجها المناطق المصابة. وعلاوة على ذلك، في الدراسات التي أجريت مع أقطاب التنغستن تمكين اختراق عميق، والأنشطة الصرع المسجلة في الأنسجة البشرية متشابهةلتلك التي لوحظت في مرضى الصرع 1،7،8.
حد آخر من خارج الحي تسجيل الأنسجة هو تعطيل الاتصالات بين مناطق الدماغ المختلفة، وبالتالي تقييد neuromodulations ديناميكية. هذا قد يفسر لماذا في مثل هذه الأنسجة يتم تسجيلها بشكل عفوي أي حال من تشبه نشبي، ولكن يتطلب أن يكون سببها التلاعب الأيونية أو الدوائية تحفيز تعزيز استثارة. وفقا لذلك، في هذا البروتوكول، وبفعل أحداث مثل الاستيلاء من خلال الجمع بين التغير في K + خارج الخلية من 3 إلى 6 ملم والحد من المغنيسيوم 2+ الخارجي من 1.3 ملم إلى المغنيسيوم 2+ خالية ACSF، من أجل زيادة استثارة الأنسجة وإزالة المغنيسيوم 2+ NMDA معتمد على كتلة المستقبلة. في الواقع، قد سبق تبين أن نشاط صرعي يتسبب في شرائح القشرة المخية الحديثة وقرن آمون الإنسان باستخدام المغنيسيوم 2+ خالية ACSF يشبه المضبوطات electrographic المسجلة في الجسم الحي 14. الى جانب ذلك،وقد تبين أن عمليات التصريف صرعي حصلت في شرائح الفص الصدغي تصبح مقاومة للمضادات المستخدمة سريريا بعد التعرض لفترات طويلة للالمغنيسيوم 2+ خالية ACSF 15،16، وبالتالي تقديم نموذج للتحقيق في أحداث pharmacoresistant مثل الاستيلاء في المختبر.
الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تتيح تسجيل على حد سواء، امكانات الحقل وأنشطة متعددة الوحدات التي تتكون في الخلايا العصبية إمكانات العمل خارج الحي. وبالتالي، الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف هي أداة قوية الكهربية مقابل رسم المخ، مما استكشاف امكانات الحقل الناتجة عن أنشطة وقت واحد من الفرق العصبية في الجسم الحي، ولكن لا تعطي الوصول إلى الخلايا العصبية واحدة السلوكيات 17. على الرغم من أن أكثر الميكروية الأخيرة يمكن تسجيل أنشطة متعددة الوحدات التي تتكون في الجسم الحي في إمكانات العمل العصبية، فهي الغازية، بحيث يقتصر استخدامها في الغالب لغرض الأبحاث خلال التسجيلات داخل الجمجمة. على وجه الخصوص، والتسجيلات الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تمثل الأسلوب المفضللدراسة الأنماط المكانية والزمانية لأحداث الصرع، وآليات الضبط والسيطرة على بداية انتشار والعمل من العقاقير المضادة للصرع الكلاسيكية والجديدة. بشكل ملحوظ، لكشف أنواع الخلايا وأساس إشارات من التصريفات الصرع، ارتفاع تقنيات الفرز ويجب الجمع بين التجارب الدوائية مع تقنيات الشرق الأوسط وأفريقيا. على الرغم من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف يمكن أن تعطي الوصول إلى طفرات فردية، فإنها لا توفر معلومات حول الخصائص الفيزيائية الحيوية ومتشابك. في المستقبل، يجب أن يقترن تقنيات أخرى لتسجيلات الشرق الأوسط وأفريقيا من أجل تحسين السلوك الخلوي عينة، وأنشطة الشبكة وإشارات متشابك. على سبيل المثال، والتصوير مضان لكشف الخلايا العصبية أو سلوك الخلايا الدبقية، وكذلك ديناميات أيون، يمكن الجمع بين الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف التسجيلات. يمكن للمزيد من التحليل اللاحق النسيجي تكشف أيضا عن تغييرات محددة من أنواع الخلايا والبروتينات أو مستقبلات بحيث يمكن ربط موقع الصرع مع إعادة ترتيب الأنشطة المحددة للهيكل العصبي. ويمكن أيضا أن تكون جزءا لا يتجزأ نظام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف في التصحيح، المشبك انشاء لربط الخلايا واحد أو المواصلة مع الأنشطة السكانية. في المستقبل، ويمكن أيضا أن تستخدم أدوات optogenetic، شريطة أن شرائح الإنسان يمكن تربيتها في المدى الطويل، كما أجريت لشرائح عضوي النمط، بحيث ترنسفكأيشن أو العدوى من أنواع معينة من الخلايا لا يمكن أن يؤديها.
Disclosures
وقدمت رعايتها من قبل أنظمة متعددة القنوات لإنتاج ونشر الفيديو والوصول المفتوح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من وكالة الاستخبارات الوطنية (بلان برنامج العلوم العصبية)، FRC (الاتحاد من أجل لا بحوث SUR LE Cerveau)، مدينة باريس (ظهور البرنامج)، INSERM ومستشفى لا بيتييه Salpêtrière (عقد الأبحاث المترجمة) إلى NR، من Neuropôle دي بحوث Francilien ([نرف]) إلى الضعف الجنسي، من جامعة بيير وماري كوري UPMC (التقارب برنامج) ومن معهد دو Cerveau آخرون البريد لا Moelle epiniere (باريس) إلى GH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Slice Chamber-2: Interface | AutoMate Scientific, Inc. | S-BSC2 | It requires separate temperature controller |
| 2-channel Temperature Controller | Multichannel Systems, Germany | TC02 | It allows to plug in and use 2 interface chambers. |
| Special cable for connection of TC01 to S-BSC2 with external reference PT100 | Multichannel Systems, Germany | CA3 | The reference PT100 is placed near the slices |
| 6pin plug-connector with PT100 | Multichannel Systems, Germany | TS-PT100 | External reference for CA3 cable |
| MEA workstation for recording data from 120-electrode MEAs | Multichannel Systems, Germany | MEA2100-120 | It includes MEA2100-120 headstage and MEA2100 interface board. www.multichannelsystems.com |
| Microelectrode array for MEA2100-120 | Multichannel Systems, Germany | 120MEA200/30 | Electrode spacing: 200 µm; electrode diameter: 30 µm; glass ring: 6 mm high. Different configurations (spacing, diameter, ring) possible. |
| Video Microscope Table | Multichannel Systems, Germany | MEA-VMT-1 | Table with a video microscope underneath to image the electrode field of the MEAs in an amplifier placed on top of the table and transfer the image to a computer. |
| Perfusion cannula | Multichannel Systems, Germany | PH01 | Heatable perfusion cannula with temperature sensor; temperature can be programmed with TC02 controller |
| MC_Rack | Multichannel Systems, Germany | Software for data acquisition and recordings | |
| Magnetic Perfusion Holder | Multichannel Systems, Germany | MPH | Magnetic perfusion holder for PH01 element to fix the perfusion cannula and connect the perfusion system to the amplifier's ground |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | Software for data analysis; info@neuroexplorer.com | |
| Peristaltic pump (drive unit) | Gilson | F155001 | 0,01 to 48 rp |
| Peristaltic pump (pump head) | Gilson | F117800 | R2 two channel |
| Ultrasonic aspirator | Integra Life sciences, USA | Cusa Excel + | It allows blunt subpial dissection of the cortex |
| Neuronavigation | Isis Solutions, France | Surgiscope | It allows real time identification of the brain structure on the preoperative MRI |
| Vibratome HM 650 V | Microm | Block slicing into 400 μm thick slices |
References
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).
- Kwan, P., Brodie, M. J. Early identification of refractory epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
- Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Longterm stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multielectrode arrays. Neuroscience Letters. 361 (1-3), 86-89 (2004).
- Sun, J. -J., Luhmann, H. J. Spatio-temporal dynamics of oscillatory network activity in the neonatal mouse cerebral cortex: Network oscillations in neonatal cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1995-2004 (2007).
- Dossi, E., et al. Functional Regeneration of the ex-vivo Reconstructed Mesocorticolimbic Dopaminergic System. Cerebral cortex. 23 (12), New York, N.Y. 2905-2922 (1991).
- Darbon, P., Scicluna, L., Tscherter, A., Streit, J. Mechanisms controlling bursting activity induced by disinhibition in spinal cord networks. The European journal of neuroscience. 15 (4), 671-683 (2002).
- Cohen, I., et al. On the Origin of Interictal Activity in Human Temporal Lobe Epilepsy in Vitro. Science. 298 (5597), 1418-1421 (1126).
- Huberfeld, G., et al. Perturbed chloride homeostasis and GABAergic signaling in human temporal lobe epilepsy. The Journal of neuroscience. 27 (37), 9866-9873 (2007).
- Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An Approach for Reliably Investigating Hippocampal Sharp Wave-Ripples In Vitro. PLoS ONE. 4 (9), (2009).
- Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29 (2), 319-327 (2009).
- Wittner, L., et al. The epileptic human hippocampal cornu ammonis 2 region generates spontaneous interictal-like activity in vitro. Brain. 132 (11), 3032-3046 (2009).
- Dzhala, V., Valeeva, G., Glykys, J., Khazipov, R., Staley, K. Traumatic alterations in GABA signaling disrupt hippocampal network activity in the developing brain. The Journal of neuroscience. 32 (12), 4017-4031 (2012).
- Menendezdela de la Prida, L., Huberfeld, G., Cohen, I., Miles, R. Threshold Behavior in the Initiation of Hippocampal Population Bursts. Neuron. 49 (1), 131-142 (2006).
- Avoli, M., Drapeau, C., Louvel, J., Pumain, R., Olivier, A., Villemure, J. -G. Epileptiform activity induced by low extracellular magnesium in the human cortex maintained in vitro. Annals of neurology. 30 (4), 589-596 (1991).
- Heinemann, U., Dreier, J., Leschinger, A., Stabel, J., Draguhn, A., Zhang, C. Effects of anticonvulsant drugs on hippocampal neurons. Hippocampus. 4 (3), 291-296 (1994).
- Li Zhang, C., Dreier, J. P., Heinemann, U. Paroxysmal epileptiform discharges in temporal lobe slices after prolonged exposure to low magnesium are resistant to clinically used anticonvulsants. Epilepsy research. 20 (2), 105-111 (1995).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents - EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
