Summary
Wir beschreiben, wie man Multi-Elektroden-Array-Aufnahmen des menschlichen epileptischen Rindengewebe durchzuführen. Epileptische Geweberesektion, Scheibe Vorbereitung und Multi-Elektroden-Array-Aufnahmen interiktaler und iktale Ereignisse detailliert gezeigt.
Abstract
Epilepsie betrifft etwa 1% der Bevölkerung, besteht aus einer Gruppe von neurologischen Störungen, die durch das periodische Auftreten von Anfällen, die normale Gehirnfunktion zu stören. Trotz Behandlung mit derzeit verfügbaren Antiepileptika Targeting neuronale Funktionen, ein Drittel der Patienten mit Epilepsie sind pharmakoresistenter. In diesem Zustand ist die chirurgische Resektion der Gehirnbereich zu erzeugen Anfälle bleibt die einzige alternative Behandlung. Studium der Human epileptischen Gewebe hat dazu beigetragen, neue epileptogenen Mechanismen während der letzten 10 Jahre zu verstehen. Tatsächlich sind diese Gewebe erzeugen spontane interiktalen epileptischen Entladungen sowie pharmakologisch induzierte iktale Ereignisse, die mit der klassischen Elektrotechniken aufgenommen werden können. Bemerkenswert ist, Multi-Elektroden-Arrays (MEAs), die mikrogefertigten Geräte Einbettung eine Reihe von räumlich angeordneten Mikroelektroden sind, bieten die einmalige Gelegenheit, gleichzeitig stimulieren und Datensatzfeld Potentials sowie Aktionspotentiale von mehreren Neuronen aus verschiedenen Bereichen des Gewebes. So bieten MEAs Aufnahmen einen ausgezeichneten Ansatz, um die räumlich-zeitlichen Muster der spontanen interiktalen und evozierte anfallsähnliche Ereignisse und die Mechanismen Anfallsbeginn und Vermehrung zugrunde liegenden studieren. Hier beschreiben wir, wie man menschliche kortikale Scheiben von chirurgisch entfernten Gewebe vorzubereiten und mit MEAs interiktalen und iktale ähnliche Ereignisse ex vivo aufzeichnen.
Introduction
Epilepsie ist eine chronische Erkrankung, bei der epileptischen Anfällen, die intermittierende gemusterten Entladungen über mehrere Sekunden bis zehn Sekunden auf Elektroenzephalogramm (EEG) Aufnahmen mit klinischen Manifestationen assoziiert sind, unterbrechen, eine interiktalen Zustand, gekennzeichnet durch das Vorhandensein von Synchron neuronaler Entladungen dauerhafte zehn Millisekunden und rief interiktalen Veranstaltungen ein. Es betrifft etwa 1% Weltbevölkerung und obwohl Anfälle sind in der Mehrzahl der Patienten gesteuert, weiß etwa ein Drittel der Menschen mit Epilepsie nicht angemessene Reaktion auf Antiepileptika 2 zeigen. In diesem Zustand, genannt pharmakoresistenter Epilepsie und deren Mechanismen müssen noch eindeutig identifiziert werden kann, die chirurgische Resektion des bestimmten Teil des Gehirns als die Beschlagnahme-onset Zone identifiziert bleibt die einzige alternative Behandlung, die ein positives Ergebnis für die Patienten. Somit sind die reseziert Proben von der Operation ergeben die Möglichkeit, die Mechanismen der interiktalen Einleitungen und Anfallsentstehung und -ausbreitung sowie Pharmakoresistenz auf lebensfähige menschliche Zentralnervengewebe ex vivo zu studieren.
Multielektrodenanordnungen (MEAs), bestehend aus einer Anordnung von räumlich verteilten Mikroelektroden ermöglichen die gleichzeitige Stimulation und Erfassung von elektrophysiologischen Aktivität von mehreren Stellen des Gewebes, wodurch eine exzellente Vorgehensweise, um die räumlich-zeitliche Muster der spontanen und evozierten Aktivität zu untersuchen . Diese Technik, die zuerst auf die entwicklungsbedingten Veränderungen der neuronalen Aktivität der Zellkultur zu überwachen und dann 3 für akute und organotypischen Gehirn und Rückenmark Scheiben 4 angepasst - 6, die gegenwärtig als ein wertvolles Werkzeug elektro.
Das aktuelle Protokoll beschreibt, wie die menschliche kortikale Scheiben von chirurgisch entfernten Gewebe vorzubereiten und mit MEAs zuverlässige ex vi aufnehmenvo interiktalen und Beschlagnahme-ähnliche Ereignisse von diesen Scheiben. Diese Technik stellt somit ein Weg, um die grundlegenden Mechanismen, die epileptische Aktivitäten Initiation, Ausbreitung und die Auswirkungen von Antiepileptika sowohl auf zellulärer und Netzebenen anzusprechen. Alle verwendeten, um zu erhalten, bereiten, zu pflegen und aufzeichnen menschlichen Scheiben Verfahren werden hier im Detail beschrieben.
Protocol
HINWEIS: Die hier beschriebene Protokoll folgt den Richtlinien des Französisch "Comité Consultatif National d'Ethique" und wird als eine Sammlungstätigkeit von INSERM erklärt.
1. Die Resektion der Menschen Epileptische Tissue
- Patienten
- Erhalten Hirngewebe von Patienten mit schwer behandelbarer Epilepsie. Besorgen Sie sich eine schriftliche Einverständniserklärung vor der Operation.
- Für alle betrieben Epilepsiepatienten führen eine umfangreiche präoperative Aufarbeitung einschließlich neurologische Untersuchung, neuropsychologische Beurteilung, Oberflächen EEG und bildgebenden Verfahren (MRT und manchmal 18 FDG-PET-Scan; 1A), gefolgt von postoperativen histologischen Untersuchung des resezierten Gewebes (1B) . HINWEIS: Eine Operation ist dann indiziert, wenn die vielfältigen Erkundungen lokalisieren ähnlich den Anfallsbeginn Zone und wenn der Nutzen der Entfernung die chirurgischen Risiken übersteigt.
- Chirurgie
- Maintain Antiepileptika präoperativ. Führen Operation unter Vollnarkose: Induktion mit inhalierten Sevofluran (6% zugeVerhältnis und 100% inhaliert Bruchteil O 2), intra venösen Sufentanyl (0,3 ug / kg) und antracurium (0,5 mg / kg), gefolgt von Wartung mit intra venösen Sufentanyl (0,5 g / kg / h), und inhaliert Sevofluran (1 MAC).
- Verwenden Sie einen Neurosystems, eine genaue Lokalisation des lädierten Kortex (1C) zu ermöglichen. Nach Hautschnitt, führen ein Bohrloch im Knochen, gefolgt von einer Kraniotomie mit einer hohen Laufbohrmaschine. Erhöhen Sie vorsichtig die Knochendeckel und öffnen Sie die Dura mit einer Schere (1D).
- Verwenden intraoperativen Ultraschall die Identifikation des anormalen Cortex und mikrochirurgischen Instrumenten und ein Ultraschallstrahlpumpe unter dem Operationsmikroskop zu erleichtern.
- Gerinnen und schneiden den pio-Arachnoidalscheide Ebene nach den Furchen Grenzen. Verwenden subpialen Dissektion zu rmitteilung die Rinde von der pia um den verletzten Bereich.
- Schneiden Sie die weiße Substanz unter der anomalen Kortex zu einem Stück "en bloc" Resektion durchführen und erspart so viel wie möglich das Gefäßsystem. Vermeidung traumatischer Manipulation des Kortex.
- Schneiden eine 1 cm dicke Scheibe aus dem resezierten Gewebes entlang einer Richtung orthogonal zu der Pia-Oberfläche, einschließlich des Sulcus Boden und Übergangs Kortex.
2. Künstliche Liquor (ACSF) zur Scheibe Vorbereitung, Inkubation und Recording
- ACSF für Schnittpräparat
- Herstellung von 1 l Saccharose basierenden ACSF 7,8, enthaltend (in mM): 250 Sucrose, 3 KCl, 25 NaHCO 3, 10 D-Glucose, 1 CaCl 2, MgCl 2 10; Auflösen dieser Salze in entionisiertem Wasser und mit Sauerstoff der Lösung mit Carbogen für mindestens 10 min.
- Setzen ~ 700 ml Saccharose ACSF bei -80 ° C für 50-60 min (oder -150 ° C für 15-20 min). Halten Sie den Rest derLösung unter Sauerstoffversorgung im Eis. HINWEIS: Die für ACSF Schnittpräparat kann bei 4 ° C gelagert werden; In diesem Fall fügen CaCl 2 und MgCl 2 der Tag des Experiments vor Abkühlung.
- ACSF für Slice Inkubation und Aufzeichnungs
- Vorbereitung mindestens 3 L des Aufzeichnungs ACSF 7,8, enthaltend (in mM): 124 NaCl, 3 KCl, 26 NaHCO 3, 10 D-Glucose, 1,6 CaCl 2, 1,3 MgCl 2; lösen diese Salze in VE-Wasser und mit Sauerstoff die Lösung mit Carbogen. Vor dem Hinzufügen von MgCl 2, halten einige ACSF Aufnahmen in 0 Mg 2+ ACSF durchzuführen. HINWEIS: Die Inkubationszeit / Aufnahme ACSF können bei 4 ° C gelagert werden; In diesem Fall fügen CaCl 2 und MgCl 2 der Tag des Experiments.
3. Ausrüstung für Scheibe Inkubation und Recording
- Schnittstelle Kammer zur Scheibe Inkubation
- Verwenden Sie ein Hirnschnittkammer leben Scheiben ex vivo zu erhalten </ Em> in Interface-Modus. HINWEIS: Die Kammer ist aus einem unteren Abschnitt, der die Heizung und den Sensorelementen und einer Keramikwaschflasche enthält und mit destilliertem Wasser gefüllt ist, und einem Oberteil, wobei die Scheiben ruhen auf einem Blatt Linsengewebes in der flachen Fläche in zusammen das Zentrum der Kammer (2A - B).
- Verwenden Sie zwei separate feinen PTFE-Schläuche, durch die das zuvor mit Sauerstoff angereicherten ACSF tritt in die Kammer. HINWEIS: Die Rohre spiralförmig in dem erwärmten Wasser und dem oberen Teil der Kammer zu gelangen; dann wird die Lösung verlässt mittels Kapillarwirkung mit Linsengewebe, das die Lösung in die Ausfahrt Brunnen vermittelt.
- Verbinden die PTFE-Schläuche der Schnittkammer, um eine peristaltische Pumpe, eine kontinuierliche Perfusion der Scheiben mit der zuvor mit Sauerstoff angereicherten Medium zu ermöglichen.
- Erhaltung der hohen Sauerstoffspannung durch Sauerstoffanreicherung mit Carbogen (95% O 2 und 5% CO 2) durch die Keramikblasen. HINWEIS: Diese erwärmt und angefeuchtet Gasmischung erreicht derScheiben im oberen Teil der Kammer durch geeignete Löcher.
- Aufrechterhaltung der Temperatur im oberen Teil der Kammer durch die Kammer mit einer Temperatursteuerung, durch eine spezielle Doppelkabelende mit einem Stecker für die Kammer Heizelement und einen externen Temperatursensor an einem Ende. Legen Sie den Sensor in der Nähe der Scheiben, um die Temperatur in der gesamten Inkubation (2C) zu überprüfen.
- Multi-Elektroden-Array-Aufnahmen
- Verwenden planaren Multielektrodenarrays mit 120 Titannitrid-Elektroden (30 & mgr; m Durchmesser) mit Siliziumnitrid und interne Referenzelektrode isoliert ist, in einer 12 x 12 Matrix mit 200 um Mitte-zu-Mitte-Abstand angeordnet sind. HINWEIS: Andere Konfigurationen mit unterschiedlichen Elektrodendurchmesser und Abstand möglich. Insbesondere kann die MEA-Chip erweitert werden, um größere Scheiben menschliche Gewebe abzutasten.
- Erwerben elektrische Signale bei 10 kHz unter Verwendung einer MEA2100-120 System (Vor- und filter Verstärker mit integrierter Datenerfassung und Analog-Digital-Wandler, 16-Bit-Datenauflösung, Eingangsspannungsbereich und die Bandbreite per Software einstellbar) über eine spezielle Software (MC_Rack). HINWEIS: Die MEA2100 heads wird aus einer Metallplatte zur Befestigung von beheizbaren Perfusion Element durch Magnethaltern ausgestattet, um kontinuierlich perfuse die Scheiben während des Aufnahme-Session.
- Halten des Gewebes auf den MEA mit einer kleinen Platinhausgemachten Anker, der eine gute elektrische Verbindung zwischen der Scheibe und den Elektroden gewährleistet.
4. Herstellung von Schnittkammer und Werkzeuge für Dissection und Slicing
- Schnittstelle Kammer
- Füllen Sie den unteren Teil der Schnittstelle Kammer mit destilliertem Wasser. Sicherzustellen, dass das Niveau von Wasser vollständig eintaucht das Heizelement und 2 bis 4 mm unterhalb der Verbindungsstelle zwischen dem unteren und dem oberen Abschnitt der Kammer. Prüfen Sie diesen Stand täglich vor dem Einschalten der Heizung,Um eine Beschädigung des Heizelementes zu vermeiden.
- Schließen Sie die Kammer auf einen Carbogen Quelle, mit einem Nebenstromregler für die Feineinstellung der Gasdruck dotiert.
- Schneiden Sie ein Blatt Linsengewebe, um den flachen Bereich der Schnittkammer zu passen, und positionieren Sie es in der Nähe Eingabelösung Rohre, um jede Blase Flucht aus der Eingabezeile vor dem Erreichen der Scheiben lassen.
- Schneiden Sie zwei Stücke von gestrandeten Baumwollfaden, solange das Stück Linsengewebe und positionieren sie entlang der wichtigsten Seiten des flachen Bereich der Kammer. HINWEIS: Dies hilft, die Perfusionslösung Spiegel in der Kammer leicht anheben.
- Die Durchflussrate der peristaltischen Pumpe bei 1 ml / min und die Pumpe aktiviert.
- Beginnen die Sauerstoffversorgung des Wassers in dem unteren Teil der Kammer.
- Stellen Sie die Temperatur des Temperaturreglers bei 37 ° C und schalten Sie ihn ein. Decken Sie den oberen Teil der Schnittstelle Kammer mit einem Stück Parafilm und warten Sie mindestens 30 Minuten für die temperature zu erhöhen und zu stabilisieren.
- Werkzeuge für die Präparation und Schneiden
- Bereiten Sie eine Dissektion Kit bestehend aus zwei feinen Pinzetten, Spatel, einem kleinen Löffel und eine Klinge; zwei Glaspetrischalen, zwei Bürsten sowie Sekundenkleber.
- Stellen Sie die Parameter des Vibratom: Dicke, 400 & mgr; m; Frequenz 70-90 Hz; Amplitude von 0,9 bis 1 mm, Geschwindigkeit: 0,1 mm / sec.
5. Menschen Kortikale Scheibe Vorbereitung
- Entfernen Sie die Saccharose-basierten ACSF von -80 ° C Gefrierschrank und mischen Sie es, um eine Art von Schneematsch zu erhalten. Sauerstoff zu versorgen es mit Carbogen, setzen ~ 250 ml in einer Glasflasche und hält sie in einer Flasche Dewar mit Eis gefüllt, während er auf den Operationssaal des Krankenhauses, um das Gewebe zu erhalten. In der Zwischenzeit halten den Rest bei -20 ° C.
HINWEIS: Während der Operation, der Neurochirurg seziert einen kleinen Block von Rindengewebe. Sofort legen Sie die Probe in eiskaltem Saccharose ACSF für die Übertragung an das Labor. - Halten die Zeit für die Übertragung aus dem Krankenhaus zum Labor zu einem Maximum von 30 Minuten benötigt. Im Labor, nehmen Sie die Saccharose-basierten oxygenierten ACSF von -20 ° C Gefrierschrank, mischen Sie es, um einen Schneematsch haben, füllen eine Petrischale und die Vibratom Pufferwanne und starten mit Sauerstoff sowohl mit Carbogen. Entfernen Sie vorsichtig das Stück von menschlichem Gewebe aus der Flasche mit einem Löffel und steckte es in die Petrischale (2D).
- Mit der Pinzette vorsichtig entfernen Blutgerinnsel, Gefäße und Hirnhäuten, um den Widerstand während des Schneidens zu vermeiden. Entfernen Sie die Hirnhäute, die darin besteht, pia-Angelegenheit, ausgehend von den Seiten der Gewebeblock, die Aufmerksamkeit nicht auf die kortikale Oberfläche beschädigen. Mit einem Messer, schneiden eine Seite des Gewebes, um eine flache Oberfläche zu erhalten, die auf dem Vibratom Probenplatte geklebt wird. HINWEIS: Die Hirnhäute, die darin besteht, pia-Materie, werden entfernt ausgehend von den Seiten der Gewebeblock, die Aufmerksamkeit nicht auf die kortikale Oberfläche beschädigen.
- Wenn der Block von tiUSGABE ist größer als die MEA Kammer, schneiden Sie ein Stück passenden Abmessungen vor dem Kleben sie auf dem Probenteller (2E).
- Kleben Sie das Gewebe, um Quer kortikalen Scheiben zu erhalten, legen Sie sie in der Pufferwanne und schneiden 400 um dicke Scheiben bei niedriger Geschwindigkeit (0,1 mm / sec) (2F).
- Schneiden Sie Stücke von Linsengewebe mit Scheibe Abmessungen; mit einem Spatel und Pinsel, übertragen Sie die Scheiben auf dieser Linsengewebe und inkubieren sie in der Schnittstelle Kammer bei 37 ° C für mindestens 1 Stunde vor dem Start-Aufnahmen (Abbildung 2G - I). Die Scheiben unter den gleichen Bedingungen fortlaufend bis zum Gebrauch. HINWEIS: Platzieren Scheiben auf Linsenpapier ist ein wichtiger Schritt, um sowohl die Durchblutung der unteren Seite der Scheiben und das Entfernen der Scheiben von der Schnittstelle Kammer vor der Aufnahme zu erleichtern.
- Während der Übertragung der Scheiben auf dem Linsengewebe, verwalten Sie sie sehr sorgfältig, vermeiden, um die Rindenschicht Bereich mit Touchdie Bürste.
- Bereiten Sie die Scheiben ein zu einer Zeit und unmittelbar übertragen jeder von ihnen auf die Schnittstelle Kammer, um eine einwandfreie Sauerstoffversorgung und Temperatur zu gewährleisten; schneiden den Block der Resektates so schnell wie möglich.
6. Vorbereitung der MEA-Setup für Recordings
- Stecker Perfusionssystem eine peristaltische Pumpe und der MEA-System mit einem Computer. Oxygenieren die Aufnahme ACSF. Stellen Sie eine leere MEA-Chip im Inneren des Verstärkers.
- Stellen Sie den Temperaturregler zum Heizen Kanüle Element auf 37 ° C in der MEA Kammer erreichen und starten Sie die Perfusion bei 5-6 ml / min. HINWEIS: Es ist in der Regel notwendig, die Temperatur eingestellt 3-4 ° C höher als die gewünschte Abhängigkeit von der Raumtemperatur und der Strömungsgeschwindigkeit.
- Überprüfen Sie die Temperatur in der MEA Kammer mit einem feinen Thermometer, womit es in der Nähe möglich an der Mitte, ohne Berührung der Elektrodenfläche.
- Starten Sie die Aufnahme Software und prüfen, ob alle MEA Elektroden gut verbunden sind und dass es keine Geräusche durch Perfusion.
- Starten MEA_Monitor, um das Funktionieren der Kamera Tabelle zu überprüfen.
7. Übertragung einer Scheibe von der Schnittstelle Kammer zu MEA Chip für die Aufnahme
- Gießen Sie etwas erwärmt Aufnahme ACSF in einer Glaspetrischale; mit einer Pinzette, nehmen Sie ein Stück von der Schnittstelle Kammer, durch Greifen sie durch das Linsengewebe, und legen Sie sie in der Petrischale. Vorsichtig lösen die Scheibe aus dem Gewebe. Wenn der Pegel der Lösung in der Schnittkammer sorgfältig während der Inkubationszeit eingestellt, wird die Scheibe von dem Linsengewebe nur durch Eintauchen in der Lösung zu lösen; Andernfalls verwenden Sie eine kleine Bürste, um die Ablösung zu erleichtern.
- Füllen Sie ein MEA-Chip mit einigen ACSF und mit einem Spatel, übertragen Sie die Scheibe hinein. Mit einem Kunststoffpasteurpipette vorsichtig entfernen Sie die Lösung, um die Scheibe auf der Elektrodenfläche haften und halten Sie es an Ort und Stelle mit einem Platin-anchoder. 1 ml der Aufnahme ACSF, platzieren Sie den MEA-Chip in den Verstärker und starten Perfusion bei 5-6 ml / min (2J - L).
- Überprüfen Sie die Schnittposition auf der MEA Aufzeichnungsbereich mithilfe MEA_Monitor, ggf. einstellen, um aus den kortikalen Schichten aufnehmen und nehmen Sie ein Bild. Starten Sie die Aufnahme.
Representative Results
Die Aufzeichnung der menschlichen kortikalen Scheibe Aktivität beginnt, während Perfusion des Gewebes mit der normalen Aufnahme ACSF (wie zuvor beschrieben) 7,8. In diesem Zustand, wenn das Gewebe gut während der Operation während der Gewebetransfer aus dem Krankenhaus und Schnittpräparat erhalten und später kann man spontane Aktivität zu beobachten, in der Form von kleinen interiktalen ähnlichen Veranstaltungen, von kleinen Clustern von MEA Elektroden nachgewiesen. Interiktalen artigen Entladungen bestand in einem Feldpotential, üblicherweise zweiphasig, umfassend einen ersten scharfen negativen Auslenkung erreicht Zehnmikrovolt, gefolgt von einer längeren gegenüberliegenden Welle über mehrere zehn Millisekunden. Fast Multi-Unit-Aktivitäten werden in der Regel im Bereich Potential vor allem in der Anfangsteil eingebettet. Ein repräsentatives Beispiel interiktaler-ähnliche Aktivität ist in Fig 3Aii, wobei die Spur durch eine MEA Elektrode erfasst wird gezeigt dargestellt.
Zu epileptischen Anfällen aus in Rekordvitro menschlichen corticalen Scheiben ist es notwendig, sie mit einem "epileptischen" ACSF Perfusion, in denen Mg 2+ nicht vorhanden ist und K + ist auf 6 mm angehoben, um Gewebe Erregbarkeit 1 (die Erhöhung der K + 3 bis 6 mM steigern allein reicht nicht aus, um Anfälle induzieren; Daten nicht gezeigt). Sobald die Perfusion mit 0 Mg 2+ 6 mM K + ACSF gestartet wurde, die Aktivität von kortikalen Schichten allmählich zunimmt und der ersten Anfall erscheint in 15 bis 20 min (15,4 ± 1,7 min, n = 10, 5 Patienten; Figur 3 Ai ). Wir evozierte ictal-ähnliche Aktivität, wie in Figur 3 gezeigt, in 75% der Patienten getestet und in 66,7% der aufgenommenen Scheiben.
Epileptische Aktivitäten werden aus dem benachbarten Elektroden der MEA-Chip aufgezeichnet, und der Vergleich der Beginn Dynamik der Feldpotential Veranstaltungen ermöglicht das Studium ihrer Website von Genese und Ausbreitung. Ein Vertreter Ergreifung von einer Scheibe hum aufgezeichnetein Großhirnrinde mit der MEA-System ist in 3B gezeigt (eine repräsentative Spur eines Zugriffs durch einen einzigen MEA Elektrode erfasst wird bei höheren zeitlichen Auflösung in 3 Aiii gezeigt). Beachten Sie, dass der Anfall von fast allen der Elektroden der MEA-Chip aufgezeichnet, was anzeigt, daß es in der Lage, eine große Rindenbereich ausbreiten wird. Darüber hinaus Blick auf die einzelnen Spuren von jeder Elektrode aufgezeichnet wird, ist es möglich, die fortschreitende Ausbreitung der Beschlagnahme über das Gewebe zu beobachten: in der Tat, zum ersten Mal startet er in der kortikalen Fläche von der rechten Hälfte des Elektrodenarrays und es breitet sich allmählich zu das Gebiet, das die linke Hälfte (.. i e, vergleiche Spuren von der Elektrode L6 und B6; 3B).
Abbildung 1: Eine kortikale Dysplasie eind. ihrer chirurgischen Entfernung A Taylor-Typ Brenn kortikalen Dysplasie (weißer Pfeil) in einer linken Stirnlappen Sulcus eingebettet ist an der präoperativen MRI (A) sichtbar gemacht, und später durch histologische Untersuchung (B) MAP-Kinase-Markierung bestätigt; Maßstab: 200 & mgr; m), die eine kortikale dyslamination, abnorme Neuronen und eine Spur auf Neuronen mit einer unvollständigen Migration in der unteren weißen Substanz. Während der Operation wird der Dysplasie nach den MRI-Daten mit einem Neuronavigationssystem (C) lokalisiert ist. Visualisierung des Gyrus, das die Dysplasie während der Operation (D).
Abbildung 2:. Ausrüstung und Verfahren für den menschlichen kortikalen Schnittpräparat Eine Schnittstelle Kammer wird zur menschlichen kortikalen Scheiben halten ex vivo (A); Die Scheiben liegen auf einem Blatt Linsengewebes in der flachen Fläche in dem oberen Teil der Kammer (B), wobei ein Temperatursensor (C, links), mit einem Temperaturregler (C, rechts, oben) durch einen zwei verbunden ended-Kabel (C, rechts, unten), platziert auf 37 ° C im gesamten Scheibe Inkubationszeit aufrechtzuerhalten. Einmal erhalten, legen Sie das reseziert Block von Gewebe in einer Petrischale mit eiskaltem Saccharosebasis ACSF (D) gefüllt und entfernen Blutgerinnsel, Gefäße und Hirnhäuten, um das Schneiden zu erleichtern. Wenn die Gewebeblock ist größer als MEA Kammern, zu isolieren ein Stück geeigneten Abmessungen mit einer Klinge (E) und kleben Sie es auf der Vibratom Probenteller (F). Schneiden Sie 400 um dicke Scheiben schneiden und mit der Hilfe von einem Spatel (G) übertragen sie auf einem Stück Linsengewebe (H) und inkubieren sie in der Schnittstelle Kammer (I). Vor der Aufnahme Remove das Linsengewebe durch Eintauchen des Slice in einer Petrischale mit ACSF gefüllt und dann in eine ACSF gefüllt MEA-Chip mit einem Spatel (J). Entfernen Sie die Lösung der Slice haften auf der MEA (K) und halten Sie sie in Position durch Verwendung eines Platin-Anker zu lassen. Legen Sie die MEA im Verstärker (L), starten Sie die Perfusion und Aufnahme.
Abbildung 3: MEA-Aufnahmen von epileptischen Anfällen in der menschlichen kortikalen Scheiben (A) Eine repräsentative Spur von menschlichen kortikalen Scheibe Aktivität durch eine MEA Elektrode aufgezeichnet ist in Panel I gezeigt.. In Gegenwart von normalem ACSF, ist es möglich, interiktalen artigen Spontanaktivität (kleines graues Rechteck, in Panel II gezoomt) zu beobachten; dann, wenn die Perfusion mit 0 Mg 2+ 6 mM K + ACSF begonnen hat, die erste seizure erscheint nach einer ~ 15 min Verzögerung und wird von anderen Ereignissen an 2-3 min Intervall gefolgt. Panel III zeigt die Beschlagnahme in der großen grauen Rechteck in Panel I mit einem vergrößerten Maßstab. Die blaue Kurve zeigt einen Zoom von der Tätigkeit, wie von der blauen Linie und Pfeil angedeutet. Panel IV) zeigt die in Panel III dargestellten Daten) Hochpass bei 250 Hz gefiltert, die Multi-Unit-Aktivität zeigen, wenn gezoomt (blaue Kurve). (B) Repräsentative Aufzeichnung eines Anfalls in Gegenwart von 0 Mg 2+ 6 mM K + ACSF aus allen MEA Elektroden. Jedes Quadrat stellt eine Elektrode von 12 x 12 MEA-Array und zeigt ein 80 Sekunden Zeitfenster; die gepunktete Linie zeigt die Position des kortikalen Oberfläche relativ zu MEA-Array.
Discussion
Pharmakoresistenter Epilepsie ist eine seltene Erkrankung, die im menschlichen Gewebe in vitro untersucht werden kann. Dies ermöglicht das Studium epileptischen menschlichen Hirnrinde, die bestimmte Mängel, die nur teilweise in Tiermodellen reproduziert werden angezeigt. Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Erstellung und Aufzeichnung menschlicher postoperativen Geweben ex vivo mit erhaltener Zelllebensfähigkeit und Netzwerke, so dass sie epileptische Aktivitäten spontan. Halte ähnliche Tätigkeiten als die in vivo aufgezeichnet ist entscheidend für die Mechanismen der Entstehung von pathologischen Aktivitäten zu untersuchen. Ferner ermöglichen solche Verfahren der Erforschung des menschlichen Geweben und vermeiden nicht perfekt Tiermodellen der Krankheit. , Studium der menschlichen Gewebe erfordert jedoch eine Synchronisation zwischen Neurochirurgen und dem Experimentallabor. Tissue Transport erfordert besondere Sorgfalt nicht traumatisch sein. Darüber hinaus ist sowohl die Menge der Probe und Gewebe beschränkt. Schließlich ist der Zugang zu richtigen Kontrollgeweben der main Sorge. Bei dieser Zubereitung die postoperative Geweben spontan interiktalen artigen Entladungen in normalen ACSF 7,8. Iktale artige Ereignisse können auch in modifizierter, prokonvulsiven ACSF ausgelöst, so dass die Mechanismen der Anfalls Initiierung und Übergang von der interiktalen Zustand zu Anfällen untersucht werden kann.
Menschliches Gewebe kann für bis zu 10 h in Schnittstellenbedingungen lebensfähig gehalten werden. Scheiben wurden als lebensfähig, wenn Multi-Unit-Aktivität oder Feldpotentiale wurden spontan beobachtet und, wenn solche Aktivitäten wurden durch zunehmende Erregbarkeit durch extrazelluläre Kaliumerhöhungen und / oder Magnesium Abnahme evozierte. Obwohl Variabilität Aktivität auftritt, wahrscheinlich auf Unterschiede in Pathologien und kortikalen Arealen, erkundeten wir epileptogenen Eigenschaften eines Gewebes nur in gesunde Scheiben zeigt spontane interiktalen und evozierte iktale Entladungen. Um Gewebe Vitalität und Aktivität zu bewahren, ist eine Schnittstelle Kammer zum Speichern ter schneidet bei 36-37 ° C für die Wiederherstellung vor der Aufnahme mit der MEA-System. Tatsächlich haben mehrere Gruppen deutlich die Vorteile der Schnittstelle basiertes Speichersystem im Vergleich zu Standard-Becherglas Lagerung und die Bedeutung der Temperatur für die Erhaltung der Netzwerkaktivität gezeigt, wie spontane sharp wave-Wellen oder cholinergen-induzierte Schwingungen 9,10. Schnittstelle Lagerung von Scheiben bereits verwendet wurde, um epileptische Aktivität von menschlichen Hippocampus-und subicular Scheiben 1,11 notieren. Mit der aktuellen MEA Technik wird nach der Erholungsphase von Schneiden in Schnittstellenbedingungen, die Netzwerkaktivität wird in submersen Bedingungen bei 37 ° C aufgezeichnet, in Gegenwart von hohen Strömungsgeschwindigkeit (5-6 ml / min), mit der MEA-System. Der reduzierte Durchmesser (1,8 cm) des MEA-Chip, der eine kleine Volumenkammer (<1,5 ml) begrenzt zusammen mit der erhöhten Strömungsgeschwindigkeit erhöht die Sauerstoffversorgung der Scheibe, von dem gezeigt wurde, einen kritischen Faktor für spontane und pha seinrmacologically-induzierte Netzwerkaktivitäten 9,10. Ferner verringert die Menge des zirkulierenden ACSF erleichtert pharmakologischen Tests.
Die Schneideverfahren ist jedoch ein Trauma für das Gewebe 12. Sowohl neuronale Architektur und Chlorid Homöostase scheinen an der Gewebeoberfläche (50 & mgr; m) gestört werden. Die Herkunft der von MEA-Chips, die Probe das Gewebe meist oberflächlich, ohne tiefe Penetration, kann von traumatisierten Bereichen ergeben aufgezeichneten Aktivitäten. Unsere Daten zeigen jedoch, dass die extrazellulären Feldpotentiale erkannt lokal sind in den meisten MEA Elektroden und früheren Arbeiten zeigen, dass sie über einen 100 bis 200 & mgr; m Abstand von der Aufnahmestelle 13 integriert erfasst, was darauf hindeutet, dass Anfälle bei unserer Vorbereitung aufgezeichnet sind unwahrscheinlich von traumatisierten Bereichen produziert. Ferner wird in Studien mit Wolframelektroden ermöglicht ein tiefes Eindringen durchgeführt, ähnlich sind die epileptischen Aktivitäten in menschlichen Geweben aufgenommenzu den bei Patienten mit Epilepsie 1,7,8 beobachtet wird.
Eine weitere Grenze der Ex-vivo-Gewebe Aufnahme ist die Unterbrechung der Verbindungen zwischen den verschiedenen Hirnarealen, so beschränken dynamischen neuromodulations. Dies mag erklären, warum in einem solchen Gewebe keine iktale artigen Ereignis spontan aufgenommen, aber erfordert, um durch ionische Manipulation oder pharmakologische Stimulation Verbesserung Erregbarkeit ausgelöst werden. Dementsprechend wird in diesem Protokoll anfallartigen Ereignisse werden durch die Kombination einer Änderung der extrazellulären K + 3 bis 6 mm und eine Verringerung der externen Mg 2+ von 1,3 mM Mg 2+ -freiem ACSF, um Gewebe Erregbarkeit erhöhen induzierte und entfernen Mg 2+ -abhängigen NMDA-Rezeptor blockieren. Tatsächlich wurde bereits gezeigt, dass epileptiforme Aktivität in menschlichen Neocortex und Hippocampus-Schnitten unter Verwendung von Mg 2+ -freiem ACSF ähnelt die elektro Anfälle in vivo 14 aufgezeichnet induziert. AußerdemEs wurde gezeigt, dass in Temporallappen Scheiben erhalten epileptiforme Entladungen werden bei längerer Einwirkung von Mg 2+ -freiem ACSF 15,16 beständig klinisch verwendeten Antiepileptika, wodurch ein Modell für die Untersuchung pharmakoresistenter anfallartigen Ereignissen in vitro.
MEAs ermöglichen die Aufnahme der beiden, Feldpotentiale und Multi-Unit-Aktivitäten aus der neuronalen Aktionspotentiale ex vivo. Somit sind MEAs eine leistungsstarke elektro Tool im Vergleich zu EEGs, die durch synchrone Aktivitäten neuronaler Ensembles in vivo erzeugten Feldpotentiale zu erkunden, aber nicht den Zugang zu einzelnen Neurons Verhaltensweisen 17. Obwohl neuere Mikroelektroden können in vivo Multi-Unit-Aktivitäten aus der neuronalen Aktionspotentiale erfassen, sind sie invasiv, so dass ihre Verwendung meist auf Forschungszweck bei intrakraniellen Aufnahmen beschränkt. Insbesondere MEAs Aufnahmen stellen eine Technik der Wahldie räumlich-zeitlichen Muster der epileptische Ereignisse zu untersuchen, die Mechanismen, die Anfallsbeginn und die Ausbreitung und die Wirkung von klassischen und neuen Antiepileptika. Bemerkenswert ist, um die Zelltypen und die Signalisierung Grundlage von epileptischen Entladungen zu entwirren, Spike Sortiertechniken und pharmakologische Tests sollten mit MEA-Techniken kombiniert werden. Obwohl MEAs kann den Zugriff auf einzelne Spitzen zu geben, liefern sie keine Informationen über synaptische und biophysikalischen Eigenschaften. In Zukunft andere Techniken sollten MEA Aufnahmen, um eine bessere Probenzellverhalten, Netzwerkaktivitäten und synaptischen Signal gekoppelt werden. Zum Beispiel Fluoreszenzbildgebung zu Neuronen oder Gliazellen Verhalten sowie Ionendynamik entwirren kann mit MEAs Aufnahmen kombiniert werden. Weitere post hoc histologische Analyse kann auch zeigen spezifischen Veränderungen der Zelltypen, Proteine oder Rezeptoren, so daß die Lage der epileptischen Aktivitäten können mit spezifischen Umlagerungen des korrelierenNervenstruktur. Die MEAs System kann auch in einem Patch-Clamp-Set-up, um einzelne Zellen oder Leitwerte mit Bevölkerung Aktivitäten korrelieren eingebettet werden. In Zukunft könnte optogenetische Werkzeuge verwendet werden, vorausgesetzt, dass die menschliche Scheiben können in der langfristigen kultiviert werden, wie für organotypischen Schnitten durchgeführt, so dass die Transfektion oder Infektion von spezifischen Zelltypen durchgeführt werden kann.
Disclosures
Sponsoring von Mehrkanalsystemen für die Produktion des Videos und offenen Zugang Veröffentlichung vorgesehen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus ANR (Programme Blanc Neurowissenschaften), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau) unterstützt, City of Paris (Programm Emergence), INSERM und La Pitié Salpêtrière Hospital (Translationale Forschung Vertrag) an NR, ab Neuropôle de Recherche Francilien (NERF) an ED, von der Université Pierre et Marie Curie UPMC (Programm Convergence) und vom Institut du Cerveau et e la Moelle epiniere (Paris) zum GH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Slice Chamber-2: Interface | AutoMate Scientific, Inc. | S-BSC2 | It requires separate temperature controller |
| 2-channel Temperature Controller | Multichannel Systems, Germany | TC02 | It allows to plug in and use 2 interface chambers. |
| Special cable for connection of TC01 to S-BSC2 with external reference PT100 | Multichannel Systems, Germany | CA3 | The reference PT100 is placed near the slices |
| 6pin plug-connector with PT100 | Multichannel Systems, Germany | TS-PT100 | External reference for CA3 cable |
| MEA workstation for recording data from 120-electrode MEAs | Multichannel Systems, Germany | MEA2100-120 | It includes MEA2100-120 headstage and MEA2100 interface board. www.multichannelsystems.com |
| Microelectrode array for MEA2100-120 | Multichannel Systems, Germany | 120MEA200/30 | Electrode spacing: 200 µm; electrode diameter: 30 µm; glass ring: 6 mm high. Different configurations (spacing, diameter, ring) possible. |
| Video Microscope Table | Multichannel Systems, Germany | MEA-VMT-1 | Table with a video microscope underneath to image the electrode field of the MEAs in an amplifier placed on top of the table and transfer the image to a computer. |
| Perfusion cannula | Multichannel Systems, Germany | PH01 | Heatable perfusion cannula with temperature sensor; temperature can be programmed with TC02 controller |
| MC_Rack | Multichannel Systems, Germany | Software for data acquisition and recordings | |
| Magnetic Perfusion Holder | Multichannel Systems, Germany | MPH | Magnetic perfusion holder for PH01 element to fix the perfusion cannula and connect the perfusion system to the amplifier's ground |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | Software for data analysis; info@neuroexplorer.com | |
| Peristaltic pump (drive unit) | Gilson | F155001 | 0,01 to 48 rp |
| Peristaltic pump (pump head) | Gilson | F117800 | R2 two channel |
| Ultrasonic aspirator | Integra Life sciences, USA | Cusa Excel + | It allows blunt subpial dissection of the cortex |
| Neuronavigation | Isis Solutions, France | Surgiscope | It allows real time identification of the brain structure on the preoperative MRI |
| Vibratome HM 650 V | Microm | Block slicing into 400 μm thick slices |
References
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