Multi-elektrode Array Recordings of Human Epileptiske Postoperativ Kortikal Tissue

Summary

Vi her beskriver hvordan du utfører multi-elektrode array-innspillinger av menneskelig epileptisk kortikale vev. Epileptisk vev reseksjon, slice forberedelse og multi-elektrode array-innspillinger av interiktal og ictal hendelser er vist i detalj.

Abstract

Epilepsi, berører om lag 1% av befolkningen, består av en gruppe nevrologiske lidelser kjennetegnet ved den periodiske forekomsten av anfall, som forstyrrer normal hjernefunksjon. Til tross for behandling med tilgjengelige antiepileptika målretting nevrale funksjoner, en tredjedel av pasienter med epilepsi er pharmacoresistant. I denne tilstanden, kirurgisk fjerning av hjernen området genererer anfall fortsatt den eneste alternativ behandling. Studere menneskelige epileptiske vev har bidratt til å forstå nye epileptogene mekanismer i løpet av de siste 10 årene. Faktisk disse vev generere spontane interiktal epileptiske utslipp samt farmakologisk indusert ictal hendelser som kan tas opp med klassiske elektrofysiologiske teknikker. Bemerkelsesverdig, multi-elektrode arrays (måle), som er microfabricated enheter embedding en rekke romlig arrangert mikroelektroder, gir en unik mulighet til å samtidig stimulere og rekordstort felt potentials, samt aksjonspotensialer av flere neuroner fra forskjellige områder av vev. Dermed MEAS innspillinger tilbyr en utmerket tilnærming for å studere rom-tid-mønstre av spontan interiktal og fremkalt anfallslignende hendelser og mekanismene bak beslag utbruddet og forplantning. Her beskriver vi hvordan å forberede menneskelige kortikale skiver fra kirurgisk reseksjon vev og å spille inn med MEAs interiktal og ictal lignende hendelser ex vivo.

Introduction

Epilepsi er en kronisk lidelse der epileptiske anfall, som er forbigående mønstrede utslipp som varer i flere sekunder til titalls sekunder på (EEG) innspillinger forbundet med kliniske manifestasjoner, avbryte en interiktal tilstand, preget av tilstedeværelsen av synkrone nevronale utslipp varige titalls millisekunder og kalte interiktal hendelser ^1. Det rammer ca 1% av verdens befolkning, og selv om beslag kontrolleres hos flertallet av pasientene, har omtrent en tredjedel av mennesker med epilepsi ikke viser tilstrekkelig respons på antiepileptika ^2. I denne tilstanden, som kalles pharmacoresistant epilepsi og hvis mekanismer har fortsatt å være tydelig identifisert, kirurgisk reseksjon av den spesifikke delen av hjernen identifisert som beslaget-utbruddet sonen er fortsatt den eneste alternativ behandling som gir et positivt utfall for pasientene. Således er de avkuttede prøver fra kirurgi, hvilket ga opporheten til å studere mekanismene for interiktal utslipp og anfalls generering og forplantning, samt pharmacoresistance på levedyktige humane sentralnervevevet ex vivo.

Multi-elektrodegrupper (måle), bestående av et arrangement av rommessig fordelte mikroelektroder, tillate den samtidige stimulering og registrering av elektrofysiologisk aktivitet fra flere steder av vevet, og dermed gi en god tilnærming for å studere spatio-temporale mønstre av spontan og fremkalt aktivitet . Denne teknikken, først anvendt for å overvåke den utviklingsmessige forandringer av neuronal cellekultur-aktivitet ³ og deretter tilpasset for akutt og organotypiske hjernen og ryggmargen skiver ^4-6, anses i dag som et verdifullt verktøy for elektrofysiologisk.

Den nåværende protokollen beskriver hvordan å forberede menneskelige kortikale skiver fra kirurgisk reseksjon vev og å spille inn med MEAs pålitelig ex VIvo interiktal og beslag lignende hendelser fra disse skiver. Denne teknikken gir dermed en måte å løse de grunnleggende mekanismene bak epileptiske aktiviteter initiering, spredning og skadevirkninger av antiepileptika hos både via mobil og nettverksnivå. Alle de fremgangsmåter som brukes for å få tak i, fremstille, vedlikeholde og registrere humane skiver er her beskrevet i detalj.

Protocol

MERK: Protokollen her beskrevet følger retningslinjene til den franske "Comité Consultatif National d'Ethique" og er erklært som en samling aktivitet ved INSERM.

1. Reseksjon of Human Epileptiske Tissue

1. Pasienter
   1. Skaff hjernevev fra pasienter som lider av intraktabel epilepsi. Skaff en skriftlig informert samtykke før operasjonen.
   2. For alle opererte epileptikere utføre en omfattende presurgical opparbeiding inkludert nevrologisk undersøkelse, nevropsykologisk vurdering, overflate EEG, og neuroimaging (MRI og noen ganger ¹⁸ FDG-PET-scan, figur 1A), etterfulgt av post-kirurgisk histologisk undersøkelse av resected vev (figur 1B) . MERK: Kirurgi er indisert når de ulike undersøkelsene lokalisere tilsvar beslaget utbruddet sonen og når fordel for fjerning stiger de kirurgiske risiko.
2. Kirurgi
   1. Maintain antiepileptika pre-operativt. Utføre kirurgi under generell anestesi: induksjon med inhalert sevoflurane (6% levert forhold og 100% fraksjon av inhalert O _2), intra venøs sufentanyl (0,3 ug / kg) og antracurium (0,5 mg / kg), etterfulgt av vedlikehold med intra venøs sufentanyl (0,5 ug / kg / time) og inhalert sevoflurane (1 MAC).
   2. Bruk en nevro system for å tillate en presis lokalisering av de lesjonerte cortex (figur 1C). Etter huden snitt, utføre en Burr hull i beinet, etterfulgt av en kraniotomi med høyt utslipp drill. Forsiktig heve bein klaff, og åpne dura med saks (figur 1D).
   3. Bruk intraoperativ ultralyd for å lette identifiseringen av den unormale cortex, og mikrokirurgiske instrumenter, og en ultrasonisk aspirator under operasjonsmikroskop.
   4. Koagulere og kutte pio-arachnoidal plan i henhold til lengdefure grenser. Bruk subpial disseksjon til release cortex fra pia rundt lesioned området.
   5. Skjær hvit substans under unormale cortex å utføre ett stykke "en bloc" reseksjon, sparing så mye som mulig blodkar. Unngå traumatisk manipulasjon av cortex.
   6. Skjær en 1 cm tykk skive ut av resected vev langs en retning ortogonalt på den pial overflaten, inkludert sulcus bunnen og overgangs cortex.

2. Kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF) for Slice Forberedelse, Inkubasjon og opptak

1. ACSF for slice forberedelse
   1. Forbered 1 L av sukrose-baserte ACSF ^7,8, inneholdende (i mM): 250 sukrose, 3 KCl, 25 _NaHCO3, 10 D-glukose, 1 _{CaCl2, MgCl2} 10; oppløse disse salter i avionisert vann og oksygenering av oppløsningen med carbogen i minst 10 min.
   2. Sett ~ 700 ml sukrose ACSF ved -80 ° C i 50-60 min (eller -150 ° C i 15-20 min). Hold resten avløsning under oksygenering i is. MERK: ACSF for slice forberedelse kan lagres ved 4 ° C; i dette tilfellet, tilsett _CaCl2 og _MgCl2 dagen for eksperimentet, før avkjøling.
2. ACSF for skive inkubasjon og opptak
   1. Forbered minst 3 L av opptaks ACSF ^7,8, inneholdende (i mM): 124 NaCl, 3 KCl, 26 _NaHCO3, 10 D-glukose, 1,6 _CaCI2, 1,3 _MgCI2; oppløse disse salter i avionisert vann og oksygenering av oppløsningen med karbogen. Før du legger _MgCl2, holde noen ACSF å utføre innspillinger i 0 Mg ²⁺ ACSF. MERK: inkubasjon / opptak ACSF kan lagres ved 4 ° C; i dette tilfellet, tilsett _CaCl2 og _MgCl2 dagen av forsøket.

3. Utstyr for Slice Inkubasjon og opptak

1. Interface kammer for skive inkubasjon
   1. Bruk en hjerne slice kammer for å opprettholde levende skiver ex vivo </ Em> i grensesnittet modus. MERK: Kammeret er sammensatt av en nedre seksjon, som inneholder oppvarming og følerelementene og en keramisk bobleren og er fylt med destillert vann, og en øvre del, hvor skivene hviler på et ark av linse vevet i det flate området midt i kammeret (figur 2A - B).
   2. Bruke to separate fint PTFE-rør, hvorigjennom preoxygenated ACSF går inn i kammeret. MERK: Rørene spiral i det oppvarmede vann, og når den øvre del av kammeret; så løsningen kommer ut ved hjelp av kapillær action med linseklut, som formidler løsningen inn exit brønner.
   3. Forbind PTFE-rør av grensesnittet kammeret til en peristaltisk pumpe, for å tillate kontinuerlig perfusjon av skivene med preoxygenated medium.
   4. Opprettholde det høye oksygenspenningen ved oksygenering med karbogen (95% _O2 og 5% _CO2) gjennom den keramiske bobleren. MERK: Dette varmet og fuktet gassblanding nårskiver i den øvre del av kammeret gjennom passende hull.
   5. Opprettholde temperaturen i den øvre del av kammeret ved å forbinde kammeret til en temperatur-regulator, gjennom en spesiell dobbel-endet kabel, som har en kontakt for kammeret varmeelement og en ekstern temperaturføler i den ene enden. Plassere føleren nær skivene for å kontrollere temperaturen i løpet av inkubasjon (figur 2C).
2. Multi-elektrodesystem opptak
   1. Bruk plane flerelektrodegrupper med 120 titannitrid elektroder (30 um diameter) isolert med silisiumnitrid og intern referanseelektrode, som er anordnet i en 12 x 12 matrise med 200 pm senter-til-senteravstanden. MERK: Andre konfigurasjoner med ulik elektrode diameter og avstand er mulig. Spesielt kan den MEA-brikken bli utvidet til å prøve større stykker av humane vev.
   2. Tilegne elektriske signaler ved 10 kHz ved hjelp av en MEA2100-120 system (pre- og filter forsterker med integrert datainnsamling og analog-digital omformer, 16 bit data oppløsning, inngangsspenning rekkevidde og båndbredde justerbar via programvare) gjennom en egen programvare (MC_Rack). MERK: MEA2100 headstage er utstyrt med en metallplate for innfesting av heatable perfusjon element gjennom magnetiske holdere, for å kontinuerlig perfuse skivene gjennom hele innspillingen.
   3. Hold vevet ned på MEA av en liten hjemmelaget platina anker, som sikrer en god elektrisk kopling mellom skiven og elektrodene.

4. Utarbeidelse av Interface Chamber og verktøy for Dissection og Slicing

1. Interface kammer
   1. Fylle den nedre delen av kammeret med grensesnitt destillert vann. Sørg for at nivået på vannet helt fordyper varmeelement og er 2 til 4 mm under krysset mellom nedre og øvre del av kammeret. Sjekk dette nivået daglig før du slår på oppvarming,For å unngå skade på varmeelementet.
   2. Forbinde kammeret til en kilde carbogen, utrustet med en sekundær strømningsregulator for fine justeringer av gasstrykk.
   3. Klipp et ark med linseklut for å passe den flate delen av stykket kammeret, og plasser den nær inngangs løsning rør, å la noen boble flykte fra inntastings før de når skivene.
   4. Skjær to stykker av strandet bomullstråd, så lenge den del av linsen vev, og plassere dem langs de viktigste sider av det flate området av kammeret. MERK: Dette bidrar til å øke svakt perfusjon løsning nivået i kammeret.
   5. Sett av strømningshastigheten av den peristaltiske pumpe ved 1 ml / min, og aktivere pumpen.
   6. Begynn oksygenering av vannet i den nedre del av kammeret.
   7. Sett temperaturen på temperaturregulator ved 37 ° C og slå den på. Dekker den øvre del av kammeret med grensesnitt et stykke parafilm og vente på minst 30 min for Temperature å øke og stabilisere seg.
2. Verktøy for disseksjon og slicing
   1. Forbered en disseksjon kit bestående av to fine tang, en slikkepott, en liten skje og et blad; to glasspetriskåler, to børster samt cyanoakrylat-lim.
   2. Sett parametrene av vibratome: tykkelse, 400 um; frekvens, 70-90 Hz; amplitude, 0,9 til 1 mm, hastighet: 0,1 mm / sek.

5. Menneskelig kortikal Slice Forberedelse

1. Fjern det sukrose-baserte ACSF fra -80 ° C fryseren og bland det for å oppnå en slags sørpe. Oxygenate det med carbogen, sette ~ 250 ml i en glassflaske, og oppbevar det på et Dewar flaske fylt med is, mens du går til kirurgi rom på sykehuset for å få vevet. I mellomtiden, hold resten ved -20 ° C.
   MERK: Under operasjonen, dissekerer nevrokirurg en liten blokk med kortikalt vev. Umiddelbart plassere prøven i iskald sukrose ACSF for overføring til laboratoriet.
2. Hold den tiden som trengs for overføringen fra sykehuset til laboratoriet til et maksimum på 30 min. I laboratoriet, ta sukrose baserte oksygenrikt ACSF ut på -20 ° C fryser, bland det å ha en slush, fylle en petriskål og vibratome bufferbrettet og begynne oksygennivået både med carbogen. Forsiktig ta ut den delen av menneskelig vev fra flasken med en skje og legg den i petriskålen (figur 2D).
3. Ved hjelp av pinsett, forsiktig fjerne blodpropper, fartøyer og hjernehinnene for å unngå motstand under kutting. Fjern hjernehinnene, som består i pia-saken, fra sidene av vevsblokk, betaler oppmerksomhet for ikke å skade kortikale overflaten. Med et blad, skjæres en side av vevet for å oppnå en flat overflate, som vil være limt på vibratome prøveplaten. MERK: hjernehinnene, som består i pia-saken, er fjernet fra sidene av vevsblokk, betaler oppmerksomhet for ikke å skade kortikale overflaten.
4. Hvis blokken av tissue er større enn MEA kammeret, skjære et stykke av passende dimensjoner før liming det på prøveplaten (figur 2E).
5. Lim vev for å oppnå tverr kortikale skiver, legg det inn i bufferbrettet og kutte 400 mikrometer tykke skiver ved lav hastighet (0,1 mm / sek) (figur 2F).
6. Skjær biter av linseklut med slice dimensjoner; med en spatel og en børsten, overfører de skiver på følgende linse vev og inkuber dem i grensesnittet kammer ved 37 ° C i minst 1 time før start opptak (figur 2G - I). Kontinuerlig lagre skiver i samme vilkår inntil bruk. MERK: Plassere skiver på linsepapir er et viktig steg for å lette både perfusjon av undersiden av skiver og fjerning av skiver fra grensesnittet kammeret før opptak.
   1. Ved overføring av skivene på linseklut, administrere dem svært nøye, unngå å røre kortikalsjiktet området medbørsten.
   2. Fremstille de stykker, ett om gangen, og umiddelbart overføre hver av dem til grensesnittet kammeret, for å sikre riktig oksygentilførsel og temperatur; skjære blokk med resected vev så raskt som mulig.

6. Utarbeidelse av MEA Setup for Recordings

1. Plugg perfusjon systemet til en peristaltisk pumpe, og MEA systemet til en datamaskin. Oksygenere innspillingen ACSF. Plasser en tom MEA brikke inne forsterkeren.
2. Sett temperaturkontroller for varmeelementet kanyle for å nå 37 ° C i MEA kammeret og starter perfusjon på 5-6 ml / min. NB: Det er vanligvis nødvendig å stille inn temperaturen 3-4 ° C høyere enn den ønskede, avhengig av romtemperaturen og strømningshastigheten.
   1. Kontroller temperaturen i MEA kammeret med en fin termometer, plassere den nærmest mulig til sentrum, uten å berøre elektroden området.
3. Starte opptak software og sjekk at alle MEA elektrodene er godt festet, og at det ikke er noe støy på grunn av perfusjon.
4. Begynn MEA_Monitor for å kontrollere driften av kameraet tabellen.

7. Overføring av en Slice Fra Interface Chamber til MEA Chip for opptak

1. Hell litt varmet opptak ACSF i et glass petriskål; med en pinsett, ta en bit fra grensesnittet kammeret, ved å gripe den gjennom linseklut, og sette den i petriskål. Fjern forsiktig skive fra vevet. Hvis nivået av oppløsningen i grensesnittet kammeret er nøye justeres i løpet av inkubasjonstiden, vil stykket løsner fra linsen vev kun ved å nedsenke det i løsningen; Ellers bruker du en liten børste til å legge til rette for løsrivelse.
2. Fyll en MEA chip med noen ACSF og med en slikkepott, overføre skive i det. Med en plast Pasteur pipette, fjern forsiktig løsning for å gjøre stykket følge på elektroden området og holde det på plass med en platina ANCHeller. Tilsett 1 ml med opptak ACSF, plasserer MEA chip inn i forsterkeren og starte perfusjon på 5-6 ml / min (figur 2J - L).
3. Sjekk stykket posisjon på MEA opptaksområdet ved å bruke MEA_Monitor, juster den om nødvendig for å ta opp fra kortikale lag og ta et bilde. Starte opptaket.

Representative Results

Opptaket av human kortikale skive aktiviteten starter samtidig perfusert vevet med normalt opptak ACSF (som tidligere beskrevet) ^7,8. I denne tilstanden, når vevet er godt bevart under operasjonen og senere under vev overføring fra sykehuset og slice forberedelse, kan man observere spontan aktivitet, i form av små interiktal lignende hendelser, oppdaget fra små klynger av MEA elektroder. Interiktal liknende utladninger besto i et felt potensial, vanligvis bifasisk, omfattende en første skarp negativ avbøyning, og nådde titalls mikrovolt, etterfulgt av en lengre rett overfor bølge varer flere titalls millisekunder. Rask multi-unit aktiviteter er vanligvis innebygd i feltet potensialet hovedsakelig i den innledende delen. Et representativt eksempel på interiktal-lignende aktivitet er illustrert i figur 3Aii, hvor trasen registrert av en MEA elektrode er vist.

For å ta opp epileptiske anfall fra ivitro humant kortikale skiver, er det nødvendig å perfuse dem med en "epileptogen" ACSF, hvori Mg2 ⁺ er fraværende og K ⁺ heves til 6 mM, for å øke vev eksitabilitet ^en (økning av K ⁺ 3-6 mM alene er ikke nok til å fremkalle anfall, data ikke vist). Når perfusjon med 0 6 mM Mg2 ⁺ K ⁺ ACSF har startet, aktiviteten av kortikale skiver gradvis øker, og det første beslag vises innen 15 til 20 min (15,4 ± 1,7 min, n = 10, fra 5 pasienter; Figur 3 Ai ). Vi fremkalt ictal-lignende aktivitet, som vist i figur 3, i 75% av pasientene som ble testet og i 66,7% av alle registrerte skiver.

Epileptiske aktiviteter er registrert fra tilstøtende elektroder av MEA chip, og sammenligning av utbruddet dynamikken i felt potensielle hendelser lar studere deres nettsted for tilblivelse og forplantning. En representant anfall tatt opp fra en bit av humen cerebral cortex med MEA-systemet er vist på figur 3B (en representativ spor av et anfall registrert av en enkelt MEA elektrode er vist ved høyere tidsmessig oppløsning i figur 3 AIII). Legg merke til at beslaget er ført fra nesten alle elektrodene i MEA-brikken, og således indikerer at den er i stand til å forplante seg til et stort område kortikale. Videre ser på de enkelte traser tatt opp fra hver elektrode, er det mulig å observere den grad forplantning av beslaget på tvers av vev: ja, begynner det første i det kortikale område som dekker den høyre halvdel av elektrodegruppen, og det gradvis sprer seg området dekker den venstre halvdelen (.. jeg e, sammenligne spor fra elektroden L6 og B6; Figur 3B).

Figur 1: En kortikal dysplasi en. d sin kirurgisk fjerning En Taylor typen focal kortikal dysplasi (hvit pil) innebygd i en venstre frontallappen sulcus er visualisert på preoperative MR (A), og senere bekreftet av histologisk undersøkelse (B) MAP kinase merking; Målestokk: 200 mikrometer) som viser en cortical dyslamination, unormale nevroner og et spor på nevroner med en ufullstendig migrasjon i nedre hvit substans. Under operasjonen blir lokalisert dysplasi i henhold til MR-data med en nevrosystem (C). Visualisering av de inneholdende den dysplasi gyrus under operasjonen (D).

Fig. 2: brukes for å opprettholde humane kortikale skiver Utstyr og fremgangsmåte for human kortikale skive fremstillingen Et grensesnitt kammeret ex vivo (A); den skiver hviler på et ark av linse vev i det flate området i den øvre del av kammeret (B), der en temperatursensor (C, til venstre), koplet til en temperatur-regulator (C, høyre, opp) gjennom en dobbelt ended kabel (C, høyre, ned), er plassert for å opprettholde 37 ° C hele skive inkubasjonstid. Når innhentet, plasserer resected blokk av vev i en petriskål fylt med iskald sukrose-basert ACSF (D) og ta blodpropper, fartøyer og hjernehinnene, for å lette slicing. Hvis vevet blokken er større enn MEA kamre, isolere et stykke av passende dimensjoner med et blad (E) som limes på vibratome prøveplaten (F). Skjær 400 um tykke skiver, og med hjelp av en spatel (G) overføre dem på stykker av linse vev (H) og inkuber dem i grensesnittet kammeret (I). Før opptak, remove objektivet vev ved å senke skive i en petriskål fylt med ACSF og overføre den til en ACSF fylt MEA chip med en slikkepott (J). Fjern løsningen å la stykket holder seg på MEA (K) og holde den i posisjon ved hjelp av en platina anker. Plasser MEA i forsterkeren (L), start perfusjon og opptak.

Figur 3: MEA opptak av epileptiske anfall hos humane kortikale skiver (A) En representativ spor av human skive kortikal aktivitet registrert av en MEA elektrode er vist i panel i.. I nærvær av normale ACSF, er det mulig å observere interiktal lignende spontane aktivitet (liten grå rektangel, zoomet inn panel ii); da, når den perfusjon med 0 6 mM Mg2 ⁺ K ⁺ ACSF har startet, den første seizure vises etter en ~ 15 min forsinkelse og etterfølges av andre hendelser på 2-3 min intervall. Panel iii viser beslag i den store grå rektangelet i panelet jeg med et zoomet skala. Den blå strek illustrerer en zoom av aktiviteten, som angitt av den blå linjen og bue. Panel iv) viser data illustrert i panel iii) høy pass filtrert på 250 Hz, som avslører multi-unit aktivitet når du zoomer (blå strek). (B) Representant opptak av et anfall i nærvær av 0 Mg ²⁺ 6 mM K ⁺ ACSF fra alle MEA elektroder. Hver rute representerer en elektrode på 12 x 12 MEA matrise og viser en 80 sek tidsvinduet; den stiplede linje indikerer posisjonen av det kortikale overflate relativt til MEA array.

Discussion

Pharmacoresistant epilepsi er en sjelden tilstand, som kan utforskes i menneskelig vev in vitro. Dette gjør det mulig å studere epileptisk menneskelige cortex, som viser konkrete mangler som bare delvis gjengitt i dyremodeller. Metoden her er beskrevet kan forberede og opptak menneskelige postoperative vev ex vivo med bevart cellular levedyktighet og nettverk slik at de spontant produserer epileptiske aktiviteter. Beholde lignende aktiviteter enn de som er registrert i vivo er avgjørende for å studere mekanismene for dannelsen av patologiske aktiviteter. Videre er slike fremgangsmåter gjør det mulig å utforske humane vev og unngå ikke-perfekte dyremodeller av sykdommen. Men å studere menneskelig vev krever synkronisering mellom nevrokirurger og den eksperimentelle laboratorium. Tissue transport krever spesiell forsiktighet for ikke å være traumatisk. I tillegg er både mengden av prøven og vev begrenset. Til slutt, er tilgang til skikkelige kontroll vev i main bekymring. Med dette preparatet, de postoperative vev spontant produsere interiktal lignende utslipp i normal ACSF ^7,8. Ictal-lignende hendelser kan også bli utløst i modifisert, proconvulsive ACSF slik at mekanismene for beslag initiering og overgangen fra interiktal tilstanden til anfall kan undersøkes.

Menneskelig vev kan holdes levedyktig i inntil 10 timer i vilkårene for grensesnitt. Slices ble ansett levedyktig når multi-unit aktivitet eller feltpotensialer ble observert spontant og når slike aktiviteter ble fremkalt av økende oppstemthet gjennom ekstracellulære kalium øker og / eller magnesium nedgang. Selv om variasjon i aktiviteten skjer, som sannsynligvis gjenspeiler forskjeller i patologi og kortikale områder, utforsket vi epileptogene egenskapene til en vev bare hos friske skiver som viser spontan interiktal og vakte ictal utslipp. For å bevare vev vitalitet og aktivitet, er et grensesnitt kammer brukes til å lagre than skiver på 36-37 ° C for å bli frisk før innspilling med MEA system. Faktisk har flere grupper tydelig vist fordelene ved grensesnittet basert lagringssystem, sammenlignet med standard begerglass lagring og viktigheten av temperaturen for bevaring av aktivitet, slik som nettverk spontane skarpe bølgekrusninger eller kolinerge-induserte oscillasjoner ^9,10. Interface lagring av skiver har tidligere blitt brukt til å spille epileptisk aktivitet fra menneskelig hippocampus og subicular skiver ^1,11. Med dagens MEA teknikk, etter utvinning perioden fra slicing i vilkårene for grensesnitt, er nettverksaktivitet registrert i neddykket forhold, i nærvær av høy strømningshastighet (5-6 ml / min) ved 37 ° C, med MEA system. Den reduserte diameter (1,8 cm) av MEA chip, som avgrenser et kammer med lite volum (<1,5 ml), sammen med den økte strømningshastighet, øker oksygentilførsel av skiven, som er blitt demonstrert å være en kritisk faktor for spontan og pharmacologically-indusert nettverksaktiviteter ^9,10. Videre, den reduserte mengden av sirkulerende ACSF muliggjør farmakologisk testing.

Den slicing prosedyren er imidlertid et trauma for vev ^12. Både neuronal arkitektur og klorid homeostase synes å være perturbert på vevsoverflaten (50 um). Opprinnelsen av aktivitetene registrert av MEA chips, som sample vevet stort sett overfladisk uten dyp penetrasjon, kan oppstå fra traumatiserte områder. Men våre data viser at de ekstracellulære feltpotensialer oppdages lokalt er registrert i de fleste MEA elektroder og tidligere arbeid viser at de er integrert over en 100 til 200 mikrometer avstand fra innspillingen nettstedet ^13, noe som tyder på at beslagene registrert i vår forberedelse er usannsynlig å være produsert av traumatiserte områder. Videre, i studier utført med wolfram elektroder muliggjør dyp penetrasjon, de epileptiske aktiviteter registrert i menneskelig vev er liktil de som er observert hos pasienter med epilepsi ^1,7,8.

En annen begrensning av ex vivo vev opptak avbrudd av sammenhengene mellom de ulike hjerneområder, og dermed begrense dynamiske neuromodulations. Dette kan forklare hvorfor i et slikt vev ingen ictal-lignende hendelse er spontant innspilt, men krever å bli utløst av ionisk manipulasjon eller farmakologisk stimulering styrke oppstemthet. Følgelig, i denne protokollen, anfalls-lignende hendelser indusert ved å kombinere en endring i ekstracellulært K ⁺ 3-6 mM og en reduksjon av ekstern Mg ²⁺ fra 1,3 mM til Mg2 ⁺ -fri ACSF, for å øke vev eksitabilitet og fjerne Mg ²⁺ -avhengig NMDA reseptor blokk. Faktisk har det tidligere blitt påvist at epileptiform aktivitet indusert i menneskelige neokortikale og hippocampus skiver ved hjelp av Mg ²⁺ -fri ACSF ligner elektrografisk anfall registrert in vivo ^14. Dessutendet har blitt vist at epileptiske utslipp oppnådd i tinninglappen skiver bli resistente mot klinisk brukte antiepileptika etter langvarig eksponering for Mg ²⁺ -fri ACSF ^15,16, og dermed gi en modell for å undersøke pharmacoresistant anfallslignende hendelser in vitro.

MEAs tillate opptak av begge, potensialer felt og multi-unit virksomhet som består i nerveaksjonspotensialer ex vivo. Dermed MEAs er en kraftig elektroverktøy i forhold til EEG, som utforsker feltpotensialer generert av synkrone aktiviteter av nevronale ensembler in vivo, men ikke gir tilgang til én nervecelle Adferd ^17. Selv om nyere mikroelektroder kan spille in vivo multi-unit virksomhet som består i nerveaksjonspotensialer, de er invasiv, så bruken er stort sett begrenset til forskningsformål under intrakranielle innspillinger. Spesielt MEAS opptak representerer en teknikk for valgå studere rom-tid-mønstre av epileptiske hendelser, mekanismene som kontrollerer beslag utbruddet og forplantning og handlingen av klassiske og nye antiepileptika. Bemerkelsesverdig, for å avdekke celletyper og signal grunnlag av epileptiske utladninger, pigge sortering teknikker og farmakologisk testing bør kombineres med MEA teknikker. Selv MEAs kan gi tilgang til individuelle pigger, har de ikke gi informasjon om synaptiske og biofysiske egenskaper. I fremtiden bør andre teknikker kobles til MEA innspillinger for bedre å prøve cellular atferd, nettverksaktiviteter og synaptisk signalering. For eksempel, for å fluorescens-avbildning rakne neuroner eller glial-celler oppførsel, så vel som ion-dynamikk, kan kombineres med Meas opptak. Videre post hoc histologisk analyse kan også avsløre spesifikke forandringer av celletyper, proteiner eller reseptorer slik at plasseringen av de epileptiske aktiviteter kan være korrelert med spesifikke rearrangementer avnervøs struktur. Den MEAs Systemet kan også bygges inn i en patch-clamp set-up å korrelere enkeltceller eller conductances med aktiviteter befolknings. I fremtiden kan optogenetic verktøy også anvendes, forutsatt at humane skiver kan dyrkes på lang sikt, så utført for organotypiske skiver, slik at transfeksjon eller infeksjon av spesifikke celletyper kan utføres.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain Slice Chamber-2: Interface	AutoMate Scientific, Inc.	S-BSC2	It requires separate temperature controller
2-channel Temperature Controller	Multichannel Systems, Germany	TC02	It allows to plug in and use 2 interface chambers.
Special cable for connection of TC01 to S-BSC2 with external reference PT100	Multichannel Systems, Germany	CA3	The reference PT100 is placed near the slices
6pin plug-connector with PT100	Multichannel Systems, Germany	TS-PT100	External reference for CA3 cable
MEA workstation for recording data from 120-electrode MEAs	Multichannel Systems, Germany	MEA2100-120	It includes MEA2100-120 headstage and MEA2100 interface board. www.multichannelsystems.com
Microelectrode array for MEA2100-120	Multichannel Systems, Germany	120MEA200/30	Electrode spacing: 200 µm; electrode diameter: 30 µm; glass ring: 6 mm high. Different configurations (spacing, diameter, ring) possible.
Video Microscope Table	Multichannel Systems, Germany	MEA-VMT-1	Table with a video microscope underneath to image the electrode field of the MEAs in an amplifier placed on top of the table and transfer the image to a computer.
Perfusion cannula	Multichannel Systems, Germany	PH01	Heatable perfusion cannula with temperature sensor; temperature can be programmed with TC02 controller
MC_Rack	Multichannel Systems, Germany		Software for data acquisition and recordings
Magnetic Perfusion Holder	Multichannel Systems, Germany	MPH	Magnetic perfusion holder for PH01 element to fix the perfusion cannula and connect the perfusion system to the amplifier's ground
Neuroexplorer	Nex Technologies		Software for data analysis; info@neuroexplorer.com
Peristaltic pump (drive unit)	Gilson	F155001	0,01 to 48 rp
Peristaltic pump (pump head)	Gilson	F117800	R2 two channel
Ultrasonic aspirator	Integra Life sciences, USA	Cusa Excel +	It allows blunt subpial dissection of the cortex
Neuronavigation	Isis Solutions, France	Surgiscope	It allows real time identification of the brain structure on the preoperative MRI
Vibratome HM 650 V	Microm		Block slicing into 400 μm thick slices