Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Multi-elektrod Array Inspelningar av Human Epileptic Postoperativ kortikalvävnad

doi: 10.3791/51870 Published: October 26, 2014

Summary

Vi beskriver här hur man utför flera elektrod array inspelningar av mänsklig epileptisk kortikal vävnad. Epileptiska vävnad resektion, skiva förberedelse och multielektrod array inspelningar av Interiktal och ictal händelser demonstreras i detalj.

Abstract

Epilepsi, som drabbar ca 1% av befolkningen, innefattar en grupp av neurologiska störningar kännetecknade av den periodiska förekomsten av krampanfall, som avbryter normal hjärnfunktion. Trots behandling med för närvarande tillgängliga antiepileptiska läkemedel riktar neuronala funktioner, en tredjedel av patienter med epilepsi är pharmacoresistant. I detta tillstånd, kirurgisk resektion av hjärnan området genererar anfall är fortfarande det enda alternativ behandling. Studera mänskliga epileptiska vävnader har bidragit till att förstå nya epileptogena mekanismer under de senaste 10 åren. Faktum är att dessa vävnader genererar spontana Interiktal epileptiska urladdningar samt farmakologiskt inducerad ictal händelser som kan spelas in med klassiska elektrofysiologiska tekniker. Anmärkningsvärt, multielektrodanordningar (MEA), som är mikrofabricerade enheter inbäddning en rad rumsligt arrangerade mikroelektroder, ger en unik möjlighet att samtidigt stimulera och postens fält potentials samt aktionspotentialer av multipla neuroner från olika områden av vävnad. Således MEA inspelningar erbjuder utmärkt metod för att studera spatio-temporala mönster av spontan Interiktal och framkallade krampliknande händelser och mekanismerna bakom anfallsdebut och förökning. Här beskriver vi hur du förbereder humana kortikala skivor från kirurgiskt resekerade vävnad och för att spela in med MEA Interiktal och ictal liknande händelser ex vivo.

Introduction

Epilepsi är en kronisk sjukdom där epileptiska anfall, vilka är intermittenta mönstrade utsläpp under flera sekunder till tiotals sekunder på elektroencefalografiska (EEG) inspelningar i samband med kliniska manifestationer, avbryta en Interiktal tillstånd, som kännetecknas av närvaron av synkrona neuronala urladdningar varar tiotals millisekunder och kallade Interiktal händelser 1. Det drabbar cirka 1% världens befolkning och även kramper kontrolleras hos majoriteten av patienterna, gör ungefär en tredjedel av personer med epilepsi visar inte lämpligt svar på antiepileptika 2. I detta tillstånd, som kallas pharmacoresistant epilepsi och vars mekanismer fortfarande måste tydligt identifieras, kirurgisk resektion av specifik del av hjärnan identifierats som anfallsdebut zon förblir det enda alternativ behandling som ger ett positivt resultat för patienterna. Således, de utskurna prover från kirurgi ger den möjhet att studera mekanismerna för Interiktal utsläpp och anfallsgenerering och utbredning samt pharmacoresistance på livsduglig vävnad mänsklig centrala nervsystemet ex vivo.

Multi-elektrod arrayer (MEA), som består av ett arrangemang av rumsligt fördelade mikroelektroder, tillåter samtidig stimulering och registrering av elektrofysiologiska aktivitet från flera platser i vävnaden, vilket ger en utmärkt metod för att studera spatio-temporala mönster av spontan och framkallad aktivitet . Denna teknik, tillämpades först för att övervaka utvecklings förändringar i nervcellskultur aktivitet 3 och sedan anpassade för akut och organotypisk hjärna och ryggmärgs skivor 4-6, anses för närvarande ett värdefullt elektroverktyg.

Den nuvarande protokollet beskriver hur man förbereder humana kortikala skivor från kirurgiskt resekerade vävnad och för att spela in med MEA pålitlig ex VIvo Interiktal och krampliknande händelser från dessa skivor. Denna teknik ger alltså ett sätt att ta itu med de grundläggande mekanismerna bakom epileptiska aktiviteter initiering, spridning och följder av antiepileptika hos både via mobil och nätverksnivå. Alla de metoder som används för att inhämta, förbereda, underhålla och spela in mänskliga skivor Här beskrivs i detalj.

Protocol

OBS: Protokollet beskrivs här följer riktlinjerna i franska "Comité Consultatif National d'Ethique" och har förklarats som en samling aktivitet genom INSERM.

1. Resektion av Human Epileptic Tissue

  1. Patienter
    1. Erhålla hjärnvävnad från patienter som lider av svårbehandlad epilepsi. Skaffa en skriftligt informerat samtycke innan operationen.
    2. För alla drivs epileptiska patienter utföra en omfattande presurgical upparbetning inklusive neurologisk undersökning, neuropsykologisk bedömning, yta EEG, och neuroimaging (MRI och ibland 18 FDG-PET-scan; Figur 1A), följt av post-kirurgisk histologisk undersökning av resekterade vävnad (Figur 1B) . OBS: Kirurgi indikeras när de olika upptäcktsfärder lokalisera på liknande beslag debut zonen och då till förmån för dess avlägsnande överstiger kirurgiska risker.
  2. Kirurgi
    1. Maintain antiepileptika preoperativt. Utför operation under narkos: induktion med inhalerat sevofluran (6% levereras förhållande och 100% inhalerad fraktion av O 2), intra venös sufentanyl (0,3 mikrogram / ​​kg) och antracurium (0,5 mg / kg) följt av underhållsbehandling med intra venös sufentanyl (0,5 | ig / kg / h) och inhaleras sevofluran (1 MAC).
    2. Använd ett neurosystem för att möjliggöra en exakt lokalisering av den skadade cortex (Figur 1C). Efter snitt i huden, utföra ett borrhål i benet, följt av en kraniotomi med en hög spill borr. Höja försiktigt benet luckan, och öppna dura med sax (Figur 1D).
    3. Använd intraoperativ ultraljud för att underlätta identifieringen av den onormala cortex, och mikroinstrument och en ultraljuds sug under operationsmikroskop.
    4. Koagulerar och skär pio-arachnoidal plan enligt sulcal gränser. Använd subpial dissektion till release cortex från pia runt den skadade området.
    5. Skär den vita substansen under onormala cortex för att utföra ett stycke "en bloc" resektion, avvara så mycket som möjligt kärlsystemet. Undvika traumatisk manipulation av cortex.
    6. Skär en 1 cm tjock skiva ur den resekterade vävnaden längs en riktning vinkelrät mot pial yta, inklusive sulcus botten och övergångs cortex.

2. artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) för Slice förberedelse, inkubation och inspelning

  1. ACSF för skiva beredning
    1. Bered en L sackaros-baserade ACSF 7,8, innehållande (i mM): 250 sackaros, 3 KCl, 25 NaHCOa 3, 10 D-glukos, 1 CaCl2, 10 MgCl2; upplösa dessa salter i avjoniserat vatten och syresätta lösningen med karbogen i minst 10 min.
    2. Sätta ~ 700 ml av sackaros ACSF vid -80 ° C under 50 till 60 min (eller -150 ° C under 15-20 min). Hålla resten avlösningen under syresättning i is. OBS: ACSF för skiva beredning kan lagras vid 4 ° C; i detta fall, tillsätt CaCl2 och MgCl2 dagen av experimentet, innan kylning.
  2. ACSF för slice inkubation och inspelning
    1. Bered minst 3 L av färd ACSF 7,8, innehållande (i mM): 124 NaCl, 3 KCl, 26 NaHCOa 3, 10 D-glukos, 1,6 CaCl2, 1,3 MgCl 2; upplösa dessa salter i avjoniserat vatten och syresätta lösningen med karbogen. Innan du lägger MgCl2, hålla lite ACSF att utföra inspelningar i 0 Mg 2+ ACSF. OBS: inkubation / inspelningen ACSF kan lagras vid 4 ° C; i detta fall, tillsätt CaCl2 och MgCl2 dagen av experimentet.

3. Utrustning för Slice Inkubation och inspelning

  1. Gränssnitt kammare för skiva inkubation
    1. Använd en hjärna skiva kammare för att upprätthålla levande skivor ex vivo </ Em> i gränssnittsläge. OBSERVERA: Kammaren består av en nedre sektion, som innehåller värme och sensorelementen och en keramisk bubblare och är fylld med destillerat vatten, och en övre del, där skivorna vila på ett ark av linsvävnaden i platt område i centrum av kammaren (Figur 2A - B).
    2. Använd två separata fina PTFE rör, genom vilka preoxygenated ACSF kommer in i kammaren. OBSERVERA: Rören spiral i det uppvärmda vattnet och når den övre delen av kammaren; varefter lösningen utträder medelst kapillärverkan med linsvävnad, som förmedlar denna lösning i exit brunnar.
    3. Anslut PTFE-rör av gränssnittet kammaren till en peristaltisk pump, för att medge kontinuerlig perfusion av skivorna med preoxygenated mediet.
    4. Bibehålla den höga syrespänningen genom syresätta med karbogen (95% O2 och 5% CO2) genom den keramiska bubblare. OBS: Denna värmd och fuktad gasblandning nårskivor i den övre delen av kammaren genom lämpliga hål.
    5. Hålla temperaturen i den övre delen av kammaren genom att ansluta kammaren till en temperaturregulator, genom en speciell dubbel-ended-kabel, som har en anslutning för kammarens värmeelementet och en extern temperaturgivare vid en ände. Placera sensorn nära skivorna för att kontrollera temperaturen i hela inkubationen (figur 2C).
  2. Multi-elektrod array inspelningar
    1. Använd plana flerelektrodanordningar med 120 titannitridpartiklar elektroder (30 um diameter) isolerade med kiselnitrid och intern referenselektrod, arrangerade i en 12 x 12 matris med 200 um centrum till centrumavstånd. OBS: Andra konfigurationer med olika elektroddiameter och avstånd är möjliga. I synnerhet kan MEA chip utvidgas till provet större skivor av mänskliga vävnader.
    2. Förvärva elektriska signaler på 10 kHz med hjälp av ett MEA2100-120-system (pre- och filter förstärkare med integrerad datainsamling och analog-digital omvandlare, 16 bitars dataupplösning, inspänningsområde och bandbredd justerbar genom mjukvara) genom en särskild programvara (MC_Rack). OBS! MEA2100 huvudsteg är utrustad med en metallplatta för fixering av uppvärmningsbara perfusion elementet genom magnetisk hållare, att kontinuerligt BEGJUTA skivorna hela inspelningen.
    3. Hålla vävnaden nedåt på MEA med en liten hemlagad platina ankare, vilket säkerställer en god elektrisk koppling mellan skiva och elektroderna.

4. Beredning av Interface avdelningen och verktyg för Dissection och Skivning

  1. Gränssnitt kammaren
    1. Fylla den undre sektionen av gränssnittet kammaren med destillerat vatten. Säkerställa att nivån av vatten omsluter fullständigt värmeelementet och är 2-4 mm under övergången mellan den nedre och den övre sektionen av kammaren. Kontrollera denna nivå dagligen innan du slår på värmen,För att undvika skada på värmeelementet.
    2. Ansluta kammaren till en karbogen källa, utrustad med en sekundär flödesregulator för finjusteringar av gastryck.
    3. Skär en skiva av linsvävnad för att passa den platta delen av munstyckskammaren, och placera den nära ingången lösnings rör, för att låta någon bubbla fly från inmatningsraden innan skivorna.
    4. Klipp två bitar av tvinnad bomullstråd så länge bit linsvävnad, och placera dem längs de viktigaste sidorna av den plana delen av kammaren. NOTERA: Detta bidrar till att något höja perfusionslösningen nivån i kammaren.
    5. Ställ in flödeshastigheten för den peristaltiska pumpen vid en ml / min och aktivera pumpen.
    6. Börja syresättning av vattnet i den nedre delen av kammaren.
    7. Ställ in temperaturen på temperaturkontroll vid 37 ° C och slå på den. Täcka den övre delen av gränssnittet kammaren med en bit parafilm och vänta minst 30 min för temperature att öka och stabiliseras.
  2. Verktyg för dissekering och skivning
    1. Förbered en dissektion kit bestående av två fin pincett, en spatel, en liten sked och ett blad; två glaspetriskålar, två borstar samt cyanoakrylatlim.
    2. Ställ in parametrarna för vibratome: tjocklek, 400 pm; frekvens, 70-90 Hz; amplitud, 0,9-1 mm, hastighet: 0,1 mm / sek.

5. Humant Kortikal Slice Framställning

  1. Avlägsna sackaros-baserade ACSF från -80 ° C frys och blanda det i syfte att erhålla ett slags slask. Syre det med karbogen, lägga ~ 250 ml i en glasflaska och förvara den på ett Dewar flaska fylld med is, men det gick till mottagningen rummet på sjukhuset för att få vävnaden. Under tiden hålla resten vid -20 ° C.
    OBSERVERA: Under operationen, dissekerar neurokirurg ett litet block av kortikal vävnad. Placera omedelbart provet i iskall sackaros ACSF för överföring till laboratoriet.
  2. Håll den tid som behövs för överföringen från sjukhuset till laboratoriet till maximalt 30 minuter. I laboratoriet, ta sackaros baserade syresatt ACSF av -20 ° C frys, blanda det att ha en slush, fylla en petriskål och vibratome buffertbrickan och börja syresätta både med karbogen. Ta försiktigt ut bit mänsklig vävnad ur flaskan med en sked och lägg den i petriskålen (Figur 2D).
  3. Med hjälp av pincett, försiktigt bort blodproppar, fartyg och hjärnhinnorna för att undvika motstånd under skärning. Ta mening, bestående av pia-materia, från sidorna av vävnadsblocket, att uppmärksamma att inte skada den kortikala ytan. Med ett blad, skär en sida av vävnaden för att erhålla en plan yta, som kommer att limmas på vibratome preparatplatta. OBS: hjärnhinnor, som består i pia-materia, är avlägsnas med början från sidorna av vävnadsblocket, att uppmärksamma att inte skada den kortikala ytan.
  4. Om blocket av tissue är större än MEA kammaren, skära en bit av lämpliga dimensioner före limning det på preparatplatta (fig 2E).
  5. Limma vävnaden för att få tvärgående kortikala skivor, lägg den i buffertbrickan och skär 400 um tjocka skivor vid låg hastighet (0,1 mm / sek) (Figur 2F).
  6. Skär bitar av linsvävnad med slice dimensioner; med en spatel och en borste, överföra skivor på dessa objektiv vävnader och inkubera dem i gränssnittet kammare vid 37 ° C under minst 1 timme före start inspelningar (Figur 2G - I). Kontinuerligt förvara skivorna i samma förhållanden fram till användning. OBS: Placera skivor på linspapper är ett viktigt steg för att underlätta både perfusion av undersidan av skivor och avlägsnandet av skivor från gränssnittet kammaren före inspelning.
    1. Medan överföra skivorna på linsvävnaden, hantera dem mycket noga, undviker att röra vid kortikala skikt område medborsten.
    2. Förbered skivorna en i taget och omedelbart överföra vart och ett av dem till gränssnittet kammaren, i syfte att säkerställa korrekt syretillförsel och temperatur; segmentera blocket av resekterade vävnad så snabbt som möjligt.

6. Beredning av MEA Setup för inspelningar

  1. Anslut perfusionssystemet till en peristaltisk pump och MEA-systemet till en dator. Syre inspelningen ACSF. Placera ett tomt MEA chip inuti förstärkaren.
  2. Ställ temperaturregulator för värmekanylelementet för att nå 37 ° C i MEA kammaren och starta perfusion vid 5-6 ml / min. OBS: Det är vanligtvis nödvändigt att ställa in temperaturen 3-4 ° C högre än en önskad, beroende på rumstemperaturen och flödeshastigheten.
    1. Kontrollera temperaturen i MEA kammare med en fin termometer, placera den närmast möjliga till centrum, utan att vidröra elektrodarea.
  3. Starta inspelningen software och kontrollera att alla MEA elektroder är väl anslutna och att det finns ingen buller på grund av perfusion.
  4. Starta MEA_Monitor att kontrollera funktionen hos kameratabellen.

7. Överföring av en skiva från Interface Chamber till MEA Chip för inspelning

  1. Häll några värmde inspelningen ACSF i ett glas petriskål; med en pincett, ta en bit från gränssnittet kammaren, genom att ta tag den genom linsen vävnaden, och placera den i petriskål. Lossa försiktigt skivan från vävnaden. Om nivån av lösningen i gränssnittet kammaren är noggrant justeras under inkubationstiden, kommer skiva lossna från linsvävnaden endast genom att sänka ned det i lösningen; annars, använd en liten borste för att underlätta avskiljandet.
  2. Fyll en MEA chip med lite ACSF och med en spatel, överföra skiva i den. Med en plast Pasteur pipett försiktigt bort lösningen för att göra skivan fastnar på elektrodområdet och hålla den på plats med en platina ancheller. Tillsätt 1 ml inspelningen ACSF, placera MEA chip in i förstärkaren och börja perfusion vid 5-6 ml / min (Figur 2J - L).
  3. Kontrollera slice position på MEA inspelningsområdet med hjälp MEA_Monitor, justera den om det behövs för att kunna spela in från de kortikala skikt och ta en bild. Starta inspelningen.

Representative Results

Inspelningen av mänsklig kortikal skiva aktivitet startar samtidigt perfusion vävnaden med normal inspelning ACSF (som tidigare beskrivits) 7,8. I detta tillstånd, när vävnaden är väl bevarat under operation och senare under vävnadsöverföring från sjukhuset och slice förberedelse, kan man observera spontan aktivitet, i form av små Interiktal liknande händelser, som upptäckts från små kluster av MEA elektroder. Interiktal liknande urladdningar bestod i en fältpotential, vanligtvis bifasisk, innefattande en initial skarp negativ avböjning och når tiotals mikrovolt, följt av en längre motsatt våg som varar flera tiotals millisekunder. Snabba flera enheter aktiviteter ingår ofta i området potentialen främst i den inledande delen. Ett representativt exempel på Interiktal liknande aktivitet illustreras i figur 3Aii, där spår registreras av en MEA elektrod visas.

För att spela in epileptiska anfall från ivitro humana kortikala skivor, är det nödvändigt att BEGJUTA dem med ett "epileptogena" ACSF, där Mg 2+ är frånvarande och K + höjs till 6 mM, för att öka vävnads retbarhet 1 (ökningen av K + 3-6 mM räcker inte för att framkalla epileptiska anfall, data visas ej). När perfusionen med 0 Mg 2 + 6 mM K + ACSF har startat, gradvis ökar aktiviteten av kortikala skivor och den första beslag visas inom 15-20 min (15,4 ± 1,7 minuter, n = 10, från 5 patienter; Fig 3 Ai ). Vi framkallade ictal-liknande aktivitet, såsom visas i figur 3, i 75% av de patienter som studerats och hos 66,7% av alla inspelade skivor.

Epileptiska aktiviteter registreras från intilliggande elektroder av MEA-chip, och jämförelse av ella dynamiken i fält potentiella händelser gör att studera deras webbplats för uppkomst och utbredning. En representativ beslag spelats in från en skiva av humen hjärnbark med MEA-systemet visas i figur 3B (ett representativt spår av ett beslag som registrerats av en enda MEA elektroden visas vid högre temporal upplösning i figur 3 AIII). Observera att beslaget är inspelad från nästan alla elektroder MEA-chip, vilket indikerar att den kan fortplanta sig till en stor kortikala område. Dessutom tittar på de enskilda spåren som spelats in från varje elektrod, är det möjligt att observera en gradvis spridning av beslaget över vävnaden: ja, det börjar först i kortikala område som omfattar den högra halvan av elektroduppsättningen, och det gradvis sprider sig till det område som omfattar den vänstra halvan (.. jag e, jämföra spår från elektrod L6 och B6, figur 3B).

Figur 1
Figur 1: En kortikala dysplasi en. d sin kirurgiskt avlägsnande A Taylor typ fokal kortikal dysplasi (vit pil) inbäddade i en vänster frontalloben sulcus visualiseras på preoperativa MRT (A), och bekräftades senare av histologisk undersökning (B) MAP-kinas märkning; skal: 200 nm) visar en kortikal dyslamination, onormala neuroner och ett spår på nervceller med en ofullständig migration i den nedre vita substansen. Under operation är dysplasi lokaliserad enligt MRI data med ett neurosystem (C). Visualisering av gyrus innehållande dysplasi under operation (D).

Figur 2
Figur 2:. Utrustning och förfarande för human kortikal skiva beredning Ett gränssnitt kammare används för att upprätthålla mänskliga kortikala skivor ex vivo (A); den skivor vilar på ett blad av linsvävnad i lägenheten område i den övre delen av kammaren (B), där en temperatursensor (C, till vänster), som är ansluten till en temperaturregulator (C, höger, upp) genom en dubbel ended kabel (C, höger, ner), är placerad för att hålla 37 ° C under slice inkubationstid. När erhållits, placera resekerade block av vävnad i en petriskål fylld med iskallt sackaros-baserade ACSF (D) och ta bort blodproppar, fartyg och hjärnhinnorna, för att underlätta skivning. Om vävnadsblock är större än MEA kammare, isolera en bit av lämpliga dimensioner med ett blad (E) och limma fast den på vibratome preparatplatta (F). Skär 400 um tjocka skivor och med hjälp av en spatel (G) överföra dem på bitar av linsvävnad (H) och inkubera dem i gränssnittet kammaren (I). Innan du spelar in, remove linsvävnaden genom att sänka ner skiva i en petriskål fylld med ACSF och överföra den till en ACSF fylld MEA chip med en spatel (J). Avlägsna lösningen att låta slice fäster på MEA (K) och hålla den på plats med hjälp av en platina ankare. Placera MEA i förstärkaren (L), börja perfusion och inspelning.

Figur 3
Figur 3: MEA inspelningar av epileptiska anfall hos humana kortikala skivor (A) En representant spår av mänsklig kortikal skiva som registrerats av en MEA elektrod visas i panelen i.. I närvaro av normal ACSF, är det möjligt att observera Interiktal liknande spontan aktivitet (lilla grå rektangel, zoomas in panelen ii); då, när perfusionen med 0 Mg 2 + 6 mM K + ACSF har startat, det första seizure visas efter en ~ 15 min fördröjning och följs av andra händelser på 2-3 min intervall. Panel III visar beslaget i den stora grå rektangel i panelen i med ett zoomat skala. Den blå kurvan visar en zoom av verksamheten, vilket indikeras av den blå linjen och pil. Panel iv) visar data som visas i panelen iii) högpass filtreras vid 250 Hz, som avslöjar flera enheter aktivitet när zoomas (blå kurva). (B) Representant inspelning av ett anfall i närvaro av 0 Mg 2 + 6 mM K + ACSF från alla MEA elektroder. Varje ruta representerar en elektrod av 12 x 12 MEA matris och visar ett 80 sek tidsfönster; den streckade linjen anger läget för den kortikala ytan i förhållande till MEA array.

Discussion

Pharmacoresistant epilepsi är ett sällsynt tillstånd, som kan utforskas i mänsklig vävnad in vitro. Detta gör det möjligt att studera epileptiska mänsklig cortex, som visar specifika brister som endast delvis återges i djurmodeller. Metoden beskrivs här låter förbereda och spela in mänskliga postoperativa vävnader ex vivo med bevarad cellulär livsduglighet och nätverk så att de spontant producerar epileptiska aktiviteter. Behålla liknande aktiviteter än de som spelats in vivo är avgörande för att studera mekanismerna för uppkomsten av patologiska aktiviteter. Vidare tillåter sådana metoder att utforska mänskliga vävnader och undvika icke perfekta djurmodeller av sjukdomen. Men studerar mänsklig vävnad kräver synkronisering mellan neurokirurger och experimentellt laboratorium. Vävnads transporter kräver särskild vård inte vara traumatiskt. Dessutom är begränsad både mängden av provet och vävnaden. Slutligen är tillgången till lämpliga kontrollvävnader main oro. Med detta preparat, de postoperativa vävnader spontant producera Interiktal liknande utsläpp vid normal ACSF 7,8. Ictal liknande händelser kan också framkallas i modifierad, prokonvulsiva ACSF så att mekanismerna för anfalls initiering och övergång från Interiktal tillstånd till anfall kan undersökas.

Mänsklig vävnad kan hållas lönsamt för upp till 10 timmar i villkoren vad gäller gränssnitt. Skivor ansågs lönsamt när flera enheter aktivitet eller fältpotentialer observerades spontant och när verksamheten hade framkallat genom att öka retbarhet genom extracellulära kaliumökningar och / eller magnesium minskar. Även variation i aktivitet inträffar sannolikt avspeglar skillnader i sjukdomstillstånd och kortikala områden, vi undersökt epileptogena egenskaper hos en vävnad endast friska skivor visar spontan Interiktal och framkallade ictal utsläpp. För att bevara vävnad vitalitet och aktivitet, är ett gränssnitt kammare används för att lagra tHan skär vid 36-37 ° C för återvinning innan inspelning med MEA-systemet. I själva verket har flera grupper tydligt visat fördelarna gränssnitt baserat lagringssystem jämfört med vanlig bägare lagring och vikten av temperaturen för att bevara nätverksaktivitet av t.ex. spontana skarpa wave-ringar eller kolinerga-inducerade svängningar 9,10. Gränssnitt lagring av skivor har använts tidigare för att spela in epileptisk aktivitet från human hippocampus och subicular skivor 1,11. Med nuvarande MEA tekniken, efter återhämtningsperiod från skivning i villkoren vad gäller gränssnitt, är nätverksaktivitet registreras i nedsänkta förhållanden, i närvaro av högt flöde (5-6 ml / min) vid 37 ° C, med MEA-systemet. Den med reducerad diameter (1,8 cm) med MEA chip, som avgränsar en liten volym kammare (<1,5 ml), tillsammans med den ökade flödeshastigheten, ökar syretillförseln för den del, som har visat sig vara en kritisk faktor för spontan och PHArmacologically inducerad nätverksaktiviteter 9,10. Vidare minskade mängden cirkulerande ACSF underlättar farmakologisk testning.

Skivning Förfarandet är dock en traumatism för vävnaderna 12. Både neuronal arkitektur och klorid homeostas verkar störas vid vävnadsytan (50 pm). Ursprunget för de verksamheter som registreras av MEA marker, vilket prov vävnaden oftast ytligt utan djup penetration, kan uppstå traumatiserade områden. Men våra data visar att de extracellulära fält potentialer detekterade lokalt registreras i de flesta MEA elektroder och tidigare arbete visar att de är integrerade över en 100 till 200 pm avstånd från inspelningsplatsen 13, vilket tyder på att kramper registrerats i våra förberedelser är osannolikt att produceras av traumatiserade områden. Vidare, i studier utförda med volframelektroder som möjliggör djup penetration, de epileptiska verksamhet som registrerats i mänskliga vävnader liknartill dem som observerades hos patienter med epilepsi 1,7,8.

En annan begränsning av ex vivo vävnads inspelning är störningar i förbindelserna mellan de olika hjärnområden, vilket begränsar dynamiska neuromodulations. Detta kan förklara varför i sådan vävnad inte ictal liknande händelse spontant registreras, men kräver att utlösas av jonisk manipulation eller farmakologisk stimulering förbättrar retbarhet. Således i detta protokoll, är krampliknande händelser induceras genom att kombinera en förändring av extracellulärt K + 3-6 mm och en minskning av extern Mg2 + från 1,3 mM till Mg2 + -fri ACSF, för att öka vävnads retbarhet och ta bort Mg 2+ -beroende NMDA-receptorblock. I själva verket har det tidigare visats att epileptiform aktivitet som induceras i humana hjärnbarkens och hippocampus skivor med användning av Mg2 + -fri ACSF liknar de elektrografiska anfall spelats in vivo 14. Dessutom,Det har visats att epileptiforma utsläpp erhållits i tinningloben skivor blir resistenta mot kliniskt använda antiepileptika efter långvarig exponering för Mg2 + -fri ACSF 15,16, vilket ger en modell för att undersöka pharmacoresistant krampliknande händelser in vitro.

MEA tillåter inspelning av båda, fält potentialer och flera enheter verksamhet som består i neuronala aktionspotentialer ex vivo. Således MEA är ett kraftfullt elektro verktyg jämfört med EEGs, som utforskar fält potentialer som genereras av synkrona aktiviteter neuronala ensembler in vivo, men inte ger tillgång till enstaka neuron beteenden 17. Även nyare mikroelektroder kan spela in vivo flera enheter verksamhet som består i neuronala aktionspotentialer, de är invasiva, så deras användning är oftast begränsad till forsknings syfte under intrakraniella inspelningar. Särskilt MEA inspelningar utgör en teknik för valatt studera Ramar mönster av epileptiska händelser, de mekanismer som styr anfallsdebut och spridning och verkan av klassiska och nya antiepileptika. Anmärkningsvärt, att riva upp de celltyper och grunden för epileptiska urladdningar signalering, spik sorteringstekniker och farmakologisk testning bör kombineras med MEA tekniker. Även MEA kan ge tillgång till enskilda spikar, ger de inte information om synaptiska och biofysiska egenskaper. I framtiden bör andra tekniker kopplas till MEA inspelningar för att bättre prov cellulära beteende, nätverksaktiviteter och synaptisk signalering. Till exempel, för att fluorescens avbildning nysta nervceller eller gliaceller beteende samt jon dynamik, kan kombineras med MEA inspelningar. Ytterligare post-hoc histologisk analys kan också avslöja specifika förändringar av celltyper, proteiner eller receptorer, så att placeringen av de epileptiska aktiviteter kan korreleras med specifika omlagringar avnervstrukturen. Den MEA-systemet kan också ingå i en patch-clamp set-up för att korrelera enskilda celler eller konduktanser med befolkningsåtgärder. I framtiden kan optogenetic verktyg också användas, förutsatt att de mänskliga skivor kan odlas på lång sikt, som utförs för organotypiska skivor, så kan genomföras att transfektion eller infektion av specifika celltyper.

Disclosures

Sponsring av multikanalsystem lämnades för produktion av video och öppen tillgång publicering.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats med bidrag från ANR (Programme Blanc neurovetenskap), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), City of Paris (Programme Emergence), INSERM och La Pitié Salpétriéresjukhuset (Translationell forskningsavtal) till NR, från Neuropôle de Recherche Francilien (Nerf) till ED, från Université Pierre et Marie Curie UPMC (Programme konvergens) och från Institut du Cerveau et e la Mølle epiniere (Paris) till GH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Slice Chamber-2: Interface AutoMate Scientific, Inc. S-BSC2 It requires separate temperature controller
2-channel Temperature Controller Multichannel Systems, Germany TC02 It allows to plug in and use 2 interface chambers. 
Special cable for connection of TC01 to S-BSC2 with external reference PT100 Multichannel Systems, Germany CA3 The reference PT100 is placed near the slices 
6pin plug-connector with PT100 Multichannel Systems, Germany TS-PT100 External reference for CA3 cable
MEA workstation for recording data from 120-electrode MEAs Multichannel Systems, Germany MEA2100-120 It includes MEA2100-120 headstage and MEA2100 interface board. www.multichannelsystems.com
Microelectrode array for MEA2100-120 Multichannel Systems, Germany 120MEA200/30 Electrode spacing: 200 µm; electrode diameter: 30 µm; glass ring: 6 mm high. Different configurations (spacing, diameter, ring) possible. 
Video Microscope Table Multichannel Systems, Germany MEA-VMT-1 Table with a video microscope underneath to image the electrode field of the MEAs in an amplifier placed on top of the table and transfer the image to a computer.
Perfusion cannula Multichannel Systems, Germany PH01 Heatable perfusion cannula with temperature sensor; temperature can be programmed with TC02 controller
MC_Rack Multichannel Systems, Germany Software for data acquisition and recordings
Magnetic Perfusion Holder Multichannel Systems, Germany MPH Magnetic perfusion holder for PH01 element to fix the perfusion cannula and connect the perfusion system to the amplifier's ground
Neuroexplorer Nex Technologies Software for data analysis; info@neuroexplorer.com
Peristaltic pump (drive unit) Gilson F155001 0,01 to 48 rp
Peristaltic pump (pump head) Gilson F117800 R2 two channel
Ultrasonic aspirator Integra Life sciences, USA Cusa Excel + It allows blunt subpial dissection of the cortex
Neuronavigation Isis Solutions, France Surgiscope It allows real time identification of the brain structure on the preoperative MRI
Vibratome HM 650 V Microm Block slicing into 400 μm thick slices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14, (5), 627-634 (2011).
  2. Kwan, P., Brodie, M. J. Early identification of refractory epilepsy. New England Journal of Medicine. 342, (5), 314-319 (2000).
  3. Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Longterm stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multielectrode arrays. Neuroscience Letters. 361, (1-3), 86-89 (2004).
  4. Sun, J. -J., Luhmann, H. J. Spatio-temporal dynamics of oscillatory network activity in the neonatal mouse cerebral cortex: Network oscillations in neonatal cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 26, (7), 1995-2004 (2007).
  5. Dossi, E., et al. Functional Regeneration of the ex-vivo Reconstructed Mesocorticolimbic Dopaminergic System. Cerebral cortex. 23, (12), New York, N.Y. 2905-2922 (1991).
  6. Darbon, P., Scicluna, L., Tscherter, A., Streit, J. Mechanisms controlling bursting activity induced by disinhibition in spinal cord networks. The European journal of neuroscience. 15, (4), 671-683 (2002).
  7. Cohen, I., et al. On the Origin of Interictal Activity in Human Temporal Lobe Epilepsy in Vitro. Science. 298, (5597), 1418-1421 (1126).
  8. Huberfeld, G., et al. Perturbed chloride homeostasis and GABAergic signaling in human temporal lobe epilepsy. The Journal of neuroscience. 27, (37), 9866-9873 (2007).
  9. Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An Approach for Reliably Investigating Hippocampal Sharp Wave-Ripples In Vitro. PLoS ONE. 4, (9), (2009).
  10. Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29, (2), 319-327 (2009).
  11. Wittner, L., et al. The epileptic human hippocampal cornu ammonis 2 region generates spontaneous interictal-like activity in vitro. Brain. 132, (11), 3032-3046 (2009).
  12. Dzhala, V., Valeeva, G., Glykys, J., Khazipov, R., Staley, K. Traumatic alterations in GABA signaling disrupt hippocampal network activity in the developing brain. The Journal of neuroscience. 32, (12), 4017-4031 (2012).
  13. Menendezdela de la Prida, L., Huberfeld, G., Cohen, I., Miles, R. Threshold Behavior in the Initiation of Hippocampal Population Bursts. Neuron. 49, (1), 131-142 (2006).
  14. Avoli, M., Drapeau, C., Louvel, J., Pumain, R., Olivier, A., Villemure, J. -G. Epileptiform activity induced by low extracellular magnesium in the human cortex maintained in vitro. Annals of neurology. 30, (4), 589-596 (1991).
  15. Heinemann, U., Dreier, J., Leschinger, A., Stabel, J., Draguhn, A., Zhang, C. Effects of anticonvulsant drugs on hippocampal neurons. Hippocampus. 4, (3), 291-296 (1994).
  16. Li Zhang, C., Dreier, J. P., Heinemann, U. Paroxysmal epileptiform discharges in temporal lobe slices after prolonged exposure to low magnesium are resistant to clinically used anticonvulsants. Epilepsy research. 20, (2), 105-111 (1995).
  17. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents - EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13, (6), 407-420 (2012).
Multi-elektrod Array Inspelningar av Human Epileptic Postoperativ kortikalvävnad
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue. J. Vis. Exp. (92), e51870, doi:10.3791/51870 (2014).More

Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue. J. Vis. Exp. (92), e51870, doi:10.3791/51870 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter