Summary
Ved hjelp av protein microarrays inneholder nesten hele S. cerevisiae proteom blir undersøkt for rask objektiv avhør av tusenvis av protein-protein interaksjoner i parallell. Denne metoden kan benyttes for protein-lite molekyl, posttranslasjonell modifikasjon, og andre assays i high-throughput.
Abstract
Høy tetthet funksjonelle protein microarrays inneholder ~ 4200 rekombinante gjær proteiner blir undersøkt for kinase protein-protein interaksjoner ved bruk av en affinitetsrenset gjær kinase fusjonsprotein som inneholder en V5-epitop tag for avlesning. Renset kinase oppnås gjennom kultur av en gjærstamme som er optimalisert for høyt kopiproteinproduksjon huse et plasmid som inneholder en kinase-V5-fusjonskonstruksjon som under en GAL-induserbar promoter. Den gjær dyrkes i media restriktive med en nøytral karbonkilde i 6 timer, fulgt av induksjon med 2% galaktose. Deretter blir kulturen høstet og kinase ble renset ved hjelp av affinitets-standard kromatografiske teknikker for å oppnå et høyt renset protein kinase for anvendelse i analysen. Det rensede kinase fortynnes med kinasebuffer til et passende område for analysen og protein microarrays blokkeres forut for hybridisering med proteinet microarray. Etter hybridisering, blir arrays probet med monoklonale V5 Antibody for å identifisere proteiner som er bundet av den kinase-V5 protein. Til slutt blir de arrays skannet ved bruk av en standard microarray scanner, og data blir ekstrahert for nedstrøms informatics analyse 1,2 for å bestemme en høy tillit sett av protein interaksjoner nedstrøms for validering in vivo.
Introduction
Behovet for å utføre globale analyser av protein biokjemi og bindende aktivitet in vivo har resultert i utviklingen av nye metoder for profilering protein-protein interaksjoner (PPI) og post-translasjonelle modifikasjoner av hele proteom 1,3-8. Protein mikromatriser er produsert som funksjonelle protein microarrays bruker helaftens funksjonelle proteiner 4-6,8,9 eller analytiske protein microarrays inneholder antistoffer 10,11. De er konstruert for å inneholde en høy tetthet av proteiner oppstilt på objektglass med en variasjon av overflatekjemi for å lette en rekke eksperimentelle betingelser som kreves for å gjennomføre omfattende biokjemiske analyser 12. Nitrocellulose og aldehyd overflatekjemi for kjemisk vedlegg gjennom lysin eller affinitet festemetoder som nikkel- chelated lysbilder for å feste His-tagget proteiner og glutation for tilhørighet vedlegg blant andre 13. Bruk av funksjonelle protein mikromatriser å påvise protein-protein interaksjoner krever tilgang til en høy kvalitet funksjonelt protein-bibliotek 14. S. cerevisiae er mottagelig for å produsere et slikt bibliotek gjennom sammenkobling av high-kopi affinitet merket protein konstruksjoner med høy gjennomstrømming kromatografisk renseteknikker. Det store flertallet av gjær genomet har blitt sekvensert og nesten hele proteom- kan uttrykkes fra en høy-kopiplasmid for rensing og biokjemiske analyser 12. Når proteiner er innhentet og kledd i 384-brønners format, de skrives ut på et objektglass slik at for rask parallell multi-parametrisk biokjemisk analyse og bioinformatiske avhør 8,14-16. Protein mikromatriser har vært brukt for enzymatiske analyser og interaksjoner med proteiner, lipider, små molekyler, og nukleinsyrer blant mange andre anvendelser. Tilgjengeligheten av proteiner på overflaten av proteometarrays gjøre dem mottagelig for forskjellige typer av analytisk påvisning inkludert, immun-affinitet, overflate-plasmonresonans, fluorescens og mange andre teknikker. Dessuten gir det mulighet for god kontroll av den eksperimentelle tilstand der det kan være vanskelig å gjøre in vivo.
Målet med denne protokollen er å demonstrere riktig bruk av funksjonelle protein microarrays å påvise protein-protein interaksjoner. Dette programmet gjør det mulig for høy gjennomstrømming parallelt biokjemisk analyse av proteinbinding aktiviteter ved hjelp av et høyt renset analytt (protein) av interesse. En C-terminal (karboksy-terminal) merket V5-fusjonsprotein agn av interesse produseres fra en høy-kopi-plasmid i en gjærstamme som er optimalisert for proteinrensing. C-terminal merking sikrer at full-lengde protein er blitt oversatt. Proteinet anvendt i denne studien er Tda1-V5-fusjonsprotein kinase, som renses ved hjelp av nikkel affinitet harpiks via en His6X tag. Den Tda1-V5 fusion bygt er renset gjennom serie eluering med et imidazol gradient for å eluere det meste sterkt anriket fraksjon for anvendelse i analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Probe Forberedelse
- Kulturen og rense V5-kinase-fusjons sonder som brukes til å undersøke interaksjoner med andre proteiner som følger:
- Bruk fersk stripete gjærstamme Y258 (Mata pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) inneholder V5-fusjonsprotein (uttrykt fra Gateway vektor Pyes-DEST52). Bruk isolerte protein som probe på mikromatriser. Plate gjær på syntetisk komplett-uracil (Sc-Ura) / 2% dekstrose / Agar og vokse ved 30 ° C i 3 dager fra frossen kultur (-80 ° C glyserol lager).
- Vaksinere startkulturer (5-20 ml) fra en enkelt koloni og vokse over natten i Sc-Ura / 2% dekstrose på risting plattform (220-250 rpm) eller hjulet ved 30 ° C.
- Den følgende morgen, inokuler 400 ml av SC-ura / 2% raffinose kultur med tilstrekkelig starterkultur til en endelig OD 600 på 0,1.
- Vokse Inoculum til OD 600 på 0,6 etterfulgt av galaktose induksjon av V5-kinase fusion konstruere ekspresjon ved å tilsette en oppløsning av 3 x gjærekstrakt / pepton (YEP) supplert med 6% galaktose, ved å tilsette nok til å fortynne induksjons-mediet med en faktor på tre, slik at sluttkonsentrasjonen av galaktose er 2%.
- Indusere cellene ved 30 ° C i 6 timer på et risteplattform. Bruk en 2 L Erlenmeyerkolbe å sikre hensiktsmessig lufting.
- Høste celler ved anvendelse av en JA-10 (eller tilsvarende) ved å spinne rotoren 400 ml av cellesuspensjonen ved 1000 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Vask cellene gang med 50 ml iskald PBS buffer og overføre til en 50 ml konisk tube. Vask pellet igjen i iskald PBS buffer (uten vaskemidler eller andre tilsetningsstoffer) som brukes for lysering og overføring til 2 ml snap-cap rør for lyse.
- Spin cellene ved 20 000 xg i 1 min ved 4 ° C til en pellet og pipette bort bufferen.
- Plasser rørene på is og fortsette med lyse trinn.
- Lyse av cellene (250-350 ul pellet) med 00,5 mm zirkonia perler i et 1: 1: 1 volum cellepellet, perler, og fosfatbufret saltløsning (PBS) lysebuffer, og vortex blandingen ved hjelp av en omrørings plattform 3 ganger med 2 minutters intervaller ved 4 ° C.
- Sentrifuger løsningen ved 20 000 xg i en bordmikrosentrifuge i 10 minutter ved 4 ° C.
- Pipetter supernatanten til polykarbonat med høy hastighet sentrifugerør og klar ved ulracentrufugation i 30 minutter ved 150 000 xg ved 4 ° C.
- Overfør det klarede lysat til et rør innehold forvasket Ni2 + affinitet harpiks (~ 100 ul) og inkuberes på en nutator i 2 timer ved 4 ° C for å fange Histidin (His) merket 6X V5-fusjonsprotein.
- Vask harpiksen tre ganger i 10 minutter ved 4 ° C med vaskebuffer. Pellet harpiksen ved hjelp av en bordsentrifuge i 5 minutter ved 1000 xg ved 4 ° C og supernatanten aspireres. Legg frisk vaskebuffer for hver vask og returnere røret i nutator for omrøring under vaskingen.
- Etter vask steps er fullført, gjelder den vaskede harpiksen til en frisk G-25 kolonne for eluering.
- Anvende 25 ul elueringsbuffer på en trinnvis måte som begynner med 100 mM imidazol Til 500 mM imidazol i 50 mM trinn for totalt 9 fraksjoner.
- Analysere de oppsamlede fraksjoner ved hjelp av natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel (SDS-PAGE) og Coomassie-farging for å identifisere de mest sterkt anriket fraksjon (er) for anvendelse i analysen, og legge til glycerol til 30% og oppbevar ved -80 ° C inntil den ble brukt i assay.
2. sondering Arrays
MERK: Vennligst se trinn 2.6 i denne delen for å forberede antistoffet løsningen før du begynner med analysen.
- For å oppdage interaksjoner, fortynne V5-fluorophore konjugert antistoff (dvs. AlexaFluor 647) til 260 ng / ml i sonde buffer og bland godt ved å riste.
MERK: Forbered dette antistoffet løsningen 30 min før bruk og plasser røret på en nutateller eller hjulet for å sikre fullstendig blanding og en homogen suspensjon av antistoff. - Fortynn V5-fusjonsproteinet sonde over et konsentrasjonsområde på 5-500 ug / ml.
MERK: optimalisert for hver protein-protein interaksjon assay ved å bruke probe buffer. Optimalisering innebærer å legge til flere sonder for å sondere buffer. Typisk 10 ug / ml blir anvendt som utgangspunkt og justeres tilsvarende basert på signalstyrken. - Fjern de protein-mikromatriser fra fryseren (-20 ° C) og bringe til 4 ° C i kjøleskap like før bruk.
- Legg blokkeringsbuffer direkte til lysbildeholderen som inneholder protein micorarrays og dekk toppen med Parafilm for å hindre lekkasje. Blokker arrayene i blokkeringsbuffer i 1 time med risting ved 50 rpm på en scene ved 4 ° C.
- Etter blokkering, overføre arrays til et fuktet kammer kjølt til 4 ° C, og tilsett 90 ul fortynnet probe direkte til matrisen overflaten. Overlappe arrmåter stå med hevet løfter slip og ruge statisk (uten risting) i fuktet kammer ved 4 ° C i 1,5 timer.
- Vask arrays 3 ganger i 1 minutt hver probe i buffer i tre 50 ml koniske rør. Legg lysbildet til koniske rør som inneholder nok pre-kjølt probe buffer til helt konvolutt raset. Tillat løfteren slip til forsiktig gli ut av protein microarray (ikke press det ut som dette kan føre til skade på tabellen overflaten).
- Påfør antistoff løsningen direkte til matrise umiddelbart etter endt vask (trinn 2.5) og overlay med hevet løfter slip som før. Inkuber arrays i 30 minutter ved 4 ° C i en fuktet kammer.
- Utfør den samme vasketrinnet som før (3 ganger 1 min i probe-buffer), og spinn i et 50 ml konisk rør ved 800 xg i en bordsentrifuge i 5 minutter ved romtemperatur. Air-tørke arrays i en lysbildeholderen i mørket i 30 minutter før du skanner rekken på 647 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den protein-protein interaksjon aktivitet ble observert ved anvendelse av en standard brikke leser for å evaluere Tda1-V5 protein kinase-fusjonskonstruksjon som et agn protein mot en gjær-funksjonelt protein mikromatrise inneholdende omtrent 4200 unike S. cerevisiae GST-fusjonsproteiner. Ytterligere avhør med Genepix programvare avdekket en rekke bindende hendelser av varierende intensitet. Affiniteten ble avleses fra gradert intensiteten av signalet som utledes fra et monoklonalt V5-fluorofor konjugert antistoff bundet til dens target (V5-kinase). ProCat scoring algoritmen 2 ble anvendt for å identifisere protein-protein interaksjoner på to forskjellige protein-mikromatriser for hvert av proteinene analysert i duplikat (hvert protein er flekket to ganger på matrisen), deretter en terskel cut-off ble bestemt for å oppnå de observerte interaksjoner.
Ved å sammenligne to matriser man henter fire tekniske replikater (n = 4) som kan brukes til å bestemme inter-assay variasjon gjennom korrelasjon (R 2) av de to stedene for hvert protein på oppstillingene. Totalt 9 protein-protein interaksjoner ble identifisert mellom Tda1-V5 agn protein og proteiner på microarray med en forhåndsdefinert terskel for å identifisere unike protein kinase interaksjoner en. Videre er de samme proteinene oppdaget i forskjellige posisjoner over hele matriser som en kontroll for å vurdere overflate gjenstander som kan bidra til falske positiver. Sammenligningen av flere bindings profiler av forskjellige kinase-V5 fusjonsproteiner muliggjør identifiseringen av kinase spesifikt protein-protein interaksjoner for testing in vivo.
I dette eksperimentet testet vi bindingsaktiviteten Tda1-V5 og identifisert flere statistisk signifikante PPIer basert på rangert etter p-verdi i forhold til andre kinaser testet. Av spesiell interesse er Rim11, som har blitt identifisert som et fosforylert mål for Tda1 i en tidligere publisert study 9. Når mål har blitt identifisert, kan de bli undersøkt for biokjemiske og funksjonelle aktivitet in vivo 1.
Figur 1:. Tda1-V5 i forhold til tom vektor kontroll Gjær protein microarrays flekket i to eksemplarer med ~ 4200 full lengde GST-fusjonsprotein ble inkubert med kontroll eller Tda1-V5 sonder. Innfelt panel sammen identisk regionen i begge arrays. Protein-protein interaksjoner ble oppdaget (blå bokser) mellom Rim11 og Tda1-V5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen present ble opprinnelig utført ved hjelp av 85 unike gjær protein kinase-V5 fusjonsproteiner å sammenligne bindingsaktivitet over distinkte og beslektede familier av gjær proteinkinaser resulterer i identifisering av nye kinase interaksjons nettverk in vivo 1. Som en voksende proteomikk profilering teknologi, utvikling av høy gjennomstrømning (HTP) screening av proteom bruker protein microarrays stolt på peptid biblioteker og eukaryote og prokaryote modellorganismer 8,17; senere, ble denne analysen plattformen brukes til høyere eukaryoter eksempel plante og menneskelig 5,7. Foreløpig er det ingen kommersielt tilgjengelig gjær protein array. Men sekvens verifisert cDNA samlinger er tilgjengelig fra flere ressurser
Selv om teknikken kan være kraftig, er en påminnelse å huske på at analysen er gjort in vitro, og dermed resultatene vil ha falske positiver. Dermed optimizing analysen tilstand og strategisk filtrering ordningen er tilrådelig å hente meningsfulle data. Neste generasjons protein microarray teknologi inneholde et mye større antall høyt rensede funksjonelle proteiner til biokjemisk analyse på tvers av en rekke organismer inkludert A. thaliana, S. cerevisiae, og Homo Sapien.
Nivået av raffinement som de nye protein microarrays har konstruert inn i dem gjør en ekspansiv rekke biokjemiske analyser som kan utføres. Nesten hele proteom- har blitt klonet og renset for S. cerevisiae ved hjelp av en C-terminal merkede biblioteket for å sikre riktig post-translasjonell modifikasjon av proteinene 14. Videre er den raske parallelle analyser som tilbys ved hjelp av protein-mikromatriser muliggjør en objektiv måte å protein-protein interaksjon og post-translasjonell modifikasjon profilering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
| Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Dextrose | Sigma | D9434 | |
| Raffinose | Sigma | R0514 | |
| Galactose | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
| Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
| Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
| Centrifuge JA-10 rotor | |||
| Centrifuge tubes (500 ml) | |||
| Falcon tube (50 ml) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes (2 ml screw cap tube) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Shaking Incubator (30 °C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
| Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1x PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
| Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1x PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
| Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| 3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | Galactose should not be autoclaved |
References
- Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
- Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays. Genome biology. 7, R110 (2006).
- Breitkreutz, A., et al. A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast. Science. 328, 1043-1046 (2010).
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
- Jeong, J. S., et al. Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293, 2101-2105 (2001).
- Ptacek, J., et al. Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature. 438, 679-684 (2005).
- Haab, B. B. Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).
- Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. Protein microarrays: novel developments and applications. Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).
- Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling. Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).
- Gelperin, D. M., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).
- Fasolo, J., Snyder, M. Protein microarrays. Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).
- Im, H., Snyder, M., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. Current protocols in protein science. Coligan, J. E. 27, Unit 27 24 (2013).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
