Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Sondering hög densitet funktionellt protein Microarrays att upptäcka protein-proteininteraktioner

Published: August 2, 2015 doi: 10.3791/51872

Summary

Använda protein mikroarrayer innehållande nästan hela S. cerevisiae proteom sonderas för snabb opartisk förhör av tusentals protein-protein interaktioner parallellt. Denna metod kan användas för protein liten molekyl, posttranslationell modifiering, och andra analyser i hög genomströmning.

Abstract

Hög densitet funktionella protein-mikroarrayer innehållande ~ 4200 rekombinanta jästproteiner undersöks med avseende kinas protein-proteinväxelverkningar med användning av en affinitetsrenad jästkinasfusionsprotein innehållande en V5-epitop-taggen för utläsning. Renat kinas erhålles genom odling av en jäststam optimerad för hög kopia proteinproduktion som hyser en plasmid innehållande en kinas-V5 fusionskonstruktion enligt en GAL inducerbar promotor. Jästen odlas i restriktiv media med en neutral kolkälla under 6 timmar följt av induktion med 2% galaktos. Därefter odlingen skördas och kinas renas med användning av standard affinitetskromatografiska tekniker för att erhålla en höggradigt renad proteinkinas för användning i analysen. Det renade kinas späds med kinasbuffert till ett lämpligt område för analysen och protein microarrays blockeras före hybridisering med protein microarray. Efter hybridiseringen, är uppsättningarna sonderades med monoklonal V5 AntibODY att identifiera proteiner bundna av kinas-V5-protein. Slutligen arrayer skannas med en vanlig microarray scanner, och data extraheras för informatik nedströms analys 1,2 för att bestämma ett högt förtroende uppsättning proteininteraktioner för validering nedströms in vivo.

Introduction

Behovet av att genomföra globala analyser av proteinbiokemi och bindande aktivitet in vivo har resulterat i utvecklingen av nya metoder för profilering protein-proteininteraktioner (protonpumpshämmare) och posttranslationella modifieringar av hela proteom 1,3-8. Protein mikroarrayer tillverkas som funktionellt protein mikroarrayer använder fullängds funktionella proteiner 4-6,8,9 eller analytiska protein mikroarrayer innehållande antikroppar 10,11. De är konstruerade för att innehålla en hög densitet av proteiner anordnade på objektglas med en mängd yta kemier för att underlätta en mängd olika experimentella villkor som krävs för att genomföra omfattande biokemiska analyser 12. Nitrocellulosa och aldehyd yta kemier för kemisk bindning genom lysin eller affinitet fäst metoder såsom nickel- kelatbundna diabilder för att fästa His-märkta proteiner och glutation för affinitets fäste bland andra 13. Användningen av funktionellt protein microarrays för att detektera protein-proteininteraktioner kräver tillgång till en högkvalitativ funktionellt protein bibliotek 14. S. cerevisiae är mottaglig för att producera ett sådant bibliotek genom parning av hög kopia affinitet taggade protein konstruktioner med hög genomströmning kromatografiska reningstekniker. Den stora majoriteten av jästgenomet har sekvenserats och nästan hela proteomet kan uttryckas från en hög-kopia plasmid för rening och biokemiska analyser 12. När proteinerna erhålles och ordnade i 384-brunnsformat, de trycks på ett objektglas som möjliggör snabb parallell fler parametrisk biokemisk analys och bioinformatik förhör 8,14-16. Protein-mikroarrayer har använts för enzymatiska analyser och interaktioner med proteiner, lipider, små molekyler och nukleinsyror bland många andra tillämpningar. Tillgängligheten av proteiner på ytan av proteometmatriser gör dem mottagliga för olika typer av analytisk detektion inklusive, immun affinitet, ytplasmonresonans, fluorescens och många andra tekniker. Dessutom tillåter den för finreglering av experimentella tillstånd där det kan vara svårt att göra in vivo.

Syftet med detta protokoll är att visa lämplig användning av funktionellt protein microarrays för att detektera protein-proteininteraktioner. Denna applikation gör det möjligt för hög genomströmning parallell biokemisk analys av proteinbindningsaktiviteter med en högrenat analyt (protein) av intresse. En C-terminalt (karboxiterminala) taggade V5-fusionsbetesprotein av intresse framställs från en hög-kopia plasmid i en jäststam optimerad för proteinrening. C-terminala märkning säkerställer att fullängdsproteinet har översatts. Det protein som används i denna studie är Tda1-V5-fusionsproteinkinas, som renas med användning av nickel affinitetsharts via en His6X tagg. Den Tda1-V5-fusions byggt renas genom seriell eluering med användning av en imidazol-gradient för att eluera den högst anrikade fraktionen för användning i analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sond Framställning

  1. Kultur och rena V5-fusionskinas sonder som används för att undersöka interaktioner med andra proteiner enligt följande:
    1. Använd nyligen strimmig jäststam Y258 (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) innehållande V5-fusionsprotein (uttryckt från GATEWAY vektor pYES-DEST52). Använd isolerade proteinet som sond på mikromatriser. Plate jästen på syntetiskt komplett-uracil (Sc-Ura) / 2% dextros / Agar och växa vid 30 ° C under 3 dagar från fryst kultur (-80 ° C glycerol lager).
    2. Inokulera startkulturer (5-20 ml) från en enda koloni och växa över natten i Sc-Ura / 2% dextros på skakplattform (220-250 rpm) eller hjul vid 30 ° C.
    3. Följande morgon, ympa 400 ml av Sc-Ura / 2% raffinos kultur med tillräcklig startkultur till en slutlig OD 600 av 0,1.
    4. Odla ympar till OD 600 av 0,6 följt av galaktos induktion av V5-kinas fusionen konstruera uttryck genom tillsats av en lösning av 3x Jästextrakt / Pepton (YEP) kompletterat med 6% Galaktos, genom att tillsätta tillräckligt för att späda ut induktionsmedia med en faktor tre, så att slutkoncentrationen av galaktos är 2%.
    5. Inducera cellerna vid 30 ° C under 6 h på en skakande plattform. Använd en 2 L Erlenmeyerkolv att säkerställa lämplig luftning.
    6. Harvest celler med användning av en JA-10 (eller jämförbar) rötor genom att snurra 400 ml cellsuspension vid 1000 xg under 5 min vid 4 ° C.
    7. Tvätta cellerna en gång med 50 ml iskall PBS-buffert och överför till en 50 ml koniska rör. Tvätta pelleten igen i iskall PBS-buffert (utan rengöringsmedel eller andra tillsatser) som används för lys och överföring till 2 ml snap-cap rör för lys.
    8. Snurra cellerna vid 20.000 xg under 1 min vid 4 ° C till en pellet och pipett bort bufferten.
    9. Placera rören på is och fortsätta med lys steg.
    10. Lyse cellerna (250-350 il pellet) med 00,5 mm zirkoniumoxid pärlor i en 1: 1: 1 volym av cellpelleten, pärlor, och fosfat-buffrad saltlösning (PBS) lysbuffert och vortexa blandningen med användning av en omrörningsplattform 3 gånger vid 2 min intervall vid 4 ° C.
    11. Centrifugera lysatet vid 20000 x g i en bords mikrofug under 10 min vid 4 ° C.
    12. Pipettera supernatanten i polykarbonat höghastighets centrifugrör och klargöra genom ulracentrufugation under 30 min vid 150.000 xg vid 4 ° C.
    13. Överför det klarnade lysatet till ett rör innehållande förtvättad Ni2 + affinitetsharts (~ 100 | al) och inkubera på en nutator under 2 h vid 4 ° C för att fånga Histidin (His) 6X tagged V5-fusionsprotein.
    14. Tvätta hartset tre gånger i 10 min vid 4 ° C med tvättbuffert. Pellets hartset med användning av en bordscentrifug under 5 min vid 1000 xg vid 4 ° C och aspirera supernatanten. Lägg till ny tvättbuffert för varje tvätt och returnera röret nutator för agitation under tvätten.
    15. Efter tvätt steps är kompletta, applicera det tvättade hartset till ett färskt G-25-kolonn för eluering.
    16. Applicera 25 | il elueringsbuffert på ett stegvist sätt med början med 100 mM imidazol till 500 mM imidazol i 50 mM inkrement för totalt nio fraktioner.
    17. Analysera de uppsamlade fraktionerna med hjälp av natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel (SDS-PAGE) och Coomassie-färgning för att identifiera den mest kraftigt anrikad fraktion (er) för användning i analysen och tillsätt glycerol till 30% och förvara vid -80 ° C tills de användes i analys.

2. sondera Arrays

OBS: Se steg 2.6 i detta avsnitt för att förbereda antikroppslösningen innan analysen påbörjas.

  1. För att detektera interaktioner, späd V5-fluoroforen konjugerad antikropp (dvs Alexafluor 647) till 260 ng / ml i sonden buffert och blanda väl genom att skaka.
    OBS: Bered denna antikropplösning 30 min före användning och placera röret på en nutateller eller hjul för att säkerställa fullständig blandning och en homogen suspension av antikroppen.
  2. Späd V5-fusionsprotein sonden över ett koncentrationsintervall av 5-500 pg / ml.
    OBS: Optimerad för varje protein-proteininteraktion analys, med användning av prob-buffert. Optimering innebär att lägga till fler prober för att undersöka buffert. Typiskt 10 | ig / ml användes som utgångspunkt och justeras därefter baserat på signalstyrkan.
  3. Avlägsna de protein microarrays från frysen (-20 ° C) och sätta till 4 ° C i kylskåp precis före användning.
  4. Lägg blockerande buffert direkt till diapositivhållaren som innehåller protein micorarrays och täcka toppen med parafilm för att förhindra läckage. Blockera arrays i blockeringsbuffert under 1 tim med skakning vid 50 varv per minut på en scen vid 4 ° C.
  5. Efter blockering överföra matriser till en fuktad kammare kyld till 4 ° C, och tillsätt 90 | il av utspädd prob direkt till arrayen ytan. Overlay ARRays med en upphöjd lyftare slip och inkubera statisk (ingen skakning) i fuktig kammare vid 4 ° C under 1,5 timmar.
  6. Tvätta arrayer 3 gånger under vardera 1 min i prob-buffert i tre 50 ml koniska rör. Lägg bilden till koniska rör innehållande tillräckligt pre-kyld sond buffert för att helt omsluta bilden. Låt lyften slip för att försiktigt glida av proteinet microarray (inte tvinga bort det eftersom det kan leda till skador på arrayen ytan).
  7. Applicera antikroppslösningen direkt till array omedelbart efter avslutad tvätt (steg 2,5) och overlay med en upphöjd lyftare slip som tidigare. Inkubera arrayer för 30 min vid 4 ° C i fuktad kammare.
  8. Utföra samma tvättningssteg som tidigare (3 gånger 1 min i probbuffert), och snurra i en 50 ml koniskt rör vid 800 x g i en bordscentrifug under 5 min vid rumstemperatur. Lufttorka uppsättningarna i en glashållare i mörker under 30 minuter innan du börjar skanna arrayen vid 647 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protein-proteininteraktioner aktivitet observerades med användning av en standardchipsläsare för att utvärdera Tda1-V5 proteinkinasfusionskonstruktion som ett betesprotein mot en jäst funktionellt protein microarray innehållande ungefär 4200 unika S. cerevisiae GST-fusionsproteiner. Ytterligare förhör med GenePix programvara visade en mängd bindande händelser av varierande intensitet. Affiniteten ades utläsa från det graderade intensiteten hos signalen härrörande från en monoklonal V5-fluoroforen konjugerad antikropp bunden till sitt mål (V5-kinas). ProCat scoring algoritm 2 användes för att identifiera protein-proteininteraktioner mellan två separata protein microarrays för vart och ett av de proteiner som analyserade i duplikat (varje protein är fläckig två gånger på matrisen), då en tröskelgräns bestämdes för att ha dödat de observerade interaktionerna.

Genom att jämföra två matriser man erhåller 4 tekniska replikat (n = 4) som kan användas för att bestämma inter-assay variation genom korrelation (R 2) av de två platserna för varje protein på matriser. Totalt 9 protein-proteininteraktioner identifierades mellan Tda1-V5 bete protein och proteinerna på microarray med hjälp av en fördefinierad tröskel för att identifiera unika proteinkinas interaktioner 1. Dessutom är de samma proteiner upptäckas i olika positioner i hela matriser som en kontroll för att bedöma ytan artefakter som kan bidra till falska positiva. Jämförelsen av multipla bindningsprofilerna för olika kinas V5 fusionsproteiner gör det möjligt att identifiera kinas specifik protein-proteininteraktioner för testning in vivo.

I detta experiment testade vi bindningsaktiviteten hos Tda1-V5 och identifierat flera statistiskt signifikanta PPI baserat på rangordnade efter p-värde jämfört med andra kinaser som testats. Av särskilt intresse är Rim11, som har identifierats som en fosforylerad mål av Tda1 i en tidigare publicerad sTudy 9. När mål har identifierats, kan de testas för biokemisk och funktionell aktivitet in vivo 1.

Figur 1
Figur 1:. Tda1-V5 jämfört med tom smittospridare Jäst protein mikroarrayer prickiga i duplikat med ~ 4200 fullängds GST-fusionsprotein inkuberades med kontroll eller Tda1-V5-sonder. Infällda panel jämför samma region i båda uppsättningarna. Protein-proteininteraktioner detekterades (blå lådor) mellan Rim11 och Tda1-V5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet presenteras ursprungligen utfördes med användning av 85 unika jäst proteinkinas-V5 fusionsproteiner för att jämföra bindningsaktivitet över distinkta och besläktade familjer av jäst proteinkinaser som resulterar i att identifiera nya kinas interaktions nätverk in vivo 1. Som en framväxande proteomik profilering teknik, utveckling av hög genomströmning (HTP) screening av proteom användning av protein mikroarrayer åberopas peptidbibliotek, och eukaryota och prokaryota modellorganismer 8,17; senare, var denna analys plattform tillämpas på högre eukaryoter såsom växt- och människo 5,7. För närvarande finns det ingen kommersiellt tillgänglig jäst proteinchip. Men verifierade sekvens cDNA samlingar finns från flera källor

Även om tekniken kan vara kraftfulla, finns en varning att hålla i minnet att analysen görs in vitro och, sålunda resultat kommer att ha falska positiva. Sålunda optimizing analys skick och strategiska filtreringssystemet är lämpligt att hämta meningsfulla uppgifter. Nästa generations proteinmicroarray teknik innehåller en mycket större antal högrenade funktionella proteiner för biokemisk analys över en mängd organismer, inklusive A. thaliana, S. cerevisiae, och Homo Sapien.

Graden av sofistikering att de nya protein-mikroarrayer har konstruerats in dem möjliggör en expansiv flertal biokemiska analyser som kan utföras. Nästan hela proteomet har klonats och renas för S. cerevisiae med användning av en C-terminalt märkta biblioteket för att säkerställa korrekt posttranslationell modifiering av proteinerna 14. Dessutom är de snabba parallella analyser erbjuds med användning protein microarrays möjliggör en objektiv metod för protein-proteininteraktion och posttranslationell modifiering profilering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Petri Dishes VWR NC-10747 or comparable
Bacto yeast extract Difco 0217-17
Bacto peptone Difco 0118-17
Bacto agar Difco 0140-01
Dextrose Sigma D9434
Raffinose Sigma R0514
Galactose Sigma G0750
Sc-Ura drop out media MP Bio 114410622
Small Culture tubes VWR/Fisher
Large Erlenmeyer Flask VWR/Fisher
Centrifuge JA-10 rotor
Centrifuge tubes (500 ml)
Falcon tube (50 ml) VWR/Fisher 21008-951
PBS Tablets Sigma P4417
FastPrep Tubes (2 ml screw cap tube)
FastPrep Machine MP Biomedicals 116004500
Zircon Beads BioSpec 11079105
Triton X100 Sigma P4417
DTT Sigma D9779
MgCl2 Sigma M8266 
NaCl Sigma S3014 
Imidazole (pH = 7.4) Sigma I5513 
PMSF Sigma 93482
Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) Roche 11873580001
Phosphatase inhibitor cocktail 1 sigma P2850
BSA Sigma A2153 
Tween-20 Sigma P1379 
ATP Sigma A1852 
Shaking Incubator (30 °C)
Nickel Affinity Resin Life Technologies R901-01
G25 column GE life sciences 27-5325-01 
Nutator VWR/Fisher
SDS-PAGE Gel (NuPage) Life Technologies
Coomassie Blue Stain Life Technologies
Monoclonal V5 Antibody Life Technologies R960-25
Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody Life Technologies 451098
Protein Microarrays Kit Life Technologies PAH0525013
Genepix Scanner Molecular Devices
Lifter Slips Thomas Scientific http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/
Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT,
2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF  (add just prior to use)
Add the reagents to 1x PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution
Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 Add the reagents to 1x PBS to obtain the desired volume of blocking buffer
Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μM ATP (for kinases), 1% BSA Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer
Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer
Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1x PBS to obtain desired volume of probe buffer
3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and  60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol)  Galactose should not be autoclaved

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fasolo, J., et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes. 25, 767-778 (2011).
  2. Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays. Genome biology. 7, R110 (2006).
  3. Breitkreutz, A., et al. A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast. Science. 328, 1043-1046 (2010).
  4. Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
  5. Jeong, J. S., et al. Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray. Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).
  6. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  7. Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).
  8. Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293, 2101-2105 (2001).
  9. Ptacek, J., et al. Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature. 438, 679-684 (2005).
  10. Haab, B. B. Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).
  11. Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).
  12. Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. Protein microarrays: novel developments and applications. Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).
  13. Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling. Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).
  14. Gelperin, D. M., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).
  15. Fasolo, J., Snyder, M. Protein microarrays. Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).
  16. Im, H., Snyder, M., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. Current protocols in protein science. Coligan, J. E. 27, Unit 27 24 (2013).
  17. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).

Tags

Cellulär Biology Utgåva 102 Protein mikroarrayer kinas jäst protein-proteininteraktioner
Sondering hög densitet funktionellt protein Microarrays att upptäcka protein-proteininteraktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fasolo, J., Im, H., Snyder, M. P.More

Fasolo, J., Im, H., Snyder, M. P. Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions. J. Vis. Exp. (102), e51872, doi:10.3791/51872 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter