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Bioengineering

कर्षण बल माइक्रोस्कोपी के लिए सेल संस्कृति सतह के पास लोकलाइजिंग रिपोर्टर फ्लोरोसेंट मोती के लिए एक उपन्यास विधि

Published: September 16, 2014 doi: 10.3791/51873
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Mechanical Science and Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

फ्लोरोसेंट जांच युक्त polyacrylamide (पीए) जैल fabricating के लिए परंपरागत तकनीकों एक पक्षपाती सतह और एक गिलास स्लाइड के बीच एक जेल sandwiching शामिल है. यहाँ, हम पाली डी lysine (पीडीएल) और फ्लोरोसेंट जांच के साथ इस स्लाइड कोटिंग जेल सतह से माइक्रोन 1.6 के भीतर जांच localizes कि दिखा.

Abstract

पीए जैल लंबे निर्माण और धुन उनके लोचदार संपत्तियों की क्षमता में आसानी के कारण सेल कर्षण बलों का अध्ययन करने के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल किया गया है. सब्सट्रेट एक बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ लेपित है, जब कोशिकाओं जेल का पालन करना और जेल ख़राब करने के कारण बलों लागू होते हैं. विरूपण सेल कर्षण और जेल की लोचदार संपत्तियों पर निर्भर करता है. सतह के विरूपण क्षेत्र में जाना जाता है, तो सतह कर्षण लोच सिद्धांत का उपयोग कर की गणना की जा सकती है. जेल विरूपण सामान्यतः समान रूप से जेल में फ्लोरोसेंट मार्कर मोती embedding द्वारा मापा जाता है. जेल विकृत रूप में जांच विस्थापित. जेल की सतह के पास जांच के ट्रैक हैं. इन जांच द्वारा रिपोर्ट displacements सतह displacements के रूप में माना जाता है. सतह से उनकी गहराई अनदेखी कर रहे हैं. यह धारणा कर्षण बल के मूल्यांकन में त्रुटि का परिचय. मोती के स्थान में जाना जाने के लिए सेल बलों की सटीक मापन के लिए, यह महत्वपूर्ण है. हम विकसित किया हैसतह से 1.6 माइक्रोन के भीतर पीए जैल में, फ्लोरोसेंट मार्कर मोती, व्यास में 0.1 और 1 माइक्रोन सीमित करने के लिए सरल रसायन विज्ञान का इस्तेमाल करता है कि एक तकनीक,. हम कोट पाली डी lysine (पीडीएल) और फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ एक coverslip. पीए जेल समाधान तो coverslip और एक पक्षपाती सतह के बीच sandwiched है. फ्लोरोसेंट मोती इलाज के दौरान जेल समाधान के लिए स्थानांतरण. Polymerization के बाद, पीए जेल जेल सतह के लिए एक विमान बंद पर फ्लोरोसेंट मोती होते हैं.

Introduction

अपने स्थानीय वातावरण के साथ एक बैठक सेल के यांत्रिक बातचीत सामान्यतः पीए जैल का उपयोग कर अध्ययन किया गया है. ये substrates इन substrates के मुख्य लाभ में से 1. एक 1997 में Dembo और वांग द्वारा स्थापित एक सरल, अच्छी तरह से विशेषता प्रोटोकॉल पर भरोसा उनकी कठोरता जेल समाधान के विशिष्ट घटकों की सांद्रता संशोधित करके देखते जा सकता है. यह अलग कठोर के वातावरण के साथ कोशिकाओं 'बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक वांछनीय मंच प्रदान करता है. पीए जैल बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन के साथ लेपित रहे हैं, कोशिकाओं बल पैदा करने, उन्हें का पालन करें. सेल बल का एक परिणाम के रूप में, जेल एक लोचदार शरीर के रूप में विकृत. इस विकृति कोशिकाओं और जेल की लोचदार संपत्तियों से लागू बल के परिमाण पर निर्भर करता है. विभिन्न अध्ययनों से सेलुलर कर्षण बलों की जांच के लिए पीए जैल कार्यरत है.

पीए जेल निर्माण का एक रूपांतर में, फ्लोरोसेंट microspheres (मोती) टी एम्बेडेड रहे हैंअलग कठोर 2 की जैल पर सेल कर्षण बलों यों जेल hroughout. सेल बल आवेदन पर, मोती जेल विरूपण के बाद उनके प्रारंभिक स्थान से विस्थापित. विरूपण क्षेत्र व्यक्तिगत मनका displacements से मापा जाता है. इस विकृति क्षेत्र लोच सिद्धांत और कर्षण बलों की गणना करने के लिए जेल की लोचदार संपत्तियों के साथ उपयोग किया जाता है. इन मापों कोशिकाओं यंत्रवत् भावना और उनके स्थानीय microenvironment 3 के साथ बातचीत के रूप में कैसे अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं.

कई व्यापक रूप से इस्तेमाल पीए जेल निर्माण प्रोटोकॉल में, मोती अपने तरल, unpolymerized राज्य में पीए जेल भर intermixed कर रहे हैं. एक पूरी तरह से polymerized पीए जेल इसकी मात्रा भर फ्लोरोसेंट मोती होते हैं. सेल कर्षण बलों जब कंप्यूटिंग, जेल सतह (सेल सब्सट्रेट अंतरफलक) के पास सबसे मोती निगरानी कर रहे हैं. इन मोतियों की displacements के बल calculatio में सादगी के लिए सेल संस्कृति सतह पर हो ग्रहण कर रहे हैंएन. जेल की गहराई के भीतर मोतियों की वास्तविक स्थान की अवहेलना कर रहा है. हालांकि, एक लोचदार मध्यम में (जैसे पीए जेल के रूप में), बल आवेदन की एक बात करने के लिए करीब एक मनका आगे दूर बिंदु से है कि एक मनका से अधिक कदम होगा. इस प्रकार, सेलुलर tractions की एक मूल्यवान समझना में सतह परिणामों में उस के रूप में सतह से बाहर (मनका स्थान पर) एक बिंदु के विस्थापन का इलाज. त्रुटि की डिग्री सतह से मनका की दूरी पर निर्भर करता है. त्रुटि मनका के स्थान की जानकारी के बिना अनुमान नहीं किया जा सकता.

बहुत सेल संस्कृति सतह के पास मोती सीमित करने के लिए एक सरल विधि के लिए जरूरत कुछ तकनीकों के द्वारा संबोधित किया गया है. एक तरह से बहुत सतह के पास गति को मापने के लिए शीर्ष फोकल हवाई जहाज़ में मोतियों की एक पर्याप्त संख्या में हैं कि इस तरह पूरे जेल भर में मोती के घनत्व को बढ़ाने के लिए है. एक और तकनीक जैसे प्रकाश से उस लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक confocal इमेजिंग कक्ष निर्माण शामिलसबसे ऊपरी फोकल हवाई जहाज़ में केवल मोतियों 4 एकत्र किया जाता है. एक अलग तरीका मोती 5 बिना एक पहले से ही polymerized जेल के शीर्ष पर मोती युक्त पीए जेल की एक अत्यंत पतली परत overlaying शामिल है. इन तकनीकों में से प्रत्येक का एक दोष जेल के भीतर मोतियों की सटीक स्थान ज्ञात नहीं है कि है. इस मोती का विस्थापन क्षेत्र, और इस तरह सेल बलों की गणना की गणना में त्रुटि का परिचय. एक और तकनीक sulfo-SANPAH 6 का उपयोग कर एक पहले से ही polymerized पीए जेल के ऊपर की सतह को मोती के विकार शामिल है. इस तकनीक मोती केवल पीए जेल के शीर्ष पर वास्तव में कर रहे हैं सुनिश्चित करता है, लेकिन वे जेल की गहराई में एम्बेडेड रहे हैं किस हद तक अज्ञात है. पहले काम कोशिकाओं बल कई माइक्रोन दूर 7 समझ सकते हैं कि सुझाव दिया गया है के रूप में यह संभवतः, सेल व्यवहार को बदल सकता है जो कोशिकाओं, के लिए एक स्थानीय स्थलाकृति बना सकते हैं. हाल ही में, 1 माइक्रोन व्यास च के साथ पीए जैल patterning के लिए एक तकनीकएक नियमित सरणी में luorescent फ़ाइब्रोनेक्टिन डॉट मार्करों 8 स्थापित किया गया था. इस मामले में, फ्लोरोसेंट मार्कर की गहराई में जाना जाता है, और फ़ाइब्रोनेक्टिन पैटर्न का परोक्ष रूप से जेल सतह पर मुद्रित किया जाता है, के रूप में अनिवार्य रूप से शून्य है. हालांकि, इस पद्धति ईसीएम प्रोटीन 1 माइक्रोन व्यास डॉट्स तक सीमित है के रूप में कोशिकाओं, संलग्न कर सकते हैं जिस पर एक सतत वातावरण प्रदान नहीं करता है. पूरी तरह से बहुत सतह के पास एक ज्ञात स्थान पर पीए जैल के भीतर ट्रैकर मोतियों को एकीकृत करने और उन्हें सीमित करने के लिए एक विधि अभी तक स्थापित किया जाना है.

यहाँ, हम बहुत पीए जेल के भीतर सेल संस्कृति सतह के निकट एक फोकल हवाई जहाज़ को माइक्रोन व्यास फ्लोरोसेंट मोतियों के लिए उप माइक्रोन विवश करने के लिए एक तकनीक का विकास. एक जेल में आम तौर पर दो गिलास प्लेट के बीच unpolymerized तरल जेल समाधान sandwiching से ठीक हो जाता है. जेल दृढ़ता से यह का पालन करता है, ताकि प्लेटों में से एक functionalized है. अन्य unfunctionalized है और जेल इलाज के बाद निकाल दिया जाता है. हम यह हटाने योग्य गिलास सु संशोधितमोतियों की एक परत के साथ यह कोटिंग से rface. Functionalized और मनका लेपित कांच की सतह के बीच तरल जेल sandwiching पर, जेल के लिए मोती स्थानांतरण यह इलाज किया जाता है. यह सतह से 1.6 माइक्रोन के भीतर जेल में मोती 'एकीकरण की दूरी की सीमा. गिलास नीचे पेट्री डिश जेल ठीक हो जाता है, जिस पर पक्षपाती सतह के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. Polymerization के दौरान एक फ्लैट टॉप जेल सतह के रूप में, एक परिपत्र कांच कवर पर्ची सैंडविच के लिए गिलास नीचे पेट्री डिश के साथ जेल प्रयोग किया जाता है. जेल निर्माण के लिए पहले, शीर्ष गिलास को कवर पर्ची एक सकारात्मक सतह प्रभारी उपज, पाली डी lysine (पीडीएल) के साथ लेपित है. पीडीएल संपीड़ित हवा के साथ उड़ रहा है, और पानी में मोतियों की एक समाधान कवर फिसल जाता है पर जमा किया जाता है. हम एक नकारात्मक चार्ज करना जो carboxylated फ्लोरोसेंट microbeads, उपयोग, और पीडीएल के साथ इलाज के द्वारा बनाई सकारात्मक आरोप लगाया सतह के साथ बातचीत. संपीड़ित हवा की एक परत के साथ coverslip बंद मनका समाधान उड़ाने के बादमोती electrostatically ड्राई कवर पर्ची के लिए युग्मित रहता है. कांच स्लाइड undamaged और पूरी तरह से बरकरार पीए जेल से निकाल दिया है पीडीएल कोटिंग, जेल सतह पर कांच की चिपचिपाहट को प्रभावित नहीं करता.

गिलास नीचे पेट्री डिश में 97% 3 aminopropyl-trimethoxysliane और 0.5% glutaraldehyde के साथ इलाज के द्वारा पक्षपाती बना रहे हैं. वांछित कठोर का पीए जैल एक मानक प्रक्रिया 9 के माध्यम से bisacrylamide और acrylamide का उचित सांद्रता के मिश्रण से बनाया जाता है. जेल समाधान की एक छोटी बूंद गिलास नीचे पेट्री डिश पर pipetted है. मोती युक्त कांच कवर पर्ची सैंडविच के लिए पेट्री डिश के साथ जेल प्रयोग किया जाता है. जेल ठीक हो जाता है, शीर्ष कवर पर्ची सतह से 1.6 माइक्रोन के भीतर पीए जेल में एम्बेडेड मोती छोड़ने हटा दिया जाता है.

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Protocol

Fabricating और सेल संस्कृति सतह के निकट एम्बेडेड फ्लोरोसेंट microspheres के साथ stiffnesses बदलती के पीए जैल functionalizing.

1 शीर्ष ग्लास कवर फिसल जाता है functionalizing

  1. साफ कांच कवर फिसल जाता है (# 1.0, 12 मिमी diam.) साबुन और पानी के साथ, इथेनॉल द्वारा पीछा बाहरी धूल हटाने के लिए.
  2. जगह कांच कवर वे coverslips के साथ बातचीत की आसानी सुविधाजनक बनाने के लिए नहीं छू रहे हैं कि इस तरह के एक कसा हुआ सतह (यानी पिपेट टिप धारक) पर निकल जाता है.
  3. कोट कवर की पूरी सतह पाली D-lysine 1 घंटा (चित्रा 1 ए) के लिए (0.1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ निकल जाता है.
  4. इस समय के दौरान, एक 1 प्रदर्शन: 0.1 माइक्रोन व्यास की कोलाइड समाधान के 10,000 कमजोर पड़ने, विआयनीकृत (डीआई) पानी के साथ लाल फ्लोरोसेंट microspheres जेल सतह पर 20 माइक्रोन 2 के अनुसार लगभग 1 microsphere के एक कण घनत्व प्राप्त करने के लिए. विभिन्न dilutions के परिणामों के लिए चित्र 2 देखें. इस dilution विशिष्ट प्रयोगों की जरूरत को पूरा करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
  5. 30 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक नहाने के पानी में पतला समाधान रखें.
  6. 1 घंटे के बाद, ध्यान से प्रत्येक कवर पर्ची उठा और हवा के साथ सूखी उड़ाने के लिए चिमटी का उपयोग करें. कसा हुआ सतह सूखी कवर फिसल जाता लौटें.
  7. प्रत्येक कवर पर्ची पर अल्ट्रासोनिक स्नान और पिपेट 150 μl से पतला कोलाइड समाधान निकालें. 10 मिनट (चित्रा 1 बी) के लिए छोड़ दें.
  8. ध्यान से प्रत्येक कवर पर्ची उठा और हवा के साथ सूखी उड़ाने के लिए चिमटी का प्रयोग करें. उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक सूखी कवर अंधेरे में कसा हुआ सतह और दुकान के लिए निकल जाता लौटें.

सीधे गिलास नीचे पेट्री डिश पर पीए जेल तैयारी 2

  1. 100 डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम हॉटप्लेट.
  2. गिलास नीचे पेट्री डिश की वांछित संख्या बाहर लेटाओ (14 मिमी से 35 मिमी पकवान सूक्ष्म खैर, # 1.0) एक रासायनिक धूआं हुड में एक फ्लैट सतह पर.
  3. 97% 3 aminopropyl-trimethoxys साथ प्रत्येक पेट्री डिश सूक्ष्म अच्छी तरह से कांच हिस्से को कवरLiane रासायनिक सक्रियण के लिए 7 मिनट के लिए (3 APTES). Polystyrene के क्षरण से बचने के लिए पेट्री डिश में प्लास्टिक की सतह के लिए 3-APTES के अनजाने टपकता से बचने के लिए सावधानी रखना.
  4. 7 मिनट के बाद, डि पानी के साथ पेट्री डिश को भरने और अपशिष्ट कंटेनर में निपटाने.
  5. फिर दोहराएँ प्रत्येक पकवान के लिए कदम 2.4 3x, और अतिरिक्त पानी निकालने के लिए पेट्री डिश हिला. कांच भाग सूखा है जब तक गर्म थाली पर पेट्री डिश रखें.
  6. गर्म थाली से पेट्री डिश निकालें और एक रासायनिक धूआं हुड में एक फ्लैट सतह पर लौटें.
  7. एक रासायनिक धूआं हुड में, 0.5% glutaraldehyde का समाधान करें और अच्छी तरह से 30 मिनट के लिए समाधान के साथ प्रत्येक पेट्री डिश के कांच भाग को कवर किया. प्लास्टिक की गिरावट से बचने के लिए पेट्री डिश में प्लास्टिक की सतह के लिए glutaraldehyde के अनजाने टपकता से बचने के लिए सावधानी रखना.
  8. 30 मिनट के बाद, डि पानी के साथ पेट्री डिश को भरने और कुल्ला करने अपशिष्ट कंटेनर में निपटाने और glutarald हटानेehyde.
  9. फिर दोहराएँ प्रत्येक पकवान के लिए कदम 2.4 3x, और अतिरिक्त पानी निकालने के लिए पेट्री डिश हिला. कांच भाग सूखा है जब तक गर्म थाली पर पेट्री डिश रखें.
  10. पीए जेल समाधान के घटकों का मिश्रण से पहले, गिलास नीचे के साथ जेल के त्वरित Sandwiching के लिए अनुमति देता है, वे आसानी से सुलभ हैं कि इस तरह के रासायनिक धूआं हुड में functionalized गिलास स्लाइड स्थानांतरित जेल समाधान मिश्रण के बाद पेट्री डिश.
  11. एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में, 1 टेबल में सूचीबद्ध सांद्रता में तत्काल उत्तराधिकार में 40% bisacrylamide, 2% acrylamide, और एक्रिलिक एसिड मिश्रण वांछित मैट्रिक्स लोच को प्राप्त करने के लिए (प्रकाशित प्रोटोकॉल 10 से अनुकूलित).
  12. जेल समाधान पूरा करने के लिए वांछित मैट्रिक्स लोच को इसी 1 टेबल में सूचीबद्ध मात्रा में 100 मिमी HEPES, 10% अमोनियम persulfate, और TEMED जोड़ें.
  13. तुरंत गिलास हिस्से के केन्द्र पर जेल समाधान के 15 μl विंदुकपेट्री डिश की.
  14. तुरंत चिमटी के साथ एक functionalized गिलास को कवर पर्ची लेने.
    1. फ्लोरोसेंट मोती जेल समाधान के साथ कंधे बनाने संपर्क पर कर रहे हैं कि इस तरह से अधिक गिलास को कवर पर्ची पलटें.
    2. धीरे functionalized ओर जेल (चित्रा 1C) के साथ संपर्क में है कि इस तरह अब तरल पीए जेल के शीर्ष पर कवर पर्ची निर्धारित करना. नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, एक दूसरे व्यक्ति कई पेट्री डिश पर तरल पीए जेल समाधान pipetting जबकि आंशिक polymerization की संभावना से बचने के क्रम में कवर पर्ची जोड़ने की भूमिका के लिए सिफारिश की है.
  15. पीए जेल के निचले स्तर में polymerizing फ्लोरोसेंट नैनोकणों पर गुरुत्वाकर्षण प्रभाव से बचने के साथ सहायता के लिए सभी पेट्री डिश पर पलटें.
  16. पीए जेल का जायजा समाधान दिख अपनी अपकेंद्रित्र ट्यूब में polymerized किया है कम से कम 35 मिनट के लिए, या जब तक प्रतीक्षा करें.
  17. पीठ पर पेट्री डिश पलटें और कवर पर्ची हटाने के साथ सहायता के लिए पीबीएस के साथ उन्हें भरने.
  18. ध्यान से कवर पर्ची की परिधि परिमार्जन करने के लिए चिमटी का उपयोग कर, पेट्री डिश के कांच भाग और कवर पर्ची की रूपरेखा के साथ संपर्क बनाने. कवर पर्ची उखाड़ फेंकना है जब तक कई चक्र को पूरा करें. कवर पर्ची निकालें और एक उचित तेजधार अपशिष्ट कंटेनर में निपटाने.
  19. सभी कवर फिसल जाता हटाने के बाद, फ्लोरोसेंट मोती जेल (चित्रा -1) को स्थानांतरित कर दिया जाएगा. , पूरी तरह से पीबीएस के साथ पीए जैल कवर प्रत्येक पकवान पर पेट्री डिश ढक्कन जगह है, और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.

3 fibronectin साथ पीए जेल functionalizing

  1. एक स्थापित प्रोटोकॉल 11 में वर्णित के रूप में निम्नलिखित premixed समाधान तैयार: समाधान भिगोएँ (137 मिमी NaCl, 5% (v / v) ग्लिसरॉल) और 2x संयुग्मन बफर (0.2 एम 2 (एन -morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस), 10 % (v / v) ग्लिसरॉल, 4.5 पीएच).
  2. पीए जैल युक्त गिलास नीचे व्यंजन से सभी पीबीएस को हटाने के लिए एक जैविक हुड में एक वैक्यूम पंप का प्रयोग करें.
  3. Pipetते जेल पूरी तरह से जलमग्न है कि इस तरह के प्रत्येक जेल पर समाधान सोख. कम से कम 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  4. गर्म 1-एथिल-3 [3 dimethylaminopropyl] carbodiimide हाइड्रोक्लोराइड (ईडीसी) और कमरे के तापमान को एन -hydroxysulfosuccinimide (एनएचएस).
  5. ईडीसी के 10x समाधान (150 मिमी डि पानी में, 19 मिलीग्राम / एमएल) और एनएचएस (250 मिमी डि पानी में, 29 मिलीग्राम / एमएल) मिलाएं.
  6. 1 हिस्सा 10x EDC, 1 हिस्सा 10x एनएचएस, 3 भागों डि पानी, और 5 भागों 2x संयुग्मन बफर मिलाएं.
  7. सोख समाधान निकालने के लिए एक जैविक हुड में एक वैक्यूम पंप का प्रयोग करें. सभी तरल पदार्थ जेल सतह से हटा दिया जाता है सुनिश्चित करें.
  8. जेल सतह को कवर किया और पेट्री डिश (150-250 μl) की गिलास नीचे अच्छी तरह से भरने के लिए पर्याप्त एनएचएस / ईडीसी समाधान जोड़ें. अंधेरे में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  9. कमरे के तापमान पर पिघलना फ़ाइब्रोनेक्टिन. एक बार thawed, एक 50 माइक्रोग्राम / एमएल fibronectin समाधान बनाने के लिए बाँझ डि पानी मिलाएं.
  10. एनएचएस / ईडीसी समाधान निकालने के लिए एक जैविक हुड में एक वैक्यूम पंप का प्रयोग करेंtion. सभी तरल पदार्थ जेल सतह से हटा दिया जाता है सुनिश्चित करें.
  11. प्रत्येक जेल के लिए fibronectin समाधान के 150 μl जोड़ें. फ़ाइब्रोनेक्टिन की कुर्की के लिए अनुमति देने के लिए 35 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  12. 35 मिनट के बाद, 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक पेट्री डिश और स्टोर करने के लिए पीबीएस जोड़ें.

4 कर्षण बल प्रयोग

  1. एक पानी के स्नान में गर्म सेल मीडिया, पीबीएस, और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए trypsin.
  2. जैल rinses के बीच में पीबीएस aspirating, बाँझ पीबीएस के साथ 5x, और हुड में शामिल छोड़ कुल्ला.
  3. कुप्पी युक्त कोशिकाओं को 1 मिलीलीटर trypsin 2 सेमी 25 प्रति जोड़ें. कोशिकाओं कुप्पी से उठा रहे हैं, के बाद सेल मीडिया के साथ trypsin पतला और कोशिकाओं गिनती. जेल सतह क्षेत्र के आधार पर, / 2 सेमी 3,000 कोशिकाओं के अंतिम सेल बोने घनत्व के लिए जेल प्रति आवश्यक कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करते हैं. पतला या सेल मीडिया मिश्रण की 150 μl कोशिकाओं की इस नंबर शामिल हैं कि इस तरह के निलंबन ध्यान देना. सेल सस्पेंस से विभाज्य 150 μlप्रत्येक जेल पर आयन.
  4. 30 मिनट के लिए एक मशीन में कोशिकाओं से युक्त पेट्री डिश रखें. फिर, ध्यान से पेट्री डिश को हटाने और पकवान की सतह पूरी तरह से जलमग्न है कि इस तरह की मीडिया (लगभग 2 मिलीग्राम) के साथ पेट्री डिश के शेष भरें.
  5. छवि अधिग्रहण तक इनक्यूबेटर में पेट्री डिश वापस रखें.
  6. , अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) चश्मे डालें, 40x पानी विसर्जन उद्देश्य डालने mCherry या बराबर फ्लोरोसेंट फिल्टर का चयन करें, और पर्यावरण कक्ष पर बारी: इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप और डाटा अधिग्रहण प्रणाली तैयार करें.
  7. इमेजिंग के लिए तैयार करते हैं, इनक्यूबेटर से एक पेट्री डिश को हटाने और खुर्दबीन मंच पर धीरे जगह है. डीआईसी इमेजिंग के लिए पेट्री डिश ढक्कन निकालें.
  8. एक एकल कोशिका का पता लगाएँ और डीआईसी में सेल की एक एकल अभी भी छवि पर कब्जा.
  9. खुर्दबीन मंच चलते बिना, प्रतिदीप्ति इमेजिंग मोड स्विच. फ्लोरोसेंट microspheres और आरईसी पर फोकसmicrospheres की एक छवि Ord.
  10. ध्यान से एक विंदुक के साथ पेट्री डिश सेल मीडिया को हटाने और 0.05% trypsin EDTA जोड़ें.
  11. छवि कोशिकाओं के बाद सेल के तहत microspheres अलग है.
  12. ImageJ 12 में उपयोग कण छवि velocimetry (PIV) विश्लेषण की वजह से सेलुलर बलों को विस्थापन क्षेत्र की गणना करने के लिए.

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Representative Results

Confocal इमेजिंग मोती जेल सतह के नीचे वास्तव में थे कि निर्धारित करने के लिए और जेल गहराई के भीतर अपने सटीक स्थान यों इस्तेमाल किया गया था. जेल के अंदर उन लोगों की तुलना में एक अलग तरंग दैर्ध्य के फ्लोरोसेंट मोती सतह पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दी गई थी, और एम्बेडेड फ्लोरोसेंट नैनोकणों और सतह पर उन के बीच की दूरी एक केन्द्रक पहचान एल्गोरिथ्म का उपयोग गणना की गई. जेल सतह पर मनका के स्थान जेल जहां कोशिकाओं की सतह के पालन पर बल लागू की ऊपर की सतह के लिए एक संदर्भ के रूप में कार्य करता है. (लाल सतह पर मोती, और इसके विपरीत के साथ जेल में हरे मोती) माना दो परिदृश्यों का एक योजनाबद्ध चित्रा 3 में दिखाया गया है. एल्गोरिथ्म तीन आयामी केन्द्रक स्थान के Z-ऊंचाई interpolates. हम तीन कठोरता जैल (1, 10, और 40 किलो पास्कल) और दो आकार (व्यास) फ्लोरोसेंट मोतियों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराया (0.1 माइक्रोन लाल और 1 माइक्रोन पीले हरे). दूरीएक जेल के भीतर मनका और एक अलग तरंग दैर्ध्य के अपने निकटतम पड़ोसी के बीच निर्धारित अपने तीन आयामी केन्द्रक के आधार पर किया गया था. 4 मोती के स्थानिक वितरण से पता चलता है (ऊपर की सतह पर और एम्बेडेड) और YZ विमान पर पेश देखें चित्रा. उत्तरार्द्ध जेल की सतह से सभी मोतियों की गहराई प्रदान करता है.

0.1 माइक्रोन मोतियों की औसत गहराई 619 एनएम, 467 एनएम, कठोरता 1, 10 के पीए जैल के लिए 278 एनएम, और 40 किलो पास्कल, क्रमशः (चित्रा 5A) है. 1 माइक्रोन व्यास मोती के लिए इसी गहराई हैं -20 40 kPa जैल, 10 किलो पास्कल जैल में 12 एनएम, और 1 किलो पास्कल जैल (चित्रा 5 ब) में 1,255 एनएम में एनएम. परंपरागत रूप से कर्षण बल माइक्रोस्कोपी पढ़ाई के लिए करना पीए जैल के लिए इस्तेमाल किया गया है के रूप में confocal इमेजिंग भी जेल भर में बिखरे मोतियों के साथ जैल पर प्रदर्शन किया गया था. पीए जेल भर में बिखरे मोतियों की गहराई में पहले वर्णित एक ही एल्गोरिथ्म का उपयोग कर मापा गया था और डी की तुलना में हैयहाँ प्रस्तुत तकनीक का उपयोग epths. 6 पारंपरिक निर्माण विधियों का उपयोग कर एक पीए जेल की गहराई के भीतर मनका फैलाव की परिवर्तनशीलता दिखाता चित्रा.

फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ functionalized जब fibroblasts पीए जेल सतह को देते हैं. एक fibroblast सेल और इसी फ्लोरोसेंट मोती परत के लिए विस्थापन क्षेत्र चित्रा 7 में दिखाया जाता है. छवि की परिधि के पास मोती ध्यान से बाहर थोड़ा दिखाई देते हैं. ग्लास जेल से हटाने पर पूरी तरह से बरकरार है, क्योंकि यह जेल की ओर से एक यांत्रिक दोष नहीं है. दरअसल, यह कारण इस प्रयोग में इस्तेमाल पानी विसर्जन उद्देश्य के लिए एक ऑप्टिकल प्रभाव का परिणाम है. मध्यम करने के लिए trypsin के अलावा पर, सेल अपने मूल राज्य के विकृत पीए जेल सतह की वापसी में जिसके परिणामस्वरूप, सतह से जारी है. एक पार सहसंबंध एल्गोरिथ्म मनका displacements 10 के आधार पर विरूपण क्षेत्र की गणना करने के लिए उपयोग किया गया था.विस्थापन के नक्शे वाई दिशा में सेल कर्षण बलों के एक प्रमुख ध्रुवीकरण को दिखाता है.

चित्रा 1
शीर्ष गिलास को कवर के लिए functionalization प्रक्रिया के चित्रा 1 चित्रण पीडीएल और फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ निकल जाता है. (ए) ग्लास कवर फिसल जाता है (नीला) 1 घंटे के लिए 0.1 मिलीग्राम / एमएल पीडीएल (नारंगी) के साथ incubated हैं. संपीड़ित हवा कवर सूखा निकल जाता झटका और पीडीएल दूर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. (बी) ग्लास कवर फिसल जाता संपीड़ित हवा लगाने से 5-10 मिनट के लिए 100 एनएम व्यास फ्लोरोसेंट मोतियों की एक समाधान के साथ incubated, और फिर हटा रहे हैं. मोतियों की एक परत electrostatically coverslip के लिए युग्मित रहता है. (सी) एक सक्रिय कांच की सतह के साथ सैंडविच पीए जेल के लिए उपयोग किया जाता है मोतियों के साथ functionalized coverslips. (डी) शीर्ष कवर पर्ची के हटाने पर पीए जेल polymerizat निम्नलिखितआयन, मोती के भीतर स्थित हैं और बहुत जेल की सतह के पास. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
0.1 माइक्रोन व्यास फ्लोरोसेंट मोती युक्त चित्रा 2 पीए जेल भूतल. मोतियों के साथ पीडीएल इलाज शीर्ष गिलास को कवर पर्ची कोटिंग करने से पहले, मनका समाधान (ए) 10,000 गुना (3.64 x 10 8 मोती / एमएल) और (बी) पतला था 20,000 गुना (1.82 x 10 8 मोती / एमएल). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3 जेल की सतह के पास स्थानीयकृत मोतियों के साथ चित्रा 3 सेल सब्सट्रेट इंटरफ़ेस. एक पीए जेल के भीतर मनका स्थान confocal माइक्रोस्कोपी और एक केन्द्रक पहचान एल्गोरिथ्म का उपयोग मात्रा था जिसमें दो परिदृश्यों का एक योजनाबद्ध. पहले परिदृश्य (ए) में दिखाया गया है जेल और सतह पर हरे रंग की 1 माइक्रोन व्यास मोती, और जेल और पर लाल 100 एनएम व्यास मोतियों के अंदर (बी) ग्रीन 1 माइक्रोन व्यास मोतियों में दूसरा अंदर लाल 100 एनएम व्यास मोती सतह. (सी) एक सेल इसकी सतह के पास जेल और इसकी सतह पर बैठे एक हरे रंग मनका अंदर स्थानीयकृत लाल मोतियों के साथ एक जेल (नीला) का पालन किया (पीला) के एक कार्टून चित्रण. का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा.

चित्रा 4
चित्रा 4 Confocal टुकड़ा (XY, बीच में) और साथ YZ लाल जेल में एम्बेडेड 0.1 माइक्रोन माला और सतह पर 1 माइक्रोन मोतियों के साथ एक जेल की (बाएं) प्रक्षेपण देखा गया. सभी कुल्हाड़ियों के लिए इकाइयों नैनोमीटर में हैं. ऊपर या हरे मोती के रूप में एक ही विमान में लाल मोतियों की समसामयिक घटनाओं मामूली लाल के लिए प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा में ओवरलैप (mCherry) और हरी (GFP) को जिम्मेदार ठहराया है. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5 पीए जेल के ऊपर की सतह के पास सीमित मोतियों की गहराई की Histograms. Stiffnesses 1 kPa, 10 किलो पास्कल, और 40kPa क्रमशः, नीले, लाल और काले द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. एक गाऊसी वक्र प्रत्येक सेट डेटा और उसके आयाम को इसी एक्स मूल्य मोतियों की औसत गहराई के रूप में व्याख्या की है करने के लिए फिट किया गया था. दो स्थितियों का परीक्षण किया गया:. (ए) 1 माइक्रोन सतह पर मोती, और (ख) सतह पर 0.1 माइक्रोन मोतियों के साथ जेल के अंदर 1 माइक्रोन मोतियों के साथ जेल के अंदर 0.1 माइक्रोन मोती यहाँ क्लिक करें इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए आंकड़ा.

चित्रा 6
चित्रा एक पारंपरिक निर्माण विधि (काला) का उपयोग पीए जेल भर में मनमाने ढंग से एम्बेडेड मोतियों की गहराई से 6 histograms और कठोरता एक के पीए जैल) 1 किलो पास्कल के लिए इस तकनीक (लाल) का उपयोग पीए जेल के ऊपर परत के पास स्थानीयकृत मोती, बी) 10 किलो पास्कल,और सी) 40 kPa. इनसेट जेल के सबसे ऊपरी 10 माइक्रोन के भीतर दोनों जेल प्रकार में मोतियों की गहराई से पता चलता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 7
सेल कर्षण की वजह से चित्रा 7 विस्थापन क्षेत्र. 10 किलो पास्कल जेल पर एक fibroblast की (ए) चरण विपरीत छवि. (बी) fibroblast द्वारा उत्पन्न कर्षण द्वारा उत्पन्न विस्थापन क्षेत्र. रंग पट्टी नैनोमीटर में मनका विस्थापन को इंगित करता है. Trypsinization से पहले एक सेल नीचे 0.1 माइक्रोन व्यास मोती (सी) प्रतिदीप्ति छवि. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.


जेल सतह पर बैठे एक अलग आकार / तरंगदैर्ध्य मनका को जेल रिश्तेदार अंदर मोतियों की औसत स्थान के 8 चित्रा चित्रण. अधिकार (40 kPa, 10 किलो पास्कल, 1 किलो पास्कल) बाएं से पीए जेल घटने की कठोरता. (ए) सतह पर जेल और हरे 1 माइक्रोन व्यास मोतियों के अंदर लाल 0.1 माइक्रोन व्यास मोती. (बी) की सतह पर जेल और लाल 0.1 माइक्रोन व्यास मोतियों के अंदर ग्रीन 1 माइक्रोन व्यास मोती. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें .

9 चित्रा
9 चित्रा Diτ के लिए सैद्धांतिक मूल्यों का stribution /. विभिन्न मनका गहराई पर आधारित μ मोती व्यास में 0.1 माइक्रोन या तो समान रूप से छितरी हुई है या (ए) 1 किलो पास्कल जैल, (बी) 10 kPa जैल, और (सी) 40 kPa जैल में सतह के पास स्थानीयकृत गया . सोने तीर मोती जेल सतह पर कर रहे हैं, जिसमें Z = 0 के मामले में, के लिए τ / μ के मूल्य इंगित करता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

115px "> 4122.5 1px "> 500
ई (kPa) 40% Acrylamide (μl) भारतीय मानक ब्यूरो (एकाग्रता) 2% बीआईएस (μl) 100 मिमी HEPES (μl) 0.1 625 0.00009 22.5 4225
0.25 625 0.0001 25 4222.5
0.5 625 0.00011 27.5 4220
0.75 > 625 0.0002 50 4197.5
1 625 0.0003 75 4172.5
1.5 625 0.0004 100 4147.5
2 625 0.0005 125
2.5 625 0.0006 150 4097.5
3 625 0.0008 200 4047.5
3.5 625 0.0009 225 4022.5
4 0.001 250 3997.5
4.5 625 0.0012 300 3947.5
5 625 0.0014 350 3897.5
5.5 625 0.0016 400
6 625 0.0018 450 3797.5
6.5 625 0.002 500 3747.5
7 625 0.0022 550 3697.5
7.5 < / TD> 625 0.0024 600 3647.5
8 1000 0.001 250 3622.5
10 1000 0.0013 325 3547.5
15 1000 0.002 3372.5
20 1000 0.0027 675 3197.5
30 1000 0.0037 925 2947.5
40 1000 0.0048 1200 2672.5

टेबलयंग मापांक के आधार पर 1 पीए जेल रासायनिक सांद्रता. एक वांछित पीए जेल लोचदार मापांक के लिए, acrylamide, bisacrylamide, और HEPES बफर के सूचीबद्ध सांद्रता 25 μl 10% अमोनियम persulfate (ए पी), 5 μl एक्रिलिक एसिड के साथ पूरक, और किया जाना चाहिए 2.5 μl TEMED.

7pt "चौड़ाई =" 62 "> 5
जेड (माइक्रोन) यू एक्स ((τ / μ) माइक्रोन)
0 0.750
0.394
1 0.237
1.5 0.164
2 0.124
2.5 0.100
3 0.083
3.5 0.071
4 0.062
4.5 0.056
0.050

टेबल Boussinesq सिद्धांत के आधार पर जेल सतह से मोतियों की गहराई, जेड, के लिए इसी τ / μ के एक समारोह के रूप में 2 displacements.

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Discussion

इस तकनीक का उपयोग करते हैं, यह मनका समाधान ठीक से पतला है और मोती वांछित व्यास के आधार पर चुना जाता है कि आवश्यक है, पीए जेल सब्सट्रेट कठोरता, और वांछित प्रयोग में पता लगाया है कि घटना के आकार के पैमाने.

शीर्ष कांच कवर फिसल जाता है functionalizing से पहले मनका समाधान गिराए जब सावधानी से लिया जाना चाहिए. जेल सतह पर मोती के बीच अंतर कोलाइड समाधान के कमजोर पड़ने कारक बदलकर बदला जा सकता है. बहुत ज्यादा समाधान गिराए कवर पर्ची के लिए कि जोड़े मोतियों की संख्या को कम करने और अंततः जेल में मोतियों की संख्या कम हो जाएगा. बहुत कम समाधान गिराए वे संपर्क में हैं और एक दूसरे से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है कि इस तरह जेल में मोतियों की भी एक उच्च घनत्व प्राप्ति कर सकते हैं. यह पूरी तरह से nanoparticle एकत्रीकरण की उपस्थिति से बचने के लिए अक्सर असंभव है, पतला समाधान के लिए अल्ट्रासोनिक तरंगों के आवेदन प्रभावी ढंग से नेन कम से कमoparticle एकत्रीकरण. हम इस प्रोटोकॉल में उपयोग colloid समाधान के 10,000 गुना कमजोर पड़ने 3.64 x 10 8 मोती / एमएल के एक मनका एकाग्रता देता है, और 0.1 माइक्रोन व्यास मोती के लिए 0.05 मोती / माइक्रोन 2 की एक वांछनीय कण घनत्व कि पैदावार मिल गया है. एक 1: 20,000 कमजोर पड़ने (1.82 x 10 8 मोती / एमएल) के कण प्रति 52 माइक्रोन 2 की औसत पैदावार 2 अलग dilutions के साथ जैल की सतह के चित्र से पता चलता है.. यह जेल के लिए स्थानांतरण कि मोतियों की संख्या में परिवर्तनशीलता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. इस functionalization दौरान संपीड़ित हवा के साथ कवर पर्ची से मनका समाधान को हटाने के साथ जुड़े परिवर्तनशीलता के कारण है. सामान्य तौर पर, हम दोनों में से कम से कम एक पहलू से कमजोर पड़ने कारक बढ़ रही लगातार मनका प्रति क्षेत्र में कम से कम एक दुगना वृद्धि में यह परिणाम है कि मिल गया है.

यह टी के पूर्ण विसर्जन में परिणाम होगा कि एक मनका आकार (व्यास) का चयन करने के लिए भी महत्वपूर्ण हैवह पीए polymerization पर जेल के अंदर मनका. चित्रा 5A रूप में दिखाया गया जेल कठोरता मोती के स्थान को प्रभावित करता है. 0.1 माइक्रोन व्यास मोती के लिए, मनका गहराई कठोरता में कमी के साथ बढ़ जाती है. इस छेद के आकार और पीए जेल कठोरता 13 के बीच व्युत्क्रम संबंध का परिणाम हो सकता है. परीक्षण तीन कठोरता जैल के सभी के लिए, मोती लगातार जेल के अंदर स्थानीयकृत हैं, और जेल सतह की 1 माइक्रोन के भीतर चित्रा 8A में सचित्र के रूप में. जेल के भीतर 1 माइक्रोन मोतियों की औसत स्थान भी कठोरता के साथ बदलता रहता है. वे 1 kPa जैल में गहरी (लगभग 1.25 माइक्रोन) एम्बेडेड रहे हैं. मोती कभी कभी जेल के शीर्ष के माध्यम से बहर जिसका अर्थ है 10 और 40 किलो पास्कल जैल के लिए, 1 माइक्रोन व्यास मोतियों की शीर्ष का स्थान जेल से नीचे 0.5 माइक्रोन के लिए ऊपर लगभग 0.5 माइक्रोन से लेकर (चित्रा 5) सतह, (चित्रा 8B). यह topogra परिचय क्योंकि यह हानिकारक हैकोशिकाओं के लिए बनावट, और स्थलाकृति सेल सब्सट्रेट बातचीत 14 को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है. इस प्रकार, यह एक विशिष्ट कठोरता के जैल तैयार करते समय इस तकनीक के लिए मोती चुनने के प्रति जागरूक होना आवश्यक है. इस विधि को चिह्नित करने के लिए उपयोग दो मनका आकार के, 0.1 माइक्रोन व्यास इष्टतम आकार साबित होता है. अन्य मनका आकार इस तकनीक के साथ उपयोग किया जा सकता है, लेकिन हम यहाँ का वर्णन के रूप में मोती जेल polymerization के दौरान स्थानीयकृत हैं जो सटीक गहराई को समझने के लिए, confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर calibrated किया जाना चाहिए.

इस तकनीक को देखने के क्षेत्र के भीतर अलग पहचाना कणों की संख्या में वृद्धि से पीए जेल में मोतियों की स्थानिक संकल्प को बेहतर बनाता है. जेल के शीर्ष के निकट एक परत को मोती स्थानीयकृत काफी जेल की समग्र कठोरता को प्रभावित नहीं करता. Isostress समग्र सिद्धांत जेल युक्त BEA के केवल 1 माइक्रोन मोटी परत की, समग्र लोचदार मापांक, ई सी गणना करने के लिए उपयोग किया जाता हैडी एस के रूप में

समीकरण 1

ई एफ polystyrene मोती (3 GPA) की लोचदार मापांक है, जहां ई एम जेल मैट्रिक्स (10 किलो पास्कल) की लोचदार मापांक है, और वी एफ और वी एम क्रमशः, माला और जेल मैट्रिक्स की मात्रा भिन्न हैं. मोती मात्रा का केवल 0.03% शामिल है, क्योंकि ई सी = 10.0025 kPa कठोरता 10 kPa के एक isotropic जेल की लोचदार मापांक से काफी अलग नहीं है. पीए जैल fabricating के लिए एक स्थापित विधि इस प्रकार polymerization के दौरान 15 मोतियों के वितरण पर गुरुत्वाकर्षण के प्रभाव को कम करने, 30 सेकंड के लिए polymerization के समय कम कर देता है. मोती जेल में भाजन करने के लिए हमारे विधि लंबे समय तक (~ 30 मिनट) polymerization के समय पर निर्भर करता हैवे जेल सतह फैलाना नहीं है कि इस तरह के. एक परत को मोती स्थानीयकृत काफी समग्र जेल कठोरता, और जेल मैट्रिक्स में मोती के हस्तांतरण में अब polymerization के समय एड्स प्रभावित नहीं करता है, क्योंकि हम अपने तकनीक में polymerization के समय को कम करने के किसी भी उपाय को शामिल नहीं करते.

हमारी तकनीक सब्सट्रेट विरूपण की माप, और इस तरह सेल कर्षण बलों की गणना जो सुधार पीए जेल के अंदर एक ज्ञात गहराई, के लिए मोती स्थानीयकरण को दर्शाता है. सेलुलर कर्षण बलों यों के लिए एक सैद्धांतिक दृष्टिकोण पहले 16,17 सूचित किया गया है. यह दृष्टिकोण लोचदार आधा अंतरिक्ष में एक अर्द्ध अनंत ठोस रूप में जेल सब्सट्रेट व्यवहार करता है. Boussinesq समाधान के लिए एक विस्थापन क्षेत्र से कर्षण बलों की गणना की व्युत्क्रम समस्या को हल करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हम कारण जेल है से बाहर का मोती को विस्थापन माप में त्रुटि यों Boussinesq अभिन्न का एक सरलीकृत संस्करण को रोजगारurface 18. एक आवेदन कतरनी तनाव के आधार पर दिए गए दिशा में विस्थापन के लिए समीकरण, τ, एक दिया त्रिज्या, आर के ऊपर, के द्वारा दिया जाता है

2 समीकरण

यू एक्स एक्स दिशा में विस्थापन है, जहां μ कतरनी मापांक है, और जेड जेल सतह से मोतियों की गहराई है. जेल की गहराई भर में मोती के विभिन्न स्थानों के लिए, इसी displacements तालिका 2 में दिखाया गया है.

यहाँ दिखाए गए मामले के लिए, त्रिज्या 1 माइक्रोन के एक औसत फोकल आसंजन आकार होने का अनुमान है. मोती कोशिकाओं (जेड = 0) के साथ समतलीय हो ग्रहण कर रहे हैं, विस्थापन 0.75 τ / μ द्वारा दिया जाता है. मोती केवल 1 माइक्रोन जेल सतह के नीचे रखते हैं, विस्थापन 0.24 τ / μ द्वारा दिया जाता है. इस1 माइक्रोन से नीचे एक स्थान पर सतह के साथ एक मनका समतलीय से विस्थापन में एक तीन गुना कमी से अधिक का प्रतिनिधित्व करता है. यह जिसका सटीक जेल के भीतर स्थानों अज्ञात हैं एम्बेडेड मोतियों की गति के आधार पर सतह कर्षण बलों की गणना में त्रुटि का परिचय. प्रस्तावित और पारंपरिक निर्माण विधियों दोनों के लिए जेल में मोतियों की गहराई के एक समारोह के रूप में τ / μ द्वारा परिभाषित कर्षण में बदलाव, महत्वपूर्ण है. 9 चित्रा बलों के वितरण से पता चलता है (अनुपात τ द्वारा दिए गए / μ) आधारित Boussinesq सिद्धांत पर मोती समान रूप से जेल में वितरित और सतह के निकट स्थानीयकृत हैं जब क्षेत्र के ऑप्टिकल गहराई के भीतर मनका गहराई, जेड के वितरण, उपयोग गणना से होने वाली. मोती कोशिकाओं, जहां जेड = 0 और τ / μ = 0.0133 के रूप में एक ही विमान पर थे अगर सेल बल का सबसे सटीक माप नतीजा होगा. 118 द्वारा इस मामले, τ / μ बढ़ जाती है जब की तुलना%, 80%, और 1 किलो पास्कल, 10 किलो पास्कल, और 40 किलो पास्कल जैल, के लिए 50% क्रमशः, मोती हम प्रस्ताव तकनीक का उपयोग कर सतह के निकट स्थानीयकृत रहे हैं. मोती समान रूप से जेल गहराई भर में वितरित कर रहे हैं, τ / μ क्रमशः 1 kPa, 10 किलो पास्कल, और 40 किलो पास्कल जैल, के लिए, सतह के पास मोती स्थानीयकृत द्वारा प्रेरित वृद्धि से परे एक अतिरिक्त 60%, 80%, और 150% बढ़ जाती है. मोती जेल गहराई भर में वितरित कर रहे हैं जब यह कर्षण गणना में लगभग 200% त्रुटि के कुल का प्रतिनिधित्व करता है. इस प्रकार, जेल के अंदर एक ज्ञात गहराई तक मोती स्थानीयकृत विस्थापन माप और सेल कर्षण बलों में सटीकता में सुधार.

यहाँ वर्णित तकनीक मोती जेल सतह के निकट स्थानीयकृत हैं कि इस तरह के कर्षण बल माइक्रोस्कोपी अनुप्रयोगों के लिए पीए जेल substrates तैयार करने के लिए एक नया तरीका प्रस्तुत करता है. पीए जेल के भीतर एक ज्ञात गहराई तक मोती सीमित AM बनाने, सेल बल आवेदन पर मोतियों की वास्तविक विस्थापन के बारे में नई जानकारी प्रदान करता हैकोशिकाओं उनके अंतर्निहित सब्सट्रेट deforming रहे हैं की सही तस्वीर अयस्क.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.

Acknowledgments

लेखकों अंतःविषय अभिनव पहल कार्यक्रम, इलिनोइस विश्वविद्यालय को स्वीकार करना होगा, 12035 अनुदान. एसके राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF) अनुदान से UIUC में वित्त पोषित किया गया 0965918 IGERT: सेलुलर और आणविक यांत्रिकी और BioNanotechnology में शोधकर्ताओं की अगली पीढ़ी के प्रशिक्षण.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) Sigma-Aldrich 281778
70% Glutaraldehyde Polysciences, Inc. 111-30-8
1 M HEPES buffer solution Sigma-Aldrich 83264
40% Acrylamide Sigma-Aldrich A4058
2% Bisacrylamide Sigma-Aldrich M1533
0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry) Invitrogen F8801
Fibronectin, Human, 1 mg BD Biosciences 354008
Ammonium persulfate Bio-RAD 161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-RAD 161-0801
Poly-D-lysine Millipore A-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)  Thermo Scientific 22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) Thermo Scientific 24500
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Life Technologies 25300-054
NaCl Sigma-Aldrich S9888
Acrylic acid  Sigma-Aldrich 147230
Glycerol Sigma-Aldrich G7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass In Vitro Scientific D35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam. Ted Pella, Inc. 26023

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 91 सेल यांत्रिकी polyacrylamide (पीए) जेल कर्षण बल माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट मोती पाली डी lysine (पीडीएल) सेल संस्कृति सतह
कर्षण बल माइक्रोस्कोपी के लिए सेल संस्कृति सतह के पास लोकलाइजिंग रिपोर्टर फ्लोरोसेंट मोती के लिए एक उपन्यास विधि
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Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51873, doi:10.3791/51873 (2014).

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