Summary
형광 프로브를 함유하는 폴리 아크릴 아미드 (PA) 겔을 제조하기위한 전통적인 기술은 접착 표면 및 유리 슬라이드 사이에 겔을 개재 포함한다. 여기서, 우리는 폴리-D-라이신 (PDL) 및 형광 프로브이 슬라이드 코팅은 겔 표면으로부터 1.6 μM 내로 프로브 지역화 것을 보여준다.
Abstract
PA 젤 긴 제조 및 조정 자신의 탄성을 할 수있는 기능의 용이성으로 인해 세포 견인 힘을 연구하기위한 플랫폼으로 사용되어왔다. 기판은 세포 외 기질 단백질로 코팅되는 경우, 세포 부착 및 겔 겔 변형 일으키는 힘을 적용한다. 변형은 세포 견인 및 겔의 탄성 특성에 의존한다. 표면 변형 필드가 알려진 경우, 표면 정지 마찰은 탄성 론을 이용하여 계산 될 수있다. 겔 변형은 일반적으로 균일하게 겔화 형광 마커 비드 매립에 의해 측정된다. 젤 변형으로 프로브는 변위. 겔의 표면 근처에 프로브를 추적됩니다. 이러한 프로브에 의해보고 된 변위는 표면 변위로 간주됩니다. 표면에서 그들의 깊이는 무시됩니다. 이 가정은 견인력 평가에 오류를 소개합니다. 비드의 위치가 알려 져야하는 셀의 힘의 정확한 측정을 위해, 중요하다. 우리는 개발표면의 1.6 μm의 내 PA 젤에, 형광 마커 구슬, 직경 0.1 μm의 한을 제한하는 간단한 화학을 활용하는 기술. 우리는 코트 폴리-D-라이신 (PDL)과 형광 구슬 커버 슬립. PA 겔 용액을 커버 슬립과 접착면 사이에 개재된다. 형광 비드가 경화 중에 겔 용액에 옮긴다. 중합 후, PA 겔은 겔 표면에 비행기 주변에 형광 구슬이 포함되어 있습니다.
Introduction
로컬 환경과 살아있는 세포의 기계적 상호 작용은 일반적으로 PA 젤을 이용하여 연구하고있다. 이러한 기판이 기판의 주요 이점 중 하나. 한 1997 Dembo 및 왕에 의해 설립 간단한 잘 특성화 프로토콜에 의존하는 그들의 강성 겔 용액의 특정 구성 요소의 농도를 변경함으로써 조절 될 수 있다는 것이다. 이것은 서로 다른 강성의 환경과 세포의 상호 작용을 연구하는 것이 바람직 플랫폼을 제공합니다. PA 젤은 세포 외 기질 (ECM) 단백질로 코팅하는 경우, 세포가 힘을 생성,이를 준수합니다. 셀 힘의 결과로,이 겔 탄성체로 변형된다. 이 변형은 세포 및 겔의 탄성 특성에 의해 가해지는 힘의 크기에 따라 달라진다. 다양한 연구 셀룰러 견인 세력을 조사하기 위해 PA 젤을 사용했다.
PA 겔 제조의 한 변형에서, 형광 마이크로 스피어 (구슬) t을 포함하는다른 경직성이의 젤에 세포 견인 힘을 정량화하기 위해 젤을 hroughout. 셀 힘 부여되면, 비즈 겔 변형 전의 초기 위치로부터 변위. 변형 필드는 각각의 비드로부터의 변위를 측정한다. 이 변형 필드는 탄성 이론 및 견인력을 계산하는 겔의 탄성 특성과 함께 이용된다. 이러한 측정은 세포가 기계적으로 감지하고 해당 지역의 미세 세와 상호 작용하는 방법에 대한 통찰력을 제공합니다.
많은 널리 사용되는 PA 겔 제조 프로토콜에서 구슬은 액체의 비중 합 상태에서 PA 젤에 걸쳐 혼합된다. 완전히 중합 PA 젤은 볼륨에 걸쳐 형광 구슬이 포함되어 있습니다. 셀 견인력을 계산할 때, 겔 표면 (셀 기판 계면)에 가까운 가장 구슬 모니터링된다. 이러한 비드의 변위는 하중 calculatio의 간략화를 위해 세포 배양 표면에서 발생하는 것으로 가정명. 겔의 깊이 내의 비드의 실제 위치는 무시된다. 그러나, 탄성 매체 (예 PA 겔 등), 힘 적용 점에 가까운 비드 멀리 포인트로부터 비드보다 더 이동한다. 따라서, 셀룰러 트랙션의 과소에 표면에 그 결과로서 표면으로부터 말단 (비드 위치에서) 점의 변위를 치료. 에러의 정도는 표면으로부터의 비드의 거리에 의존한다. 오류가 비드의 위치의 지식없이 추정 될 수 없다.
매우 세포 배양 표면 근처 비드를 한정하는 간단한 방법의 필요성이 몇 가지 기술에 의해 해결되었다. 하나의 방법은 매우 표면 근처 움직임을 측정하는 상부 초점면에 비드 충분한 숫자가되도록 전체에 걸쳐 겔 비드의 밀도를 증가시키는 것이다. 또 다른 기술은 광으로부터 생균 이미징 촛점 촬상 챔버 건물 포함최상위 초점 평면에서만 비드 (4)를 수집한다. 다른 방법은 구슬 다섯없이 이미 중합 된 겔의 상단에 구슬을 포함하는 PA 젤의 매우 얇은 층을 오버레이 포함한다. 이러한 기술의 각각의 단점은 겔 내의 비드의 정확한 위치를 알 수없는 점이다. 이 비드의 변위 필드, 따라서 세포의 힘의 계산의 계산에 오류를 소개한다. 또 다른 기술은 설포 SANPAH 6을 이용하여 이미 중합 PA 겔의 상면에 접합 비드를 포함한다. 이 기술은 비드 만 PA 겔 위에 실로 보장하지만, 그들은 겔의 깊이에 매립되어있는 정도를 알 수있다. 이전 작품은 세포가 힘 마이크론 멀리 칠을 감지 할 수 있음을 제안했다 이것은 잠재적으로 세포의 동작을 변경할 수있는 세포에 대한 지역의 지형을 만들 수 있습니다. 최근에, 1 μm의 직경 F와 PA 젤을 패터닝하는 기술정규화 배열 luorescent 피브로넥틴 도트 마커 팔을 설립되었습니다. 이 경우, 형광 마커의 깊이가 알려져 있으며, 피브로넥틴 패턴 간접적 겔 표면 상에 인쇄 될 때, 본질적으로 제로이다. 그러나,이 방법은 ECM 단백질 1 μm의 직경 도트로 한정되는 바와 같이 세포가 부착 할 수있는 연속적인 환경을 제공하지 않는다. 완전히 매우 표면 근처 알려진 위치 PA 겔 내에 추적기 구슬을 통합하고이를 한정하는 방법이 아직 확립되어야한다.
여기서, 우리는 매우 PA 겔 내의 세포 배양 표면 근처 초점면에 μm의 직경 형광 비드 부 μM을 제한하는 기술을 개발한다. 겔은 전형적으로 두 개의 유리판 사이에 미 중합 액체 겔 용액을 개재하여 경화된다. 겔에 강하게 밀착되도록 플레이트 중 하나가 작용된다. 다른 작용 화하고 겔 경화 후에 제거된다. 우리는이 이동식 유리 스와 수정비즈의 층으로 코팅하여 rface. 기능화 및 비드 코팅 유리 표면 사이의 액체 겔을 끼운 후, 겔 비드 전송은 경화된다. 이것은 표면의 1.6 μM 내의 겔화 구슬 '통합의 거리를 제한한다. 유리 바닥 페트리 접시는 젤이 경화되는 부착면으로 사용된다. 중합시 겔 평면형 표면을 형성하도록, 원형 유리 커버 슬립이 샌드위치에 유리 바닥 페트리 접시와 겔을 사용한다. 겔의 제조에 앞서, 상부 유리 커버 슬립은 양성 표면 전하를 산출, 폴리-D-라이신 (PDL)로 코팅된다. PDL은 압축 공기를 분출하고, 물에 비드 용액 커버 슬립 상에 증착된다. 우리는 음전하를 운반 카르 형광 마이크로 비즈를 이용하고, PDL로 처리하여 생성 된 양으로 대전 된 표면과 상호 작용. 압축 공기의 단일 층 커버 슬립 오프 비드 용액을 불어 후에구슬은 정전 건조 커버 슬립에 연결 상태를 유지합니다. 유리 슬라이드가 완전히 손상되지 않은 그대로 PA 겔로부터 제거됨에 따라 PDL 코팅은 겔 표면에 유리의 접착에 영향을 미치지 않는다.
유리 바닥 페트리 접시는 97 % 3 - 아미노 프로필 - trimethoxysliane 및 0.5 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)로 처리하여 부착 만들어집니다. 원하는 경직성의 PA 젤은 표준 절차 구를 통해 비스 아크릴 아미드와 아크릴 아미드의 적절한 농도를 혼합하여 만들어집니다. 겔 용액의 액체 방울은 유리 바닥 배양 접시 상에 피펫 팅한다. 비드를 함유 유리 커버 슬립이 샌드위치에 페트리 접시와 겔을 사용한다. 겔이 경화 될 때, 상단 커버 슬립은 표면으로부터 1.6 μM 내에 PA 겔에 포함 된 비드를 남겨 제거된다.
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Protocol
제조 및 세포 배양 표면 근처에 포함 된 형광 미소와 강성을 변화의 PA 젤 관능.
1 상단 커버 유리 전표를 기능화
- 청소 유리 커버 슬립 (# 1.0, 12mm의 DIAM.) 비누와 물, 에탄올 다음은 외부의 먼지를 제거합니다.
- 도시 유리 커버들은 커버 슬립의 용이성과의 상호 작용을 용이하게 닿지 않도록되도록 강판의 표면 (즉, 피펫 팁 홀더)에 실수.
- 코트 커버의 표면 전체가 폴리-D-라이신 1 시간 (도 1a)에 대한 (0.1 ㎎ / ㎖)와 함께 미끄러.
- 이 시간 동안, 일 수행 0.1 μm의 직경의 콜로이드 용액 만 희석 탈 (DI) 물에 적색 형광 마이크로 스피어는 겔 표면에 20 μm의 2 당 약 1 마이크로 스피어의 입자 밀도를 얻었다. 다양한 희석의 결과는 그림 2를 참조하십시오. 이 dilutioN은 특정 실험의 필요성을 충족시키기 위해 변경 될 수있다.
- 30 분 동안 초음파 물을 욕조에 희석 된 용액을 놓습니다.
- 1 시간 후, 신중하게 각 커버 슬립을 들어 올려 공기와 바람을 불어 건조 핀셋을 사용합니다. 강판 표면에 건조 커버 전표를 돌려줍니다.
- 각 커버 슬립 위에 초음파 목욕 및 피펫 150 μL의 희석 된 콜로이드 용액을 제거합니다. 10 분 (그림 1B)에 두십시오.
- 주의 깊게 각 커버 슬립을 들어 올려 공기와 바람을 불어 건조 핀셋을 사용합니다. 사용할 준비가 될 때까지 건조 커버가 어둠 속에서 강판 표면과 가게에 미끄러 져 돌아갑니다.
직접 바닥이 유리 페트리 접시에 PA 젤을 준비 2
- 100 ° C로 예열 열판.
- 유리 바닥 배양 접시의 원하는 수의 레이아웃 (14mm와 35mm 요리를 마이크로 웰, # 1.0) 화학 흄 후드의 평평한면에.
- 97 % 3 - 아미노 프로필 trimethoxys 각 페트리 접시 마이크로 웰의 유리 부분을 덮리안 화학 활성화를위한 7 분 (3-APTES). 폴리스티렌의 열화를 방지하는 페트리 접시에서 플라스틱의 표면에 3-APTES 부주의 떨어지는 않도록주의하여주십시오.
- 7 분 후, DI 워터와 페트리 접시를 작성하고 폐기물 용기에 폐기하십시오.
- 를 반복 한 다음 각 요리에 대한 단계 2.4 배, 그리고 여분의 물을 제거하기 위해 페트리 접시를 흔들. 유리 부분은 물기가 없어 질 때까지 뜨거운 접시에 배양 접시를 놓습니다.
- 핫 플레이트에서 배양 접시를 제거하고 화학 흄 후드에서 평평한 표면으로 돌아갑니다.
- 화학 퓸 후드에서, 0.5 % 글루 타르 알데히드 용액을 잘 30 분 동안 용액으로 각각 페트리 접시의 유리 부분을 커버. 플라스틱의 열화를 방지하는 페트리 접시에서 플라스틱의 표면에 글루 타르 알데히드의 부주의 떨어지는 않도록주의하여주십시오.
- 30 분 후, DI 워터와 페트리 접시를 채우고 씻어 폐기물 용기에 폐기하고 glutarald를 제거ehyde.
- 를 반복 한 다음 각 요리에 대한 단계 2.4 배, 그리고 여분의 물을 제거하기 위해 페트리 접시를 흔들. 유리 부분은 물기가 없어 질 때까지 뜨거운 접시에 배양 접시를 놓습니다.
- PA 겔 용액의 성분을 혼합하기 전에, 유리 바닥 겔의 짧은 협 허용들은 쉽게 접근 할 수 있도록 화학적 흄 후드로 기능화 된 유리 슬라이드를 이동 겔 용액을 혼합 한 후 배양 접시가.
- 15 ㎖의 원심 관에, 표 1에 기재된 농도로 직접 연속적으로 40 % 비스 아크릴 아미드, 2 % 아크릴 아미드, 및 아크릴산을 혼합 행렬 원하는 탄성을 달성하기 위해 (출판 (10)로부터 적응 프로토콜).
- 겔 용액을 완료하기 위해 필요한 매트릭스 탄성에 대응하는 표 1에 열거 개당 100 mM의 HEPES, 10 %의과 황산 암모늄,과 TEMED를 추가한다.
- 즉시 유리 부의 중심에 겔 용액 15 μL 피펫배양 접시의.
- 즉시 핀셋 기능화 된 유리 커버 슬립을 선택합니다.
- 형광 구슬이 젤 솔루션 측면 만드는 접촉이되도록 위에 유리 커버 슬립 플립.
- 부드럽게 기능화 측 겔 (도 1C)와 접촉되도록 해주기 액체 PA 겔의 상단에 커버 슬립을 놓는다. 주 : 최상의 결과를 위해, 두 번째 사람은 다수의 배양 접시에 액체 PA 겔 용액을 피펫 팅하면서 부분적인 중합을 방지하기 위해 커버 슬립을 추가의 역할을 위해 권장된다.
- PA 젤 낮은 수준으로 중합 형광 나노 입자에 중력 효과를 방지 지원하기 위해 모든 페트리 접시를 뒤집습니다.
- PA 젤의 원액이 눈에 띄게 그 원심 분리 관에서 중합했다 적어도 35 분 동안, 또는 때까지 기다립니다.
- 다시 이상 배양 접시를 뒤집어 커버 슬립을 제거 지원하기 위해 PBS로 채운다.
- 조심스럽게 커버 슬립의 둘레를 긁어 핀셋을 사용하여, 배양 접시의 유리 부와 커버 슬립의 개요와 접촉. 커버 슬립이 빠질 때까지 여러주기를 수행합니다. 커버 슬립을 제거하고 적절한 날카로운 물건 폐기 용기에 폐기하십시오.
- 모든 커버 전표를 제거한 후, 형광 구슬은 겔 (그림 1D)에 전송 한 것입니다. 완전히 PBS와 PA 젤 커버 각 접시에 페트리 접시의 뚜껑을 배치하고 4 ° C에서 보관.
3 피브로넥틴과 PA 젤 기능화
- 설립 프로토콜 11에 설명 된대로 다음과 같은 예 혼합 솔루션을 준비 : 솔루션을 적시 (137 mM의 NaCl을, 5 % (v / v)로 글리세롤) 및 2 배 접합 버퍼 (0.2 M 2 (N의 -morpholino) 에탄 술폰산 (MES), 10 % (v / v)로 글리세롤, 산도 4.5).
- PA 겔을 함유하는 유리 - 바닥 접시에서 모든 PBS를 제거하는 생물학적 후드에서 진공 펌프를 사용한다.
- 피펫테 겔이 완전히 침수 될 수 있도록 각 젤에 솔루션을 흡수. 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양한다.
- 온난 한 에틸 3 - [3 - 디메틸 아미노 프로필] 카르 보디이 미드 히드로 클로라이드 (EDC) 및 실온의 N -hydroxysulfosuccinimide (NHS).
- EDC의 10 배 용액 (150 mM의 DI 물에, 19 ㎎ / ㎖) 및 NHS (250 mM의 DI 물에, 29 ㎎ / ㎖)를 혼합한다.
- 1 부를보기 배 EDC, NHS 1 부를 10 배, 3 부 DI 물, 및 5 중량 배 공액 버퍼를 섞는다.
- 흡수 용액을 제거하는 생물학적 후드에서 진공 펌프를 사용합니다. 모든 유체가 겔 표면으로부터 제거되어 있는지 확인합니다.
- 겔 표면을 커버하고 페트리 접시 (150 ~ 250 μL)의 유리 바닥을 잘 채울 수있는 충분한 NHS / EDC 솔루션을 추가합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 실온에서 배양한다.
- 실온에서 해동 피브로넥틴. 일단 해동, 50 μg / ml의 피브로넥틴 솔루션을 만들기 위해 멸균 DI 물을 섞는다.
- NHS / EDC의 솔루을 제거하는 생물학적 후드에서 진공 펌프를 사용하여기. 모든 유체가 겔 표면으로부터 제거되어 있는지 확인합니다.
- 각 겔에 피브로넥틴 용액 150 μl를 추가합니다. 피브로넥틴의 부착을 허용하기 위해 35 분 동안 실온에서 배양한다.
- 35 분 후 최대 2 주 동안 4 ° C에서 각 페트리 접시 및 저장에 PBS를 추가합니다.
4 트랙션 포스 실험
- 물을 욕조에 따뜻한 세포 미디어, PBS, 37 ° C에 트립신.
- 젤 린스 사이에 PBS를 흡입, 멸균 PBS로 5 배, 그리고 후드에 덮여있는 상태로 둡니다 씻어.
- 플라스크를 포함하는 셀에 1 ㎖의 트립신이 25cm 당을 추가합니다. 세포가 플라스크에서 해제 된 후, 세포 미디어 트립신을 희석 세포를 계산합니다. 겔 표면 영역에 기초하여, / cm 2 3,000 세포의 최종 세포 밀도 시드 젤 당 필요한 세포의 수를 결정한다. 희석 또는 셀 미디어 혼합물의 150 μL 세포의 숫자를 포함하도록 서스펜션을 집중한다. 세포 suspens의 나누어지는 150 μL각 젤에 이온.
- 30 분 동안 인큐베이터에서 세포를 포함하는 페트리 접시를 놓습니다. 이어서, 신중 배양 접시를 제거하고 접시의 표면이 완전히 잠기도록 용지 (약 2 mL)로 페트리 접시의 나머지 부분을 채운다.
- 이미지 수집 될 때까지 배양기에서 배양 접시를 다시 배치합니다.
- , 미분 간섭 대비 (DIC) 프리즘을 삽입, 40 배 침수 목적을 삽입 mCherry 또는 이에 상응하는 형광 필터를 선택하고 환경 챔버를 켜 : 이미징 현미경 및 데이터 수집 시스템을 준비합니다.
- 영상을 준비 할 때, 인큐베이터에서 한 페트리 접시를 제거하고 현미경 무대에 조심스럽게 놓습니다. DIC 이미징 페트리 접시의 뚜껑을 제거합니다.
- 하나의 셀을 찾아 DIC의 셀의 하나의 정지 영상을 캡처합니다.
- 현미경 스테이지를 이동하지 않고 형광하는 촬상 모드를 전환. 형광 마이크로 및 녹화에 초점미소 구체의 화상 함수 ord.
- 조심스럽게 피펫으로 배양 접시에서 세포 미디어를 제거하고 0.05 % 트립신-EDTA를 추가합니다.
- 이미지 셀 후 셀 아래 미소 구는 분리했다.
- ImageJ에 12에서 사용 입자 영상 유속계 (PIV) 분석에 의한 세포 힘 변위 필드를 계산합니다.
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Representative Results
공 초점 이미징은 비즈 겔 표면 아래에 실제로 있다고 결정하고 젤 깊이 내 자신의 정확한 위치를 정량화하기 위해 사용되었다. 겔 내부 것과 다른 파장의 형광 비드 표면에 정착하도록 허용하고, 임베디드 형광 나노 입자 및 그 표면 사이의 거리가 중심 식별 알고리즘을 이용하여 계산 하였다. 겔 표면 상에 비드의 위치는 겔 세포가 표면에 부착시에 힘을인가의 상면에 대한 기준으로서 역할을한다. (적색 표면에 비즈, 반대로 함께 겔 녹색 비드) 고려 두 시나리오의 개략도가도 3에 도시된다. 알고리즘은 입체 중심 위치의 z-높이를 보간한다. 우리는 세 강성 젤 (1, 10, 40 kPa의) 두 개의 크기 (직경) 형광 구슬이 과정을 반복 (0.1 μm의 빨간색과 1 μm의 노란색, 녹색). 거리겔 내에서 비드와 다른 파장의 가장 가까운 이웃 사이에 결정되는 입체 중심을 기준으로했다. 4 구슬의 공간 분포를 보여줍니다 (상면 및 임베디드)와 YZ 평면에 투영 된 뷰 그림. 후자는 겔의 표면으로부터 모든 비드의 깊이를 제공한다.
0.1 μm의 구슬의 평균 깊이는 619 nm의, 467 nm의 강성 한, 10의 PA 젤에 대한 278 nm의, 40 kPa의 각각 (그림 5A)입니다. 1 μm의 직경 구슬에 해당하는 깊이는 -20 40 kPa의 젤, 10 kPa의 젤에서 12 나노 미터, 1 kPa의 젤 (그림 5B)에서 1,255 nm의에서 나노. 전통적 견인력 현미경 연구를위한 PA 겔에 사용 된 바와 같이 공 초점 촬상 또한 겔에 분산 구슬 겔상에서 수행 하였다. PA 겔에 분산 비드의 깊이는 전술 한 바와 같은 알고리즘을 사용하여 측정하고, D와 비교된다여기 제시 기술을 사용하여이 epths. 6 전통적인 제조 방법을 이용하여 PA 겔의 깊이 내에 비드 분산액 변동을 도시도.
피브로넥틴으로 작용 할 때 섬유 아세포는 PA 겔 표면에 부착합니다. 섬유 아세포의 세포 및 해당 형광 비드 층 변위 필드는도 7에 도시된다. 된 이미지 주변 비즈 초점이 약간 보인다. 유리는 겔에서 분리 한 완전히 그대로 유지 이것은, 겔 부분에 기계적 결함이 아니다. 오히려 인해이 실험에 사용 된 물에 침지 대물 광학 효과의 결과이다. 배지에 트립신을 첨가하면, 세포가 원래의 상태로 변형 PA 겔 표면의 복귀 결과, 표면으로부터 방출된다. 상호 상관 알고리즘은 비드 (10)의 변위에 기초하여 상기 변형 필드를 계산하는 데에 이용 하였다.변위 맵은 y 방향 셀 견인력의 지배적 인 편광을 나타낸다.
상단 유리 커버에 대한 작용 과정의 그림 1 그림 PDL 및 형광 구슬 미끄러. (A) 유리 커버 슬립 (파란색) 1 시간 동안 0.1 ㎎ / ㎖ PDL (오렌지)와 함께 배양한다. 압축 된 공기가 커버 건조 미끄러 불어 PDL을 제거하기 위해 사용된다. (B) 유리 커버 슬립은 압축 공기를인가하여 5-10 분 동안 100 nm의 직경을 형광 비드 용액과 함께 배양 한 다음 제거된다. 구슬의 한 층은 정전 기적으로 커버 슬립에 결합 된 상태로 유지됩니다. (C) 활성화 된 유리 표면에 샌드위치 PA 젤에 사용되는 구슬 기능화 된 커버. (D) 상단 커버 슬립 제거하여 PA 젤 polymerizat 다음이온은 구슬에 위치해 있습니다 매우 겔의 표면 근처. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
0.1 μm의 직경 형광 비드를 포함하는도 2 PA 젤 표면. 구슬 PDL 처리 상부 유리 커버 슬립을 도포하기 전에 비드 용액 (A)의 10,000 배 (3.64 × 10 8 비즈 / ml) 및 (B)로 희석시켰다 20,000 배 (1.82 × 10 8 구슬 / ㎖). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
![그림 3]("/files/ftp_upload/51873/51873fig3highres.jpg"폭)
겔의 표면 근처 지역화 구슬도 3 셀 기판 계면. PA 겔 내의 비드 위치는 공 초점 현미경과 중심 식별 알고리즘을 사용하여 정량 하였다되는 두 가지 시나리오의 개략도. 첫 번째 시나리오는 (A)에 도시되어 젤 표면에 녹색 1 μm의 직경 비즈, 및 겔 및 레드 100 nm의 직경 비드 내부 (B) 그린 1 μm의 직경 구슬 2 내측 적색 100 nm의 직경 구슬 표면. (C) 세포의 표면 근처에 젤의 표면에 앉아 녹색 구슬 안에 지역화 된 빨간 구슬을 가진 겔 (파란색)에 부착 (노란색)의 만화 그림. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.
그림 4 공 초점 슬라이스 (XY, 센터) 및 동반 YZ 빨간색 젤에 포함 된 0.1 μm의 구슬 표면에 1 μm의 구슬 젤 (왼쪽) 투영 전망을 제공합니다. 모든 축에 대한 단위는 나노 미터에 있습니다. 위 또는 녹색 구슬과 같은 평면에서 빨간색 구슬의 수시 발생이 약간 적색 형광 방출 스펙트럼의 중첩 (mCherry)과 녹색 (GFP)에 기인한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 PA 겔의 상부면 근처에 국한 비드 깊이 히스토그램. 강성을 1kPa, 10 kPa의, 40kPa의 각각 빨간색, 파란색과 검은 색으로 표시됩니다. 가우스 곡선은 각각의 설정 데이터와 진폭에 해당하는 x 값이 구슬의 평균 깊이로 해석됩니다에 맞게되었습니다. 두 가지 시나리오를 테스트했다 :. (A) 1 μm의 표면에 구슬, 및 (B) 표면에 0.1 μm의 구슬 젤 내부의 1 μm의 구슬 젤 내부에 0.1 μm의 구슬 여기를 클릭하십시오이의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다 그림.
그림 전통적인 제조 방법 (검은 색)을 사용하여 PA 젤에 걸쳐 임의로 포함 된 구슬의 깊이의 6 히스토그램 및 강성의 PA 젤) 1 kPa의이 기술 (빨간색)를 사용하여 PA 젤의 상단 층 근처 지역화 구슬, B) 10 kPa의,및 C) 40 kPa의. 삽입 된이 겔의 가장 상위 10 μm의 내 두 젤 타입의 구슬의 깊이를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
셀 견인에 의한 그림 7 변위 필드입니다. 10 kPa의 겔 섬유 아세포의 (A) 위상차 이미지. (B) 섬유 모세포에 의해 생성 된 마찰력에 의해 생성 된 변위 필드. 색상 막대가 나노 미터 비드 변위를 나타냅니다. 트립신하기 전에 셀 아래에 0.1 μm의 직경 구슬 (C) 형광 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
겔 표면에 앉아 다른 크기 / 파장 비드 겔 상대 내부 구슬의 평균 위치를 그림 8 그림. 우측 (40 kPa의, 10 kPa의 1 kPa의) 왼쪽에서 PA 젤 감소의 강성. (A) 표면에 젤과 녹색 1 μm의 직경 구슬이 빨갛게 0.1 μm의 직경 구슬. (B) 표면에 젤과 빨간색 0.1 μm의 직경 구슬 안에 녹색 1 μm의 직경 구슬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 9 디τ에 대한 이론치 stribution은 /. 다양한 비드 깊이에 기초 μ 비즈 직경 0.1 μm의 역시 균일하게 분산 또는 (A) 1 kPa의 젤, (B) 10 kPa의 젤, 및 (C) 40 kPa의 겔의 표면 근처 지역화 된 . 골드 화살표 비즈 겔 표면에있는에 Z = 0 경우에 대한 τ / μ의 값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| E (kPa의) | 40 % 아크릴 아미드 (μL) | BIS (농도) | 2 % BIS (μL) | 100 mM의 HEPES (μL) | 0.1 | 625 | 0.00009 | 22.5 | 4225 |
| 0.25 | 625 | 0.0001 | 25 | 4222.5 | |||||
| 0.5 | 625 | 0.00011 | 27.5 | 4220 | |||||
| 0.75 | > 625 | 0.0002 | 50 | 4197.5 | |||||
| 1 | 625 | 0.0003 | 75 | 4172.5 | |||||
| 1.5 | 625 | 0.0004 | 100 | 4147.5 | |||||
| 이 | 625 | 0.0005 | 125 | 115px; "> 4122.5||||||
| 2.5 | 625 | 0.0006 | 150 | 4097.5 | |||||
| 3 | 625 | 0.0008 | 200 | 4047.5 | |||||
| 3.5 | 625 | 0.0009 | 225 | 4022.5 | |||||
| 4 | 0.001 | 250 | 3997.5 | ||||||
| 4.5 | 625 | 0.0012 | 300 | 3947.5 | |||||
| 5 | 625 | 0.0014 | 350 | 3897.5 | |||||
| 5.5 | 625 | 0.0016 | 400 | ||||||
| 6 | 625 | 0.0018 | 450 | 3797.5 | |||||
| 6.5 | 625 | 0.002 | 500 | 3747.5 | |||||
| 7 | 625 | 0.0022 | 550 | 3697.5 | |||||
| 7.5 < / TD> | 625 | 0.0024 | 600 | 3647.5 | |||||
| 8 | 1000 | 0.001 | 250 | 3622.5 | |||||
| 10 | 1000 | 0.0013 | 325 | 3547.5 | |||||
| 15 | 1000 | 0.002 | 1 픽셀; "> 5003372.5 | ||||||
| 20 | 1000 | 0.0027 | 675 | 3197.5 | |||||
| 30 | 1000 | 0.0037 | 925 | 2947.5 | |||||
| 40 | 1000 | 0.0048 | 1200 | 2672.5 |
표영률에 기초하여 1 PA 겔 화학 농도. 원하는 PA 겔 탄성률 들면, 아크릴 아미드, 비스 아크릴 아미드, 및 HEPES 완충액 나열된 농도는 25 ㎕의 10 %과 황산 암모늄 (APS), 5 ㎕의 아크릴산으로 보충되어야 2.5 ㎕의는 TEMED.
| Z (μM) | u는 X ((τ / μ) μm의) |
| 0 | 0.750 |
| 0.394 | |
| 1 | 0.237 |
| 1.5 | 0.164 |
| 이 | 0.124 |
| 2.5 | 0.100 |
| 3 | 0.083 |
| 3.5 | 0.071 |
| 4 | 0.062 |
| 4.5 | 0.056 |
| 0.050 |
표 Boussinesq 이론에 기초하여 겔 비드 표면으로부터의 깊이 (Z)에 대응하는 τ / μ의 함수로서 2 변위.
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Discussion
이 방법을 사용할 때, 비드 용액 적절히 희석 및 비즈 원하는 직경에 기초하여 선택되는 것이 필수적이며, PA 겔 기판 강성이고 원하는 실험 탐구되는 현상의 크기 스케일.
상단 유리 커버 슬립을 기능화하기 전에 비드 솔루션을 희석 할 때주의를 기울여야한다. 겔 표면에 구슬 사이의 간격은 콜로이드 용액의 희석 배수를 변화시킴으로써 변경 될 수있다. 너무 용액을 희석하여 커버 슬립에 그 커플 구슬의 수를 감소시키고, 궁극적으로 겔 비드의 수를 감소시킬 것이다. 너무 적은 용액을 희석하는 것은 그들이 접촉과 서로 구별 될 수 없도록 겔 비드 너무 높은 밀도를 얻을 수있다. 완전히 통합 된 나노 입자의 존재를 방지하는 것이 불가능하지만, 희석 한 용액에 초음파의인가는 효과적으로 최소화 유모oparticle 집계. 우리는이 프로토콜에서 이용 콜로이드 용액의 10000 배 희석액을 3.64 × 10 8 비드 / ㎖의 비드 농도를 제공하고, 0.1 μm의 직경 구슬 0.05 비즈 / μm의 (2)의 바람직한 입자 밀도를 얻을 수 있음을 발견 하였다. 1 : 20000 희석액 (1.82 × 10 8 비드 / ㎖) 당 52 μm의 입자 (2)의 평균을 산출이 다양한 희석액과 겔의 표면의 이미지를 보여준다.. 이 겔 비드로 전송할 수의 변동이 있음을 주목해야한다. 이 작용 동안 압축 공기로 커버 슬립에서 비드 용액을 제거와 관련된 변화에 기인한다. 일반적으로, 우리는 두 가지 중 적어도 배 희석 계수의 증가는 지속적으로 비드 당 분야에서 적어도 두 배 증가를 초래 것을 발견 하였다.
그것은 t의 완전 침수가 발생합니다 구슬의 크기 (직경)를 선택하는 것이 중요하다그는 PA 중합시 젤 내부에 구슬. 도 5a에 도시 한 바와 같이 겔 강도는 구슬의 위치에 영향을 미친다. 0.1 μm의 직경 구슬, 비드 깊이 강성 저하에 따라 증가한다. 이것은 기공 크기 및 PA 겔 강성 (13) 사이의 반비례 관계의 결과 일 수있다. 테스트 셋 강성 겔 모두, 비드 일관 겔 내부에 지역화 및 겔 표면의 1 μM에서도 8a에 도시 된 바와 같이. 겔 내에서 1 μm의 구슬의 평균 위치는 강성에 따라 달라집니다. 그들은 1 kPa의 젤에 대해 깊이 (약 1.25 μm의) 포함됩니다. 구슬이 종종 겔의 상단을 통해 돌출 의미 10, 40 kPa의 젤의 경우, 1 μm의 직경 구슬의 상단의 위치가 젤 아래 0.5 μm의 위의 약 0.5 μm의 범위 (그림 5) 표면 (그림 8B). 이 topogra을 소개하기 때문 해로운셀 PHY 및 지형은 셀 기판 (14)의 상호 작용에 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 따라서, 특정 강성의 겔을 제조 할 때이 기술에 대한 선택의 비드 유념 할 필요가있다. 이 방법을 특성화하기 위해 사용되는 두 개의 구슬 크기의 0.1 μm의 직경은 최적의 크기를 증명한다. 다른 비드 크기는이 기술과 함께 이용 될 수 있지만, 여기서 설명하는 바와 같이 겔 비드 중합시 지역화되는 정확한 깊이를 이해하기 위해, 공 초점 현미경을 사용하여 캘리브레이션되어야한다.
이 기술은 시야 내에 구별 입자의 수를 증가시킴으로써 PA 겔 구슬의 공간 분해능을 향상시킨다. 겔의 상단에 레이어에 구슬을 해당 지역의 언어로 크게 겔의 합성 강성에 영향을주지 않습니다. Isostress 복합 이론 겔 함유 BEA 만 1 μm의 두께의 층으로, 복합 탄성률 E의 C를 계산하기 위해 이용된다DS로
E의 f는 폴리스티렌 비드 (3 GPa로)의 탄성 계수이고, E의 m은 겔 매트릭스 (10 kPa의)의 탄성 계수이고, V의 F 및 V m은 각각 구슬 및 겔 매트릭스의 체적 분율이다. 비드 체적의 단지 0.03 %를 포함하기 때문에, E의 C = 10.0025 kPa의 강성은 10 kPa의 등방성의 겔의 탄성률보다 크게 다르지 않다. PA 겔의 제조 방법은, 이와 같이 설정된 중합 중에 비드 (15)의 분포에 대한 중력의 영향을 최소화하고, 30 초에 중합 시간을 감소시킨다. 비즈 겔로 중합하는 우리의 방법은 더 이상 (~ 30 분) 중합 시간에 의존그들은 겔 표면에 돌출하지 않도록. 단일 층으로 비드를 지역화 것은 상당히 복합 겔 강도 및 겔 매트릭스에 구슬의 전송에 더 긴 중합 시간 원조에 영향을주지 않기 때문에, 우리는 우리의 기술에서는 중합 시간을 줄일 수있는 측정 값을 포함하지 않는다.
우리의 기술은 기판의 변형의 측정, 따라서 세포 견인 힘의 계산을 향상 PA 젤 내부에 알려진 깊이에 구슬을 지역화하는 방법을 보여줍니다. 휴대 견인 힘을 정량화하는 이론적 접근 방법은 이전에 16, 17을보고되었다. 이 방법은 탄성 반 공간에서 반 무한 고체로서 겔 기판을 취급한다. Boussinesq 용액 변위 필드로부터 견인력을 계산의 역 문제를 해결하기 위해 사용된다. 우리 의한 겔의 비드로부터 원위 변위 측정에 오차를 정량화 Boussinesq 적분의 단순화 된 버전을 사용urface 18. 전단 응력인가에 기초하여 주어진 방향으로의 변위 방정식은, τ은 소정 반경 R 위에 주어진다
U X가 X 방향의 변위이고, μ는 전단 계수이며, z는 겔 비드 표면으로부터의 깊이이다. 겔의 비드 깊이에 걸쳐 다양한 위치는, 대응하는 변위를 표 2에 나타낸다.
여기에 도시 된 경우에 대해, 반경 1 μm의 평균 크기 초점 접착 것으로 추정된다. 비드가 세포 (Z = 0)과 동일 평면으로 가정하는 경우, 배기량은 0.75 τ / μ에 의해 주어진다. 비드 만 1 μm의 겔 표면 아래를 경우 변위 0.24 τ / μ에 의해 주어진다. 이1 μm의 아래 위치에 표면에 구슬 평면에서 변위 배 감소보다 더 큰 나타냅니다. 이것은 정확한 겔 내에서 위치를 알 수없는 임베디드 구슬의 움직임에 따라 표면의 견인 세력의 계산에 오류를 소개합니다. 제안 된 전통적인 제조 방법 모두에 대한 겔의 비드의 깊이의 함수로서 τ / μ에 의해 정의 된 견인력에 편차가 중요하다.도 9는 힘의 분포를 나타낸다 (비 τ 주어진다을 / μ) 기반 Boussinesq 이론 비드 균일 겔 분포 및 표면 근처에서 국소 때 피사계 심도 내의 광학 비드 깊이 (Z)의 분포를 이용하여 연산 결과가. 비드가 세포, Z = 0 및 τ / μ = 0.0133으로 동일 평면에있을 때의 휴대 힘의 가장 정확한 측정을 초래할 것이다. (118)에 의해이 경우, τ / μ 증가에 비해%, 80 %, 및 1 kPa의 10 kPa의, 및 40 kPa의 겔, 50 %는 각각, 비드 우리가 제안하는 기술을 사용하여 표면 근처에 국부적 때. 비드 균일 겔 깊이에 걸쳐 분산 될 때, τ / μ는 각각 1 kPa의 10 kPa의, 및 40 kPa의 겔에 대해, 표면 근처 비드 지역화 의한 증가를 넘어 부가적인 60 %, 80 % 및 150 % 증가한다. 구슬이 겔 깊이에 분포하는 경우에 견인 계산 거의 200 % 오차의 합계를 나타냅니다. 따라서, 겔 내부에 알려진 깊이에 구슬을 국산화하는 변위 측정 및 세포 견인 세력의 정확도를 향상시켜줍니다.
여기에 설명 된 기술은 구슬 겔 표면 근처 지역화되도록 견인 현미경 애플리케이션을 위해 PA 겔 기판을 제조하는 새로운 방법을 제시한다. PA 겔 내에서 알려진 깊이에 구슬을 한정하는 것은시를 만드는 세포 하중 적용에 따라 구슬의 실제 변위에 대한 새로운 정보를 제공합니다세포가 하부 기판을 변형하는 방법의 정확한 포토 광석.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 학제 간 혁신 이니셔티브 프로그램, 일리노이 대학을 감사드립니다, 12035을 부여합니다. SK는 국립 과학 재단 (NSF) 부여에서 UIUC에 투자되었다 0,965,918 IGERT : 세포 및 분자 역학 및 BioNanotechnology에 연구원의 차세대를 훈련.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 70% Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 111-30-8 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| 40% Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| 2% Bisacrylamide | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| 0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry) | Invitrogen | F8801 | |
| Fibronectin, Human, 1 mg | BD Biosciences | 354008 | |
| Ammonium persulfate | Bio-RAD | 161-0700 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-RAD | 161-0801 | |
| Poly-D-lysine | Millipore | A-003-E | |
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
| N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25300-054 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Acrylic acid | Sigma-Aldrich | 147230 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Materials | |||
| 35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass | In Vitro Scientific | D35-14-1-N | |
| Glass cover slips, 12 mm diam. | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
References
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