Summary
Traditionele technieken voor het vervaardigen polyacrylamide (PA) gels die fluorescente probes omvatten waartussen een gel tussen een hechtend oppervlak en een glasplaatje. Hier laten we zien dat deze dia bekleden met poly-D-lysine (PDL) en fluorescerende probes lokaliseert de probes binnen 1,6 urn uit het gel oppervlak.
Abstract
PA gels lang gebruikt als een platform om cel trekkrachten vanwege gemak van fabricage en de mogelijkheid om stemmen hun elastische eigenschappen te bestuderen. Wanneer het substraat wordt bekleed met een extracellulaire matrix eiwitten, cellen zich aan de gel en krachten toepassen, waardoor de gel te vervormen. De vervorming is afhankelijk van de cel tractie en de elastische eigenschappen van de gel. Wanneer de vervorming van het oppervlak gebied bekend is, kan het oppervlak tractie worden berekend met elasticiteitsleer. Gel vervorming wordt gewoonlijk gemeten door het inbedden fluorescente merker korrels gelijkmatig in de gel. De probes verdringen als gel vervormt. De probes nabij het oppervlak van de gel worden gevolgd. De verplaatsingen die door deze probes worden beschouwd als oppervlak verplaatsingen. Hun diepten van het oppervlak worden genegeerd. Deze aanname introduceert fout in trekkracht evaluaties. Voor nauwkeurige meting van cel krachten, is het essentieel voor de locatie van de korrels bekend zijn. We hebben ontwikkeldeen techniek die eenvoudig chemie gebruikt om fluorescente merker kralen, 0,1 en 1 urn in diameter beperken, in PA gels, op 1,6 pm van het oppervlak. We jas een dekglaasje met poly-D-lysine (PDL) en fluorescerende kralen. PA gel oplossing wordt dan ingeklemd tussen het dekglaasje en een hechtoppervlak. De fluorescerende kralen overdracht naar de geloplossing tijdens het uitharden. Na polymerisatie, de PA gel bevat fluorescerende kralen op een vlak nabij het gel oppervlak.
Introduction
De mechanische interactie van een levende cel met de lokale omgeving is algemeen bestudeerd middels PA gels. Deze substraten rekenen op een eenvoudige, goed gekarakteriseerde protocol vastgesteld door Dembo en Wang in 1997 1. Een van de belangrijkste voordelen van deze substraten is dat de stijfheid kan worden afgestemd door het modificeren van de concentraties van specifieke componenten van de gel oplossing. Dit verschaft een gewenst platform interactie van cellen met verschillende omgevingen starheid bestuderen. Wanneer PA gels worden bekleed met extracellulaire matrix (ECM) eiwitten, cellen zich aan hen kracht genereren. Door cel werking, gel vervormt als een elastisch lichaam. Deze vervorming is afhankelijk van de grootte van de door de cellen en de elastische eigenschappen van de gel toegepaste kracht. Diverse studies hebben PA gels gebruikt om cellulaire trekkrachten te onderzoeken.
In een variant van PA gel fabricage, zijn fluorescerende microbolletjes (korrels) ingebed throughout de gel naar cel trekkrachten te kwantificeren op gels van verschillende rigiditeiten 2. Bij cel kracht toepassing, de kralen te verdringen uit hun oorspronkelijke locatie volgende gel vervorming. Het veld vervorming gemeten van de afzonderlijke kraal verplaatsingen. Dit veld vervorming gebruikt elasticiteit theorie en de elastische eigenschappen van de gel om de trekkrachten berekenen. Deze metingen geven inzicht in hoe cellen mechanisch gevoel en interactie met hun lokale micro-omgeving 3.
In vele algemeen gebruikte PA gel fabricage protocollen, worden de beads vermengd gehele PA gel in vloeibare, niet-gepolymeriseerde toestand. Een volledig gepolymeriseerde PA gel bevat fluorescerende kralen gehele volume. Bij het berekenen cel trekkrachten worden beads meest nabij het gel oppervlak (cel-substraat interface) gecontroleerd. De verplaatsingen van deze kralen worden geacht plaats te hebben op de celkweek oppervlak voor eenvoud de kracht BEREKEn. De plaats van de korrels in de diepte van de gel wordt genegeerd. In een elastisch medium (zoals PA gel), een korrel dichter bij een bijzondere krachtuitoefening meer dan een kraal die verder van het te verplaatsen. Aldus behandelen van de verplaatsing van een punt (op de korrel locatie) distaal van het oppervlak dat aan het oppervlak leidt tot een onderschatting van cellulaire aandrijvingen. De mate van fouten afhankelijk van de afstand van de hiel van het oppervlak. De fout kan niet worden bepaald zonder kennis van de locatie van de kraal.
De behoefte aan een eenvoudige methode om kralen beperken vlakbij de celkweek oppervlak heeft gericht een aantal technieken. Een manier is om de dichtheid van de korrels verhogen de gehele gel zodat er voldoende kralen in de top focal plane beweging meten vlakbij het oppervlak. Een andere techniek betreft de bouw van een confocale beeldvorming kamer voor live cell imaging zodanig dat het licht vanalleen de kralen in de bovenste meest focal plane wordt verzameld 4. Een andere werkwijze omvat bedekkend een uiterst dunne laag PA gel die kralen bevatten bovenop een reeds gepolymeriseerde gel zonder kralen 5. Een nadeel van elk van deze technieken is dat de precieze locatie van de korrels in de gel niet bekend. Dit introduceert fout in de berekening van de verplaatsing gebied van de kralen, en dus de berekening van cel krachten. Een andere techniek omvat conjugatie van kralen om het bovenvlak van een reeds gepolymeriseerd PA onder toepassing Sulfo-SANPAH 6. Deze techniek zorgt de kralen zijn inderdaad alleen op de bovenkant van de PA gel, maar de mate waarin ze zijn ingebed in de diepte van de gel is onbekend. Dit kan mogelijk zorgen voor een lokale topografie voor de cellen, die het gedrag van cellen kunnen veranderen, zoals eerder werk heeft gesuggereerd dat cellen kracht enkele microns weg 7 kan voelen. Onlangs, een techniek voor patroonvorming PA gels met 1 urn diameter fluorescent fibronectine dot markers in een geregulariseerd scala opgericht 8. In dit geval wordt de diepte van de fluorescente merkers bekend, en is in wezen nul, zoals de fibronectine patroon indirect gedrukt op het gel oppervlak. Echter, deze methode geen continue omgeving waarop cellen kunnen hechten, zoals de ECM eiwit beperkt tot 1 urn diameter dots. Een methode voor het volledig integreren tracker kralen binnen PA gels en beperken ze naar een bekende locatie zeer dicht bij het oppervlak moet nog worden vastgesteld.
Hier ontwikkelen we een techniek om sub-micrometer tot micrometer diameter fluorescerende kralen te beperken tot een focal plane vlakbij de celkweek oppervlak binnen PA gel. Een gel wordt gewoonlijk uitgehard door daartussen gepolymeriseerde vloeibare geloplossing tussen twee glasplaten. Een van de platen wordt gefunctionaliseerd zodat de gel sterk opgevangen. De andere is ongefunctionaliseerde en wordt verwijderd nadat de gel kuren. We passen deze verwijderbaar glazen suce door het bekleden met een laag korrels. Bij daartussen de vloeistof gel tussen de gefunctionaliseerde en het glasoppervlak parels gecoate, de kralen overdracht aan de gel tijdens het uitharden. Dit beperkt de afstand van integratie de kralen "in de gel op 1,6 pm van het oppervlak. Glazen bodem Petrischalen worden gebruikt als het hechtende oppervlak waarop de gel wordt uitgehard. Om een platte top gel oppervlak tijdens de polymerisatie te vormen, is een ronde glazen afdekplaat slip gebruikt om sandwich de gel met de glazen bodem petrischaal. Vóór gel fabricage, wordt de bovenste glazen dekglas gecoat met poly-D-lysine (PDL), hetgeen een positieve oppervlaktelading. De PDL wordt afgeblazen met perslucht en een oplossing van korrels in water wordt afgezet op de dekglaasjes. We maken gebruik van gecarboxyleerde fluorescerende microbolletjes, die een negatieve lading te dragen, en de interactie met de positief geladen oppervlak gemaakt door behandeling met PDL. Na het blazen van de kraal oplossing van het dekglaasje met perslucht, een enkele laagbeads blijft elektrostatisch gekoppeld met de droge dekglas. De PDL coating heeft geen invloed op de kleverigheid van het glas om het gel oppervlak, zoals de objectglaasjes onbeschadigd en uit de PA gel volledig intact.
De glazen bodem Petrischalen hechtende gemaakt door behandeling met 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane en 0,5% glutaaraldehyde. PA gels gewenste starheid worden gemaakt door het mengen van geschikte concentraties bisacrylamide en acrylamide via een standaardprocedure 9. Een druppel van de gel oplossing gepipetteerd op de glazen bodem petrischaal. Het dekglaasje bevattende korrels met daartussen de gel met de petrischaal. Wanneer de gel wordt uitgehard, wordt de bovenste dekglas verwijderd waardoor de korrels ingebed in de PA gel binnen 1,6 pm van het oppervlak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fabriceren en functionaliseren PA gels van verschillende stijfheden met fluorescerende microbolletjes ingesloten bij celkweek oppervlak.
1 functionaliserend de Top Glass Cover Slips
- Schoon glazen dekglaasjes (# 1.0, 12 mm diam.) Met water en zeep, gevolgd door ethanol om vreemde stof te verwijderen.
- Plaats glazen dekglaasjes op een geraspte oppervlak (bijvoorbeeld pipetpunt houder), zodat zij niet aanraken tot gemak van interactie met de dekglaasjes vergemakkelijken.
- De producten van het gehele oppervlak van de dekglaasjes met poly-D-lysine (0,1 mg / ml) gedurende 1 uur (figuur 1A).
- Gedurende deze tijd is, een 1: 10.000 verdunning van de colloïdale oplossing van 0,1 urn diameter, fluorescerende microbolletjes met gedeïoniseerd (DI) water met een deeltjesdichtheid van ongeveer 1 microbolletjes per 20 urn 2 op het gel oppervlak te verkrijgen. Zie figuur 2 voor de resultaten van verschillende verdunningen. Dit dilution kan worden aangepast aan de behoefte van specifieke experimenten voldoen.
- Plaats de verdunde oplossing in een ultrasoon waterbad gedurende 30 minuten.
- Na 1 uur, gebruik een pincet om til elke dekglas en blaas droog met lucht. Zet de droge dekglaasjes om de geraspte oppervlak.
- Verwijder de verdunde colloïdale oplossing van het ultrasoon bad en pipet 150 ul op elk dekglas. Laat gedurende 10 minuten (Figuur 1B).
- Gebruik een pincet om til elke dekglas en blaas droog met lucht. Zet de droge dekglaasjes om de geraspte oppervlak en op te slaan in het donker totdat u ze gaat gebruiken.
2 Voorbereiding PA Gel Direct aan Glass Bottom Petrischalen
- Verwarm de kookplaat tot 100 ° C.
- Leg het gewenste aantal glazen bodem petrischalen (35 mm schotel met 14 mm micro-goed, # 1.0) op een vlakke ondergrond in een zuurkast.
- Bedek het glazen gedeelte van elke petrischaal micro-goed met 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane (3-APTES) gedurende 7 min voor activatie. Wees voorzichtig onbedoelde druipen van de 3-APTES aan het oppervlak van de kunststof in de petrischaal voorkomen degradatie van de polystyreen voorkomen.
- Na 7 minuten, vul de petrischaal met DI-water en gooi niet gevaarlijk afval afvoeren.
- Herhaal stap 2.4 3x voor elk gerecht, en dan schud de petrischaal om extra water te verwijderen. Plaats de petrischalen op de hete plaat tot het glas gedeelte droog is.
- Verwijder de petrischaaltjes van de hete plaat en terug te keren naar een vlak oppervlak in een zuurkast.
- In een zuurkast, maak een oplossing van 0,5% glutaaraldehyde en bedekken het glazen gedeelte van elke petrischaal en de oplossing gedurende 30 minuten. Wees voorzichtig onbedoelde druipen van de glutaraldehyde aan het oppervlak van de kunststof in de petrischaal voorkomen afbraak van het kunststof te vermijden.
- Na 30 min, vul de petrischaal met DI-water en gooi in afvalcontainer te spoelen en verwijder de glutaraldehyde.
- Herhaal stap 2.4 3x voor elk gerecht, en dan schud de petrischaal om extra water te verwijderen. Plaats de petrischalen op de hete plaat tot het glas gedeelte droog is.
- Voor het mengen van de componenten van de PA geloplossing, verplaatst het gefunctionaliseerde glaasjes in de zuurkast zodat zij gemakkelijk toegankelijk zijn, waardoor de snelle sandwichen van de gel met de glazen bodem petrischalen na mengen van de gel oplossing.
- In een 15 ml centrifugebuis, meng 40% bisacrylamide, 2% acrylamide en acrylzuur direct na elkaar in de in tabel 1 vermelde concentraties (naar gepubliceerde protocol 10) om de gewenste matrix elasticiteit te bereiken.
- Voeg 100 mM HEPES, 10% ammoniumpersulfaat en TEMED in tabel 1 vermelde hoeveelheden die overeenkomen met de gewenste matrix elasticiteit van de geloplossing voltooien.
- Onmiddellijk Pipetteer 15 ul geloplossing op het midden van de ruit gedeeltevan de petrischaaltjes.
- Onmiddellijk halen een gefunctionaliseerde glazen afdekplaat slip met een pincet.
- Flip de glazen afdekplaat slip boven zodanig dat de fluorescerende kralen zijn op de zijkant maken het contact met gel oplossing.
- Leg het dekglas voorzichtig bovenop de nu vloeistof PA gel zodanig dat de gefunctionaliseerde zijde in contact met de gel (figuur 1C). Opmerking: Voor het beste resultaat is een tweede persoon aanbevolen voor de rol van het toevoegen van het dekglas om de mogelijkheid van een gedeeltelijke polymerisatie vermijden tijdens pipetteren vloeistof PA gel oplossing op meerdere petrischaaltjes.
- Flip alle petrischalen naar helpen bij het vermijden van zwaartekracht op fluorescente nanodeeltjes polymeriseren in lagere niveaus van de PA gel.
- Wacht ten minste 35 minuten of totdat de voorraadoplossing van PA gel zichtbaar gepolymeriseerd in de centrifugebuis.
- Flip de petrischaaltjes terug over en vul ze met PBS om te helpen met het verwijderen van het dekglas.
- Zorgvuldig maken contact met het glazen gedeelte van de petrischaal en de omtrek van het dekglas, met een pincet aan de omtrek van het dekglas schrapen. Voeren verschillende cycli totdat het dekglas wordt verdreven. Verwijder het deksel slip en gooi op een juiste slijpsel afvalcontainer.
- Na het verwijderen van alle dekglaasjes, zal fluorescerende kralen hebben overgedragen aan de gel (figuur 1D). Bedek de PA gels volledig met PBS, plaats de petrischaal deksel op elk gerecht, en bewaar bij 4 ° C.
3 functionaliserend PA gel met Fibronectine
- Bereid de volgende voorgemengde bereid zoals vermeld in een vooraf vastgesteld protocol 11: Opnemen oplossing (137 mM NaCl, 5% (v / v) glycerol) en 2x conjugatie buffer (0,2 M 2-(N -morpholino) ethaansulfonzuur (MES), 10 % (v / v) glycerol, pH 4,5).
- Gebruik een vacuümpomp in een biologische kap om alle PBS van de glazen bodem gerechten met de PA gels verwijderen.
- Pipette genieten oplossing op elke gel zodanig dat de gel volledig is ondergedompeld. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur.
- Warm 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) en N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) op kamertemperatuur.
- Meng 10x oplossing van EDC (150 mM, 19 mg / ml in gedeïoniseerd water) en NHS (250 mM, 29 mg / ml in gedeïoniseerd water).
- Meng 1 deel 10x EDC, 1 deel 10x NHS, 3 delen DI water, en 5 delen 2x vervoeging buffer.
- Gebruik een vacuümpomp in een biologisch kap aan het weken oplossing te verwijderen. Zorg ervoor dat alle vloeistof wordt verwijderd uit de gel oppervlak.
- Voeg genoeg NHS / EDC oplossing om de gel oppervlak bedekken en vul de glazen bodem en van de petrischaal (150-250 pi). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min in het donker.
- Ontdooi fibronectine bij kamertemperatuur. Eenmaal ontdooid, meng steriel DI water in een 50 ug / ml fibronectine oplossing.
- Gebruik een vacuümpomp in een biologische kap aan de NHS / EDC oplos verwijderentie. Zorg ervoor dat alle vloeistof wordt verwijderd uit de gel oppervlak.
- Voeg 150 ul van fibronectine oplossing voor elke gel. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 35 min om voor hechting van fibronectine.
- Na 35 min, voeg PBS aan elke petrischaal en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken.
4 trekkracht Experimenten
- Warm cell media, PBS en trypsine tot 37 ° C in een waterbad.
- Spoel gels 5x met steriel PBS, opzuigen van de PBS in tussen spoelingen en laat afgedekt in de kap.
- Voeg 1 ml trypsine per 25 cm 2 kolf die cellen. Na cellen worden opgeheven van fles, verdun de trypsine met mobiele media en tel de cellen. Op basis van gel oppervlak Bepaal het aantal cellen vereist per gel voor een uiteindelijke cel zaaidichtheid van 3000 cellen / cm 2. Verdunnen of concentreren suspensie zodanig dat 150 ul van de cel-media mengsel bevat dit aantal cellen. Aliquot 150 pi cel suspension op elke gel.
- Plaats de platen met cellen in een incubator gedurende 30 minuten. Dan voorzichtig de petrischalen verwijderd en vul de rest van de petrischaal met media (ongeveer 2 ml) zodanig dat het oppervlak van de schaal geheel wordt ondergedompeld.
- Plaats de petrischalen terug in de couveuse tot het beeld acquisitie.
- Bereid de microscoop en data-acquisitie systeem voor beeldvorming: steek de 40x water immersie objectief, steek de Differentieel Interferentie Contrast (DIC) prisma, selecteer de mCherry of gelijkwaardig fluorescerende filter, en zet de klimaatkamer.
- Na bereiding voor beeldvorming, verwijdert u een petrischaal uit de incubator en leg het voorzichtig op de microscoop podium. Verwijder de petrischaal deksel voor DIC imaging.
- Zoek een enkele cel en een stilstaand beeld van de cel in DIC vangen.
- Zonder het verplaatsen van de microscoop podium, schakelt de weergave modus te fluorescentie. Focus op de fluorescerende microsferen en record een afbeelding van de microsferen.
- Verwijder voorzichtig cel media uit de petrischaal met een pipet en voeg 0,05% trypsine-EDTA.
- Beeld de microbolletjes onder de cel nadat de cellen losgemaakt.
- Gebruik stromingsvisualisatie (PIV) analyse ImageJ 12 de verplaatsing veld berekenen door cellulaire krachten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Confocale beeldvorming werd gebruikt om te bepalen dat de kralen inderdaad onder het gel oppervlak en de precieze locatie te kwantificeren in de gel diepte. Fluorescent kralen van een andere golflengte dan die in de gel werden bezinken op het oppervlak, en de afstand tussen de ingebedde fluorescente nanodeeltjes en die op het oppervlak werd berekend volgens een zwaartepunt identificatiealgoritme. De locatie van de kraal over het gel oppervlak dient als referentie voor het bovenoppervlak van de gel-waar de cellen toepassen werking na hechting aan het oppervlak. Een schema van beide scenario overwogen (groene kralen in de gel met rode parels op het oppervlak, en vice versa) wordt getoond in figuur 3. Het algoritme interpoleert de z-hoogte van het driedimensionale zwaartepunt location. We herhaalden dit proces drie stijfheid gels (1, 10, en 40 kPa) en twee grootte (diameter) fluorescente korrels (0,1 urn en 1 urn rood geel-groen). De afstandtussen een korrel in de gel en zijn naaste buur van een andere golflengte werd bepaald op basis van de driedimensionale zwaartepunt. Figuur 4 toont de ruimtelijke verdeling van de kralen (op bovenoppervlak en ingesloten) en de geprojecteerde weergave op het YZ-vlak. De laatste geeft de diepte van de korrels van het oppervlak van de gel.
De gemiddelde diepte van 0,1 urn korrels 619 nm, 467 nm, 278 nm voor PA gels stijfheid 1, 10 en 40 kPa respectievelijk (figuur 5A). De overeenkomstige diepte van 1 urn diameter kralen -20 nm in 40 kPa gels, 12 nm in 10 kPa gels en 1.255 nm in 1 kPa gels (figuur 5B). Confocale beeldvorming werd ook uitgevoerd op gels met kralen verspreid over de gel zo is van oudsher gebruikt voor PA gels bedoeld voor trekkracht microscopie studies. De diepte kralen gedispergeerd door de PA gel werd gemeten met hetzelfde algoritme hiervoor beschreven en vergeleken met de depths met de techniek die we hier voor te stellen. Figuur 6 illustreert de variabiliteit van pareldispersie binnen de diepte van een PA gel volgens traditionele fabricagemethoden.
Fibroblasten hechten aan de PA gel oppervlak wanneer gefunctionaliseerde met fibronectine. De verplaatsing veld voor een fibroblast cellen en de bijbehorende fluorescerende kralen laag zijn weergegeven in figuur 7. Beads in de buurt van de rand van het beeld lijken enigszins onscherp. Dit is niet een mechanisch defect van de zijde van de gel, de glazen volledig intact blijft na verwijdering van de gel. Integendeel, het is het resultaat van een optisch effect door het water immersie objectief gebruikt in dit experiment. Na de toevoeging van trypsine aan het medium, wordt de cel vrijkomt uit het oppervlak, waardoor het rendement van de vervormde PA gel oppervlak in zijn oorspronkelijke staat. A cross-correlatie algoritme werd gebruikt om de vervorming veld op basis kraal verplaatsingen 10 berekenen. Hetverschuivingskaartfilter illustreert een dominant polarisatie van de cel trekkrachten in de y-richting.
Figuur 1 Illustratie functionaliseringsgraad proces voor top glazen dekglaasjes met PDL en fluorescerende kralen. (A) Glas dekglaasjes (blauw) worden geïncubeerd met 0,1 mg / ml PDL (oranje) voor 1 uur. Samengeperste lucht wordt blazen dekglaasjes droog en verwijder de PDL. (B) dekglaasjes geïncubeerd met een oplossing van 100 nm diameter fluorescerende kralen 5-10 min en vervolgens verwijderd door perslucht. Een laag van korrels blijft elektrostatisch gekoppeld met het dekglaasje. (C) dekglaasjes gefunctionaliseerd met kralen worden gebruikt sandwich PA gel met een geactiveerd glasoppervlak. (D) Na verwijdering van het bovenste dekglas volgende PA gel polymerization, de kralen zijn gelegen binnen en zeer dicht bij het oppervlak van de gel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 PA Gel Surface bevattende 0,1 urn diameter Fluorescent Beads. Vóór de PDL-behandelde top dekglaasje met parels bekleden werd de oplossing verdund bead (A) 10.000 maal (3,64 x 10 8 kralen / ml) en (B) 20.000 maal (1,82 x 10 8 kralen / ml). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
![Figuur 3]("/files/ftp_upload/51873/51873fig3highres.jpg")
Figuur 3 Cel-substraat interface met kralen gelokaliseerd nabij het oppervlak van de gel. Een schema van twee scenario's waarin bead locatie binnen een PA gel werd gekwantificeerd met behulp van confocale microscopie en centroide identificatiealgoritme. Het eerste scenario is getoond in (A) Rood 100 kralen nm diameter in de gel en groene 1 urn diameter parels op het oppervlak, en de tweede (B) Green 1 urn diameter parels binnen de gel rood 100 nm diameter Kralen het oppervlak. (C) Een cartoon illustratie van een cel (geel) gehandeld op een gel (blauw) met rode kralen gelocaliseerd in de gel in de buurt van het oppervlak en een groene kraal zit op het oppervlak. Klik hier om een grotere versie te bekijken dit cijfer.
Figuur 4 Confocale slice (XY, midden) en bijbehorende YZ (links) projectie aanzichten van een gel met rode 0,1 urn kralen ingebed in de gel en 1 urn kralen op het oppervlak. De eenheden voor alle assen in nanometers. Incidentele gevallen van rode kralen boven of in hetzelfde vlak als groene parels wordt toegeschreven aan een kleine overlapping in de fluorescentie-emissie spectra voor rood (mCherry) en groen (GFP). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5 Histogrammen van de diepte van korrels beperkt nabij het bovenoppervlak van PA gel. Stijfheden 1 kPa, 10 kPa, en 40kPa worden voorgesteld door blauw, rood en zwart respectievelijk. Een Gaussian curve fit elke gegevensreeks en de x-waarde die overeenkomt met de amplitude wordt geïnterpreteerd als de gemiddelde diepte van kralen. Twee scenario's werden getest:. (A) 0,1 micrometer parels binnen de gel met 1 micrometer kralen op het oppervlak, en (B) 1 micrometer parels binnen de gel met 0,1 micrometer kralen op het oppervlak Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.
Figuur 6 Histogrammen van de diepte van parels willekeurig ingebedde gehele PA gel een traditionele fabricagemethode (zwart) en kralen gelokaliseerd nabij de bovenste laag van PA onder toepassing van deze techniek (rood) voor PA gels stijfheid A) 1 kPa, B) 10 kPa,en C) 40 kPa. Inzet toont de diepte van de kralen in beide soorten gel binnen de bovenste meest 10 micrometer van de gel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7 Verplaatsing veld door cel tractie. (A) fase contrast beeld van een fibroblast op 10 kPa gel. (B) Verplaatsing veld gegenereerd door tractie gegenereerd door de fibroblast. (C) Fluorescentie beeld van 0,1 micrometer diameter parels onder een cel voorafgaand aan behandeling met trypsine kleur balk geeft kraal verplaatsing in nanometers.. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8 illustratie gemiddelde locatie van parels binnen de gel ten opzichte van een andere maat / golflengte kraal zitten op het gel oppervlak. De stijfheid van PA gel afneemt van links naar rechts (40 kPa, 10 kPa, 1 kPa). (A) Rode 0,1 micrometer kralen diameter in de gel en groene 1 micrometer diameter kralen op het oppervlak. (B) Groen 1 micrometer diameter parels binnen de gel en rode 0,1 micrometer diameter kralen op het oppervlak. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken .
Figuur 9 Distribution theoretische waarden τ / μ gebaseerd op verschillende dieptes bead. Beads 0,1 urn in diameter werden ofwel uniform gedispergeerd of gelokaliseerd nabij het oppervlak (A) 1 kPa gels, (B) 10 kPa gels, en (C) 40 kPa gels . De gouden pijl geeft de waarde van τ / μ voor de z = 0 geval, waarin kralen zijn op de gel oppervlak. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| E (kPa) | 40% acrylamide (pl) | BIS (concentratie) | 2% BIS (pl) | 100 mM HEPES (pl) | 0,1 | 625 | 0.00009 | 22.5 | 4225 |
| 0.25 | 625 | 0,0001 | 25 | 4222,5 | |||||
| 0.5 | 625 | 0.00011 | 27.5 | 4220 | |||||
| 0.75 | > 625 | 0.0002 | 50 | 4197,5 | |||||
| 1 | 625 | 0.0003 | 75 | 4172,5 | |||||
| 1.5 | 625 | 0,0004 | 100 | 4147,5 | |||||
| 2 | 625 | 0.0005 | 125 | 115px; "> 4122,5||||||
| 2,5 | 625 | 0.0006 | 150 | 4097,5 | |||||
| 3 | 625 | 0.0008 | 200 | 4047,5 | |||||
| 3,5 | 625 | 0,0009 | 225 | 4022,5 | |||||
| 4 | 0.001 | 250 | 3997,5 | ||||||
| 4,5 | 625 | 0,0012 | 300 | 3947,5 | |||||
| 5 | 625 | 0,0014 | 350 | 3897,5 | |||||
| 5.5 | 625 | 0,0016 | 400 | ||||||
| 6 | 625 | 0.0018 | 450 | 3797,5 | |||||
| 6.5 | 625 | 0.002 | 500 | 3747,5 | |||||
| 7 | 625 | 0,0022 | 550 | 3697,5 | |||||
| 7.5 < / Td> | 625 | 0,0024 | 600 | 3647,5 | |||||
| 8 | 1000 | 0.001 | 250 | 3622,5 | |||||
| 10 | 1000 | 0,0013 | 325 | 3547,5 | |||||
| 15 | 1000 | 0.002 | 1px; "> 5003372,5 | ||||||
| 20 | 1000 | 0,0027 | 675 | 3197,5 | |||||
| 30 | 1000 | 0,0037 | 925 | 2947,5 | |||||
| 40 | 1000 | 0,0048 | 1200 | 2672,5 |
Tabel1 PA Gel chemische concentraties gebaseerd op modulus. Een gewenst PA gel elastische modulus, de vermelde concentraties acrylamide, bisacrylamide en HEPES buffer worden aangevuld met 5 gl acrylzuur, 25 gl 10% ammoniumpersulfaat (APS) en 2,5 ul TEMED.
| z (pm) | u x ((τ / μ) micrometer) |
| 0 | 0.750 |
| 0.394 | |
| 1 | 0.237 |
| 1.5 | 0.164 |
| 2 | 0.124 |
| 2,5 | 0.100 |
| 3 | 0.083 |
| 3,5 | 0.071 |
| 4 | 0.062 |
| 4,5 | 0.056 |
| 0.050 |
Tabel 2 verplaatsingen als functie van τ / μ gevonden volgens diepte, z, kralen uit het gel oppervlak op basis Boussinesq theorie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij gebruik van deze techniek, is het essentieel dat de kraal oplossing goed verdund en de korrels worden gekozen gebaseerd op de gewenste diameter, PA gel substraat stijfheid, en de omvang omvang van de verschijnselen die is onderzocht in de gewenste experiment.
Voorzichtigheid is geboden bij het verdunnen van de kraal oplossing voorafgaand aan funktionaliseren top dekglaasjes. De afstand tussen parels op het gel oppervlak kan worden veranderd door het veranderen van de verdunningsfactor van de colloïde oplossing. Verdunnen van de oplossing te veel zal het aantal korrels die koppelen aan de dekglas verminderen en het aantal kralen in de gel te verminderen. Verdunnen van de oplossing te weinig kan een te hoge densiteit van kralen in de gel zodanig dat zij in contact en kan niet worden onderscheiden van elkaar verkregen. Hoewel het vaak onmogelijk om de aanwezigheid van nanodeeltjes aggregatie volledig te vermijden, de toepassing van ultrasone golven om de verdunde oplossing effectief minimaliseert nanoparticle aggregatie. Wij hebben gevonden dat een 10.000-voudige verdunning van de colloïde-oplossing gebruikt in dit protocol wordt een kraal concentratie van 3,64 x 10 8 kralen / ml en levert een gewenste deeltjesdichtheid van 0,05 kralen / um 2 0,1 urn diameter kralen. Een 1: 20.000 verdunning (1,82 x 10 8 kralen / ml) levert een gemiddelde van 52 pm2 per deeltje Figuur 2 toont beelden van het oppervlak van gels met verschillende verdunningen.. Opgemerkt zij dat er variatie in het aantal korrels die over aan de gel. Dit komt door de variabiliteit geassocieerd met het verwijderen van de kraal oplossing van het dekglaasje met perslucht tijdens functionalisering. In het algemeen hebben wij gevonden dat het verhogen van de verdunningsfactor met ten minste een factor twee vaste resulteert in ten minste een tweevoudige verhoging van de oppervlakte per bead.
Het is ook van cruciaal belang voor een kraal grootte (diameter) die zal resulteren in een volledige onderdompeling van t kiezenhij kraal in de gel na polymerisatie PA. Gel stijfheid invloed op de locatie van kralen als getoond in figuur 5A. Voor 0,1 urn diameter kralen, de kraal diepte toeneemt met afnemende stijfheid. Dit kan een gevolg van de omgekeerde relatie tussen poriegrootte en PA gel stijf 13 zijn. Voor alle drie de stijfheid gels getest, worden de korrels steeds gelokaliseerd in de gel, en binnen 1 urn van het gel oppervlak zoals getoond in figuur 8A. De gemiddelde locatie van 1 urn kralen in de gel varieert ook met stijfheid. Ze zijn ingebed dieper (ongeveer 1,25 pm) in de 1 kPa gels. Voor de 10 en 40 kPa gels, de locatie van de top van 1 urn diameter kralen varieert van ca. 0,5 pm boven 0,5 urn onder de gel (figuur 5) oppervlak, waardoor de korrels soms steken door de bovenkant van de gel (figuur 8B). Dit is nadelig omdat het introduceert topography voor de cellen en topografie bekend beïnvloeden cel-substraat interacties 14. Derhalve moet bewust kiezen parels voor deze techniek bij het bereiden van gels specifieke stijfheid zijn. Van de twee korrelgroottes toegepast om deze werkwijze te karakteriseren, 0,1 urn diameter blijkt de optimale grootte. Andere korrelgrootten kunnen worden gebruikt met deze techniek, maar moet worden gekalibreerd met behulp van confocale microscopie zoals hier beschreven, de precieze diepte waarop de korrels worden gelokaliseerd in het gel polymerisatie begrijpen.
Deze techniek verbetert de ruimtelijke resolutie van kralen in PA gel door het aantal onderscheidbare deeltjes in het gezichtsveld. Lokaliseren de korrels een laag nabij de top van de gel geen significante invloed op de samenstelling stijfheid van de gel. Isostress samengestelde theorie wordt gebruikt voor het berekenen van de samengestelde elastische modulus, E c, van slechts de 1 urn dikke laag gel die beads als
waarbij E f de elastische modulus van de polystyreen korrels (3 GPa) E m is de elasticiteitsmodulus van de gelmatrix (10 kPa) en v f en v m zijn de volumegehalten van de kralen en gelmatrix, respectievelijk. Omdat de korrels omvatten slechts 0,03% van het volume, E c = 10,0025 kPa niet significant anders dan de elastische modulus van een isotrope gel stijfheid 10 kPa. Een gevestigde werkwijze voor het vervaardigen PA gels vermindert de polymerisatietijd 30 seconden, waardoor het effect van de zwaartekracht op de verdeling van de kralen minimaliseren tijdens polymerisatie 15. De werkwijze berust op de langste (~ 30 min) polymerisatietijd voor de kralen polymeriseren in de gelzodat zij de gel oppervlak uitsteken. Omdat het lokaliseren van de kralen aan een enkele laag niet significant van invloed op de samengestelde gel stijfheid, en hoe langer polymerisatie tijd helpt bij de overdracht van de kralen in de gel matrix, hebben we geen enkele maatregel om de polymerisatie te verminderen in onze techniek op te nemen.
Onze techniek laat zien hoe de kralen lokaliseren op een bekende diepte binnen PA gel, waarin de meting substraat vervorming en dus de berekening van cel trekkrachten verbetert. Een theoretische benadering van de cellulaire trekkrachten kwantificeren eerder gemeld 16,17. Deze benadering is de gel substraat als een semi-oneindige vaste elastische half space. De Boussinesq oplossing wordt gebruikt om de inverse probleem berekenen trekkrachten van een verplaatsing veld lossen. We gebruiken een vereenvoudigde versie van de Boussinesq integraal de fout in verplaatsingsmeting kwantificeren vanwege beads distaal van de gel sppervlakte 18. De vergelijking voor de verplaatsing in een bepaalde richting gebaseerd op een toegepaste schuifspanning τ gedurende een bepaalde straal R wordt gegeven door
where u x de verplaatsing in de x richting, μ is de afschuifmodulus en z de diepte van de korrels van het gel oppervlak. Voor verschillende locaties van lasnaden over de diepte van de gel, worden overeenkomstige verplaatsingen weergegeven in tabel 2.
Bij het hier getoonde geval, wordt de radius geschat op gemiddeld focale adhesie grootte van 1 urn. Als de kralen worden verondersteld te worden in hetzelfde vlak als de cellen (z = 0), wordt de verplaatsing gegeven met 0,75 τ / μ. Als de kralen zijn slechts 1 micrometer onder de gel oppervlak, wordt de verplaatsing gegeven door 0,24 τ / μ. Dezeis groter dan een drievoudige verlaging van verplaatsing van een kraal coplanair met het oppervlak van een locatie 1 urn hieronder. Dit introduceert fout in de berekening van de oppervlakte trekkrachten op basis van de beweging van ingebedde korrels waarvan de precieze locaties binnen de gel onbekend. De variatie in tractie gedefinieerd τ / μ, als functie van de diepte van de kralen in de gel voor zowel de voorgestelde traditionele fabricagemethoden significant. Figuur 9 toont de verdeling van krachten (door de verhouding τ / μ) gebaseerd Boussinesq theorie die voortvloeien uit berekening gebruik de verdeling van de kraal diepten, z in het optische scherptediepte wanneer korrels gelijkmatig verdeeld in de gel en gelokaliseerd nabij het oppervlak. De meest nauwkeurige meting van cel werking zouden voortvloeien kralen waren in hetzelfde vlak als de cellen, waarin z = 0 en τ / μ = 0,0133. In vergelijking met deze zaak, τ / μ stijgt met 118%, 80% en 50% voor 1 kPa, 10 kPa en 40 kPa gels respectievelijk als korrels worden gelokaliseerd nabij het oppervlak met de techniek die we voorstellen. Wanneer korrels gelijkmatig zijn verdeeld over de gel diepte, τ / μ verhoogt nog 60%, 80% en 150% boven de verhoging geïnduceerd door lokaliseren kralen nabij het oppervlak, voor 1 kPa, 10 kPa en 40 kPa gels, respectievelijk. Dit betekent een totaal van bijna 200% correct tractie berekeningen wanneer de kralen zijn verdeeld over de gel diepte. Aldus lokaliseren van de kralen op een bekende diepte in de gel verbetert de nauwkeurigheid in verplaatsingsmetingen en mobiele trekkrachten.
De hier beschreven techniek presenteert een nieuwe manier om PA gel substraten bereiden trekkracht microscopie toepassingen zodanig dat de korrels zijn gelokaliseerd nabij het gel oppervlak. Beperken de kralen aan een bekende diepte in PA gel geeft nieuwe informatie over de daadwerkelijke verplaatsing van kralen op cel kracht applicatie, het creëren amerts nauwkeurig beeld van hoe de cellen vervormen hun onderliggende substraat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag het Interdisciplinair Innovation Initiative Program, Universiteit van Illinois te erkennen, verlenen 12035. SK werd gefinancierd op UIUC van National Science Foundation (NSF) Subsidie 0.965.918 IGERT: Het trainen van de volgende generatie van onderzoekers in Cellulaire en Moleculaire Mechanica en bionanotechnologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 70% Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 111-30-8 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| 40% Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| 2% Bisacrylamide | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| 0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry) | Invitrogen | F8801 | |
| Fibronectin, Human, 1 mg | BD Biosciences | 354008 | |
| Ammonium persulfate | Bio-RAD | 161-0700 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-RAD | 161-0801 | |
| Poly-D-lysine | Millipore | A-003-E | |
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
| N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25300-054 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Acrylic acid | Sigma-Aldrich | 147230 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Materials | |||
| 35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass | In Vitro Scientific | D35-14-1-N | |
| Glass cover slips, 12 mm diam. | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
References
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).
- Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction. JoVE. , http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=2173 (2010).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses. Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
- Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-β responsiveness. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).
- Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic,, Smith, M. L. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biol. , Chapter 10, Unit 1 16 (2010).
- Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide. Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).
- Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Théry, M. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nature Materials. 11, 642-649 (2012).
- Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response. Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).
- Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinković, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology. PLoS ONE. 6 (5), e19929 (2011).
- Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).
- Tolić-Nørrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).
- Atanackovic, T., Guran, A. Theory of Elasticity for Scientists and Engineers. , Maple-Vail Book Manufacturing Group. York, PA. (2000).
