En ny metode for lokalisering Reporter fluoriserende perler Nær Cell Culture Surface for trekkraft Mikros

Summary

Tradisjonelle teknikker for å fabrikkere polyakrylamid (PA) geler inneholdende fluorescerende prober innebære sandwiching en gel mellom en vedheftende overflate, og en glass-slide. Her viser vi at belegg dette lysbildet med poly-D-lysin (PDL) og fluorescerende prober lokaliserer sondene til innenfor 1,6 mikrometer fra gelen overflaten.

Abstract

PA geler har lenge vært brukt som en plattform for å studere celletrekkrefter pga lett fabrikasjon og evnen til å stille sine elastiske egenskaper. Når substratet er belagt med et ekstracellulært matriksprotein, celler holder seg til gelen og anvende krefter, noe som fører til at gelen deformeres. Den deformasjon avhenger av celle trekkraft og de elastiske egenskapene til gelen. Hvis deformasjonen feltet på overflaten er kjent, kan overflate trekkraft bli beregnet ved hjelp av elastisitetsteori. Gel deformasjon blir vanligvis målt ved å inkludere fluorescerende markør perler jevnt inn i gelen. Sondene fortrenge som gel deformeres. Probene i nærheten av overflaten av gelen blir sporet. De forskyvninger er rapportert av disse sonder er ansett som overflateforskyvninger. Deres dybder fra overflaten blir ignorert. Denne antakelsen introduserer feil i trekkraft evalueringer. For nøyaktig måling av cellekrefter, er det avgjørende for plasseringen av perlene for å være kjent. Vi har utvikleten teknikk som benytter enkel kjemi å begrense fluorescerende markør perler, 0,1 og 1 mikrometer i diameter, i PA-geler, innen 1,6 mikrometer på overflaten. Vi frakk en dekkglass med poly-D-lysin (PDL) og fluoriserende perler. PA gel-løsning blir deretter klemt mellom dekkglass og et vedheftende overflate. De fluorescerende perler overføring til gel-løsning under herding. Etter polymeriseringen, inneholder PA gel fluorescerende perler på et plan i nærheten av geloverflaten.

Introduction

Den mekaniske interaksjonen mellom en levende celle med sin lokale miljøet har ofte blitt studert ved hjelp av PA gels. Disse substrater er avhengig av en enkel, godt karakterisert protokoll etablert av Dembo og Wang i 1997 ^1. En av de viktigste fordelene med disse substrater, er at deres stivhet kan bli innstilt ved å endre konsentrasjonen av bestemte komponenter i gelen løsning. Dette gir en ønskelig plattform for å studere cellenes interaksjon med miljøer av ulike stivheter. Når PA geler er belagt med ekstracellulær matrise (ECM) proteiner, celler holder seg til dem, å generere kraft. Som et resultat av cellekraft, deformerer den gel som et elastisk legeme. Denne deformasjon er avhengig av størrelsen av den kraft som utøves av cellene og de elastiske egenskapene til gelen. Ulike studier har ansatt PA gels å undersøke cellulære veigrep.

I en variant av PA gel fabrikasjon, er fluorescerende mikrosfærer (perler) innebygd throughout gelen å kvantifisere celle trekk kraften på gels av ulike stivheter ^to. Ved celle force program, perler fortrenge fra sin opprinnelige plassering etter gel deformasjon. Den deformasjon felt måles fra de enkelte perle forskyvninger. Denne deformasjon feltet blir utnyttet med elastisitetsteorien, og de elastiske egenskapene til gelen for å beregne de trekkrefter. Disse målingene gir innsikt i hvordan celler mekanisk sanse og samhandle med sine lokale mikromiljøet ^tre.

I mange hyppig benyttede PA-gel fabrikasjons protokoller, blir perlene blandes hele PA gel i sin væske, upolymerisert tilstand. Et fullt polymerisert PA gel inneholder fluoriserende perler i hele sitt volum. Ved beregning av celle veigrep, er perler fleste nærheten geloverflaten (celle-underlaget grensesnitt) overvåkes. De forskyvninger av disse perlene er antatt å forekomme på cellekulturoverflate for enkelhet i kraft calculation. Den faktiske plasseringen av perlene i dybde av gelen er sett bort fra. Imidlertid, i et elastisk medium (for eksempel PA-gel), en limstreng nærmere til et punkt over kraftpåførings vil bevege seg mer enn en limstreng som er lengre borte fra punktet. Således behandler forskyvningen av et punkt (ved vulsten plassering) distalt fra overflaten som det på overflaten resulterer i en undervurdering av cellulære tractions. Graden av feil avhenger av avstanden av vulsten fra flaten. Feilen kan ikke beregnes uten kjennskap til plassering av perlen.

Behovet for en enkel metode for å begrense perler meget nær den cellekulturoverflate er løst ved noen teknikker. En måte er å øke tettheten av perlene i hele gelen, slik at det finnes et tilstrekkelig antall perler i den øverste fokalplanet for å måle bevegelse meget nær overflaten. En annen teknikk innebærer å bygge en konfokal avbildningskammer for levende celle avbildning slik at lyset frabare perlene i det øverste fokalplan samles ^4. En annen metode involverer overlegging av et ekstremt tynt sjikt av PA-gel inneholdende perler på toppen av en allerede polymeriserte gel uten perler ^5. En ulempe ved hver av disse teknikkene er at den nøyaktige plassering av kulene i gelen ikke er kjent. Dette introduserer feil i beregningen av forskyvningsfeltet av kulene, og dermed beregningen av cellekrefter. En annen teknikk omfatter konjugering av perler til den øvre flate av et allerede polymerisert PA under anvendelse av Sulfo-SANPAH ^6. Denne teknikken sørger for perlene er faktisk bare på toppen av PA gel, men i hvilken grad de er innleiret i dybden av gelen er ukjent. Dette kan potensielt skape en lokal topografi for cellene, noe som kan endre celle atferd, som tidligere arbeid har foreslått at cellene kan forstand force flere mikrometer unna ^7. Nylig ble en teknikk for patterning PA geler med 1 mikrometer diameter fluorescent fibronectin punktmarkører i en ordnet rekke ble etablert ^åtte. I dette tilfellet er dybden av de fluorescerende markører er kjent, og er i det vesentlige lik null, som fibronektin mønsteret er trykt på indirekte geloverflaten. Men denne metoden ikke gir en kontinuerlig miljø på hvilke celler kan feste, som ECM protein er begrenset til 1 mikrometer diameter prikker. Har ennå etableres En fremgangsmåte for full integrering av tracker perler innen PA geler og avgrense dem til en kjent posisjon svært nær overflaten til.

Her utvikler vi en teknikk for å begrense sub-mikrometer til mikrometer diameter fluoriserende perler til et fokusplanet svært nær cellekultur overflaten innen PA gel. En gel blir typisk herdet ved sandwiching upolymerisert flytende gel-løsning mellom to glassplater. En av platene er funksjonalisert slik at gelen kleber sterkt til den. Den andre er unfunctionalized og fjernes etter gel botemidler. Vi modifisere denne flyttbare glass surface ved å belegge den med et lag av perler. Ved sandwiching flytende gel mellom funksjonalisert og vulsten belagt glassoverflate, den perler overføring til gel mens den herder. Dette begrenser avstanden av perlene 'integrering inn i gelen innen 1,6 mikrometer på overflaten. Glass-bunn petriskåler ble anvendt som den vedheftende flate der gelen er herdet. For å danne en flat toppoverflate gel under polymeriseringen, er en sirkulær glass dekkglass som brukes til sandwich-gelen med glass-bunn petriskål. Før gel fabrikasjon, er den øverste glass dekkglass belagt med poly-D-lysin (PDL), hvilket ga en positiv overflateladning. Den PDL blåses bort med trykkluft, og en løsning av perler i vann avsettes på dekkglass. Vi bruker karboksylerte fluorescerende microbeads, som bærer en negativ ladning, og samhandle med positivt ladet overflate skapt av behandling med PDL. Etter blåser perlen løsning av dekkglass med trykkluft, et enkelt lag avperler forblir elektro koblet til den tørre dekkglass. Den PDL belegget påvirker ikke klebrighet av glasset til gelen overflate, som glass-slides er uskadet, og fjernes fra PA gel helt intakt.

Glass-bunn petriskåler er gjort klebende ved behandling med 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane og 0,5% glutaraldehyd. PA gelene ønskede stivheter er laget ved å blande egnede konsentrasjoner av akrylamid, og akrylamid via en standard prosedyre ^9. En dråpe av gelen oppløsningen ble pipettert inn i glass-bunn petriskål. Glasset dekkglass inneholdende perlene blir brukt til sandwich-gelen med petriskål. Når gelen er herdet, er den øvre dekkglass fjernes etterlater kulene er innleiret i PA gel i løpet av 1,6 um fra overflaten.

Protocol

Fabrikere og funksjonalise PA geler av varierende stiffnesses med fluorescerende mikrokuler er innebygd i nærheten av cellekulturoverflaten.

1. funksjon Top Glass dekkglass

1. Rene glass dekkglass (# 1.0, 12 mm diam.) Med såpe og vann, etterfulgt av etanol for å fjerne overflødig støv.
2. Plasser glassdeksel glipper på en revet overflate (dvs. pipettespissen holder) slik at de ikke berører å lette enkel interaksjon med dekkglass.
3. Dekk hele overflaten av dekselet glir med poly-D-lysin (0,1 mg / ml) i 1 time (figur 1A).
4. I løpet av denne tid, utføre en 1: 10,000 fortynning av kolloid oppløsning av 0,1 mikrometer i diameter, til røde fluorescerende mikrosfærer med deionisert (DI) vann skaffe en partikkeltetthet på omtrent 1 mikrosfære per 20 mikrometer ² på geloverflaten. Se figur 2 for resultatene av forskjellige fortynninger. Dette dilution kan endres for å møte behovet for særskilte eksperimenter.
5. Plasser den fortynnede løsning i et ultrasonisk vannbad i 30 min.
6. Etter 1 time, bruker pinsett for å forsiktig løfte hver dekkglass og føn med luft. Returnere de tørre dekkglass til revet overflaten.
7. Fjern den fortynnede kolloid løsning fra ultralydbadet og pipette 150 mL på hver dekkglass. Permisjon for 10 min (figur 1B).
8. Bruk pinsett for å forsiktig løfte hver dekkglass og føn med luft. Returnere den tørre dekselet slips til revet overflate og oppbevares mørkt til den er klar til bruk.

2. Forbereder PA Gel Direkte på Glass Bottom petriskåler

1. Forvarm kokeplate til 100 ° C.
2. Legg ut ønsket antall glass bunn petriskåler (35 mm tallerken med 14 mm mikro-vel, # 1.0) på et flatt underlag i et avtrekksskap.
3. Dekker glassparti av hver petriskål mikro-brønn med 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane (3-APTES) i 7 min for kjemisk aktivering. Ta forsiktighet for å unngå utilsiktet drypping av 3-APTES til overflaten av plasten i petriskål for å unngå nedbrytning av polystyren.
4. Etter 7 min, fylle petriskål med DI vann og kast inn i avfallsbeholder.
5. Gjenta trinn 2.4 3x for hver rett, og deretter riste petriskål for å fjerne ekstra vann. Plasser petriskåler på den varme platen før glasset parti er tørr.
6. Fjern petriskåler fra den varme platen og gå tilbake til et flatt underlag i et avtrekksskap.
7. I avtrekksskap, få en oppløsning av 0,5% glutaraldehyd og dekke glassparti av hver petriskål godt med løsningen i 30 min. Ta forsiktighet for å unngå utilsiktet drypping av glutaraldehyd til overflaten av plasten i petriskål for å unngå nedbrytning av plasten.
8. Etter 30 min, fylle petriskål med DI vann og kast inn i avfallsbeholder for å skylle og fjerne glutaraldehyde.
9. Gjenta trinn 2.4 3x for hver rett, og deretter riste petriskål for å fjerne ekstra vann. Plasser petriskåler på den varme platen før glasset parti er tørr.
10. Før blanding av komponentene i PA gel-løsning, beveger de funksjonglassplater inn i avtrekksskap slik at de er lett tilgjengelige, slik at for den hurtig Sandwiching av gelen med glassbunn petriskåler etter blanding gelen løsning.
11. I et 15 ml sentrifugerør, bland 40% akrylamid, 2% akrylamid og akrylsyre i umiddelbar rekkefølge i de konsentrasjoner som er oppført i tabell 1 (tilpasset fra publisert protokoll ¹⁰⁾ for å oppnå den ønskede matriks elastisitet.
12. Tilsett 100 mM HEPES, 10% ammonium-persulfat og TEMED i mengder angitt i tabell 1 tilsvarer ønsket matrise elastisitet for å fullføre geloppløsning.
13. Umiddelbart pipettere 15 pl gel-løsning på midten av glassdelenav petriskåler.
14. Umiddelbart plukke opp en funksjon glassdekselstrimmel med pinsett.
    1. Flip glass dekkglass over slik at de fluorescerende kuler er på siden kommer i kontakt med gel-løsning.
    2. Lå dekkglass forsiktig på toppen av den nå-væske PA gel slik at den funksjonalisert side er i kontakt med gelen (figur 1C). Merk: For best resultat, er en annen person anbefales for rollen med å legge dekkglass for å unngå muligheten for delvis polymerisasjon mens pipettering flytende PA gel løsning på flere petriskåler.
15. Vend alle petriskåler enn å hjelpe til med å unngå gravitasjonseffekter på fluorescerende nanopartikler polymeriserende i lavere nivåer i PA gel.
16. Vent i minst 35 min eller inntil den stamløsning av PA gel har synlig polymerisert i sin sentrifugerør.
17. Vend petriskåler tilbake igjen og fylle dem med PBS for å bistå med å fjerne dekkglass.
18. Kontroller nøye kontakt med glasset parti av petriskålen, og omrisset av dekkglass, ved hjelp av pinsetter for å skrape omkretsen av dekkglass. Utføre flere sykluser før dekkglass er forskyves. Ta av dekkglass og kast på en skikkelig skarpe gjenstander avfallsbeholder.
19. Etter å ha fjernet alle dekkglass, vil fluoriserende perler har overført til gel (figur 1D). Dekk til PA gels helt med PBS, plasser petriskål lokket på hver tallerken, og oppbevar ved 4 ° C.

3. funksjon PA gel med Fibronectin

1. Forbered følgende forhåndsblandede løsninger som er beskrevet i en etablert protokoll ^11: Bløt-løsning (137 mM NaCl, 5% (v / v) glycerol) og 2x konjugering buffer (0,2 M 2 (N -morpholino) etansulfonsyre (MES), 10 % (v / v) glyserol, pH 4,5).
2. Bruk en vakuumpumpe i et biologisk hette for å fjerne all PBS fra glassbunn skåler inneholdende PA-geler.
3. Pipette suge løsningen på hver gel, slik at gelen er fullstendig neddykket. Inkuber ved romtemperatur i minst 1 time.
4. Varm 1-etyl-3-[3-dimetylamino-propyl] karbodiimid-hydroklorid (EDC) og N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) til romtemperatur.
5. Bland 10x oppløsninger av EDC (150 mM, 19 mg / ml i DI-vann) og NHS (250 mM, 29 mg / ml i DI-vann).
6. Bland en del 10x EDC, en del 10x NHS, 3 deler DI vann, og 5 deler 2x konjugering buffer.
7. Bruk en vakuumpumpe i et biologisk hette for å fjerne slikke-løsning. Sørge for at all væske er fjernet fra gelen overflate.
8. Tilsett nok NHS / EDC-løsning for å dekke gelen overflate og fyller glass-bunn brønn av petriskålen (150-250 pl). Inkuber ved romtemperatur i 30 min i mørket.
9. Tine fibronektin ved romtemperatur. Tint, bland sterilt DI-vann til å lage en 50 pg / ml fibronectin løsning.
10. Bruk en vakuumpumpe i et biologisk hette for å fjerne NHS / EDC Solusjon. Sørge for at all væske er fjernet fra gelen overflate.
11. Tilsett 150 ul av fibronektin-løsning til hver gel. Inkuber ved romtemperatur i 35 min for å tillate binding av fibronektin.
12. Etter 35 min, legg PBS til hver petriskål og oppbevar ved 4 ° C i opptil 2 uker.

4. Trekkraft Experiments

1. Varm cellemedier, PBS, og trypsin til 37 ° C i et vannbad.
2. Skyll gels 5x med sterilt PBS, aspirere PBS i mellom skyllinger, og la dekket i panseret.
3. Tilsett 1 ml trypsin pr 25 cm ² til kolbe inneholdende celler. Etter celler er løftet fra kolbe, fortynne trypsin med celle media og telle cellene. Basert på gel flateareal, bestemme antall celler som kreves per gel for en endelig celletetthet på seeding 3000 celler / cm ^2. Fortynn eller konsentrere suspensjonen slik at 150 ul av cellemedia blandingen inneholder dette antall celler. Delmengde 150 mL av cellearmerIon på hver gel.
4. Plasser Petri-skåler inneholdende celler i en inkubator i 30 min. Deretter forsiktig fjerne petriskåler og fylle den resterende petriskål med media (ca. 2 ml), slik at overflaten av skålen er fullstendig neddykket.
5. Plasser petriskåler tilbake i inkubatoren til bildet oppkjøpet.
6. Forbered mikroskopet og datainnsamling system for bildebehandling: Sett 40x vannimmersjonsobjektiv, setter Differential Interference Kontrast (DIC) prisme, velg mCherry eller tilsvarende fluorescerende filter, og slå på miljøkammeret.
7. Når forberedt for bildebehandling, fjerner du en petriskål fra inkubatoren og legg det forsiktig på mikroskop scenen. Fjern petriskål lokk til DIC avbildning.
8. Finn en enkelt celle og fange en enkelt stillbilde av cellen i DIC.
9. Uten å flytte mikroskopet scenen, bytter bildemodus for å fluorescens. Fokus på fluorescerende mikrosfærer og recORD et bilde av mikrokulene.
10. Fjern forsiktig cellemateriale fra petriskål med en pipette og tilsett 0,05% trypsin-EDTA.
11. Bilde mikrosfærene under cellen etter at cellene har løsrevet.
12. Bruk partikkel image velocimetry (PIV) analyse i ImageJ ¹² å beregne forskyvning feltet på grunn av mobilnettet styrker.

Representative Results

Konfokal avbildning ble brukt for å fastslå at perlene var faktisk under gel overflate og for å kvantifisere deres nøyaktige posisjon innenfor den gel dybde. Fluorescent perler av en annen bølgelengde enn de inne i gel ble tillatt å slå seg ned på overflaten, og avstanden mellom de innleirede fluorescerende nanopartikler og de på overflaten ble beregnet ved hjelp av en sentroide identifikasjonsalgoritme. Plasseringen av vulsten på gelen overflaten tjener som en referanse for den øvre overflate av gelen-der celler anvende kraft ved tilslutning til overflaten. En skjematisk av de to scenarier muligens (grønne kuler i gelen med røde perler på overflaten, og omvendt) er vist i figur 3.. Algoritmen interpolerer den z-høyde av de tre-dimensjonale sentroideplasseringen. Vi gjentok denne prosess tre stivhets geler (1, 10, og 40 kPa) og to størrelser (diameteren) fluorescerende kuler (0,1 mikrometer rød og 1 mikrometer gul-grønt). Avstandenmellom en perle inne i gelen og dens nærmeste nabo med en annen bølgelengde ble bestemt basert på tre-dimensjonale geometriske tyngdepunkt. Figur 4 viser den romlige fordelingen av perlene (på toppflaten og embedded) og den projiserte visningen på YZ-plan. Sistnevnte gir dypet av alle perlene fra overflaten av gelen.

Den gjennomsnittlige dybde på 0,1 mikrometer perler er 619 nm, 467 nm, 278 nm for PA gelene stivhet 1, 10 og 40 kPa, respektivt (figur 5A). De tilsvarende dybder for en mikrometer diameter perler er -20 nm i 40 kPa gels, 12 nm på 10 kPa gels, og 1255 nm i en kPa gels (Figur 5B). Konfokal bildebehandling ble også utført på geler med perler spredt over hele gel som har vært tradisjonelt brukt for PA gels beregnet for trekkraft mikroskopi studier. Dybden av perler dispergert gjennom hele gelen PA ble målt ved bruk av den samme algoritmen som tidligere er beskrevet, og er i forhold til depths ved hjelp av teknikken vi presenterer her. Figur 6 illustrerer variasjonen av vulsten dispersjon i dybden av en PA-gel ved hjelp av tradisjonelle fremstillingsmetoder.

Fibroblaster feste til PA gel overflaten når functionalized med fibronectin. Den forskyvningsfeltet for en fibroblast-celle og den tilsvarende fluoriserende perler sjikt er vist i figur 7. Beads nær periferien av bildet vises litt ute av fokus. Dette er ikke en mekanisk feil på en del av gelen, som glasset forblir intakt etter fjerning fra gelen. Snarere er det et resultat av en optisk effekt på grunn av den vannimmersjonsobjektiv brukt i dette eksperimentet. Ved tilsetning av trypsin til mediet, blir cellen frigjøres fra overflaten, noe som resulterer i retur av den deformerte PA gel overflaten til sin opprinnelige tilstand. En kryss-korrelasjonsalgoritme er anvendt for å beregne deformasjon feltet basert på bead forskyvninger ^10. Denforskyvning kart illustrerer en dominerende polarisering av cellen trekkrefter i y-retningen.

Figur 1. Illustrasjon av funksjon prosess for topp glassdeksel slips med PDL og fluoriserende perler. (A) Glass dekkglass (blå) inkuberes med 0,1 mg / ml PDL (oransje) for 1 hr. Komprimert luft blir brukt til å blåse lokket glir tørr og fjerne PDL (B). Glass dekkglass blir inkubert med en oppløsning av 100 nm diameter fluorescerende kuler i 5-10 min, og deretter fjernes ved å anvende komprimert luft. Ett lag av perler forblir elektrostatisk koblet til dekkglass. (C) dekkglass funksjonalisert med perler blir brukt til sandwich-PA gel med et aktivert glassoverflaten. (D) Ved fjerning av det øvre dekselet slip følgende PA gel polymerization, er perlene ligger innenfor og veldig nær overflaten av gelen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. PA Gel overflate som inneholder 0,1 mikrometer diameter Fluorescent perler. Før belegning av PDL-behandlede topp glassdekselstrimmel med perler, ble løsningen fortynnet vulsten (A) 10 000 ganger (3,64 x 10 ⁸ perler / ml) og (B) 20.000 ganger (1,82 x 10 ⁸ perler / ml). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Celle-substrat grensesnitt med perler lokalisert nær overflaten av gelen. Skjematisk to scenarier der vulsten plassering innen en gel PA ble kvantifisert ved hjelp av konfokal mikroskopi og en sentroide identifikasjonsalgoritme. Den første situasjon er vist i (A) Red 100 nm diameter perler inne i gelen og grønne 1 mikrometer diameter perler på overflaten, og den andre i (B) Grønne en mikrometer-diameter perler inne i gelen og rød 100 nm diameter perler på overflaten. (C) En tegneserie illustrasjon av en celle (gul) festet til en gel (blått) med røde perler lokalisert inne i gelen i nærheten av dets overflate, og en grønn vulsten sitter på dens overflate. Trykk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Enhetene for alle akser Figur 4. Confocal skive (XY, midten) og tilhørende YZ (venstre) projeksjon visninger av en gel med røde 0,1 mikrometer perler innebygd i gel og en mikrometer perler på overflaten. Er i nanometer. Sporadiske forekomster av røde perler over eller i samme plan som grønne perler skyldes noe overlapp i fluorescensemisjonen spektra for rød (mCherry) og grønn (GFP). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. histogrammer av dybden av perler innestengte nær toppoverflaten av PA gel. Stivheter 1 kPa, 10 kPa og 40kPa blir representert av blått, rødt og sort, respektivt. En gausskurve ble plass til hvert datasett og x-verdi tilsvarende sin amplitude tolkes som den gjennomsnittlige dybden av perler. To scenarier ble testet:. (A) 0,1 mikrometer perler inne i gel med en mikrometer perler på overflaten, og (B) 1 mikrometer perler inne i gel med 0,1 mikrometer perler på overflaten Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette figuren.

Figur 6. histogrammer av dybden av perler innebygd vilkårlig gjennom hele PA under anvendelse av en tradisjonell fremstillingsmetode (svart) og perler lokalisert i nærheten av det øverste laget av PA under anvendelse av denne teknikk (rød) for PA gelene stivhet A) 1 kPa, B) 10 kPa,og C) 40 kPa. Inset viser dybden av perlene i både gel typer innenfor den øvre mest 10 mikrometer av gel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7. Displacement feltet på grunn av celle trekkraft. (A) Fase kontrastbilde av en fibroblast på 10 kPa gel. (B) Fortrengning felt som genereres av trekkraft som genereres av fibroblast. Color bar indikerer perle forskyvning i nanometer. (C) Fluorescens bilde av 0,1 mikrometer diameter perler under en celle før trypsinering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8. Illustrasjon av gjennomsnittlig plasseringen av perler inne i gel i forhold til en annen størrelse / bølgelengde vulsten sitter på geloverflaten. Stivhet PA gel avtar fra venstre mot høyre (40 kPa, 10 kPa, 1 kPa.) (A) Red 0,1 mikrometer diameter perler inne i gel og grønne 1 mikrometer diameter perler på overflaten. (B) Grønn 1 mikrometer diameter perler inne i gel og røde 0,1 mikrometer diameter perler på overflaten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren .

Figur 9. Distribution av teoretiske verdier for τ / μ basert på forskjellige sveisestrengdybde. Beads 0,1 mikrometer i diameter ble enten jevnt dispergert eller lokalisert nær overflaten i (A) en gel kPa, (B) 10 kPa geler, og (C) 40 kPa geler . Gullet pilen indikerer verdien av τ / μ for z = 0 tilfellet, hvor perler er på geloverflaten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

115px; "> 4122,5 1px; "> 500

E (kPa)	40% Akrylamid (ul)	BIS (konsentrasjon)	2% BIS (il)	100 mM HEPES (il)	0.1	625	0,00009	22.5	4225
0,25	625	0.0001	25	4222,5
0.5	625	0,00011	27.5	4220
0.75	> 625	0,0002	50	4197,5
1	625	0,0003	75	4172,5
1.5	625	0,0004	100	4147,5
2	625	0.0005	125
2.5	625	0,0006	150	4097,5
3	625	0,0008	200	4047,5
3.5	625	0,0009	225	4022,5
4		0.001	250	3997,5
4,5	625	0,0012	300	3947,5
5	625	0,0014	350	3897,5
5.5	625	0,0016	400
6	625	0,0018	450	3797,5
6.5	625	0.002	500	3747,5
7	625	0,0022	550	3697,5
7.5 < / Td>	625	0.0024	600	3647,5
8	1000	0.001	250	3622,5
10	1000	0,0013	325	3547,5
15	1000	0.002	3372,5
20	1000	0,0027	675	3197,5
30	1000	0,0037	925	2947,5
40	1000	0,0048	1200	2672,5

Tabell1. PA Gel Kjemiske konsentrasjoner basert på Youngs modulus. For en ønsket PA gel elastisitetsmodul, bør de nevnte konsentrasjoner av akrylamid, bisakrylamid, og HEPES-buffer supplert med 5 ul akrylsyre, 25 mL 10% ammoniumpersulfat (APS), og 2,5 ul TEMED.

7PT "width =" 62 "> 5

z (mikrometer)	u x ((τ / μ) mikrometer)
0	0.750
	0.394
1	0.237
1.5	0.164
2	0,124
2.5	0.100
3	0.083
3.5	0.071
4	0.062
4,5	0.056
0.050

Tabell 2. Forskyvninger som en funksjon av τ / μ tilsvarende dybde, z, av perlene fra geloverflaten basert på Boussinesq teori.

Discussion

Ved bruk av denne teknikk, er det vesentlig at vulsten løsning er riktig fortynnet og perlene blir valgt på grunnlag av ønsket diameter, PA gel substrat stivhet, og størrelsen omfanget av de fenomener som er undersøkt i den ønskede eksperimentet.

Forsiktighet bør utvises ved fortynne perle løsning før funksjon topp glass dekkglass. Avstanden mellom perlene på gelen overflaten kan endres ved å endre fortynningsfaktoren av kolloid oppløsning. Fortynning av oppløsningen for mye vil redusere antallet av perler som par til dekkglass og til slutt redusere antall perler i gelen. Fortynning av oppløsningen for lite kan gi en for høy densitet av perler i gelen slik at de er i kontakt, og kan ikke skjelnes fra hverandre. Mens det ofte er umulig å fullstendig unngå nærvær av nanopartikkel aggregering, anvendelse av ultrasoniske bølger til den fortynnede oppløsningen effektivt minimaliserer nanoparticle aggregering. Vi har funnet at en 10.000 gangers fortynning av kolloid-løsning anvendt i denne protokollen gir en limstreng konsentrasjon på 3,64 x 10 ⁸ perler / ml, og gir en ønskelig partikkeltetthet på 0,05 mikrometer perler / ² til 0,1 pm diameter perler. A 1: 20,000 fortynning (1,82 x 10 ⁸ perler / ml) gir et gjennomsnitt på 52 mikrometer ² per partikkel Figur 2 viser bilder av overflaten av geler med forskjellige fortynninger.. Det bør bemerkes at det er variasjon i antall perler som overfører til gelen. Dette er på grunn av variasjonen i forbindelse med å fjerne vulsten løsning fra dekkglass med komprimert luft under funksjonalisering. Generelt, har vi funnet at økende fortynningsfaktoren med minst en faktor på to gjennomgående resulterer i i det minste en dobling i området per perle.

Det er også viktig å velge en kulestørrelse (diameter), som vil resultere i full neddykking av tHan perle inne i gel ved polymerisasjon PA. Gel stivhet påvirker plasseringen av perler, som vist i figur 5A. For 0,1 mikrometer diameter perler, øker perle dybden med avtagende stivhet. Dette kan være et resultat av det inverse forhold mellom porestørrelse og PA gel ¹³ stivhet. For alle de tre stivhets geler som ble testet, blir perlene gående lokalisert inne i gel, og i løpet av omkring 1 pm av gelen overflaten som vist i figur 8A. Den gjennomsnittlige plasseringen av en mikrometer-perler i gelen varierer også med stivhet. De er innleiret dypere (ca. 1,25 mm) inn i en kPa geler. For de 10 og 40 kPa geler, beliggenheten av toppen av en mikrometer diameter perler i området fra omtrent 0,5 mikrometer til 0,5 mikrometer ovenfor under gel (figur 5) overflate, hvilket betyr at perlene iblant stikker frem gjennom toppen av gelen (figur 8B). Dette er uheldig fordi den introduserer topogragrafi for cellene, og topografi er kjent for å påvirke ^{celle-substrat-14} interaksjoner. Således er det nødvendig å være oppmerksom på å velge kuler til denne teknikken ved fremstilling av geler av en bestemt stivhet. Av de to kulestørrelser som benyttes til å karakterisere denne metoden, 0,1 um diameter beviser den optimale størrelse. Andre perlestørrelser kan benyttes i denne teknikk, men bør kalibreres ved hjelp av konfokal mikroskopi som beskrives her, for å forstå den nøyaktige dybden til hvilken perlene er lokalisert under gel-polymerisasjon.

Denne teknikk gir bedre romlig oppløsning av perler i PA-gel ved å øke antallet av skjelnbare partikler innenfor synsfeltet. Lokalisering av perlene i et sjikt nær toppen av gelen som ikke signifikant påvirker det sammensatte stivheten av gelen. Isostress kompositt teori blir anvendt for å beregne den sammensatte elastisitetsmodul, E _c, av kun en mikrometer tykt lag av gel inneholdende beads som

hvor E _f er elastisitetsmodulen av de polystyrenkuler (3-GPA), er _m E elastisitetsmodulen til gelen matrisen (10 kPa), og v _f og v _m er volumandelene av perlene og gelmatriks, respektivt. Fordi perlene utgjør bare 0,03% av volumet, E _c = 10,0025 kPa er ikke signifikant forskjellig enn elastisitetsmodulen av en isotrop gel av stivhet 10 kPa. En etablert fremgangsmåte for fremstilling av PA geler reduserer polymerisasjons-tiden til 30 sek, og dermed minimere virkningen av tyngdekraften på fordelingen av perlene under polymeriseringen ^15. Vår fremgangsmåte er avhengig av den lengre (~ 30 min) polymerisasjon tid for perlene til å polymerisere inn i gelenslik at de ikke stikker geloverflaten. Fordi perlene til å lokalisere et enkelt lag som ikke signifikant påvirker det sammensatte gel stivhet, og jo lengre polymeriseringstid hjelpemidler i overføring av perler inn i gelmatriksen, har vi ikke innlemme ethvert tiltak for å redusere polymerisasjon tid i vårt teknikk.

Vår teknikk demonstrerer hvordan man skal lokalisere perlene til en kjent dybde inne PA gel, noe som forbedrer måling av substratet deformasjon, og dermed beregningen av cellen trekkrefter. En teoretisk tilnærming til å kvantifisere de cellulære trekkraft styrker har tidligere blitt rapportert ^16,17. Denne fremgangsmåten behandler gelen substratet som et semi-uendelig, fast stoff i elastisk halve mellomrom. Den Boussinesq løsning brukes til å løse det inverse problemet for beregning av trekkrefter fra en forskyvningsfeltet. Vi benytter en forenklet versjon av Boussinesq integral å kvantifisere feil i forskyvningsmåling på grunn av perler distale fra gelen surface ^18. Ligningen for forskyvning i en gitt retning basert på en påført skjærspenning, τ, over en gitt radius, R, er gitt av

hvor u _x er forskyvningen i X-retningen, er μ den skjærmodul, og z er dybden av perlene fra geloverflaten. For forskjellige steder av perlene i hele dybden av gelen, blir tilsvarende forskyvninger vist i tabell 2.

For den situasjon som er vist her, er radien beregnet til å være et gjennomsnitt fokal adhesjon størrelse på 1 mikrometer. Hvis kulene er antatt å være i samme plan som de celler (z = 0), blir forskyvningen gitt ved 0,75 τ / μ. Dersom perlene er bare 1 mikrometer under gel overflaten, er forskyvningen gitt ved 0,24 τ / μ. Detterepresenterer mer enn en tredelt reduksjon i forskyvning fra en limstreng i samme plan med overflaten til et sted under en mikrometer. Dette introduserer feil i beregningen av overflate trekkraft styrker basert på bevegelse av embedded perler som presise steder i gel er ukjent. Variasjonen i trekkraft definert ved τ / μ, som en funksjon av dybden av perlene i gelen for begge de foreslåtte og tradisjonelle fremstillingsmetoder er betydelig. Figur 9 viser fordelingen av krefter (gitt av forholdet τ / μ) basert på Boussinesq teori som resulterer fra beregninger utnytte fordeling av perle dybder, z, i den optiske dybdeskarphet når perlene er jevnt fordelt i gel og lokalisert nær overflaten. Den mest nøyaktige måling av cellekraft vil resultere dersom perlene var i samme plan som de celler, der z = 0 og τ / μ = 0,0133. Sammenlignet med dette tilfellet τ / μ øker med 118%, 80% og 50% etter 1 kPa, 10 kPa og 40 kPa geler, henholdsvis, når perlene er lokalisert nær overflaten ved hjelp av teknikken foreslår vi. Når perlene er jevnt fordelt i gel dybde, øker τ / μ ytterligere 60%, 80% og 150% utover økningen indusert av lokaliserende perler i nærheten av overflaten, for 1 kPa, 10 kPa og 40 kPa geler, respektivt. Dette representerer et totalt nesten 200% feil i traksjonsberegninger når perlene er fordelt over hele gelen dybde. Således, lokalisering perlene til en kjent dybde inne i gel forbedrer nøyaktigheten i forskyvningsmålinger og celletrekkrefter.

Den teknikk som er beskrevet her presenterer en ny måte til å forberede PA gel substrater for trekkraft mikros applikasjoner slik at perlene er lokalisert i nærheten av geloverflaten. Avgrense perlene til en kjent dybde innenfor PA gel gir ny informasjon om den faktiske forskyvning av perler ved cellekraftpåførings, skaper ammalm nøyaktig bilde av hvordan cellene deformeres deres underliggende substrat.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)	Sigma-Aldrich	281778
70% Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	111-30-8
1 M HEPES buffer solution	Sigma-Aldrich	83264
40% Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
2% Bisacrylamide	Sigma-Aldrich	M1533
0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry)	Invitrogen	F8801
Fibronectin, Human, 1 mg	BD Biosciences	354008
Ammonium persulfate	Bio-RAD	161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-RAD	161-0801
Poly-D-lysine	Millipore	A-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)	Thermo Scientific	22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)	Thermo Scientific	24500
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Life Technologies	25300-054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Acrylic acid	Sigma-Aldrich	147230
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass	In Vitro Scientific	D35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam.	Ted Pella, Inc.	26023