Un nuovo metodo per la localizzazione Reporter perline fluorescenti vicino alla superficie coltura cellulare per la trazione microscopia a forza

Summary

Le tecniche tradizionali per la realizzazione di poliacrilammide (PA) gel contenenti sonde fluorescenti comportano un gel a sandwich tra una superficie aderente e un vetrino. Qui, dimostriamo che il rivestimento questa diapositiva con poli-D-lisina (PDL) e sonde fluorescenti localizza le sonde entro 1,6 micron dalla superficie del gel.

Abstract

Gel PA sono stati a lungo utilizzati come piattaforma per studiare le forze di trazione delle cellule grazie alla facilità di fabbricazione e la possibilità di regolare le loro proprietà elastiche. Quando il substrato viene rivestito con una proteina della matrice extracellulare, le cellule aderiscono al gel e applicare forze, causando il gel di deformarsi. La deformazione dipende dalla trazione cellulare e le proprietà elastiche del gel. Se il campo di deformazione della superficie è noto, la trazione superficiale può essere calcolata utilizzando la teoria dell'elasticità. Gel deformazione viene comunemente misurata inserendo perline marcatori fluorescenti uniformemente nel gel. Le sonde spostano come il gel si deforma. Le sonde vicino alla superficie del gel sono tracciati. Gli spostamenti riportati da queste sonde sono considerati come spostamenti superficiali. Le loro profondità dalla superficie vengono ignorati. Questa ipotesi introduce errore in forza di trazione valutazioni. Per la misura precisa di forze di cellule, è fondamentale per la posizione delle perline per essere conosciuto. Abbiamo sviluppatouna tecnica che utilizza la chimica semplice confinare perline marcatori fluorescenti, 0,1 e 1 micron di diametro, in gel PA, a 1,6 micron della superficie. Abbiamo cappotto un coprioggetto con poli-D-lisina (PDL) e perline fluorescenti. Soluzione di gel PA viene quindi inserita tra il vetrino ed una superficie aderente. Le perline fluorescenti trasferimento alla soluzione di gel durante la polimerizzazione. Dopo la polimerizzazione, il gel PA contiene microsfere fluorescenti su un aereo vicino alla superficie del gel.

Introduction

L'interazione meccanica di una cellula vivente con il suo ambiente locale è stato comunemente studiata utilizzando gel PA. Questi substrati basano su un semplice protocollo ben caratterizzato stabilito da Dembo e Wang nel 1997 ^1. Uno dei principali vantaggi di questi substrati è che la loro rigidezza può essere regolato modificando le concentrazioni dei componenti specifici della soluzione di gel. Ciò fornisce una piattaforma auspicabile studiare l'interazione cellule 'con ambienti di diverse rigidità. Quando gel PA vengono rivestiti con matrice extracellulare (ECM) proteine, cellule aderiscono ad esse, la forza che genera. Come risultato della forza cella, il gel si deforma come un corpo elastico. Questa deformazione dipende dalla grandezza della forza applicata dalle cellule e le proprietà elastiche del gel. Vari studi hanno impiegato gel PA per indagare le forze di trazione cellulari.

In una variante di PA gel fabbricazione, microsfere fluorescenti (sfere) sono incorporati tel corso il gel di quantificare le forze di trazione cellulare su gel di differenti rigidità ^2. Su di applicazione della forza di cellule, le perle spostano dalla loro posizione iniziale dopo gel deformazione. Il campo di deformazione è misurata dai singoli spostamenti tallone. Questo campo di deformazione viene utilizzata con la teoria dell'elasticità e le proprietà elastiche del gel per calcolare le forze di trazione. Queste misure forniscono informazioni su come le cellule percepiscono meccanicamente ed interagiscono con il loro microambiente locale ^3.

In molti protocolli gel di fabbricazione ampiamente utilizzati PA, le perle sono mescolati in tutto il gel PA nel suo, stato liquido non polimerizzato. Un gel completamente polimerizzato PA contiene perline fluorescenti in tutto il suo volume. Nel calcolo delle forze di trazione delle cellule, perline maggior parte vicino alla superficie del gel (interfaccia cellula-substrato) sono monitorati. Gli spostamenti di queste perle si presume che si verificano sulla superficie della coltura cellulare per semplicità nella CALCOLO vigoren. La posizione attuale delle perle all'interno della profondità del gel viene ignorato. Tuttavia, in un mezzo elastico (ad esempio gel PA), una perlina più vicino al punto di applicazione della forza si muoverà più di un cordone che è più lontano dal punto. Così, trattando lo spostamento di un punto (nella posizione tallone) distale dalla superficie come che i risultati di superficie in una sottostima del trazioni cellulari. Il grado di errore dipende dalla distanza del tallone dalla superficie. L'errore non può essere definita senza la conoscenza della posizione del tallone.

La necessità di un metodo semplice per limitare perline molto vicino alla superficie di coltura cellulare è stato affrontato da alcune tecniche. Un modo è quello di aumentare la densità di perline per tutto l'arco gel tale che ci sia un numero sufficiente di perline nel piano focale superiore per misurare il movimento molto vicino alla superficie. Un'altra tecnica prevede la costruzione di una camera di imaging confocale per l'imaging cellulare dal vivo in modo tale che la luce dasolo le perline nel piano superiore più focale è raccolto ^4. Un altro metodo consiste sovrapponendo uno strato estremamente sottile di PA gel contenente microsfere sulla cima di un gel già polimerizzato, senza perline ^5. Un inconveniente di ciascuna di queste tecniche è che la posizione precisa dei branelli all'interno del gel non è noto. Questo introduce errori nel calcolo del campo di spostamenti delle perline, e quindi il calcolo delle forze cellulari. Un'altra tecnica prevede coniugazione perline alla superficie superiore di un gel PA già polimerizzato usando solfo-SANPAH ^6. Questa tecnica garantisce le perline sono infatti solo sulla parte superiore del gel PA, ma la misura in cui sono incorporati nella profondità del gel è sconosciuta. Ciò potrebbe potenzialmente creare una topografia locale per le cellule, che potrebbero alterare il comportamento delle cellule, come il lavoro preliminare ha suggerito che le cellule possono percepire forza diversi micron di distanza ^7. Recentemente, una tecnica per patterning gel PA con 1 micron di diametro fluorescent marcatori fibronectina punti in una matrice regolarizzato è stato fondato ^8. In questo caso, la profondità dei marcatori fluorescenti è noto, ed è sostanzialmente pari a zero, come il modello fibronectina è indirettamente stampata sulla superficie del gel. Tuttavia, questo metodo non fornisce un ambiente continuo in cui le cellule possono attaccare, come la proteina ECM è limitata a 1 micron di diametro puntini. Deve essere ancora stabilito un metodo per integrare pienamente perline Tracker all'interno gel PA e loro confinamento in un percorso noto molto vicino alla superficie.

Qui, sviluppiamo una tecnica per limitare sub-micron di perline fluorescenti di diametro micron ad un piano focale molto vicino alla superficie di coltura cellulare all'interno del gel PA. Un gel è tipicamente curata da sandwich non polimerizzato soluzione di gel liquido tra due lastre di vetro. Una delle piastre viene funzionalizzati in modo che il gel aderisce fortemente ad esso. L'altro è unfunctionalized e viene rimosso dopo le cure del gel. Modifichiamo questo vetro rimovibile surfaccia rivestendo con uno strato di perline. Su sandwich il gel liquido tra il funzionalizzati e la superficie di vetro tallone rivestito, il trasferimento di perline per il gel mentre sta curando. Questo limita la distanza di integrazione dei branelli 'nel gel entro 1,6 micron della superficie. Piatti con fondo di vetro Petri sono utilizzati come la superficie di adesione sulla quale è guarito il gel. Per formare una superficie superiore piana del gel durante la polimerizzazione, una circolare copertura in vetro antiscivolo è usato per sandwich di gel con la piastra di Petri con fondo di vetro. Prima di gel di fabbricazione, il coperchio superiore in vetro antiscivolo è rivestito con poli-D-lisina (PDL), ottenendo una carica superficiale positiva. Il Pdl è saltato fuori con aria compressa, e una soluzione di perline in acqua si deposita sulle coprioggetto. Utilizziamo microsfere fluorescenti carbossilati, che portano una carica negativa, e interagire con la superficie carica positiva creata dal trattamento con PDL. Dopo aver soffiato la soluzione tallone fuori il vetrino con aria compressa, un singolo strato diperline rimane elettrostaticamente accoppiati alla copertura di slittamento asciutto. Il rivestimento PDL non influenza l'adesività del vetro alla superficie del gel, i vetrini sono integri e rimossa dal gel PA completamente intatto.

Le piastre di Petri con fondo di vetro sono fatti aderente dal trattamento con il 97% a 3 amminopropil-trimethoxysliane e 0,5% glutaraldeide. PA gel di rigidità desiderati vengono creati miscelando opportune concentrazioni di bisacrilammide e acrilamide mediante una procedura standard ^9. Una goccia della soluzione di gel è pipettati sul piatto di Petri con fondo di vetro. Il vetrino di vetro contenente le perline viene utilizzato per sandwich di gel con la piastra di Petri. Quando il gel è guarito, la fodera superiore viene rimosso lasciando le sferette incorporati nel gel PA a 1,6 micron dalla superficie.

Protocol

Realizzazione e funzionalizzazione PA gel di diversa rigidità con microsfere fluorescenti incorporate in prossimità della superficie di coltura cellulare.

1 funzionalizzare i coprioggetto piano in vetro

1. Pulire i vetrini di vetro (# 1.0, diametro 12 mm.) Con acqua e sapone, seguito da etanolo per rimuovere la polvere estranei.
2. Posizionare il coperchio di vetro scivola su una superficie grattugiato (cioè titolare puntale) in modo che non si tocchino per facilitare la facilità di interazione con i coprioggetti.
3. Rivestire l'intera superficie del coperchio scivola con poli-D-lisina (0,1 mg / ml) per 1 ora (Figura 1A).
4. Durante questo tempo, eseguire una diluizione 1: 10.000 della soluzione di colloide di 0,1 micron di diametro, microsfere fluorescenti rossi con deionizzata (DI) per ottenere una densità di particelle di circa 1 a microsfere per 20 micron ² sulla superficie del gel. Vedere la Figura 2 per i risultati delle varie diluizioni. Questo dilution può essere modificato per soddisfare l'esigenza di esperimenti specifici.
5. Inserire la soluzione diluita in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 30 minuti.
6. Dopo 1 ora, utilizzare pinzette per sollevare attentamente ogni vetrino e asciugare con aria. Riportare i vetrini asciutti in superficie grattugiato.
7. Rimuovere la soluzione colloidale diluita dal bagno ad ultrasuoni e pipetta 150 microlitri su ogni vetrino. Lasciare agire per 10 minuti (Figura 1B).
8. Utilizzare le pinzette per sollevare attentamente ogni vetrino e asciugare con aria. Riportare il coperchio secco scivola sulla superficie grattugiato e conservare al buio fino al momento dell'uso.

2 Preparare PA Gel Direttamente Glass Bottom piastre di Petri

1. Piastra Preriscaldare a 100 ° C.
2. Disporre il numero desiderato di fondo in vetro Petri (35 mm piatto con 14 millimetri micro-bene, # 1.0) su una superficie piana in una cappa.
3. Coprire la parte in vetro di ogni Petri piatto micro-bene con il 97% a 3 amminopropil-trimethoxysliane (3-APTES) per 7 minuti per l'attivazione chimica. Fare attenzione per evitare gocciolamento accidentale dei 3-APTES alla superficie della plastica nella scatola di Petri per evitare il degrado del polistirolo.
4. Dopo 7 minuti, riempire la piastra di Petri con acqua deionizzata e smaltire in contenitore per i rifiuti.
5. Ripetere il punto 2.4 3x per ogni piatto, e poi agitare la piastra di Petri per rimuovere l'acqua in più. Porre le capsule di Petri sulla piastra calda fino a quando la parte in vetro è asciutto.
6. Rimuovere le piastre di Petri dalla piastra calda e tornare a una superficie piana in una cappa.
7. In una cappa, fare una soluzione di 0,5% di glutaraldeide e coprire la porzione di vetro di ciascuna piastra di Petri bene con la soluzione per 30 min. Fare attenzione per evitare gocciolamenti involontaria della glutaraldeide alla superficie della plastica nella scatola di Petri per evitare il degrado della plastica.
8. Dopo 30 minuti, riempire la piastra di Petri con acqua deionizzata e smaltire in contenitore per i rifiuti per risciacquare e rimuovere il glutaraldehyde.
9. Ripetere il punto 2.4 3x per ogni piatto, e poi agitare la piastra di Petri per rimuovere l'acqua in più. Porre le capsule di Petri sulla piastra calda fino a quando la parte in vetro è asciutto.
10. Prima di miscelare i componenti della soluzione di gel PA, spostare i vetrini funzionalizzati nella cappa tale che siano facilmente accessibili, consentendo il rapido sandwiching del gel con il fondo di vetro piastre Petri dopo la miscelazione la soluzione di gel.
11. In una provetta da centrifuga da 15 ml, mescolare il 40% bisacrilammide, 2% acrilamide, e di acido acrilico in successione immediata alle concentrazioni elencate nella tabella 1 (adattato dal protocollo pubblicato ¹⁰⁾ per ottenere l'elasticità matrice desiderata.
12. Aggiungi HEPES 100 mM, 10% persolfato di ammonio, e TEMED in quantità elencate nella tabella 1 corrispondono a matrice di elasticità desiderato per completare la soluzione di gel.
13. Pipettare Subito 15 ml di soluzione di gel sul centro della porzione di vetrodelle piastre di Petri.
14. Prendere immediatamente una copertura di slittamento vetro funzionalizzato con una pinzetta.
    1. Capovolgere il vetrino di vetro sopra in modo che le perline fluorescenti sono sul contatto making lato con la soluzione di gel.
    2. Disporre il vetrino delicatamente sulla sommità del gel PA ora-liquido tale che il lato funzionalizzato è in contatto con il gel (Figura 1C). Nota: Per ottenere i migliori risultati, una seconda persona è consigliato per il ruolo di aggiungere la polizza di copertura, al fine di evitare la possibilità di polimerizzazione parziale mentre pipettaggio soluzione di gel PA liquida su più piastre di Petri.
15. Capovolgere tutti i piatti di Petri su per assistere evitare effetti gravitazionali sulle nanoparticelle fluorescenti polimerizzazione in più bassi livelli del gel PA.
16. Attendere almeno 35 minuti, o fino a quando la soluzione madre di gel PA ha visibilmente polimerizzato nella sua provetta da centrifuga.
17. Capovolgere le piastre di Petri indietro sopra e riempirli con PBS per assistere con la rimozione del vetrino.
18. Fare attenzione contatto con la porzione di vetro della piastra Petri e il contorno del vetrino, con una pinzetta per raschiare la circonferenza del vetrino. Eseguire diversi cicli fino a quando la polizza di copertura viene sloggiato. Rimuovere il vetrino e smaltire in un vero e proprio contenitore per rifiuti taglienti.
19. Dopo aver rimosso tutti i vetrini, perline fluorescenti saranno trasferiti al gel (Figura 1D). Coprire i gel PA completamente con PBS, posizionare il coperchio piastra di Petri su ogni piatto, e conservare a 4 ° C.

3. funzionalizzazione gel PA con fibronectina

1. Preparare le seguenti soluzioni premiscelate, come descritto in un protocollo prestabilito ^11: Mettere a bagno la soluzione (137 mM NaCl, 5% (v / v) glicerolo) e tampone 2x coniugazione (0.2 M 2 (N -morpholino) Acido ethanesulfonic (MES), 10 % (v / v) glicerolo, pH 4,5).
2. Utilizzare una pompa a vuoto in una cappa biologica per rimuovere tutti PBS dai piatti con fondo di vetro che contengono i gel PA.
3. Pipettarete ammollo soluzione su ogni gel in modo che il gel sia completamente sommerso. Incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
4. Caldo 1-etil-3-[3-dimetilamminopropil] carbodiimide cloridrato (EDC) e N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) a temperatura ambiente.
5. Mescolare 10x soluzioni di EDC (150 mm, 19 mg / ml in acqua deionizzata) e NHS (250 mm, 29 mg / ml in acqua deionizzata).
6. Mescolare 1 parte di 10x EDC, 1 parte di 10x NHS, 3 parti di acqua DI, e 5 parti di 2x tampone coniugazione.
7. Utilizzare una pompa a vuoto in una cappa biologica per rimuovere la soluzione in ammollo. Assicurarsi che tutto il fluido viene rimosso dalla superficie del gel.
8. Aggiungere abbastanza soluzione NHS / EDC per coprire la superficie del gel e riempire il pozzo fondo di vetro della scatola di Petri (150-250 ml). Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.
9. Fibronectina Scongelare a temperatura ambiente. Una volta scongelati, miscelare acqua deionizzata sterile per creare una / soluzione di fibronectina ml 50 mg.
10. Utilizzare una pompa a vuoto in una cappa biologica per rimuovere le solu NHS / EDCzione. Assicurarsi che tutto il fluido viene rimosso dalla superficie del gel.
11. Aggiungere 150 ml di soluzione di fibronectina a ciascun gel. Incubare a temperatura ambiente per 35 minuti per consentire fissaggio della fibronectina.
12. Dopo 35 minuti, aggiungere PBS ad ogni piastra di Petri e conservare a 4 ° C per un massimo di 2 settimane.

4. Esperimenti Forza di trazione

1. Mezzi pesanti cella, PBS, e tripsina a 37 ° C in un bagno d'acqua.
2. Sciacquare gel 5x con PBS sterile, aspirare il PBS tra risciacqui, e lasciare coperto nel cappuccio.
3. Aggiungere 1 ml di tripsina ogni 25 cm ² per le cellule boccetta contenente. Dopo che le cellule vengono sollevati dal pallone, diluire il tripsina con supporto di cellule e contare le cellule. Sulla base della superficie del gel, determinare il numero di cellule necessarie per gel per un finale densità di semina cellulare di 3.000 cellule / cm ^2. Diluire o concentrato sospensione tale che 150 ml di miscela di cellule-media contiene il numero di cellule. Aliquote di 150 ml di suspens cellulariion a ogni gel.
4. Porre le capsule Petri contenenti le cellule in un incubatore per 30 min. Quindi, rimuovere accuratamente le piastre di Petri e riempire il resto della piastra di Petri con i media (circa 2 ml) tale che la superficie del piatto è completamente sommerso.
5. Porre le capsule di Petri torna in incubatrice fino acquisizione delle immagini.
6. Preparare il sistema di acquisizione dati microscopio e per l'imaging: inserire l'obiettivo ad immersione 40x acqua, inserire il contrasto di interferenza differenziale (DIC) prisma, selezionare il mCherry o il filtro fluorescente equivalente, e accendere la camera ambientale.
7. Quando preparate per l'imaging, rimuovere una piastra di Petri dal termostato e posizionarlo delicatamente sul palco microscopio. Togliere il coperchio piatto di Petri per l'imaging DIC.
8. Individuare una singola cella e catturare una singola immagine fissa della cella in DIC.
9. Senza spostare il palco microscopio, cambiare la modalità di imaging di fluorescenza. Focus sulle microsfere fluorescenti e recORD un'immagine delle microsfere.
10. Rimuovere con attenzione supporti cella dalla piastra di Petri con una pipetta e aggiungere 0,05% tripsina-EDTA.
11. Immagine le microsfere sotto la cella dopo che le cellule hanno staccato.
12. Usa particella immagine velocimetry (PIV) analisi in ImageJ ¹² per calcolare il campo di spostamento a causa di forze cellulari.

Representative Results

L'imaging confocale è stato utilizzato per determinare che le perle erano effettivamente sotto la superficie del gel e di quantificare la loro collocazione precisa all'interno della profondità di gel. Perline fluorescenti di una lunghezza d'onda diversa da quelle all'interno del gel sono stati lasciati depositare sulla superficie, e la distanza tra le nanoparticelle fluorescenti incorporate e quelle sulla superficie è stata calcolata utilizzando un algoritmo di identificazione centroide. La posizione del tallone sulla superficie del gel serve come riferimento per la superficie superiore del gel in cui le cellule si applicano vigore all'atto aderenza alla superficie. Una schematica dei due scenari considerati (perline verdi in gel con perline rosse sulla superficie, e viceversa) è mostrato in Figura 3. L'algoritmo interpola la z-altezza del baricentro posizione tridimensionale. Abbiamo ripetuto questo processo per tre gel rigidezza (1, 10, e 40 kPa) e due dimensioni (diametro) perline fluorescenti (0,1 micron rosso e 1 micron di colore giallo-verde). La distanzatra una perlina all'interno del gel e il suo vicino più prossimo di una diversa lunghezza d'onda è stato determinato in base al suo baricentro tridimensionale. Figura 4 mostra la distribuzione spaziale di perline (sulla superficie superiore e incorporato) e la vista proiettata sul piano YZ. Quest'ultimo fornisce le profondità di tutte le perline dalla superficie del gel.

La profondità media di 0,1 micron perline è 619 nm, 467 nm, 278 nm per PA gel di rigidità 1, 10, e 40 kPa, rispettivamente (Figura 5A). Le profondità corrispondenti per 1 micron di diametro perle sono -20 nm in 40 gel kPa, 12 nm a 10 kPa gel, e 1.255 nm in 1 gel kPa (Figura 5B). Confocale è stata anche eseguita su gel con perline sparse il gel come è stato tradizionalmente usato per i gel PA destinati a studi di microscopia a forza di trazione. La profondità di perline disperso in tutto il gel PA è stata misurata usando lo stesso algoritmo precedentemente descritto e viene confrontato con il depths utilizzando la tecnica che presentiamo. Figura 6 illustra la variabilità di dispersione tallone all'interno della profondità di un gel PA utilizzando metodi di fabbricazione tradizionali.

I fibroblasti attribuiscono alla superficie del gel PA quando funzionalizzato con fibronectina. Il campo di spostamento per un cellulare di fibroblasti e la corrispondente perline fluorescenti strato sono mostrati in Figura 7. Perline vicino alla periferia dell'immagine appaiono leggermente fuori fuoco. Questo non è un difetto meccanico da parte del gel, come il vetro rimane completamente intatto dopo la rimozione dal gel. Piuttosto, è il risultato di un effetto ottico dovuto alla obiettivo ad immersione acqua utilizzata in questo esperimento. Dopo l'aggiunta di tripsina al mezzo, la cella viene rilasciato dalla superficie, con conseguente ritorno della superficie deformata gel PA al suo stato originale. Un algoritmo di cross-correlazione è stato utilizzato per calcolare il campo di deformazione basato su spostamenti tallone ^10. Ilmappa di spostamento illustra una polarizzazione dominante delle forze di trazione cella nella direzione y.

Figura 1 Illustrazione del processo di funzionalizzazione per la copertura in vetro superiore scivola con Pdl e perline fluorescenti. scivola (A) copertura di vetro (blu) vengono incubati con 0,1 mg / ml PDL (arancione) per 1 ora. L'aria compressa viene utilizzata per far saltare il coperchio scivola asciutta e rimuovere il Pdl. Scivola (B) copertura in vetro vengono incubati con una soluzione di perline fluorescenti diametro 100 nm per 5-10 minuti, e poi rimosso mediante l'applicazione di aria compressa. Uno strato di perline rimane elettrostaticamente accoppiato al coprioggetto. (C) coprioggetto funzionalizzati con perline vengono utilizzate per gel PA panino con una superficie di vetro attivato. (D) Dopo la rimozione della copertura di slittamento superiore seguente PA gel polymerizatione, le perle si trovano all'interno e molto vicino alla superficie del gel. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2 PA Gel superficie contenente 0,1 micron di diametro perline fluorescenti. Prima di rivestire la copertura di slittamento vetro superiore PDL-trattati con perline, la soluzione tallone è stata diluita (A) 10.000 volte (3.64 x 10 ⁸ perline / ml) e (B) 20.000 volte (1,82 x 10 ⁸ perline / ml). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3 Interfaccia Cell-substrato con perline localizzate vicino alla superficie del gel. Uno schema di due scenari in cui posizione tallone all'interno di un gel PA è stata quantificata utilizzando la microscopia confocale e un algoritmo di identificazione del baricentro. Il primo scenario è mostrata in (A) Red 100 perle del diametro nm all'interno del gel e verdi 1 micron di diametro perle sulla superficie, e la seconda in (B) Verde 1 perline micron di diametro all'interno del gel e rosso 100 perline diametro nm su la superficie. (C) Un fumetto illustrazione di una cella (giallo) aderito a un gel (blu) con perline rosse localizzate all'interno del gel vicino alla sua superficie e una perlina verde, seduto sulla sua superficie. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4 slice confocale (XY, centro), che accompagna YZ (sinistra) viste di proiezione di un gel con il rosso di 0,1 micron perline incorporati nel gel e 1 micron perline sulla superficie. Le unità per tutti gli assi sono in nanometri. Occorrenze occasionali di perline rossi sopra o sullo stesso piano, come perline verdi è attribuita a leggera sovrapposizione in spettri di emissione di fluorescenza per il rosso (mCherry) e verde (GFP). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5 istogrammi della profondità di perline confinati in prossimità della superficie superiore del gel PA. Rigidezze 1 kPa, 10 kPa, e 40kPa sono rappresentati dal blu, rosso e nero, rispettivamente. Una curva gaussiana era adatta per ogni set di dati e il valore x corrispondente alla sua ampiezza è interpretato come la profondità media di perline. Due scenari sono stati testati:. (A) 0,1 micron perline all'interno del gel con 1 micron perline sulla superficie, e (B) 1 micron perline all'interno del gel con 0,1 micron perline sulla superficie Cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questo figura.

Figura 6 Istogrammi della profondità di perline incorporato arbitrariamente tutta gel PA utilizzando un metodo di fabbricazione tradizionale (nero) e perline localizzati vicino alla strato superiore della PA gel utilizzando questa tecnica (rosso) per le PA gel di rigidezza A) 1 kPa, B) 10 kPa,e C) 40 kPa. Inset mostra la profondità delle perle in entrambi i tipi di gel all'interno della parte superiore più 10 micron del gel. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura campo 7 Cilindrata dovuto alla trazione delle cellule. Contrasto immagine (A) Fase di un fibroblasto il 10 kPa gel. (B) campo di spostamento generato dalla trazione generata dalla fibroblasti. (C) Fluorescenza immagine di 0,1 micron di diametro perle sotto una cella prima di tripsinizzazione bar a colori indica lo spostamento tallone in nanometri.. Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8 illustrazioni di posizione media di perline all'interno del gel relativa ad un differente branello dimensioni / lunghezza d'onda seduto sulla superficie del gel. La rigidità PA diminuisce gel da sinistra a destra (40 kPa, 10 kPa, 1 kPa). (A) Red 0,1 micron perle diametro interno del gel e verdi 1 micron di diametro perle sulla superficie. (B) Verde 1 micron perle diametro interno del gel e rosso 0,1 micron di diametro perline sulla superficie. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .

Figura 9 Distribuzione dei valori teorici per τ / μ basa su varie profondità tallone. Perle di 0,1 micron di diametro sono stati sia uniformemente distribuito o localizzato in prossimità della superficie in (A) 1 kPa gel, (B) 10 gel kPa, e (C) 40 gel kPa . La freccia d'oro indica il valore di τ / μ per z = 0 caso, in cui perle sono sulla superficie del gel. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

115px; "> 4122,5 1px; "> 500

E (kPa)	40% acrilamide (ml)	BIS (concentrazione)	2% BIS (ml)	HEPES 100 mM (ml)	0.1	625	0,00009	22.5	4225
0.25	625	0.0001	25	4.222,5
0.5	625	0,00011	27.5	4220
0.75	> 625	0.0002	50	4.197,5
1	625	0,0003	75	4.172,5
1.5	625	0,0004	100	4.147,5
2	625	0.0005	125
2.5	625	0.0006	150	4.097,5
3	625	0.0008	200	4.047,5
3.5	625	0,0009	225	4.022,5
4		0.001	250	3.997,5
4.5	625	0,0012	300	3.947,5
5	625	0,0014	350	3.897,5
5.5	625	0.0016	400
6	625	0,0018	450	3.797,5
6.5	625	0.002	500	3.747,5
7	625	0.0022	550	3.697,5
7.5 < / Td>	625	0,0024	600	3.647,5
8	1000	0.001	250	3.622,5
10	1000	0.0013	325	3.547,5
15	1000	0.002	3.372,5
20	1000	0,0027	675	3.197,5
30	1000	0,0037	925	2.947,5
40	1000	0,0048	1200	2.672,5

Tavolo1. PA Gel concentrazioni chimici a base di Modulo di Young. Per un gel PA desiderata modulo elastico, le concentrazioni elencate di acrilammide, bisacrilammide, e tampone HEPES dovrebbero essere integrati con 5 ml di acido acrilico, 25 microlitri 10% di ammonio persolfato (APS), e 2,5 microlitri TEMED.

7pt "width =" 62 "> 5

z (micron)	u x ((τ / μ) micron)
0	0.750
	0,394
1	0,237
1.5	0,164
2	0.124
2.5	0.100
3	0,083
3.5	0.071
4	0,062
4.5	0.056
0.050

Tabella 2 spostamenti in funzione di τ / μ corrispondente alla profondità, z, di perline dalla superficie del gel basato sulla teoria di Boussinesq.

Discussion

Quando si utilizza questa tecnica, è essenziale che la soluzione tallone è correttamente diluito e le perline sono scelti in base a diametro desiderato, PA substrato gel rigidità, e la scala di grandezza dei fenomeni che è esplorato nell'esperimento desiderato.

Si deve usare cautela quando si diluisce la soluzione tallone prima di funzionalizzazione migliori scivola copertura in vetro. La spaziatura tra le perle sulla superficie del gel può essere modificata variando il fattore di diluizione della soluzione di colloide. Diluendo la soluzione troppo ridurrà il numero di sfere che coppia al vetrino e infine ridurre il numero di perline in gel. Diluendo la soluzione troppo poco può produrre troppo elevata densità di perline in gel in modo che siano a contatto e non possono essere distinti l'uno dall'altro. Mentre è spesso impossibile evitare completamente la presenza di aggregazione delle nanoparticelle, l'applicazione di onde ultrasoniche per la soluzione diluita minimizza efficacemente nanaggregazione oparticle. Abbiamo scoperto che un 10.000 volte diluizione della soluzione colloidale utilizzata in questo protocollo fornisce una concentrazione goccia di 3,64 x 10 ⁸ perline / ml, e produce una densità di particelle desiderabile di 0,05 micron perline / ² per 0,1 micron di diametro perle. A 1: 20.000 diluizione (1,82 x 10 ⁸ perline / ml) produce una media di 52 micron ² per particella Figura 2 mostra immagini della superficie del gel con diverse diluizioni.. Va notato che vi è variabilità del numero di sfere che trasferiscono al gel. Ciò è dovuto alla variabilità associata con la rimozione della soluzione tallone dal vetrino con aria compressa durante la funzionalizzazione. In generale, abbiamo trovato che aumentando il fattore di diluizione di almeno un fattore due costantemente traduce in almeno un raddoppio della superficie per tallone.

E 'anche fondamentale per scegliere una taglia tallone (diametro), che si tradurrà in full immersion di tegli tallone all'interno del gel su PA polimerizzazione. Gel rigidità influisce sulla posizione di perline come mostrato in Figura 5A. Per 0,1 micron di diametro perle, la profondità tallone aumenta con la diminuzione rigidità. Questo potrebbe essere il risultato della relazione inversa tra la dimensione dei pori e PA gel rigidità ^13. Per tutti e tre i gel rigidità testate, le perle sono costantemente localizzati all'interno del gel, e entro 1 micron della superficie del gel come illustrato nella Figura 8A. La posizione media di 1 micron perline nel gel varia anche con rigidità. Essi sono incorporati più profondo (circa 1,25 micron) nei gel 1 kPa. Per i 10 e 40 kPa gel, la posizione della parte superiore di 1 micron di diametro perline va da circa 0,5 micron a 0,5 micron sopra sotto del gel (Figura 5) di superficie, il che significa che le perline occasionalmente sporgono attraverso la parte superiore del gel (Figura 8B). Questo è dannoso perché introduce topograPHY per le cellule, e la topografia è noto per influenzare le interazioni cellula-substrato ^14. Pertanto, è necessario essere consapevoli di scegliere perline per questa tecnica quando si prepara un gel di rigidità specifica. Dei due dimensioni tallone utilizzati per caratterizzare questo metodo, 0,1 micron di diametro dimostra la dimensione ottimale. Altre dimensioni tallone possono essere utilizzati con questa tecnica, ma deve essere tarato usando la microscopia confocale come descriviamo qui, per capire la profondità esatta a cui le perle sono localizzati durante la polimerizzazione del gel.

Questa tecnica migliora la risoluzione spaziale di perline in gel PA aumentando il numero di particelle distinguibili all'interno del campo di vista. Localizzazione dei branelli di uno strato vicino alla parte superiore del gel non influenza significativamente la rigidezza composito del gel. Isosollecitazione teoria composito è utilizzato per calcolare il modulo elastico composito, E _c, del solo 1 micron di spessore di strato di gel contenente beads come

dove E _f è il modulo elastico delle perle di polistirene (3 GPa), E _m è il modulo elastico della matrice di gel (10 kPa), e V _f e v _m sono le frazioni volumetriche dei branelli e gel matrice, rispettivamente. Poiché le perle rappresentano solo lo 0,03% del volume, E _c = 10,0025 kPa non è significativamente diverso dal modulo elastico di un gel isotropa di rigidità 10 kPa. Un metodo stabilito per la fabbricazione di gel PA riduce il tempo di polimerizzazione di 30 secondi, minimizzando così l'effetto della gravità sulla distribuzione delle perline durante la polimerizzazione ^15. Il nostro metodo si basa sul più lungo (~ 30 min) tempo di polimerizzazione per le perline a polimerizzare nel geltale da non sporgere la superficie del gel. Perché localizzare le perle di un singolo strato non influenza significativamente la rigidità gel composito, e il più lungo tempo di polimerizzazione aiuti nel trasferimento di perline nella matrice del gel, noi non incorporiamo alcuna misura per ridurre il tempo di polimerizzazione nella nostra tecnica.

La nostra tecnica dimostra come localizzare le perline ad una profondità noto all'interno gel PA, che migliora la misurazione della deformazione del substrato, e quindi il calcolo delle forze di trazione cella. Un approccio teorico per quantificare le forze di trazione cellulari è stato precedentemente riportato ^16,17. Questo approccio considera il substrato gel come un semi-infinito solido in metà spazio elastico. La soluzione Boussinesq viene utilizzato per risolvere il problema inverso del calcolo forze di trazione da un campo di spostamento. Impieghiamo una versione semplificata del Boussinesq integrale di quantificare l'errore di misura dello spostamento dovuto perline distali dal gel surface ^18. L'equazione per lo spostamento in una direzione determinata sulla base di una tensione di taglio applicata, τ, in un dato raggio, R, è dato da

dove u _x è lo spostamento nella direzione x, μ è il modulo di taglio, e z è la profondità delle perle dalla superficie del gel. Per varie sedi di perline in tutta la profondità del gel, spostamenti corrispondenti sono mostrati nella Tabella 2.

Per il caso qui illustrato, il raggio è stimato essere una dimensione media di adesione focale di 1 micron. Se le perle si presume siano complanari con le cellule (z = 0), lo spostamento è dato da 0,75 τ / μ. Se le perle sono solo 1 micron al di sotto della superficie del gel, lo spostamento è dato da 0,24 τ / μ. Questorappresenta una riduzione superiore triplice spostamento da un complanare tallone con la superficie di una posizione 1 micron di seguito. Questo introduce errore nel calcolo delle forze di trazione superficiali basati sul moto di perline incorporate la cui posizione all'interno del gel precisi non sono noti. La variazione in trazione definita da τ / μ, in funzione della profondità delle perline in gel per entrambi i metodi di fabbricazione proposti o tradizionali è significativo. Figura 9 mostra la distribuzione delle forze (dato dal rapporto τ μ /) riferiscono sulla teoria di Boussinesq che derivare dal calcolo utilizzando la distribuzione delle profondità di perline, z, entro la profondità ottica di campo quando perle sono uniformemente distribuite nel gel e localizzati in prossimità della superficie. La misurazione più accurata della forza cellula viene a crearsi se fossero perle sullo stesso piano come le cellule, dove z = 0 e τ / μ = 0,0133. Rispetto a questo caso, τ / μ aumenta di 118%, 80%, e 50% per 1 kPa, 10 kPa e 40 kPa gel, rispettivamente, quando perle sono localizzati in prossimità della superficie con la tecnica che proponiamo. Quando perle sono distribuite uniformemente in tutta la profondità di gel, τ / μ aumenta di un ulteriore 60%, 80% e 150% oltre l'aumento indotto dalla localizzazione perline vicino alla superficie, per 1 kPa, 10 kPa e 40 kPa gel, rispettivamente. Questo rappresenta un totale di errore quasi 200% nei calcoli di trazione quando i talloni sono distribuiti in tutta la profondità del gel. Così, localizzazione delle perline ad una profondità nota all'interno del gel migliora la precisione nelle misurazioni di spostamento e le forze di trazione cellulare.

La tecnica qui descritta presenta un nuovo modo per preparare substrati gel PA per applicazioni di forza di trazione di microscopia tali che le perle sono localizzati in prossimità della superficie del gel. Limitando le perle ad una profondità nota entro gel PA fornisce nuove informazioni sulla cilindrata effettiva di perline su applicazione della forza delle cellule, creando amORE quadro preciso di come le cellule sono deformanti loro substrato sottostante.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)	Sigma-Aldrich	281778
70% Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	111-30-8
1 M HEPES buffer solution	Sigma-Aldrich	83264
40% Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
2% Bisacrylamide	Sigma-Aldrich	M1533
0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry)	Invitrogen	F8801
Fibronectin, Human, 1 mg	BD Biosciences	354008
Ammonium persulfate	Bio-RAD	161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-RAD	161-0801
Poly-D-lysine	Millipore	A-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)	Thermo Scientific	22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)	Thermo Scientific	24500
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Life Technologies	25300-054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Acrylic acid	Sigma-Aldrich	147230
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass	In Vitro Scientific	D35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam.	Ted Pella, Inc.	26023