Summary
Les techniques traditionnelles de fabrication de polyacrylamide (PA) des gels contenant des sondes fluorescentes consistent en sandwich un gel entre une surface adhérente et une lame de verre. Ici, nous montrons que le revêtement de cette lame avec la poly-D-lysine (PDL) et des sondes fluorescentes localise les sondes à l'intérieur de 1,6 um à partir de la surface du gel.
Abstract
Gels PA ont longtemps été utilisés comme une plate-forme pour étudier les forces de traction cellulaire raison de la facilité de fabrication et la capacité d'ajuster leurs propriétés élastiques. Lorsque le substrat est revêtu d'une protéine de la matrice extracellulaire, les cellules adhèrent au gel et appliquent des forces, ce qui provoque le gel de se déformer. La déformation dépend de la traction de la cellule et les propriétés élastiques du gel. Si le champ de la surface de déformation est connu, la traction de la surface peut être calculée en utilisant la théorie de l'élasticité. Gel de déformation est généralement mesurée par incorporation de perles de marqueur fluorescent uniformément dans le gel. Les sondes déplacent que le gel se déforme. Les sondes proches de la surface du gel sont suivies. Les déplacements signalés par ces sondes sont considérés comme des déplacements de surface. Leurs profondeurs de la surface sont ignorés. Cette hypothèse introduit une erreur dans l'évaluation de la force de traction. Pour une mesure précise des forces de cellules, il est essentiel que l'emplacement des billes, qui sera appelée. Nous avons développéune technique qui utilise la chimie simple de limiter les perles de marqueurs fluorescents, 0,1 et 1 pm de diamètre, dans des gels d'AP, à l'intérieur de 1,6 pm de la surface. On couche une lamelle couvre-objet avec du poly-D-lysine (PDL) et des billes fluorescentes. Solution de gel PA est alors pris en sandwich entre la lamelle et une surface adhérente. Les billes fluorescentes pour transférer la solution de gel au cours du durcissement. Après polymérisation, le gel contient des billes fluorescentes PA sur un plan proche de la surface du gel.
Introduction
L'interaction mécanique d'une cellule vivante avec son environnement local a souvent été étudiée en utilisant des gels de l'AP. Ces substrats reposent sur un protocole simple et bien établi caractérisé par Wang et Dembo en 1997 1. L'un des principaux avantages de ces substrats est que leur rigidité peut être ajustée en modifiant les concentrations des composants spécifiques de la solution de gel. Ceci fournit une plate-forme souhaitable d'étudier l'interaction des cellules avec des environnements de rigidités différentes. Lorsque gels PA sont recouvertes d'matrice extracellulaire de protéines (ECM), les cellules adhèrent à eux, de génération de force. En raison de la force de la cellule, le gel se déforme comme un corps élastique. Cette déformation dépend de la grandeur de la force appliquée par les cellules et les propriétés élastiques du gel. Diverses études ont utilisé des gels PA pour enquêter sur les forces de traction cellulaires.
Dans une variante de PA gel fabrication, microsphères fluorescentes (perles) sont intégrés tout au long de gel de quantifier les forces de traction cellulaire sur des gels de différentes rigidités 2. Lors de l'application de la force de la cellule, les billes déplacent à partir de leur position initiale après une déformation de gel. Le champ de déformation est mesurée à partir des déplacements individuels de talons. Cette zone de déformation est utilisé par la théorie de l'élasticité et les propriétés élastiques du gel de calculer les forces de traction. Ces mesures permettent de mieux comprendre la façon dont les cellules détectent et interagissent avec leur micro-environnement local 3 mécaniquement.
Dans de nombreux protocoles gel de fabrication largement utilisées PA, les perles sont mélangées à travers le gel PA dans son état liquide, non polymérisé. Un gel PA entièrement polymérisé contient des billes fluorescentes dans tout son volume. Lorsque le calcul de forces de traction de la cellule, la plupart des perles près de la surface du gel (de l'interface cellule-substrat) sont surveillés. Les déplacements de ces billes sont supposées se produire sur la surface de culture cellulaire pour la simplicité de la force CALCULn. La position réelle des perles au sein de la profondeur du gel n'est pas respectée. Cependant, dans un milieu élastique (tel que le gel PA), un cordon plus proche d'un point d'application de la force se déplace plus d'un bourrelet qui est plus éloignée de la pointe. Ainsi, le traitement du déplacement d'un point (à l'emplacement du bourrelet) distale par rapport à la surface que celle de la surface conduit à une sous-estimation des tractions cellulaires. Le degré d'erreur dépend de la distance de la bille à partir de la surface. L'erreur ne peut être estimée à l'insu de l'emplacement du cordon.
Le besoin d'une méthode simple pour limiter les perles très près de la surface de culture cellulaire a été traitée par plusieurs techniques. Un moyen consiste à augmenter la densité des billes de gel tout au long de telle sorte qu'il y ait un nombre suffisant de billes dans le plan focal supérieur à mesurer le mouvement très près de la surface. Une autre technique consiste à construire une chambre d'imagerie confocal pour l'imagerie des cellules vivantes de telle sorte que la lumière provenant deseules les billes dans le plan focal le plus supérieur est recueilli 4. Une autre méthode consiste à superposer une couche extrêmement mince de gel PA contenant des billes sur le dessus d'un gel déjà polymérisé sans billes 5. Un inconvénient de chacune de ces techniques est que l'emplacement précis des billes dans le gel n'est pas connue. Cela introduit une erreur dans le calcul du champ de déplacement des billes, et donc le calcul des forces de cellules. Une autre technique consiste à conjugaison de billes à la surface supérieure d'un gel PA déjà polymérisé en utilisant sulfo-SANPAH 6. Cette technique assure les billes sont en effet uniquement sur la partie supérieure du gel PA, mais la mesure dans laquelle elles sont noyées dans l'épaisseur du gel est inconnu. Cela pourrait créer une topographie locale pour les cellules, ce qui pourrait modifier le comportement de la cellule, comme un travail préalable a suggéré que les cellules peuvent sentir la force de quelques microns de distance 7. Récemment, une technique de structuration gels PA avec 1 um de diamètre fluorescent marqueurs fibronectine de points dans un tableau régularisée a été créé 8. Dans ce cas, la profondeur des marqueurs fluorescents est connu, et est pratiquement nul, car le motif de la fibronectine est indirectement imprimé sur la surface du gel. Cependant, cette méthode ne fournit pas un environnement continu sur lequel les cellules peuvent se fixer, comme la protéine d'ECM est limitée à 1 um de diamètre des points. Une méthode pour intégrer pleinement les perles tracker dans des gels d'AP et les confiner dans un endroit connu de très près de la surface n'a pas encore été établie.
Ici, on développe une technique pour contraindre sous-um de diamètre de billes fluorescentes um à un plan focal à proximité de la surface de culture cellulaire à l'intérieur de gel PA. Un gel est habituellement durci par solution en sandwich de gel liquide non polymérisé entre deux plaques de verre. Une des plaques est fonctionnalisé de sorte que le gel adhère fortement à elle. L'autre est non fonctionnalisé et est retiré après les cures de gel. Nous modifions ce verre amovible surface en le revêtant avec une couche de billes. Lors de la prise en sandwich entre le gel liquide fonctionnalisé et la surface de verre revêtue de talon, le transfert des billes de gel pendant qu'il durcit. Cela limite la distance de l'intégration des perles dans le gel à 1,6 um de la surface. Plats de Pétri à fond de verre sont utilisés en tant que la surface adhérente sur laquelle le gel est durci. Pour former une surface supérieure plate de gel au cours de la polymérisation, une lamelle circulaire de verre est utilisé pour prendre en sandwich le gel de la boîte de Pétri à fond de verre. Avant de gel fabrication, le couvercle en verre haut glissement est recouvert de poly-D-lysine (PDL), ce qui donne une charge de surface positive. Le PDL est soufflé avec de l'air comprimé, et une solution de billes dans l'eau est déposée sur les lamelles. Nous utilisons des microbilles fluorescentes carboxyles, qui portent une charge négative, et d'interagir avec la surface chargée positivement créé par traitement avec PDL. Après soufflage de la solution de talon de la lamelle couvre-objet avec de l'air comprimé, une seule couche deperles demeure électrostatique couplé à la lamelle sec. Le revêtement PDL n'affecte pas l'adhérence du verre à la surface du gel, comme les lames de verre sont en bon état et présente dans le gel PA intact.
Les boîtes de Pétri à fond de verre sont faites adhérente par un traitement avec 97% de 3-aminopropyl-trimethoxysliane et 0,5% de glutaraldéhyde. Gels PA de rigidités souhaités sont créés en mélangeant des concentrations appropriées de bisacrylamide et d'acrylamide par une procédure standard 9. Une goutte de la solution de gel est introduit à la pipette sur la boîte de Pétri à fond de verre. La lamelle couvre-objet en verre contenant les billes est utilisé pour prendre en sandwich le gel de la boîte de Pétri. Lorsque le gel est durci, le couvercle supérieur est enlevé, laissant glisser les perles noyées dans le gel à l'intérieur de PA 1,6 um à partir de la surface.
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Protocol
La fabrication et la fonctionnalisation des gels d'AP de raideurs des microsphères fluorescentes incorporées à proximité de la surface de culture cellulaire ou moins.
1. fonctionnalisation des Top couvercle en verre glissades
- Nettoyer les lamelles de verre (# 1.0, 12 mm diam.) Avec de l'eau et du savon, puis par de l'éthanol pour enlever la poussière étrangère.
- Lieu couvercle de verre glisse sur une surface râpée (c.-à-support d'embout de pipette) de telle sorte qu'ils ne se touchent pas pour faciliter l'interaction avec les lamelles.
- Enduire la surface de la couverture glisse avec Poly-D-Lysine (0,1 mg / ml) pendant 1 h (figure 1A).
- Pendant ce temps, effectuer une dilution de 1: 10 000 de la solution de colloïde de 0,1 um de diamètre, les microsphères fluorescentes rouges avec désionisée (DI) de l'eau pour obtenir une densité de particule d'environ 1 pm 20 microsphères par deux sur la surface du gel. Voir la Figure 2 pour les résultats de différentes dilutions. Cette dilution peut être modifié pour répondre aux besoins des expériences spécifiques.
- Placer la solution diluée dans un bain d'eau à ultrasons pendant 30 min.
- Après 1 heure, utiliser des pinces pour soulever soigneusement chaque lamelle et sécher à l'air. Remettre les lamelles sèches à la surface râpé.
- Retirer la solution colloïdale diluée du bain ultrasonique et pipette 150 ul sur chaque lamelle. Laisser reposer 10 min (figure 1B).
- Utilisez des pinces pour soulever soigneusement chaque lamelle et sécher à l'air. Retour la couverture sèche glisse à la surface râpé et magasin dans le noir jusqu'au moment de servir.
2 Préparation PA gel directement sur le verre des boîtes de Pétri de fond
- Plaque de cuisson Préchauffer le four à 100 ° C.
- Disposez le nombre désiré de fond de verre des boîtes de Pétri (35 mm plat 14 mm micro-bien, # 1.0) sur une surface plane dans une hotte chimique.
- Couvrir la partie en verre de chaque boîte de Pétri micro-bien avec 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane (3 APTES) pendant 7 min pour l'activation chimique. Prenez garde à éviter les entrées par inadvertance des 3-APTES à la surface de la matière plastique dans la boîte de Pétri pour éviter la dégradation du polystyrène.
- Après 7 minutes, remplir la boîte de Pétri avec de l'eau DI et disposer dans un contenant à déchets.
- Répétez l'étape 2.4 3x pour chaque plat, puis secouez la boîte de Pétri pour éliminer l'eau supplémentaire. Placez les boîtes de Pétri sur la plaque chauffante jusqu'à ce que la partie en verre est sec.
- Retirez les boîtes de Petri de la plaque chaude et revenir à une surface plane dans une hotte chimique.
- Dans une hotte chimique, préparer une solution de glutaraldéhyde à 0,5% et couvrir la partie de verre de chaque boîte de Pétri avec la même solution pendant 30 min. Prendre des précautions pour éviter les entrées par inadvertance du glutaraldéhyde à la surface de la matière plastique dans la boîte de Petri pour éviter la dégradation de la matière plastique.
- Après 30 minutes, remplir la boîte de Pétri avec de l'eau déminéralisée et disposer dans un récipient des déchets de rincer et enlever le glutaraldehyde.
- Répétez l'étape 2.4 3x pour chaque plat, puis secouez la boîte de Pétri pour éliminer l'eau supplémentaire. Placez les boîtes de Pétri sur la plaque chauffante jusqu'à ce que la partie en verre est sec.
- Avant de mélanger les composants de la solution de gel PA, déplacer les lames de verre fonctionnalisées dans la hotte chimique de telle sorte qu'ils sont facilement accessibles, ce qui permet la prise en sandwich rapide du gel avec le fond de verre des boîtes de Petri après mélange de la solution de gel.
- Dans un tube à centrifuger de 15 ml, mélanger 40% de bisacrylamide, 2% d'acrylamide et d'acide acrylique, en succession immédiate dans les concentrations indiquées dans le tableau 1 (adaptation de protocole publié 10) pour obtenir l'élasticité souhaitée de la matrice.
- Ajouter 100 mM de HEPES, 10% de persulfate d'ammonium et le TEMED en quantités indiquées dans le tableau 1 correspondant à l'élasticité de la matrice souhaitée pour compléter la solution de gel.
- Immédiatement pipette 15 ul de la solution de gélatine sur le centre de la partie en verredes boîtes de Pétri.
- Ramasser immédiatement un verre lamelle fonctionnalisé avec des pincettes.
- Retourner la lamelle couvre-objet en verre au-dessus de telle sorte que les billes fluorescentes sont sur la prise de contact latéral avec la solution de gel.
- Disposer la lamelle doucement sur le dessus du gel maintenant PA-liquide de telle sorte que le côté fonctionnalisé est en contact avec le gel (Figure 1C). Remarque: Pour de meilleurs résultats, une deuxième personne est recommandé pour le rôle de l'ajout de la lamelle afin d'éviter le risque de polymérisation partielle tandis que le pipetage liquide solution de gel PA sur plusieurs boîtes de Pétri.
- Retournez toutes les boîtes de Pétri sur pour aider à éviter les effets de la gravité sur les nanoparticules fluorescentes de polymérisation dans les niveaux inférieurs du gel PA.
- Attendez au moins 35 minutes, ou jusqu'à ce que la solution mère de gel PA a visiblement polymérisé dans son tube de centrifugeuse.
- Retourner les boîtes de Pétri à l'endroit et de les remplir avec du PBS pour aider à enlever la lamelle.
- Faire soigneusement tout contact avec la partie en verre de la boîte de Pétri et le contour de la lamelle, en utilisant des pinces à gratter de la circonférence de la lamelle. Effectuer plusieurs cycles jusqu'à ce que la lamelle est délogé. Retirer la lamelle et éliminer dans un récipient approprié des déchets piquants ou coupants.
- Après avoir retiré toutes les lamelles, perles fluorescentes ont transféré au gel (figure 1D). Couvrir les gels PA complètement avec du PBS, placez le plat couvercle Petri sur chaque plat, et conserver à 4 ° C.
3. fonctionnalisation gel PA avec la fibronectine
- Préparer les solutions ci-après prémélangés, comme décrit dans un protocole établi 11: solution de trempage (137 mM NaCl, 5% (v / v) de glycerol) et le tampon 2x de conjugaison (0,2 M 2 (N-morpholino) de l'acide éthanesulfonique (MES), 10 % (v / v) de glycerol, pH 4,5).
- Utilisez une pompe à vide dans une hotte biologique pour éliminer tous PBS des plats à fond de verre contenant les gels PA.
- Pipette solution de trempage sur chaque gel tel que le gel est complètement submergé. Incuber à température ambiante pendant au moins 1 heure.
- Chaud 1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl] carbodiimide chlorhydrate (EDC) et du N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) à température ambiante.
- Mélanger 10x solutions d'EDC (150 mM, 19 mg / ml dans de l'eau DI) et NHS (250 mM, 29 mg / ml dans de l'eau DI).
- Mélanger 1 partie 10x EDC, une partie 10x NHS, 3 pièces d'eau DI, et 5 parties 2x tampon de conjugaison.
- Utilisez une pompe à vide dans une hotte biologique pour éliminer la solution de trempage. Assurez-vous que tout le liquide est enlevé de la surface du gel.
- Ajouter suffisamment de solution NHS / EDC pour couvrir la surface du gel et de remplir le puits de la boîte de Petri (150-250 pi) à fond de verre. Incuber à température ambiante pendant 30 min dans l'obscurité.
- Fibronectine décongeler à température ambiante. Une fois décongelé, mélanger l'eau déminéralisée stérile pour créer un / ml solution de fibronectine 50 pg.
- Utilisez une pompe à vide dans une hotte biologique pour éliminer les solu NHS / EDCtion. Assurez-vous que tout le liquide est enlevé de la surface du gel.
- Ajouter 150 ul de solution de fibronectine à chaque gel. Incuber à température ambiante pendant 35 min pour permettre la fixation de fibronectine.
- Après 35 min, ajouter PBS dans chaque boîte de Pétri et conserver à 4 ° C pendant 2 semaines.
4 Expérimentations la force de traction
- Médias chaud de la cellule, du PBS, et de la trypsine à 37 ° C dans un bain d'eau.
- Rincer gels 5x avec du PBS stérile, aspirer le PBS entre les rinçages, et laissez le à couvert dans la hotte.
- Ajouter 1 ml de trypsine par cm 2 à 25 cellules du flacon contenant. Après que les cellules sont soulevés de ballon, diluer la trypsine avec les médias de cellules et de compter les cellules. Sur la base de la surface de gel, de déterminer le nombre de cellules nécessaires pour gel pour une densité finale de l'ensemencement des cellules de 3.000 cellules / cm 2. Diluer ou concentrer la suspension de telle sorte que 150 ul du mélange cellules-support contient ce nombre de cellules. Aliquotes de 150 pi de suspens cellulairesd'ions sur chaque gel.
- Placez les boîtes de Pétri contenant des cellules dans un incubateur pendant 30 min. Ensuite, retirer soigneusement les boîtes de Pétri et remplir le reste de la boîte de Pétri avec les médias (environ 2 ml) de telle sorte que la surface de la boîte est complètement submergé.
- Placez les boîtes de Pétri dans l'incubateur jusqu'à ce que l'acquisition de l'image.
- Préparez le système d'acquisition microscope et données pour l'imagerie: insérer l'objectif à immersion 40x de l'eau, insérer le contraste d'interférence différentiel (DIC) prisme, sélectionnez le mCherry ou filtre fluorescent équivalent, et tourner sur la chambre de l'environnement.
- Lorsqu'il est préparé pour l'imagerie, enlevez une boîte de Pétri de l'incubateur et le placer délicatement sur la platine du microscope. Retirez le couvercle plat de Pétri pour l'imagerie DIC.
- Recherchez une seule cellule et capturer une image fixe unique de la cellule en DIC.
- Sans bouger la platine du microscope, changer le mode d'imagerie à fluorescence. Concentrez-vous sur les microsphères fluorescentes et record une image des microsphères.
- Retirez délicatement les médias de la cellule à partir de la boîte de Pétri avec une pipette et ajouter 0,05% de trypsine-EDTA.
- Image, les microsphères sous la cellule après avoir détaché les cellules.
- Utilisation par images de particules (PIV) analyse ImageJ 12 pour calculer le champ de déplacement en raison des forces cellulaires.
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Representative Results
L'imagerie confocale a été utilisé pour déterminer que les billes sont bien en dessous de la surface du gel et de quantifier leur localisation précise dans la profondeur de gel. Des billes fluorescentes de longueur d'onde différente de celle à l'intérieur du gel ont été autorisés à se déposer sur la surface, et la distance entre les nanoparticules fluorescentes incorporées et celles sur la surface a été calculée en utilisant un algorithme d'identification du centre de gravité. L'emplacement de la bille sur la surface du gel sert de référence pour la surface supérieure du gel, où les cellules appliquer une force sur l'adhésion à la surface. Un schéma des deux scénarios envisagés (perles vertes dans le gel avec des perles rouges sur la surface, et vice-versa) est illustré à la figure 3. L'algorithme interpole la hauteur z de l'emplacement centroïde en trois dimensions. Nous avons répété ce processus pour trois gels de rigidité (1, 10, et 40 kPa) et deux taille (diamètre) des billes fluorescentes (0,1 um rouge et 1 um jaune-vert). La distanceentre un bourrelet à l'intérieur du gel et son voisin le plus proche d'une longueur d'onde différente est déterminée en fonction de son centre de gravité en trois dimensions. figure 4 montre la distribution spatiale des billes (sur la surface supérieure et noyés) et la vue projetée sur le plan YZ. Ce dernier fournit les profondeurs de toutes les perles de la surface du gel.
La profondeur moyenne de 0,1 um de perles est de 619 nm, 467 nm, 278 nm pour des gels d'AP de rigidité 1, 10 et 40 kPa, respectivement (Figure 5A). Les profondeurs correspondantes pour une um de perles d'un diamètre de 40 nm -20 kPa, gels 12 nm à 10 kPa gels et 1255 nm dans une gels kPa (Figure 5B). L'imagerie confocale a également été effectuée sur des gels avec des perles dispersées dans le gel comme cela a été traditionnellement utilisé pour des gels d'AP destinés à des études de microscopie à force de traction. La profondeur des perles dispersées dans le gel PA a été mesurée en utilisant le même algorithme décrit précédemment et est comparé à la depths aide de la technique, nous présentons ici. figure 6 illustre les variations de la dispersion de billes à l'intérieur de la profondeur d'un gel PA en utilisant des procédés de fabrication traditionnels.
Les fibroblastes se fixent à la surface du gel lors de PA fonctionnalisé avec de la fibronectine. Le champ de déplacement pour un cellulaire de fibroblastes et la couche de billes fluorescentes correspondant sont présentés dans la figure 7. Perles près de la périphérie de l'image semble légèrement floue. Ce n'est pas un défaut mécanique de la partie du gel, comme le verre reste intact lors de l'enlèvement à partir du gel. Au contraire, il est le résultat d'un effet d'optique dû à l'objectif à immersion dans l'eau utilisé dans cette expérience. Lors de l'addition de trypsine au support, la cellule est libéré à partir de la surface, ce qui entraîne le retour de la surface déformée de gel PA à l'état d'origine. Un algorithme de corrélation croisée a été utilisée pour calculer le champ de déformation sur la base de déplacements de talon 10. Laillustre une carte déplacement polarisation dominant des forces de traction de la cellule dans la direction y.
Figure 1: Illustration des processus de fonctionnalisation pour le capot supérieur en verre glisse avec PDL et perles fluorescentes. feuillets (A) de couverture en verre (en bleu) sont incubés avec 0,1 mg / ml PDL (orange) pendant 1 heure. L'air comprimé est utilisé pour souffler sur les lamelles sec et retirez le PDL. Feuillets (B) de la couverture de verre sont incubées avec une solution de 100 nm de diamètre billes fluorescentes pendant 5-10 min, puis éliminés par application d'air comprimé. Une couche de billes reste électrostatique couplée à la lamelle couvre-objet (C). Lamelles couvre-fonctionnalisé avec des billes de gel sont utilisés PA sandwich avec une surface de verre activée. (D) lors du retrait du couvercle supérieur glissement suivant PA gel polymerization, les perles sont situés à l'intérieur et très près de la surface du gel. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Gel PA surface contenant 0,1 um de diamètre de perles fluorescentes. Avant le revêtement de la lamelle couvre-objet en verre haut PDL-traité avec des billes, la solution a été diluée de talon (A) 10 000 fois (3,64 x 10 8 billes / ml) et (B) 20.000 fois (1,82 x 10 8 billes / ml). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
![Figure 3]("/files/ftp_upload/51873/51873fig3highres.jpg")
Figure 3 l'interface substrat-cellulaire avec des billes localisées près de la surface du gel. Un schéma de deux scénarios dans lesquels l'emplacement de talon à l'intérieur d'un gel PA a été quantifiée en utilisant la microscopie confocale et un algorithme d'identification centroïde. Le premier scénario est représenté en (A) des billes rouges 100 nm de diamètre à l'intérieur du gel et vertes 1 um billes de diamètre sur la surface, et le second (B) Vert 1 perles um de diamètre à l'intérieur du gel et rouges billes 100 nm de diamètre sur la surface. (C) Une illustration de bande dessinée d'une cellule (jaune) ont adhéré à un gel (bleu) avec des perles rouges localisées à l'intérieur du gel près de sa surface et un cordon vert assis sur sa surface. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 tranche confocale (XY, au centre) et accompagnant YZ (à gauche) des vues de projection d'un gel à 0,1 um billes rouges incorporés dans le gel et 1 um à la surface des billes. Les unités utilisées pour tous les axes sont en nanomètres. Événements occasionnels de perles rouges au-dessus ou dans le même plan que les perles vertes sont attribués à léger chevauchement dans les spectres d'émission de fluorescence pour le rouge (mCherry) et verte (GFP). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 histogrammes de la profondeur de perles confinés près de la surface supérieure du gel PA. Raideurs 1 kPa, 10 kPa et 40kPa sont représentés par bleu, rouge et noir, respectivement. Une courbe de Gauss a été ajusté à chaque ensemble de données et la valeur de x correspondant à son amplitude est interprété comme la profondeur moyenne des billes. Deux scénarios ont été testés:. (A) 0,1 um perles à l'intérieur du gel avec 1 um perles sur la surface, et (B) 1 um perles à l'intérieur du gel avec 0,1 um perles sur la surface S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: histogrammes de la profondeur de billes intégré arbitrairement tout au long de gel PA en utilisant une méthode de fabrication traditionnelle (noir) et des perles localisées près de la couche supérieure de gel PA en utilisant cette technique (rouge) pour des gels d'AP de rigidité A) 1 kPa, B) 10 kPa,et C) de 40 kPa. médaillon montre la profondeur des perles dans les deux types de gel dans la partie supérieure plus 10 um du gel. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure champ 7. déplacement en raison de la traction de la cellule. Image de contraste (A) de la phase d'un fibroblaste sur gel 10 kPa. (B) du champ de déplacement généré par la traction générée par le fibroblaste. barre de couleur indique perle déplacement en nanomètres. (C) l'image de fluorescence de 0,1 um billes de diamètre en dessous d'une cellule avant traitement à la trypsine. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8: Illustration de l'emplacement moyenne de perles à l'intérieur du gel par rapport à une autre taille / longueur d'onde perles assis sur la surface du gel. La rigidité de PA gel diminue de gauche à droite (40 kPa, 10 kPa, 1 kPa). (A) 0,1 um billes de diamètre rouges à l'intérieur du gel et verts 1 um billes de diamètre sur la surface. (B) Vert 1 um perles de diamètre à l'intérieur du gel et rouges 0,1 um billes de diamètre sur la surface. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .
Figure 9 Distribution de valeurs théoriques pour τ / μ basées sur différentes profondeurs de talon. Perles de 0,1 pm de diamètre ont été soit uniformément dispersé ou localisée à proximité de la surface de (A) 1 kPa gels, (B) 10 gels kPa, et (c) 40 gels kPa . La flèche d'or indique la valeur de τ / μ pour le z = 0 cas, dont les perles sont sur la surface du gel. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| E (kPa) | 40% d'acrylamide (pi) | BRI (concentration) | 2% de la BRI (pl) | MM HEPES (en ul) 100 | 0,1 | 625 | 0.00009 | 22,5 | 4225 |
| 0,25 | 625 | 0,0001 | 25 | 4222,5 | |||||
| 0,5 | 625 | 0.00011 | 27,5 | 4220 | |||||
| 0,75 | > 625 | 0,0002 | 50 | 4197,5 | |||||
| 1 | 625 | 0,0003 | 75 | 4172,5 | |||||
| 1.5 | 625 | 0,0004 | 100 | 4147,5 | |||||
| 2 | 625 | 0,0005 | 125 | 115px; "> 4122,5||||||
| 2.5 | 625 | 0,0006 | 150 | 4097,5 | |||||
| 3 | 625 | 0,0008 | 200 | 4047,5 | |||||
| 3.5 | 625 | 0,0009 | 225 | 4022,5 | |||||
| 4 | 0,001 | 250 | 3997,5 | ||||||
| 4.5 | 625 | 0,0012 | 300 | 3947,5 | |||||
| 5 | 625 | 0,0014 | 350 | 3897,5 | |||||
| 5.5 | 625 | 0,0016 | 400 | ||||||
| 6 | 625 | 0,0018 | 450 | 3797,5 | |||||
| 6.5 | 625 | 0,002 | 500 | 3747,5 | |||||
| 7 | 625 | 0,0022 | 550 | 3697,5 | |||||
| 7,5 < / Td> | 625 | 0,0024 | 600 | 3647,5 | |||||
| 8 | 1000 | 0,001 | 250 | 3622,5 | |||||
| 10 | 1000 | 0,0013 | 325 | 3547,5 | |||||
| 15 | 1000 | 0,002 | 1px; "> 5003372,5 | ||||||
| 20 | 1000 | 0,0027 | 675 | 3197,5 | |||||
| 30 | 1000 | 0,0037 | 925 | 2947,5 | |||||
| 40 | 1000 | 0,0048 | 1200 | 2672,5 |
Table1. PA Gel chimiques concentrations basé sur le module de Young. Pour un module d'élasticité de gel PA souhaité, les concentrations indiquées d'acrylamide, bisacrylamide, et tampon HEPES devrait être complété avec de l'acide acrylique 5 pi, 25 pi de 10% de persulfate d'ammonium (APS), et 2,5 pi Temed.
| z (pm) | u x ((τ / μ) um) |
| 0 | 0,750 |
| 0,394 | |
| 1 | 0,237 |
| 1.5 | 0,164 |
| 2 | 0,124 |
| 2.5 | 0,100 |
| 3 | 0,083 |
| 3.5 | 0,071 |
| 4 | 0,062 |
| 4.5 | 0,056 |
| 0,050 |
Tableau 2: Les déplacements en fonction de τ / μ correspondant à la profondeur, z, de perles de la surface du gel sur la base de la théorie de Boussinesq.
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Discussion
En utilisant cette technique, il est essentiel que la solution de talon est correctement dilué et les perles sont choisies en fonction du diamètre désiré, la rigidité du substrat PA de gel, et l'échelle de la taille des phénomènes qui sont explorées dans l'expérience souhaitée.
Il faut être prudent lors de la dilution de la solution de billes avant fonctionnalisation top des lamelles de verre. L'espacement entre les billes sur la surface du gel peut être modifiée en changeant le facteur de dilution de la solution de colloïde. La dilution de la solution trop réduira le nombre de perles qui couplent à la lamelle couvre-objet et finalement de réduire le nombre de billes dans le gel. La dilution de la solution trop petit peut donner une trop grande densité de billes dans le gel de telle sorte qu'ils sont en contact et ne peuvent être distingués les uns des autres. Alors qu'il est souvent impossible d'éviter complètement la présence de l'agrégation des nanoparticules, l'application d'ondes ultrasonores de la solution diluée minimise efficacement nanagrégation oparticle. Nous avons constaté qu'une 10 000 fois la dilution de la solution de colloïde utilisé dans ce protocole donne une concentration de billes de 3,64 x 10 8 perles / ml, et on obtient une densité de particule souhaitable de 0,05 perles / um 2 à 0,1 um billes de diamètre. A 1: 20 000 dilution (1,82 x 10 8 billes / ml) donne une moyenne de 52 um par particule 2 La figure 2 montre des images de la surface de gels de différentes dilutions.. Il convient de noter qu'il existe une variabilité dans le nombre de perles qui transfèrent au gel. Cela est dû à la variabilité d'élimination de la solution de talon de la lamelle couvre-objet avec de l'air comprimé au cours de la fonctionnalisation. En général, nous avons trouvé que l'augmentation du facteur de dilution par au moins un facteur de deux en résulte constamment dans au moins un doublement de la zone par bille.
Il est également essentiel de choisir une taille de perles (diamètre) qui se traduira par une immersion totale de til perle à l'intérieur du gel lors de la polymérisation PA. rigidité de gel affecte l'emplacement de billes comme le montre la figure 5A. Pour 0,1 um de diamètre des billes, la profondeur de talon augmente avec la diminution de la rigidité. Ceci pourrait être le résultat de la relation inverse entre la taille de pore et la rigidité de gel PA 13. Pour l'ensemble des trois gels testés rigidité, les billes sont localisés à l'intérieur uniformément le gel, et à moins de 1 um de la surface du gel comme illustré sur la figure 8A. La position moyenne de 1 um perles dans le gel varie aussi avec raideur. Elles sont ancrées plus profondément (environ 1,25 um) dans les gels 1 kPa. Pour les 10 et 40 gels kPa, l'emplacement de la partie supérieure de 1 um billes de diamètre est comprise entre environ 0,5 um au-dessus de 0,5 um en dessous du gel (figure 5) de surface, ce qui signifie que les billes de temps en temps font saillie à travers la partie supérieure du gel (Figure 8B). Cela est préjudiciable car il introduit topographie pour les cellules, et la topographie est connu pour affecter les interactions cellule-substrat 14. Ainsi, il est nécessaire d'être conscient de choisir des perles pour cette technique lors de la préparation des gels d'une rigidité spécifique. Sur les deux tailles de perles utilisées pour caractériser cette méthode, 0,1 um de diamètre prouve la taille optimale. D'autres tailles de billes peuvent être utilisés dans cette technique, mais doivent être étalonnés en utilisant la microscopie confocale que nous décrivons ici, pour comprendre la profondeur précise à laquelle les billes sont localisés pendant la polymérisation en gel.
Cette technique permet d'améliorer la résolution spatiale de billes en gel PA par augmentation du nombre de particules distinguables à l'intérieur du champ de vision. La localisation des billes à une couche proche de la partie supérieure du gel n'affecte pas de manière significative la rigidité du gel composite. Isocontrainte théorie composite est utilisé pour calculer le module d'élasticité composite, E c, seulement la couche 1 um d'épaisseur de gel contenant beads comme
où E f est le module d'élasticité des billes de polystyrène (3 GPa), E m est le module d'élasticité de la matrice de gel (10 kPa), et V f et V m sont des fractions de volume des billes et de la matrice de gel, respectivement. Etant donné que les billes comprennent seulement 0,03% du volume, E c = 10,0025 kPa n'est pas significativement différent de celui du module élastique d'un gel isotrope de rigidité 10 kPa. Procédé de fabrication d'établi gels d'AP de réduire le temps de polymérisation à 30 sec, ce qui minimise l'effet de la gravité sur la répartition des billes en cours de polymérisation 15. Notre procédé est basé sur le (~ 30 min), le temps de polymérisation plus longue pour les billes à polymériser dans le gelde telle sorte qu'ils ne font pas saillie de la surface du gel. Parce que la localisation des perles à une seule couche n'affecte pas significativement la rigidité de gel composite, et le plus polymérisation aides de temps dans le transfert de billes dans la matrice de gel, nous n'avons pas intégrer toute mesure visant à réduire le temps de polymérisation dans notre technique.
Notre technique montre comment localiser les billes à l'intérieur d'une profondeur connue gel PA, ce qui améliore la mesure de la déformation du substrat, et donc le calcul de forces de traction de la cellule. Une approche théorique de quantifier les forces de traction cellulaires a déjà été signalé 16,17. Cette approche traite le substrat de gel comme un solide semi-infini en demi-espace élastique. La solution de Boussinesq est utilisée pour résoudre le problème inverse de calcul de forces de traction à partir d'un champ de déplacement. Nous utilisons une version simplifiée de la Boussinesq intégrante de quantifier l'erreur dans la mesure du déplacement dû à des billes de gel distales surface 18. L'équation pour le déplacement dans une direction donnée sur la base d'une contrainte de cisaillement appliquée, τ, sur un rayon donné, R, est donnée par
u où x est le déplacement dans la direction x, μ est le module de cisaillement, et z est la profondeur des perles de la surface du gel. Pour les différents emplacements des billes sur toute la profondeur du gel, les déplacements correspondants sont présentés dans le tableau 2.
Dans le cas représenté ici, le rayon est estimé à une taille d'adhésion focale moyenne de 1 pm. Si les perles sont supposés être coplanaires avec les cellules (Z = 0), le déplacement est donnée par τ 0,75 / μ. Si les perles sont seulement 1 pm au-dessous de la surface du gel, le déplacement est donnée par τ 0,24 / μ. Cereprésente supérieure à une réduction de la triple dans un même plan de déplacement de la bille avec la surface à un emplacement en dessous de 1 um. Cela introduit une erreur dans le calcul de forces de traction de la surface en fonction du mouvement de billes incorporés dont les emplacements à l'intérieur du gel ne sont pas connus précisément. La variation de traction défini par τ / μ, en fonction de la profondeur des billes dans le gel à la fois les méthodes de fabrication envisagées et traditionnels est importante. Figure 9 montre la répartition des forces (donné par le rapport τ / μ) sur la base sur la théorie de Boussinesq, résultant de calcul utilisant la distribution des profondeurs de perles, z, dans la profondeur optique de champ lorsque les billes sont réparties uniformément dans le gel et localisés près de la surface. La mesure la plus précise de la force de la cellule en résulterait si les perles sont sur le même plan que les cellules, où z = 0 et τ / μ = 0,0133. Par rapport à ce cas, τ / μ augmente de 118%, 80%, 50% et de 1 kPa, 10 kPa et 40 kPa gels, respectivement, lorsque les billes sont localisés à proximité de la surface à l'aide de la technique que nous proposons. Lorsque les billes sont réparties uniformément sur toute la profondeur de gel, τ / μ augmente un supplément de 60%, 80% et 150% au-delà de l'augmentation induite par la localisation de billes à proximité de la surface, de 1 kPa, 10 kPa et 40 gels kPa, respectivement. Ceci représente une erreur totale de près de 200% dans les calculs de traction lorsque les billes sont réparties dans toute la profondeur du gel. Ainsi, la localisation des billes à une profondeur connue dans le gel permet d'améliorer la précision dans la mesure de déplacement et les forces de traction de la cellule.
La technique décrite ici présente une nouvelle façon de préparer PA substrats de gel pour des applications force de traction de microscopie telles que les billes sont localisés près de la surface du gel. Confiner les perles à une profondeur connue dans gel PA fournit de nouvelles informations sur le déplacement réel des perles lors de l'application de la force de cellule, créant hminerai image précise de la façon dont les cellules sont déforment leur substrat sous-jacent.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Programme Initiative interdisciplinaire de l'innovation, de l'Université de l'Illinois, 12035 accorder. SK a été financé à UIUC de la National Science Foundation (NSF) de Grant 0965918 IGERT: Former la prochaine génération de chercheurs en mécanique moléculaire et cellulaire et Bionanotechnology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 70% Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 111-30-8 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| 40% Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| 2% Bisacrylamide | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| 0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry) | Invitrogen | F8801 | |
| Fibronectin, Human, 1 mg | BD Biosciences | 354008 | |
| Ammonium persulfate | Bio-RAD | 161-0700 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-RAD | 161-0801 | |
| Poly-D-lysine | Millipore | A-003-E | |
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
| N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25300-054 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Acrylic acid | Sigma-Aldrich | 147230 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Materials | |||
| 35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass | In Vitro Scientific | D35-14-1-N | |
| Glass cover slips, 12 mm diam. | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
References
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