Summary
蛍光プローブを含有するポリアクリルアミド（PA）ゲルを製造するための伝統的な技術は、接着面とスライドガラスの間にゲルを挟むことを含む。ここでは、ポリ-D-リジン（PDL）および蛍光プローブを用いたこのスライドを被覆するゲル表面から1.6ミクロン以内のプローブを局在化することを示している。
Abstract
PAゲルは長い製作、チューニング、その弾性特性をする能力の容易さに起因する細胞牽引力を研究するためのプラットフォームとして使用されてきた。基質は細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされたとき、細胞がゲルに付着し、ゲルを変形させる、力を加える。変形は、細胞牽引力とゲルの弾性特性に依存します。表面の変形場が既知の場合、表面牽引弾性理論を用いて計算することができる。ゲルの変形は、一般的にゲル中に均一に蛍光マーカービーズを埋め込むことによって測定される。プローブは、ゲルが変形として変位する。ゲルの表面近くでプローブが追跡されます。これらのプローブによって報告変位が表面変位と見なされる。表面からの彼らの深さは無視されます。この仮定は、牽引力評価に誤差が導入されています。ビーズの位置が知られるために、細胞の力の正確な測定のためには重要である。私たちは、開発した表面の1.6μmの範囲内、PAゲル中で、直径が0.1〜1μmのを蛍光マーカービーズを閉じ込めるために、単純な化学的性質を利用した技術。私たちはコートポリ-D-リジン（PDL）とカバーガラスと蛍光ビーズ。 PAゲル溶液を次にカバースリップと付着面の間に挟まれている。蛍光ビーズは、硬化中にゲル溶液を移す。重合後、PAゲルは、ゲル表面に近い面上に蛍光ビーズが含まれています。
Introduction
その局所環境との生体細胞の機械的相互作用は、一般的にPAゲルを用いて研究されている。これらの基板は、これらの基質の主な利点の1つは1997年にDemboおよびWangによって確立単純な、十分に特徴付けられたプロトコルに依存して、その剛性がゲル溶液の特定の成分の濃度を変更することによって調整することができるということである。これは、異なる剛性の環境と細胞の相互作用を研究するのが望ましいのプラットフォームを提供します。 PAゲルを、細胞外マトリックス（ECM）タンパク質で被覆されている場合には、細胞が力を発生させる、それらに付着する。細胞力の結果として、ゲルは、弾性体として変形する。この変形は、細胞およびゲルの弾性特性によって印加される力の大きさに依存する。さまざまな研究は、細胞の牽引力を調査するためにPAゲルを採用している。
PAゲル製造の一変形例では、蛍光ミクロスフェア（ビーズ）tで埋め込まれている異なる剛性2のゲル上の細胞牽引力を定量化するためにゲルをhroughout。細胞力を印加すると、ビーズは、ゲル変形に追従し、その初期の場所から移動さ。変形場は、個別のビーズの変位から測定される。この変形場は、弾性理論と牽引力を計算するために、ゲルの弾性特性を用いて利用される。これらの測定は、細胞が機械的に感知し、それらの局所微小環境3と対話する方法についての洞察を提供しています。
多くの広く使用されているPAゲルの製造のプロトコルでは、ビーズはその液体、未重合状態のPAゲル全体に混在している。完全に重合のPAゲルは、その体積全体蛍光ビーズが含まれています。細胞の牽引力を計算するときに、ゲル表面（細胞 - 基板界面）付近の最もビーズが監視される。これらのビーズの変位は、力で簡単にするために、細胞培養表面上で起こると仮定されるcalculationは。ゲルの深さの中のビーズの実際の位置は無視されます。しかし、弾性媒質中（例えば、PAゲルなど）、力の作用点に近いビードが遠くにポイントからであるビード以上に移動します。このように、携帯トラクションの過小評価における表面の結果で、そのような面から遠位（ビーズの位置で）点の変位を処理する。誤差の程度は、表面からのビーズの距離に依存する。エラーは、ビーズの位置についての知識なしに推定することができない。
非常に細胞培養表面の近くでビーズを閉じ込めるための単純な方法の必要性は、いくつかの技術により対処されてきた。一つの方法は、非常に表面近傍の動きを測定するための上部焦点面内のビーズの十分な数があるようにゲル全体を通してビーズの密度を増加させることである。別の技術は、光のことを生細胞イメージングのための共焦点撮像チャンバーを構築することを含む最上部の焦点面での唯一のビーズは4収集されます。別の方法は、ビーズ5せずに、既に重合したゲルの上にビーズを含有するPAゲルの非常に薄い層を重ねることを含む。これらの技術のそれぞれの欠点は、ゲル内のビーズの正確な位置が分からないことである。これは、ビーズの変位場、したがって、細胞力の計算の計算に誤差が導入されています。別の技術は、スルホ-SANPAH 6を用いて既に重合PAゲルの上面にビーズの結合を伴う。この手法は、ビーズのみPAゲルの上に実際にいることを保証するが、それらはゲルの深さに埋め込まれている程度は不明である。従来の研究では、細胞が数ミクロン離れて7の力を感じることができることを示唆しているので、これは潜在的に、細胞の挙動を変化させることができ、細胞のためのローカルな地形を作成することができます。最近では、直径1μmfにPAゲルをパターニングするための技術正則配列内luorescentフィブロネクチンドットマーカーは、8を設立しました。この場合、蛍光マーカーの深さが知られており、フィブロネクチンパターンが間接的にゲル表面に印刷されるように、本質的にゼロである。 ECMタンパク質は、直径1μmドットに制限されているようしかし、この方法では、細胞が付着できる上に連続的な環境を提供していません。完全に極めて表面近くに既知の場所にPAゲル内トラッカービーズを統合し、それらを閉じ込めるための方法は未だ確立されなければならない。
ここでは、非常にPAゲル内の細胞培養表面の近くに焦点面にミクロン径蛍光ビーズ、サブミクロンを制限する技術を開発する。ゲルは、典型的には、2枚のガラス板の間に未重合液体ゲル溶液を挟んで硬化される。ゲルは強く、それに付着するようにプレートの一つは、官能化されている。他の非官能化し、ゲルが硬化した後に除去される。私たちは、この取り外し可能なガラスのsuを変更ビーズの層で被覆することによりデータポート。官能化及びビーズコーティングされたガラス表面との間に液体ゲルを挟む際に、ゲルビーズへの転送は、それが硬化される。これは、表面の1.6μmの範囲内にゲルにビーズ「統合の距離を制限。ガラス底ペトリ皿は、ゲルが硬化された接着性の表面として使用される。重合の間に平坦な頂ゲル表面を形成するために、円形のガラスカバースリップは、ガラス底ペトリ皿でのゲルサンドイッチに使用される。ゲルの製造に先立って、上部ガラスカバースリップは、正の表面電荷を生じる、ポリ-D-リジン（PDL）でコーティングされている。 PDLは、圧縮空気で吹き飛ばしており、水中のビーズの溶液をカバースリップ上に堆積される。私たちは、負の電荷を運ぶカルボキシル化蛍光マイクロビーズを利用して、PDLで処理することによって作成された、正に帯電した表面と相互作用する。圧縮空気でカバースリップオフビーズ溶液を吹き付けた後、単層のビーズは、静電的に乾燥したカバースリップに結合されたままになります。ガラススライドに損傷がなく、完全に無傷のPAゲルから除去されるように、PDLコーティングは、ゲル表面にガラスの接着性には影響しません。
ガラス底ペトリ皿は、97％3 - アミノプロピル - trimethoxyslianeおよび0.5％グルタルアルデヒドで処理することにより付着行われる。希望剛性のPAゲルは、標準的な手順9を介してビスアクリルアミドとアクリルアミドの適切な濃度を混合することにより作成される。ゲル溶液の液滴は、ガラス底ペトリ皿上にピペットされる。ビーズを含むガラスカバースリップをペトリ皿にゲルを挟むために使用される。ゲルが硬化した場合、トップカバースリップは、表面から1.6μmの範囲内のPAゲル中に埋め込まれたビーズを残して削除されます。
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Protocol
製造および細胞培養表面の近くに埋め込まれた蛍光ミクロスフェアとの剛性を変化させるPAゲルを官能化する。
1トップガラスカバースリップを官能
- クリーンガラスカバースリップ（＃1.0、12mmのDIAM。）石鹸と水で、余分なゴミを除去するためにエタノールが続く。
- それらはカバースリップとの相互作用を容易にするために触れないようおろし面に置き、ガラスカバースリップ（ すなわちピペットチップホルダー）。
- コートカバーの表面全体が1時間（ 図1A）のためのポリ-D-リジン（0.1 mg / ml）を用いてスリップ。
- この時間の間、1行う：直径0.1μmのコロイド溶液の10,000希釈し、脱イオン（DI）水を用いて赤色蛍光ミクロスフェアは、ゲル表面上に20μmの2当たり約1マイクロスフェアの粒子密度を得る。さまざまな希釈の結果については、図2を参照してください。このdilutionは、特定の実験の必要性を満たすように修正することができる。
- 30分間の超音波水浴中で希釈した溶液を配置します。
- 1時間後、慎重に各カバースリップを持ち上げ、空気で乾燥爆破するピンセットを使用しています。すりおろした表面にドライカバースリップを返します。
- 各カバースリップの上に超音波浴とピペットを150μlから希釈したコロイド溶液を削除します。 10分（ 図1B）に向けて出発。
- 慎重に各カバースリップを持ち上げ、空気で乾燥送風するピンセットを使用してください。使用するまで暗所におろし面とストアに乾燥カバースリップを返します。
直接グラスボトムペトリ皿上のPAゲルの準備2。
- 100℃に予熱ホットプレート。
- 化学ヒュームフード内の平らな面に（14ミリメートルマイクロウェル、＃1.0と35mmディッシュ）ガラス底ペトリ皿の所望の数をレイアウト。
- 97％3 - アミノプロピル - trimethoxys各ペトリ皿のマイクロウェルのガラス部分をカバーつる植物化学的活性化のために7分間（3-APTES）。ポリスチレンの劣化を避けるために、ペトリ皿プラスチックの表面に3-APTESの不注意液だれしないように注意してください。
- 7分後、DI水を用いてペトリ皿に充填し、廃棄物容器に廃棄する。
- その後繰り返し各皿のためのステップ2.4の3倍、そして余分な水を除去するためにペトリ皿を振る。ガラス部分が乾燥するまでホットプレート上でペトリ皿を置きます。
- ホットプレートからシャーレを取り出し、化学ドラフト内で平らな面に戻ります。
- 化学ドラフト内で、0.5％グルタルアルデヒドの溶液を作製し、30分間溶液を各ウェルシャーレのガラス部分を覆う。プラスチックの劣化を避けるために、ペトリ皿プラスチックの表面にグルタルアルデヒドの不注意滴下をしないように注意してください。
- 30分後、DI水を用いてペトリ皿に充填し、すすぐために廃棄物容器に廃棄しglutaraldを除去ルデヒド。
- その後繰り返し各皿のためのステップ2.4の3倍、そして余分な水を除去するためにペトリ皿を振る。ガラス部分が乾燥するまでホットプレート上でペトリ皿を置きます。
- PAゲル溶液の成分を混合する前に、ガラス底のゲルの迅速な挟み込みを考慮して、それらが容易にアクセス可能であるように化学ヒュームフードに官能化ガラススライドを移動させるゲル溶液を混合した後、ペトリ皿。
- 15mlの遠心管中で、所望のマトリックス弾性を達成するために、（公開されたプロトコル10から適応） 表1に列挙された濃度で、即時に連続して40％ビスアクリルアミド、2％のアクリルアミド、およびアクリル酸を混合する。
- ゲル溶液を完了するために、所望のマトリックス弾性に対応する表1に列挙される量で、100mMのHEPES、10％の過硫酸アンモニウムおよびTEMEDを加える。
- すぐにガラス部分の中央にゲル溶液の15μlのピペットペトリ皿の。
- すぐにピンセットで官能化されたガラスカバースリップを拾う。
- 蛍光ビーズは、ゲル溶液との副意思コンタクト上になるように上のガラスカバースリップを反転します。
- 官能化された側は、ゲル（ 図1C）に接触するようになりました-液体PAゲルの上に静かにカバースリップを置きます。注：最良の結果を得るには、二人目は、複数のペトリ皿上に液体のPAゲル溶液をピペットしながら、部分重合の可能性を避けるために、カバースリップを追加する役割をすることをお勧めします。
- PAゲルの下位レベルに重合した蛍光ナノ粒子上の重力の影響を回避することを支援するために、すべてのペトリ皿を裏返し。
- 少なくとも35分間待って、またはPAゲルの原液は目に見えて、その遠心管中で重合されるまで。
- 振り返ってペトリ皿を裏返して、カバースリップを除去しながら支援するために、PBSでそれらを埋める。
- 慎重にカバースリップの周囲を掻き取るピンセットを使用して、ペトリ皿のガラス部分およびカバースリップの輪郭に接触する。カバーガラスが脱落するまで、数サイクルを実行します。カバースリップを外し、適切な鋭利物廃棄容器に廃棄してください。
- すべてのカバースリップを除去した後、蛍光ビーズは、ゲル（ 図1D）に移しています。 PBSで完全にPAゲルをカバーし、各皿にペトリ皿のふたを置き、4℃で保管してください。
3フィブロネクチンとPAゲルを官能
- 溶液（137mMの塩化ナトリウム、5％（v / v）グリセロール）に浸し、2×結合緩衝液（0.2 M 2（Nのモルホリノ）エタンスルホン酸（MES）、10：確立されたプロトコル11で説明したように、以下の予混合溶液を調製する％（v / v）グリセロール、pH4.5中）。
- PAゲルを含むガラスボトムディッシュからすべてのPBSを除去するために、生物学的フード内の真空ポンプを使用してください。
- ピペットでteのゲルが完全に水没するように、各ゲル上に溶液を浸します。少なくとも1時間室温でインキュベートする。
- 室温に1 -エチル-3 - [3 -ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDC）及びN -hydroxysulfosuccinimide（NHS）暖かい。
- EDC（150mMの、19 mg / mlのDI水中）およびNHS（250ミリモル、29 mg / mlのDI水中）の10倍の溶液を混合する。
- 1部の10倍のEDC、1部の10倍のNHS、3部DI水、および結合バッファー2×5部を混ぜる。
- 浸す溶液を除去するために、生物学的フード内の真空ポンプを使用してください。すべての液体をゲル表面から除去されていることを確認します。
- ゲル表面を覆い、ペトリ皿（150〜250μl）を、ガラス底のウェルを満たすのに十分なNHS / EDC溶液を添加する。暗所で30分間室温でインキュベートする。
- 室温で解凍フィブロネクチン。解凍したら、50μg/ mlのフィブロネクチンソリューションを作成するの滅菌DI水を混ぜる。
- NHS / EDCソリューを除去するために、生物学的フード内の真空ポンプを使用しる。すべての液体をゲル表面から除去されていることを確認します。
- 各ゲルにフィブロネクチン溶液150μlを追加します。フィブロネクチンの結合を可能にするために35分間室温でインキュベートする。
- 35分後、2週間まで4℃で各ペトリ皿や店舗に、PBSを追加します。
4。トラクションフォース実験
- 温かい細胞培地、PBS、そして水浴中37℃でトリプシン。
- ゲルはリンスの間に、PBSを吸引、滅菌PBSで5倍、そしてフード内でカバーされたまま洗浄します。
- 細胞を含むフラスコに25cm 2の当たり1mlのトリプシンを追加します。細胞がフラスコから持ち上げられた後、細胞培地でトリプシンを希釈し、細胞をカウントします。ゲルの表面積に基づいて、/ cm 2で3,000細胞の最終細胞播種密度をゲルごとに必要な細胞の数を決定する。希釈してまたは細胞培地混合物を150μlの細胞のこの数を含むようにサスペンションを集中。一定分量の細胞suspens150μlの各ゲルに上のイオン。
- 30分間インキュベーター内で細胞を含有するペトリ皿を置きます。その後、慎重にペトリ皿を除去し、皿の表面が完全に水没するようなメディア（約2ml）を用いてペトリ皿の残りを埋める。
- 画像取得まで、インキュベーター内でシャーレをバックに配置します。
- 、微分干渉コントラスト（DIC）プリズムを挿入し、40倍の水浸対物レンズを挿入mCherryをまたは同等の蛍光フィルターを選択し、環境室をオンにします。イメージングのための顕微鏡とデータ収集システムを準備します。
- イメージングのために準備すると、インキュベーターから1ペトリ皿を取り外し、顕微鏡ステージ上で静かに置きます。 DICイメージングのためのペトリ皿のふたを取り外します。
- 単一のセルの位置を確認し、DIC内のセルの1枚の静止画をキャプチャします。
- 顕微鏡ステージを移動させることなく、蛍光を撮像モードに切り替える。蛍光マイクロスフェアとRECに注力微小球のイメージをORD。
- 慎重にピペットでペトリ皿から細胞培地を除去し、0.05％トリプシン-EDTAを追加します。
- イメージセル後のセルの下の微小球が切り離されている。
- 使用して粒子画像流速測定法（PIV）携帯力による変位場を計算するためにはImageJ 12での分析。
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Representative Results
共焦点イメージングは、ビーズがゲル表面の下に実際にあったことを決定するために、ゲル深度内にそれらの正確な位置を定量した。ゲル内のものとは異なる波長の蛍光ビーズは、表面上に沈降させ、埋め込み蛍光ナノ粒子表面上のそれらの間の距離は、重心の同定アルゴリズムを用いて計算した。ゲル表面上のビーズの位置はゲルの細胞表面への付着の際に力を加えるの上面の基準となる。 （緑色の表面上の赤いビーズを有するゲルビーズ、およびその逆）と考えつのシナリオの概略を図3に示す。アルゴリズムは三次元の重心位置のz高さを補間する。私たちは3剛性ゲル（1,10、および40キロパスカル）と二つの大きさ（直径）蛍光ビーズ（0.1μmの赤と黄緑が1μm）のために、このプロセスを繰り返した。距離ゲル内のビードとの間の異なる波長の最も近い隣人がその三次元重心に基づいて決定した。 図4（上面および埋め込 みに）ビーズの空間分布及びYZ平面上の投影図を示している。後者は、ゲルの表面から全てのビーズの深さを提供します。
0.1μmのビーズの平均深さは619ナノメートル、467ナノメートル、剛性1,10のPAゲルのための278nmであり、40キロパスカルであった（ 図5A）である。直径1μmのビーズに対応する深さは-20 40キロパスカルゲル中のナノメートル、10キロパスカルゲル中の12nmであり、1キロパスカルゲル（ 図5B）1,255 nmの。共焦点イメージングはまた、伝統的に牽引力顕微鏡研究のために意図PAゲルに使用されているようにゲル全体に分散ビーズをゲル上で実施した。 PAゲル全体に分散し、ビーズの深さは、以前に記載したのと同じアルゴリズムを使用して測定し、およびdと比較されここで提示する技術を使用してepthsは、 図6は、従来の製造方法を用いて、PAゲルの深さ内にビーズ分散の変動を示している。
フィブロネクチンで官能とき線維芽細胞は、PAゲル表面に付着。線維芽細胞および対応する蛍光ビーズ層用変位場は、 図7に示されている。画像の周辺部の近くのビーズのピントがわずかに見える。ガラスはゲルから除去すると、完全に無傷のままであるように、これは、ゲルの一部に機械的な欠陥ではありません。むしろ、本実験で使用した水浸対物レンズによる光学的効果の結果である。培地にトリプシンを添加すると、細胞は元の状態に変形したPAゲル表面の戻り、その結果、表面から放出される。相互相関アルゴリズムは、ビーズ10の変位に基づいて変形場を計算するために利用された。ザ·変位マップは、y方向のセル牽引力の支配的な偏光を示す図である。
トップガラスカバーのための官能化プロセスの図1。イラストは、PDLや蛍光ビーズでスリップ。 （A）ガラスカバースリップ（青）が1時間0.1 mg / mlのPDL（オレンジ）と共にインキュベートする。圧縮空気は、カバースリップブロードライし、PDLを除去するために使用される。（B）ガラスカバースリップは、圧縮空気を印加することにより、5〜10分間、100 nmの直径の蛍光ビーズ溶液とインキュベートし、次いで除去される。ビーズの1つの層は、静電的にカバーガラスに結合されたままになります。（C）カバーガラスビーズで官能活性化ガラス表面とサンドイッチのPAゲルに使用されている。（D）トップカバースリップを除去すると、PAゲルpolymerizat以下イオンは、ビーズが内部に配置され、非常にゲルの表面に近い。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
直径0.1μmの蛍光ビーズを含む図2のPAゲル表面はビーズでPDL処理されたトップカバーガラスを被覆する前に、ビーズ溶液は、（A）10,000倍（3.64×10 8ビーズ/ ml）および（B）で希釈し 、 2万倍（1.82×10 8ビーズ/ ml）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ゲルの表面付近に局在化ビーズを有する図3細胞-基板界面。PAゲル内のビーズの位置は、共焦点顕微鏡法および重心同定アルゴリズムを用いて定量した2つのシナリオの概略図。最初のシナリオは、ゲル内部の（ア）レッド直径100nmビーズと緑の直径1μmの表面にビーズ、および（B）は、ゲル内部のグリーンが1μm径のビーズの赤い100 nmの直径のビーズ中二に示されているその表面付近のゲルの内部に局在し、赤のビーズとその表面上に座って、緑のビーズとゲル（青）に付着した細胞の表面。（C）漫画のイラスト（黄色）。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。
赤いゲルに埋め込 ま0.1μmのビーズ表面に1μmのビーズとゲルの図4の共焦点スライス（XY、中央）とそれに付随するYZ（左）投影ビュー。すべての軸の単位はナノメートル単位である。上記または緑のビーズと同じ平面の赤いビーズの臨時の出現はわずかに赤色蛍光発光スペクトルの重複（mCherryを）と緑色（GFP）に起因すると考えられる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5のPAゲルの上部表面付近に閉じ込められたビーズの深さのヒストグラム。剛性1キロパスカル、10キロパスカル、および40キロパスカルは、それぞれ、青、赤、黒で表されている。ガウス曲線は、各データセットに当てはめであり、その振幅に対応するxの値がビーズの平均深さとして解釈されます。つのシナリオを試験した：（A）表面に1μmのビーズを用いたゲルの内部が0.1μmビーズと、（B）表面に0.1μmのビーズを用いたゲルの内部1μmのビーズをこれの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。フィギュア。
剛性AのPAゲルのために、この技術（赤）を使用して、PAゲルの最上層付近に局在従来の製造方法（黒）を使用して、PAゲル全体にわたって任意に埋め込 まれたビーズと、ビーズの深さを図6のヒストグラム）を1kPa、B） 10キロパスカル、およびC）40キロパスカル。挿入図は、ゲルの最上層は10μm以内の両方のゲルタイプのビーズの深さを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
セル牽引による図7。変位場。 10キロパスカルのゲル上の線維芽細胞の（A）位相コントラスト画像。（B）線維芽細胞によって生成された牽引力によって生成変位フィールド。カラーバーは、セルの下に直径0.1μmビーズ（C）蛍光画像はトリプシン処理の前に。ナノメートルで、ビーズの変位を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ゲル表面の上に座って、異なるサイズ/波長ビーズにゲル関連する内部ビーズの平均位置の図8。イラスト。左から右（40キロパスカル、10キロパスカル、1キロパスカル）に、PAゲル減少の剛性。（A）レッドゲル表面に緑色の直径1μmビーズ内部の直径0.1μmビーズ。ゲルの内部（B）グリーン直径1μmビーズ、表面に赤い直径0.1μmビーズ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 。
図9。ディτの理論値のstributionは/。さまざまなビーズの深さに基づいて、μのビーズは、直径0.1μmのいずれかに均一に分散または（A）1キロパスカルゲル、（B）は 10キロパスカルゲル、および（C）40キロパスカルゲルで表面付近に局在していた。金の矢印は、ビーズがゲル表面上である、z = 0 の場合、ためにτ/μの値を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| E（キロパスカル） | 40％アクリルアミド（μL） | BIS（濃度） | 2％BIS（μL） | 100のHEPES（μL） | 0.1 | 625 | 0.00009 | 22.5 | 4225 |
| 0.25 | 625 | 0.0001 | 25 | 4222.5 | |||||
| 0.5 | 625 | 0.00011 | 27.5 | 4220 | |||||
| 0.75 | > 625 | 0.0002 | 50 | 4197.5 | |||||
| 1 | 625 | 0.0003 | 75 | 4172.5 | |||||
| 1.5 | 625 | 0.0004 | 100 | 4147.5 | |||||
| 2 | 625 | 0.0005 | 125 | 115px; "> 4122.5||||||
| 2.5 | 625 | 0.0006 | 150 | 4097.5 | |||||
| 3 | 625 | 0.0008 | 200 | 4047.5 | |||||
| 3.5 | 625 | 0.0009 | 225 | 4022.5 | |||||
| 4 | 0.001 | 250 | 3997.5 | ||||||
| 4.5 | 625 | 0.0012 | 300 | 3947.5 | |||||
| 5 | 625 | 0.0014 | 350 | 3897.5 | |||||
| 5.5 | 625 | 0.0016 | 400 | ||||||
| 6 | 625 | 0.0018 | 450 | 3797.5 | |||||
| 6.5 | 625 | 0.002 | 500 | 3747.5 | |||||
| 7 | 625 | 0.0022 | 550 | 3697.5 | |||||
| 7.5 < / TD> | 625 | 0.0024 | 600 | 3647.5 | |||||
| 8 | 1000年 | 0.001 | 250 | 3622.5 | |||||
| 10 | 1000年 | 0.0013 | 325 | 3547.5 | |||||
| 15 | 1000年 | 0.002 | 1pxの; "> 5003372.5 | ||||||
| 20 | 1000年 | 0.0027 | 675 | 3197.5 | |||||
| 30 | 1000年 | 0.0037 | 925 | 2947.5 | |||||
| 40 | 1000年 | 0.0048 | 1200 | 2672.5 |
テーブルヤング率に基づいて、1 PAゲルの化学的濃度は、所望のPAゲルの弾性率は、アクリルアミド、ビスアクリルアミド、およびHEPES緩衝液のリストされた濃度は、25μlの10％過硫酸アンモニウム（APS）、5μlのアクリル酸を補充されなければならずTEMEDμlの2.5。
| Z（μm）と | uはX（（τ/μ）ミクロン） |
| 0 | 0.750 |
| 0.394 | |
| 1 | 0.237 |
| 1.5 | 0.164 |
| 2 | 0.124 |
| 2.5 | 0.100 |
| 3 | 0.083 |
| 3.5 | 0.071 |
| 4 | 0.062 |
| 4.5 | 0.056 |
| 0.050 |
表ブシネスク理論に基づくゲル表面からビーズの深さに対応するτ/μの関数としての2変位、zは 、。
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Discussion
この技術を使用する場合は、ビーズ溶液が適切に希釈し、ビーズを所望の直径、PAゲル基材の剛性、および所望の実験で調査された現象の大きさの尺度に基づいて選択されることが不可欠である。
トップガラスカバースリップを官能する前にビーズ溶液を希釈する際に注意すべきである。ゲル表面上のビーズ間の間隔は、コロイド溶液の希釈係数を変更することによって変更することができる。あまり溶液を希釈すると、カバースリップへのカップルビーズの数を減らし、最終的にはゲル中のビーズの数を減少させる。少なすぎる溶液を希釈すること、それらが接触し、互いに区別することができないように、ゲル中のビーズの高すぎる密度を得ることができる。それは完全にナノ粒子凝集の存在を回避することがしばしば不可能であるが、希釈された溶液への超音波の適用は効果的にナンを最小化するoparticle集約。私たちは、このプロトコルで利用されるコロイド溶液の10,000倍希釈が3.64×10 8ビーズ/ mlのビーズ濃度を与え、0.05ビーズ/直径0.1μmのビーズμm2での所望の粒子密度が得られることを見出した。 1：20,000希釈（1.82×10 8ビーズ/ ml）を粒子あたり52平方μm の平均をもたらす2は異なる希釈でゲルの表面の画像を示します。これは、ゲルに転送するビーズの数にばらつきがあることに留意すべきである。これは機能化時に圧縮空気でカバースリップからビーズ溶液を取り除くに関連する変動によるものである。一般的には、少なくとも2の係数で希釈係数の増加が一貫してビーズ当たり面積の少なくとも倍の増加をもたらすことを見出した。
これは、tの完全な浸漬になりますビーズサイズ（直径）を選択することも重要である彼は、PA重合時のゲルの中にビーズ。 図5Aに示すように、ゲル剛性は、ビーズの位置に影響を与える。直径0.1μmのビーズは、ビーズの深さは剛性の減少に伴って増加する。これは、細孔サイズおよびPAゲル剛性13との間の逆の関係の結果であり得る。試験した3つの剛性のゲルのすべてについて、ビーズを一貫してゲル内部に局在化され、ゲル表面の1ミクロン以内に、図8Aに示すように、ゲル内の1μmのビーズの平均位置も剛性に応じて変化する。彼らは、1キロパスカルのゲルに深く（約1.25μm）を埋め込まれている。 10〜40キロパスカルのゲルについて、直径1μmビーズのトップの位置が約0.5μmの上からビーズが時折ゲルの上を通って突出意味ゲル（ 図5）の表面（ 図 0.5μm以下の範囲である図8（b））。それはtopograを紹介するので、これは有害である細胞のための物理ポート、及びトポグラフィーは、細胞-基質相互作用14に影響を与えることが知られている。したがって、比剛性のゲルを調製する際に、この技術のためにビーズを選択するに留意する必要がある。この方法を特徴づけるために利用さ2ビーズサイズのうち、0.1μmの直径は、最適なサイズを証明する。他のビーズサイズは、この技術で利用されてもよいが、ここで説明するように、ビーズ、ゲル、重合中に局在しているれる正確な深さを理解するために、共焦点顕微鏡を用いて較正されるべきである。
この技術は、視野内の識別可能な粒子の数を増加させることによって、PAゲルビーズの空間分解能を向上させる。ゲルの上部付近の層にビーズのローカライズが大幅ゲルの複合剛性に影響を与えません。複合理論Isostress BEAを含むゲルのわずか1μmの厚さの層の複合弾性率E c を計算するために利用されているdsのように
E fはポリスチレンビーズ（3 GPaの）弾性率であり、E mは、ゲルマトリックス（10 kPa）での弾性率であり、v fは及びv mは、それぞれ、ビーズ、ゲルマトリックスの体積分率である。ビーズはボリュームの唯一の0.03％を含んでいるため、E Cの = 10.0025キロパスカル剛性10キロパスカルの等方性ゲルの弾性率よりも有意差はありません。 PAゲルを製造するための確立された方法は、このように重合反応15中のビーズの分布に重力の影響を最小限に抑え、30秒に重合時間を減少させる。ビーズがゲルに重合させるための提案手法では、より長い（〜30分）、重合時間に依存していますそれらはゲル表面に突出しないようにする。単層のビーズをローカライズすると大幅に複合ゲル剛性、及びゲルマトリックス中へのビーズの転送においてより長い重合時間を助けるには影響しませんので、私たちは私たちの技術では、重合時間を短縮するためにあらゆる対策を組み込んでいない。
私たちの技術は、基板変形の測定、したがって、細胞の牽引力の計算を改善し、PAゲル内部の既知の深さにビーズをローカライズする方法を示します。細胞の牽引力を定量化するための理論的アプローチは、以前16,17が報告されている。このアプローチは、弾性半空間で半無限固体としてのゲル基材を処理します。ブシネスク溶液は、変位場からの牽引力を算出する逆問題を解くために使用される。私たちは、原因ゲルsから遠位ビーズに変位測定に誤差を定量化するブシネスク一体型の簡易版を採用urface 18。所与の半径上に適用せん断応力、τ、R、に基づいて、指定された方向の変位の方程式は次式で与えられる。
uはxは x方向の変位であり、μはせん断弾性係数であり、zは、ゲル表面からのビーズの深さである。ゲルの深さ全体にわたってビーズのさまざまな場所では、対応する変位を表2に示す。
ここに示されているケースでは、半径が1μmの平均接着斑の大きさと推定される。ビーズは細胞（z = 0 の ）と同一平面ことを想定している場合は、変位は0.75τ/μにより与えられる。ビーズはわずか1ミクロンゲル表面の下にある場合、変位は0.24τ/μで与えられる。この1μm未満の場所に表面とビーズ同一平面上からの変位が3倍の減少よりも大きく表しています。これは正確なゲル内の場所知られていない組み込みビーズの動きに基づいて、表面の牽引力の計算に誤差が導入されています。提案された、伝統的な製造方法の両方について、ゲル中のビーズの深さの関数としてτ/μで定義されたトラクションの変化が、重要である。 図9は、力の分布を示す（比τで与えられて/μ）に基づくビーズが均一にゲル中に分布し、表面付近に局在している分野の光学的深度内ブシネスクビーズ深さの分布を利用し、計算から得られる理論、zは 、上。ビーズは、z = 0、τ/μ= 0.0133細胞と同一平面上にある場合、セル力の最も正確な測定をもたらすであろう。 118によるこのような場合に比べて、τ/μが大きくなるビーズは、私たちが提案する技術を使用して表面付近に局在しているそれぞれ％、80％、および1キロパスカル、10キロパスカル、及び40キロパスカルゲル50％、。ビーズが均一にゲル深さ全体にわたって分布している場合、τ/μはそれぞれ、1キロパスカル、10キロパスカルと40キロパスカルのゲルについて、表面近くのビーズを局在化により誘導される増加を超えてさらに60％、80％、および150％増加させる。ビーズは、ゲルの深さ全体に分布している場合にトラクション計算で約200％の誤差の合計を表す。このように、ゲルの中に既知の深さにビーズをローカライズすると、変位測定および細胞牽引力の精度を向上させます。
ここに記載の技術は、ビーズ、ゲル表面付近に局在しているような牽引力顕微鏡アプリケーション用PAゲル基質を調製するための新しい方法を提示する。 PAゲル内の既知の深さにビーズを閉じ込めることは午前の作成、セルフォース適用時にビーズの実際の変位に関する新しい情報を提供しています細胞がその下にある基板を変形する方法を正確に把握する鉱石。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。
Acknowledgments
著者は、学際的イノベーションイニシアティブプログラム、イリノイ大学、助成金12035を承認したいと思います。 SKが国立科学財団（NSF）グラントからUIUCで賄われていた0965918 IGERT：細胞分子力学とバイオナノテクノロジーの研究者次世代トレーニング。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 70% Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 111-30-8 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| 40% Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| 2% Bisacrylamide | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| 0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry) | Invitrogen | F8801 | |
| Fibronectin, Human, 1 mg | BD Biosciences | 354008 | |
| Ammonium persulfate | Bio-RAD | 161-0700 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-RAD | 161-0801 | |
| Poly-D-lysine | Millipore | A-003-E | |
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
| N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25300-054 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Acrylic acid | Sigma-Aldrich | 147230 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Materials | |||
| 35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass | In Vitro Scientific | D35-14-1-N | |
| Glass cover slips, 12 mm diam. | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
References
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).
- Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction. JoVE. , http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=2173 (2010).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses. Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
- Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-β responsiveness. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).
- Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic,, Smith, M. L. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biol. , Chapter 10, Unit 1 16 (2010).
- Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide. Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).
- Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Théry, M. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nature Materials. 11, 642-649 (2012).
- Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response. Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).
- Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinković, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology. PLoS ONE. 6 (5), e19929 (2011).
- Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).
- Tolić-Nørrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).
- Atanackovic, T., Guran, A. Theory of Elasticity for Scientists and Engineers. , Maple-Vail Book Manufacturing Group. York, PA. (2000).
