En ny metod för att lokalisera Reporter Fluorescent Pärlor Nära Cell Culture Yta för Traction Force Microscopy

Summary

Traditionella tekniker för att tillverka polyakrylamid (PA) geler som innehåller fluorescerande prober innebär sandwich en gel mellan en vidhäftande yta och en glasskiva. Här visar vi att belägga denna slid med poly-D-lysin (PDL) och fluorescerande prober lokaliserar probema till inom 1,6 nm från gelytan.

Abstract

PA geler har länge använts som en plattform för att studera celldragkrafter på grund av lätta att bearbeta och möjligheten att ställa sina elastiska egenskaper. När substratet är belagd med en extracellulär matrisprotein, celler vidhäfta till gelén och applicera krafter, vilket gör att gelén att deformeras. Deformationen beror på cell dragkraft och de elastiska egenskaperna hos gelén. Om deformationen fältet av ytan är känd, kan ytan dragkraft beräknas med elasticitetsteorin. Gel deformation mäts vanligen genom att bädda fluorescerande markör pärlor jämnt in i gelén. Sonderna förflyttar eftersom gelen deformeras. Probema nära ytan av gelén spåras. De förskjutningar som rapporterats av dessa sönder betraktas som ytan förskjutningar. Deras djup från ytan ignoreras. Detta antagande introducerar fel i dragkraft utvärderingar. För exakt mätning av cell krafter, är det kritiskt för platsen av pärlorna att vara känd. Vi har utvecklaten teknik som utnyttjar enkel kemi för att begränsa fluorescerande markörpärlor, 0,1 och 1 ^ m i diameter, i PA-geler, inom 1,6 um av ytan. Vi belägga en täckglas med poly-D-lysin (PDL) och fluorescerande pärlor. PA gellösning sedan inklämd mellan täckglas och en vidhäftande yta. De fluorescerande pärlor överföra till gellösningen under härdning. Efter polymerisation innehåller PA-gelen fluorescerande pärlor på ett plan nära gelytan.

Introduction

Den mekaniska växelverkan av en levande cell med sin omgivning har ofta studerats med hjälp av PA-geler. Dessa substrat förlita sig på en enkel, väl karakteriserad protokoll fastställts av Dembo och Wang 1997 ^1. En av de största fördelarna med dessa substrat är att deras styvhet kan ställas in genom att ändra koncentrationen av specifika komponenter i gellösningen. Detta ger en önskvärd plattform för att studera celler interaktion med miljöer av olika stelheter. När PA geler är belagda med extracellulära matrix (ECM) proteiner, celler följa dem, genererar kraft. Som ett resultat av cell kraft deformerar gelén som en elastisk kropp. Denna deformation beror på storleken av den kraft som appliceras av cellerna och de elastiska egenskaperna hos gelén. Olika studier har anställt PA geler för att undersöka cellulära dragkrafter.

I en variant av PA gel tillverkning, är fluorescerande mikrosfärer (pärlor) inbäddade throughout gelen att kvantifiera celldragkrafter på geler av olika stelheter ^2. Vid cellkraft ansökan pärlorna tränga undan från sin ursprungliga plats efter gel deformation. Deformationen fältet mäts från de enskilda pärla förskjutningar. Denna deformation fält utnyttjas med elasticitetsteorin och de elastiska egenskaperna hos gelén för att beräkna de dragkrafter. Dessa mätningar ger insikt om hur celler mekaniskt känna och interagera med sina lokala mikromiljö ^3.

I många allmänt använda PA gel tillverkningsprotokoll, är pärlorna blandade i hela PA-gelen i flytande, opolymeriserad tillstånd. En fullt polymeriserade PA gel innehåller fluorescerande pärlor i hela dess volym. Vid beräkning celldragkrafter, är pärlor de flesta nära gelytan (cell-substrat gränssnitt) övervakas. De förskjutningar av dessa pärlor antas ske på cellodlingsytan för enkelhet i kraft calculation. Den faktiska placeringen av pärlorna inom djupet av gelén inte beaktas. Men i ett elastiskt medium (t.ex. PA-gel), en pärla närmare en punkt där kraften appliceras kommer att flytta mer än en kula som är längre bort från punkten. Således behandlar förskjutningen av en punkt (vid pärlan plats) distalt från ytan som är i ytan leder till en underskattning av cellulära tractions. Graden av fel beror på avståndet av vulsten från ytan. Felet kan inte beräknas utan kunskap om placeringen av vulsten.

Behovet av en enkel metod för att begränsa pärlor mycket nära cellodlingsytan har tagits upp av några tekniker. Ett sätt är att öka densiteten hos pärlorna genom hela gelén sådan att det finns ett tillräckligt antal pärlor i den övre fokalplanet för att mäta rörelse mycket nära ytan. En annan teknik innebär att bygga en konfokal avbildning kammare för levande cell imaging så att ljuset frånbara pärlorna i det översta fokalplan samlas ^4. En annan metod innefattar att överlagra ett extremt tunt skikt av PA-gel innehållande pärlor på toppen av en redan polymeriserad gel utan pärlor ^5. En nackdel med var och en av dessa tekniker är att den exakta placeringen av pärlorna i gelén inte är känd. Detta introducerar fel i beräkningen av förskjutningsfältet av pärlorna, och sålunda beräkningen av cellkrafter. En annan teknik involverar konjugering av pärlor till den övre ytan av en redan polymeriserad PA-gel med användning av Sulfo-SANPAH ^6. Denna teknik säkerställer pärlorna faktiskt endast på toppen av PA-gel, men i vilken utsträckning de är inbäddade i djupet av gelén är okänd. Detta skulle kunna skapa en lokal topografi för cellerna, som kunde ändra cellens beteende, som tidigare arbete har föreslagit att cellerna kan känna av kraft flera mikrometer bort ^7. Nyligen, en teknik för mönstring PA geler med 1 um diameter fluorescent fibronektin dot markörer i en reglerats matris bildades ^8. I detta fall är djupet hos de fluorescerande markörer kända, och är i huvudsak noll, eftersom den fibronektin mönstret indirekt tryckt på gelytan. Men denna metod inte ger en sammanhängande miljö som cellerna kan fästa, som ECM-proteinet är begränsat till prickar diameter 1 pm. En metod för att helt integrera tracker pärlor inom PA-geler och begränsa dem till en känd plats mycket nära ytan har ännu inte fastställts.

Här utvecklar vi en teknik för att begränsa under im till um diameter fluorescerande pärlor till ett fokalplan mycket nära cellodlingsytan inom PA-gel. En gel är vanligen botas genom sandwiching opolymeriserad lösning flytande gel mellan två glasplattor. En av plattorna är funktionaliserad så att gelén vidhäftar kraftigt till det. Den andra är icke-funktionaliserad och tas bort efter gel botemedel. Vi ändra denna borttagbara glas surface genom beläggning med ett skikt av pärlor. Vid sandwich den flytande gel mellan funktion och pärlan belagda glasytan, den pärlor överföring till gelén medan den härdar. Detta begränsar avståndet pärlorna integration i gelen inom 1,6 um av ytan. Glas-botten petriskålar användes som den vidhäftande ytan på vilken gelén härdas. För att bilda en plan övre gelytan under polymerisationen, är ett cirkulärt täckglas användes för att sandwich gelén med glasbotten petriskål. Före gel tillverkning, är det övre täckglas belagda med poly-D-lysin (PDL), vilket gav en positiv ytladdning. PDL blåses bort med tryckluft, och en lösning av pärlorna i vatten avsätts på täckglas. Vi använder karboxylerade fluorescerande mikropärlor, som bär en negativ laddning, och interagera med den positivt laddade ytan skapas genom behandling med PDL. Efter blåsning vulsten lösning utanför täckglas med tryckluft, ett enda skikt avpärlor förblir elektro kopplad till torra täckglas. Den PDL beläggningen påverkar inte vidhäftningen av glaset till gelytan, eftersom glas är oskadade och tas bort från PA gelen helt intakt.

De glasbottnade petriskålar görs vidhäftande genom behandling med 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane och 0,5% glutaraldehyd. PA geler av önskade stelheter skapas genom att blanda lämpliga koncentrationer av bisakrylamid och akrylamid via ett standardförfarande ^9. En droppe av gellösningen pipetteras på glasbotten petriskål. Glastäckglas innehåller pärlorna används för att smörgås gelén med petriskål. När gelén härdas är det övre täckremsa avlägsnas och lämnar de pärlor inbäddade i PA-gel inom 1,6 | im från ytan.

Protocol

Tillverka och funktionalisering PA geler av olika styvheter med fluorescerande mikrosfärer inbäddade nära cellodlingsytan.

1 funktionalisering av Top täckglas

1. Rena glastäckglas (# 1,0, 12 mm diam.) Med tvål och vatten, följt av etanol för att avlägsna ovidkommande damm.
2. Placera täckglas på en riven yta (dvs pipettspets hållare), så att de inte vidrör för att underlätta enkel interaktion med täckglas.
3. Bestryk hela ytan av täckglas med poly-D-lysin (0,1 mg / ml) under 1 h (figur 1A).
4. Under denna tid, utför en 1: 10.000 utspädning av kolloid lösning av 0,1 | im diameter, för att röda fluorescerande mikrosfärer med avjoniserat (DI) vatten erhålla en partikeltäthet av omkring 1 mikrosfär per 20 ^ m ² på gelytan. Se figur 2 för resultaten av olika spädningar. Denna dilution kan modifieras för att tillgodose behovet av specifika experiment.
5. Placera den utspädda lösningen i en ultraljuds vattenbad under 30 min.
6. Efter 1 timme, använd pincett för att försiktigt lyfta varje täckglas och blås torrt med luft. Returnera de torra täckglas till den rivna ytan.
7. Ta den utspädda kolloid lösning ur badet och pipetten 150 ^ på varje täckglas. Låt stå i 10 minuter (Figur 1B).
8. Använd pincett för att försiktigt lyfta varje täckglas och blås torrt med luft. Returnera torra täckglas till den rivna ytan och förvara i mörker tills den ska användas.

2. Förberedelse PA Gel Direkt Glass Bottom petriskålar

1. Värm värmeplatta till 100 ° C.
2. Lägg ut önskat antal glas botten petriskålar (35 mm skålen med 14 mm micro-well, # 1.0) på en plan yta i ett dragskåp.
3. Täck glas delen av varje petriskål mikro väl med 97% 3-aminopropyl-trimethoxysLiane (3-APTES) under 7 min för kemisk aktivering. Ta försiktighet för att undvika oavsiktligt droppande av de 3-APTES till ytan av plasten i petriskålen för att undvika nedbrytning av polystyren.
4. Efter 7 minuter, fyll petriskål med DI-vatten och kassera in avfallsbehållare.
5. Upprepa steg 2,4 3x för varje maträtt, och sedan skaka petriskålen för att ta bort extra vatten. Placera petriskålar på den varma plattan tills glasparti är torr.
6. Avlägsna de petriskålar från den varma plattan och återgå till en plan yta i ett kemiskt dragskåp.
7. I ett dragskåp, göra en lösning av 0,5% glutaraldehyd och täcka glaspartiet av varje petriskål väl med lösningen under 30 min. Ta försiktighet för att undvika oavsiktligt droppande av glutaraldehyd till ytan av plasten i petriskålen för att undvika nedbrytning av plasten.
8. Efter 30 minuter, fyll petriskål med DI-vatten och kassera in avfallsbehållare för att skölja och ta bort glutaraldehyde.
9. Upprepa steg 2,4 3x för varje maträtt, och sedan skaka petriskålen för att ta bort extra vatten. Placera petriskålar på den varma plattan tills glasparti är torr.
10. Före blandning av komponenterna i PA gellösningen, flytta funktionglasen i dragskåp, så att de är lätt tillgängliga, gör det möjligt att snabbt sandwich av gelén med glasbotten petriskålar efter blandning gellösningen.
11. I ett 15 ml centrifugrör, blanda 40% bisakrylamid, 2% akrylamid och akrylsyra i omedelbar följd i de koncentrationer som anges i tabell 1 (anpassad från publicerat protokoll ¹⁰⁾ för att uppnå den önskade matris elasticitet.
12. Lägg 100 mM HEPES, 10% ammoniumpersulfat och TEMED i mängder som anges i tabell 1 som motsvarar önskad matris elasticitet för att slutföra gellösningen.
13. Omedelbart pipettera 15 ul av gellösningen på mitten av glaspartietav de petriskålar.
14. Omedelbart plocka upp en funktion glas täckglas med pincett.
    1. Vänd på glaset täckglas över så att de fluorescerande pärlorna är på den sida få kontakt med gellösning.
    2. Lay locket glida försiktigt på toppen av den nu-vätska PA-gel, så att den funktion sidan är i kontakt med gelén (figur 1C). Obs: För bästa resultat är en andra person som rekommenderas för rollen att lägga locket glida för att undvika risken för partiell polymerisation medan pipettering flytande PA gel lösningen på flera petriskålar.
15. Vänd alla petriskålar över att hjälpa till med att undvika gravitationseffekter på fluorescerande nanopartiklar polymerisering till lägre nivåer i PA gel.
16. Vänta minst 35 minuter, eller tills stamlösningen av PA gel har synbart polymeriseras i centrifugrör.
17. Vänd de petriskålar tillbaka över och fylla dem med PBS för att hjälpa till med att ta bort täckglas.
18. Försiktigt göra kontakt med glasparti av petriskålen och konturerna av locket glida, med användning av en pincett för att skrapa omkretsen av täckglas. Utför flera cykler tills täckglas är rubbas. Ta bort täckglas och avyttra på ett korrekt vassa avfallsbehållare.
19. Efter att alla täckglas kommer fluorescerande pärlor har överfört till gel (Figur 1D). Täck PA geler helt med PBS, placera skålen locket petri på varje maträtt, och förvara vid 4 ° C.

3 Funktion PA gel med fibronektin

1. Bered följande förblandade lösningar såsom beskrivits i ett etablerat protokoll ^11: Sug-lösning (137 mM NaCl, 5% (volym / volym) glycerol) och 2x konjugering buffert (0,2 M 2-(N morfolino) etansulfonsyra (MES), 10 % (vol / vol) glycerol, pH 4,5).
2. Använd en vakuumpump i ett biologiskt huva för att ta bort alla PBS från glasbottnade rätter som innehåller PA geler.
3. Pipette suga lösningen på varje gel, så att gelén är helt nedsänkt. Inkubera vid rumstemperatur under åtminstone en timme.
4. Varm 1-etyl-3-[3-dimetylaminopropyl] karbodiimid-hydroklorid (EDC) och N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) till rumstemperatur.
5. Blanda 10x lösningar av EDC (150 mM, 19 mg / ml i avjoniserat vatten) och NHS (250 mM, 29 mg / ml i avjoniserat vatten).
6. Blanda 1 del 10x EDC, 1 del 10x NHS, 3 delar DI vatten, och 5 delar 2x konjugering buffert.
7. Använd en vakuumpump i en biologisk huv för att avlägsna blötlösning. Kontrollera att all vätska avlägsnas från gelén yta.
8. Tillsätt tillräckligt NHS / EDC-lösning för att täcka gelytan och fylla glaset bottnad brunn i petriskålen (150-250 | il). Inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter i mörker.
9. Thaw fibronektin vid rumstemperatur. När väl tinat, blanda sterilt avjoniserat vatten för att skapa en 50 | ig / ml fibronektin lösning.
10. Använd en vakuumpump i ett biologiskt huva för att ta bort NHS / EDC lösningartion. Kontrollera att all vätska avlägsnas från gelén yta.
11. Lägg 150 pl av fibronektin lösning till varje gel. Inkubera vid rumstemperatur under 35 min för att medge vidfästning av fibronektin.
12. Efter 35 minuter, tillsätt PBS till varje petriskål och förvara vid 4 ° C i upp till 2 veckor.

4. Dragkraft Experiment

1. Varm cellmedia, PBS, och trypsin till 37 ° C i ett vattenbad.
2. Skölj geler 5x med steril PBS, aspirera PBS mellan sköljningar, och lämna täckt i huvan.
3. Tillsätt 1 ml trypsin per 25 cm ² till kolv som innehåller celler. Efter cellerna lyfts från, späd trypsin med cellmedier och räkna cellerna. Baserat på gel-ytarea, bestämma antalet celler som krävs per gel för en slutlig cellsåddtäthet av 3.000 celler / cm ^2. Späd eller koncentrat fjädring så att 150 l av cellmedieblandningen innehåller detta antal celler. Alikvotera 150 pl av cell Suspension på varje gel.
4. Placera petriskålar innehållande celler i en inkubator under 30 minuter. Sedan försiktigt bort petriskålar och fyll resten av petriskål med media (ca 2 ml) så att ytan av skålen är helt under vatten.
5. Placera petriskålar tillbaka i inkubatorn tills bilden förvärvet.
6. Förbered mikroskop och datainsamlingssystem för avbildning: sätt in 40x nedsänkning i vatten mål, sätt in Differential Interference Contrast (DIC) prisma, välj mCherry eller motsvarande fluorescerande filter, och slå på miljökammaren.
7. När förberedd för bildbehandling, ta bort en petriskål från inkubatorn och placera den försiktigt på mikroskop scenen. Ta skålen lock Petri för DIC avbildning.
8. Lokalisera en enda cell och fånga en enda stillbild av cellen i DIC.
9. Utan att röra mikroskop scenen, växla bildläge till fluorescens. Fokusera på de fluorescerande mikrosfärer och recORD en bild av mikrosfärerna.
10. Ta försiktigt bort cell media från petriskål med en pipett och tillsätt 0,05% trypsin-EDTA.
11. Bild mikrosfärerna inom cellen efter att cellerna har lossnat.
12. Använd partikelbild Velocimetry (PIV) analys ImageJ ¹² för att beräkna förskjutningsfältet på grund av cellulära krafter.

Representative Results

Konfokal avbildning användes för att bestämma att pärlorna faktiskt var nedanför gelytan och kvantifiera deras exakta läge inom gelén djup. Fluorescerande pärlor av en annan våglängd än inne i gelén fick sätta sig på ytan, och avståndet mellan de inbäddade fluorescerande nanopartiklar och de som på ytan beräknades med hjälp av en centroid identifieringsalgoritm. Placeringen av pärlan på gelytan tjänar som referens för den övre ytan av gel-där celler gäller kraft vid vidhäftning till ytan. En schematisk bild av de två scenarier som anses (gröna kulor i gelén med röda pärlor på ytan, och vice versa) är visad i fig 3. Algoritmen interpolerar z-höjd på den tredimensionella centroid location. Vi upprepade denna process för tre styvhet geler (1, 10 och 40 kPa) och två storlek (diameter) fluorescerande pärlor (0,1 pm röda och 1 um gul-grön). Avståndetmellan en pärla i gelén och dess närmaste granne på en annan våglängd bestämdes utifrån dess tredimensionella centroid. Figur 4 visar den geografiska fördelningen av pärlor (överst yta och inbäddade) och den projicerade syn på YZ-planet. Den senare ger djupet av alla pärlorna från ytan av gelén.

Den medeldjup på 0.1 um pärlor är 619 nm, 467 nm, 278 nm för PA geler av styvhet 1, 10 och 40 kPa respektive (figur 5A). Motsvarande djup för diameter pärlor 1 um är -20 nm i 40 kPa geler, 12 nm i 10 kPa geler och 1255 nm i en kPa geler (figur 5B). Confocal avbildning utfördes även på geler med pärlor spridda över hela gelen som har traditionellt använts för PA geler avsedda för dragkraft mikroskopi studier. Djupet av pärlor dispergerades i hela PA gelén mättes med användning av samma algoritm som tidigare beskrivits och jämförs med depths använder den teknik som vi presenterar här. Figur 6 illustrerar variationen i pärlan spridning inom djupet av ett PA-gel med traditionella tillverkningsmetoder.

Fibroblaster fäster till PA gelytan när funktion med fibronektin. Förskjutningen fält för en fibroblastcell och motsvarande fluorescerande pärlor skikt visas i figur 7. Pärlor nära periferin av bilden verkar något oskarp. Detta är inte ett mekaniskt fel på den del av gelén, som glaset förblir helt intakt efter avlägsnande från gelén. Snarare är det ett resultat av en optisk effekt på grund av nedsänkning i vatten mål användes i detta experiment. Efter tillsatsen av trypsin till mediet, är cellen frigörs från ytan, vilket resulterar i returen av den deformerade PA gelytan till sitt ursprungliga skick. En korskorrelation algoritm användes för att beräkna deformationen fältet utifrån pärla förskjutningar ^10. Denförskjutnings illustrerar en dominerande polarisering av celldragkrafter i y-riktningen.

Figur 1 Illustration av funktionprocess för toppglastäckglas med PDL och fluorescerande pärlor. (A) Glas täckglas (blå) inkuberas med 0,1 mg / ml PDL (orange) under 1 timme. Tryckluft används för att blåsa locket glider torr och avlägsna PDL. (B) glastäckglas inkuberas med en lösning av 100 nm diameter fluorescerande pärlor för 5-10 min, och avlägsnas därefter genom applicering av tryckluft. Ett skikt av pärlor förblir elektrostatiskt kopplad till täckglas. (C) täck funktionaliserad med pärlor används för att sandwich PA-gel med en aktiverad glasytan. (D) Vid avlägsnandet av det övre locket glida följande PA gel polymerization pärlorna ligger inom och mycket nära ytan av gelen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. PA gelytan Innehållande 0,1 um diameter fluorescerande pärlor. Före beläggning av PDL-behandlade övre glastäckglas med pärlor, var vulsten lösningen utspäddes (A) 10.000 gånger (3,64 x 10 ⁸ pärlor / ml) och (B) 20.000 gånger (1,82 x 10 ⁸ pärlor / ml). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 Cell-substratgränssnittet med pärlor lokaliserade nära ytan av gelén. En schematisk bild av två scenarier där vulsten läge inom ett PA gelén kvantifierades med användning av konfokal mikroskopi och en centroid identifieringsalgoritm. Det första scenariot visas i (A) Red 100 pärlor nm diameter inne i gelen och gröna en um diameter pärlor på ytan, och den andra i (B) Gröna pärlor 1 um diameter inne i gelen och röda 100 pärlor nm diameter på ytan. (C) En tecknad illustration av en cell (gul) följs en gel (blå) med röda pärlor lokaliserade inne i gelen nära dess yta och en grön pärla som sitter på ytan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 Konfokala slice (XY, mitten) och medföljande YZ (vänster) projektions vyer av en gel med röda 0.1 um pärlor inbäddade i gelén och en um pärlor på ytan. Enheterna för alla axlar är i nanometer. Enstaka förekomster av röda pärlor över eller i samma plan som gröna pärlor skrivs viss överlappning i spektra fluorescensemissions för rött (mCherry) och grön (GFP). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5 Histogram över djupet av pärlor stängda nära den övre ytan av PA-gel. Styv 1 kPa, 10 kPa, och 40kPa representeras av blått, rött och svart, respektive. En Gaussisk kurva passar till varje datauppsättning och x-värde som motsvarar dess amplitud tolkas som medeldjupet av pärlor. Två scenarier testades:. (A) 0.1 um kulor inne i gelen med en um pärlor på ytan, och (B) en um kulor inne i gelen med 0,1 um pärlor på ytan Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6 Histogram i djupet av pärlor inbäddade godtyckligt hela PA-gel med användning av en traditionell tillverkningsmetod (svart) och pärlor lokaliserade nära det översta lagret av PA-gel med den här tekniken (röd) för PA geler av styvhet A) 1 kPa, B) 10 kPa,och C) 40 kPa. Inset visar djupet av pärlorna i både gel typerna inom den övre mest 10 mikrometer av gelen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7 Deplacement fältet grund cell dragkraft. (A) Faskontrast bild av en fibroblast på 10 kPa gel. (B) Vikt som alstras av dragkraft som genereras av fibroblast. Färg stapeln visar pärla förskjutning i nanometer. (C) Fluorescens bild av pärlor 0.1 um diameter nedanför en cell innan trypsinization. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8 Illustration av genomsnittlig placering av kulor inne i gelen i förhållande till en annan storlek / våglängd pärla sitter på gelytan. Styvhet PA gel minskar från vänster till höger (40 kPa, 10 kPa, 1 kPa). (A) Röda kulor inne i gelen och gröna en um diameter pärlor på ytan 0.1 um diameter. (B) Gröna pärlor 1 um diameter inne i gelen och röda pärlor diameter 0.1 um på ytan. Klicka här för att se en större version av denna siffra .

Figur 9 Distribution av teoretiska värden för τ / μ baserade på olika bead djup. Beads 0,1 pm i diameter var antingen likformigt dispergerad eller lokaliserade nära ytan på (A) 1 kPa geler, (B) 10 kPa geler, och (C) 40 kPa geler . Guldet pilen visar värdet på τ / μ för z = 0 fall där pärlorna är på gelytan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

115px; "> 4122,5 1px; "> 500

E (kPa)	40% akrylamid (il)	BIS (koncentration)	2% BIS (il)	100 mM HEPES (il)	0,1	625	0,00009	22,5	4225
0,25	625	0,0001	25	4222,5
0,5	625	0.00011	27,5	4220
0,75	> 625	0,0002	50	4197,5
1	625	0,0003	75	4172,5
1,5	625	0,0004	100	4147,5
2	625	0,0005	125
2,5	625	0,0006	150	4097,5
3	625	0,0008	200	4047,5
3,5	625	0,0009	225	4022,5
4		0,001	250	3997,5
4,5	625	0,0012	300	3947,5
5	625	0,0014	350	3897,5
5,5	625	0,0016	400
6	625	0,0018	450	3797,5
6,5	625	0,002	500	3747,5
7	625	0,0022	550	3697,5
7,5 < / Td>	625	0,0024	600	3647,5
8	1000	0,001	250	3622,5
10	1000	0,0013	325	3547,5
15	1000	0,002	3372,5
20	1000	0,0027	675	3197,5
30	1000	0,0037	925	2947,5
40	1000	0,0048	1200	2672,5

Tabell1. PA Gel kemiska koncentrationer baserade på Youngs modul. För ett önskat PA gel elasticitetsmodul, bör de angivna koncentrationerna av akrylamid, bisakrylamid och HEPES buffert kompletteras med 5 ^ akrylsyra, 25 pl 10% ammoniumpersulfat (APS), och 2,5 pl TEMED.

7PT "width =" 62 "> 5

z (^ m)	u x ((τ / μ) um)
0	0,750
	0,394
1	0,237
1,5	0,164
2	0,124
2,5	0,100
3	0,083
3,5	0,071
4	0,062
4,5	0,056
0,050

Tabell 2. Förskjutningar som en funktion av τ / μ motsvarande djup, z, av pärlor från gelytan baserat på Boussinesq teori.

Discussion

Vid användning av denna teknik, är det viktigt att pärlan lösningen är korrekt utspädd och pärlorna väljs utifrån önskad diameter, PA gel substrat stelhet och storlekstabellen av de fenomen som utforskas i önskad experimentet.

Försiktighet bör iakttas vid späda pärla lösningen före funktion bästa täckglas. Mellanrummet mellan pärlorna på gelén yta kan förändras genom förändring av utspädningsfaktorn för den kolloidala lösningen. Utspädning av lösningen för mycket kommer att minska det antal pärlor som par till täckglas och slutligen minska antalet pärlor i gelén. Utspädning av lösningen för lite kan ge en för hög täthet av pärlor i gelén så att de är i kontakt och kan inte särskiljas från varandra. Medan det ofta är omöjligt att fullständigt undvika förekomsten av nanopartikel aggregering, tillämpningen av ultraljudvågor till den utspädda lösningen minimerar effektivt nanoparticle aggregering. Vi har funnit att en 10.000-faldig utspädning av den kolloidala lösningen som användes i detta protokoll ger en vulst koncentration av 3,64 x 10 ⁸ pärlor / ml och ger en önskvärd partikeldensitet av 0,05 pärlor / xm ² för pärlor med diametern 0,1 | im. En 1: 20.000 utspädning (1,82 x 10 ⁸ pärlor / ml) ger ett genomsnitt av 52 | im ² per partikel Figur 2 visar bilder av ytan av geler med olika utspädningar.. Det bör noteras att det finns variabilitet i antalet pärlor som överför till gelén. Detta beror på variabiliteten associerad med avlägsna vulsten lösningen från locket glida med tryckluft under funktionalisering. I allmänhet har vi funnit att en ökning av utspädningsfaktorn med åtminstone en faktor två genomgående resulterar i åtminstone en fördubbling i området per pärla.

Det är också viktigt att välja en pärla storlek (diameter) som kommer att resultera i full nedsänkning av than bead inuti gel vid PA polymerisation. Gel styvhet påverkar placeringen av pärlor som visas i figur 5A. För pärlor diameter 0.1 um, ökar pärla djupet med minskande styvhet. Detta kan vara en följd av det omvända förhållandet mellan porstorlek och PA gel styvhet ^13. För alla de tre styvhets geler testade kulorna konsekvent lokaliserade inuti gelén, och inom 1 ^ m av gelén yta såsom illustreras i fig 8A. Den genomsnittliga placeringen av ett pm pärlor i gelén varierar också med stelhet. De är inbäddade djupare (ca 1,25 um) i en kPa geler. Vid 10 och 40 kPa geler, placeringen av den övre delen av kulorna med diametern 1 | im i intervallet från cirka 0,5 um ovan till 0,5 um nedan gelén (figur 5) yta, vilket innebär att pärlorna ibland skjuter ut genom den övre delen av gelén (Figur 8B). Detta är till nackdel eftersom det introducerar topograPHY för cellerna, och topografin är känd för att påverka cell-substratinteraktioner ^14. Därför är det nödvändigt att vara uppmärksam på att välja pärlor för denna teknik vid beredning av geler av en viss stelhet. Av de två pärlstorlekar används för att karakterisera denna metod, 0,1 pm diameter visar den optimala storleken. Andra pärlstorlekar kan användas i med denna teknik, men bör kalibreras med hjälp konfokalmikroskopi som vi beskriver här, för att förstå den exakta djupet till vilket pärlorna är lokaliserade under gelpolymerisation.

Denna teknik förbättrar spatial upplösning av pärlor i PA-gel genom att öka antalet av urskiljbara partiklar inom synfältet. Lokalisera pärlorna till ett skikt nära toppen av gelén påverkar inte signifikant den sammansatta styvhet av gelén. Isostress komposit teori används för att beräkna den sammansatta elasticitetsmodulen, E _c, av enbart 1 ^ m tjocka lager av gel innehållande beads som

där E _{​​^ är} elasticitetsmodulen för de polystyrenpärlor (3 GPa), E är _m elasticitetsmodulen för gelmatrisen (10 kPa), och v _{^ och} v _m är de volymfraktioner av pärlorna och gelmatris, respektive. Eftersom pärlorna innefatta endast 0,03% av volymen, _Ec = 10,0025 kPa är inte signifikant annorlunda än elasticitetsmodulen för ett isotropt gel av styvhet 10 kPa. En etablerad metod för att tillverka PA geler minskar polymerisationstiden till 30 sekunder, vilket minimerar effekten av tyngdkraften på fördelningen av pärlor under polymerisation ^15. Vår metod förlitar sig på längre (~ 30 min) polymerisationstiden för pärlorna att polymerisera in i gelénså att de inte sticker gelytan. Eftersom lokalisera pärlorna till ett enda lager inte signifikant påverka den sammansatta gel styvhet, och ju längre polymeriseringstiden hjälpmedel i överföringen av pärlor i gelmatrisen, vi införa några åtgärder för att minska polymerisation tid i vår teknik.

Vår teknik visar hur man lokalisera pärlorna till ett känt djup inuti PA-gel, vilket förbättrar mätningen av substratets deformation och sålunda beräkningen av celldragkrafter. En teoretisk metod för att kvantifiera de cellulära dragkrafter har tidigare rapporterats ^16,17. Detta tillvägagångssätt behandlar gelén substratet som en semiinfinit solid i elastisk halv utrymme. Den Boussinesq Lösningen används för att lösa det inversa problemet att beräkna dragkrafter från en förskjutningsfält. Vi använder en förenklad version av den Boussinesq gral att kvantifiera fel i mätning av rörelse på grund av pärlor distala från gelén surface ^18. Ekvationen för förskjutning i en given riktning baserat på en pålagd skjuvspänning, τ, över en given radie, R, ges av

där u _x är förskjutningen i x-riktningen, är μ skjuvmodulen, och z är djupet av pärlorna från gelytan. Av olika platser av pärlor i hela djupet av gelén, är motsvarande förskjutningarna visas i tabell 2.

För det fall som visas här, är radien beräknas till ett genomsnitt fokal adhesion storlek av 1 | im. Om pärlorna antas vara i samma plan med cellerna (Z = 0), är den förskjutning som ges av 0,75 τ / μ. Om pärlorna är endast 1 pm under gelytan, är förskjutningen ges av 0,24 τ / μ. Dettarepresenterar mer än en trefaldig minskning av förskjutning från en pärla i samma plan som ytan på en plats en um nedan. Detta introducerar fel i beräkningen av ytan dragkrafter som bygger på rörelse inbäddade kulor vars exakta platser i gelen är okända. Variationen i dragkraft som definieras av τ / μ, som en funktion av djupet av pärlorna i gelén både de föreslagna och traditionella tillverkningsmetoder är betydande. Figur 9 visar fördelningen av krafter (fås med förhållandet τ / μ) baserad på Boussinesq teorin att resultera från beräkning utnyttjar distributionen av bead djup, Z, inom den optiska skärpedjup när kulorna är likformigt fördelade i gelén och lokaliserade nära ytan. Den mest exakta mätningen av cellkraft skulle uppstå om pärlor var på samma plan som cellerna, där z = 0 och τ / μ = 0,0133. Vid jämförelse med detta fall, τ / μ ökar med 118%, 80% och 50% under 1 kPa, 10 kPa och 40 kPa geler, respektive, när kulorna är lokaliserade nära ytan med hjälp av den teknik som vi föreslår. När pärlorna är jämnt fördelade över gelén djup ökar τ / μ en ytterligare 60%, 80% och 150% utöver den ökning som induceras av lokaliserande pärlorna nära ytan, för 1 kPa, 10 kPa och 40 kPa geler, respektive. Detta motsvarar totalt nästan 200% fel i dragberäkningar när kulorna är fördelade över hela gelen djupet. Således lokalisera pärlorna till ett känt djup inne i gelen förbättrar noggrannheten i förskjutningsmätningar och celldragkrafter.

Tekniken beskrivs här presenterar ett nytt sätt att förbereda PA gel substrat för dragkraft mikroskopi applikationer så att kulorna är lokaliserade nära gelytan. Att begränsa pärlorna till ett känt djup inom PA-gel ger ny information om den verkliga förskjutningen av pärlor vid cellkraft program, skapa ammalm korrekt bild av hur cellerna deformeras deras underliggande substratet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)	Sigma-Aldrich	281778
70% Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	111-30-8
1 M HEPES buffer solution	Sigma-Aldrich	83264
40% Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
2% Bisacrylamide	Sigma-Aldrich	M1533
0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry)	Invitrogen	F8801
Fibronectin, Human, 1 mg	BD Biosciences	354008
Ammonium persulfate	Bio-RAD	161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-RAD	161-0801
Poly-D-lysine	Millipore	A-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)	Thermo Scientific	22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)	Thermo Scientific	24500
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Life Technologies	25300-054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Acrylic acid	Sigma-Aldrich	147230
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass	In Vitro Scientific	D35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam.	Ted Pella, Inc.	26023