Summary
Små dyr imaging teknikker tillate serie diagnostiske undersøkelser og terapeutiske intervensjoner i vivo. Nylig, har omfanget av søknader betydelig utvidet og i dag omfatter vurdering av colonic svulst utvikling, sårheling og overvåking av betennelse. Denne protokollen illustrerer disse ulike potensielle anvendelser av murine endoskopi.
Abstract
Musemodeller er mye brukt til å studere patogenesen av menneskelige sykdommer og å vurdere diagnostiske prosedyrer samt terapeutiske intervensjoner preklinisk. Imidlertid gjelder vurdering av patologiske forandringer krever ofte histologisk analyse, og da utføres ex vivo, nødvendig død av dyret. Derfor i konvensjonelle eksperimentelle innstillinger, intra-individuelle oppfølgingsundersøkelse er sjelden mulig. Dermed utvikling av murine endoskopi i levende mus gjør at etterforskerne for første gang til både direkte visualisere gastrointestinal slimhinne og også gjenta prosedyren for å overvåke endringer. Mange søknader om in vivo murine endoskopi eksisterer, inkludert studere tarmbetennelse eller sårtilheling, skaffe slimhinne biopsier gjentatte ganger, og til lokalt administrere diagnostiske eller terapeutiske midler som bruker miniatyr injeksjonskateter. I det siste har molekylær avbildning utvidet billeddiagnostikk modalities tillater spesifikk påvisning av bestemte mål-molekyler med bestemte photoprobes. I konklusjonen, har murine endoskopi dukket opp som en roman cutting-edge teknologi for diagnostisk eksperimentelle in vivo avbildning og kan ha betydelig innvirkning på preklinisk forskning på ulike felt.
Introduction
Dyremodeller har sterkt beriket vår forståelse av mange tarm patologier. Laboratoriet mus (Mus musculus) har dukket opp som en førsteklasses dyremodell i biomedisinsk forskning på grunn av sitt rike genetisk og genomisk informasjon og er lett tilgjengelig i transgene og knockout stammer. I tillegg til å bedre forståelsen sykdom patogenesen, er dyremodeller også viktigere brukt for å teste narkotika kandidater samt prekliniske diagnostiske eller terapeutiske intervensjoner. Men til tross for ulike musemodeller som etterligner menneskelig sykdom, mange diagnostiske og intervensjons alternativer som rutinemessig brukes i pasientbehandling er ikke tilgjengelige for mus. Følgelig til overvåkingsstrategier overvåke løpet av murine sykdom eller effekten av terapeutiske intervensjoner er ofte begrenset til indirekte observasjoner eller post mortem analyser. Mens ikke-invasive prosedyrer finnes for overvåking mus vitalitet som sykdomsaktivitet indekser, quantification av vekttap eller gevinst, blod, urin og avføring analyser, dette er bare indirekte indikatorer, og er partisk av interindividuell variasjon. I tillegg, post mortem analyser hindre langsgående observasjoner ved gjentatte tidspunkter. Sofistikerte imaging teknikker for å overvåke sykdomsaktivitet hos mus har bare nylig blitt introdusert 1,2. Selv om disse bildeteknikker gir mulighet for gjentatte analyser, de bare gir et beskrivende og ofte upresis syn på tarmen, ikke muliggjøre direkte slimhinne visualisering eller tillate diagnostiske eller terapeutiske intervensjoner som biopsi erverv eller aktuell og intramucosal anvendelse av legemiddelkandidater.
Nylig har høy oppløsning endoskop systemer for bruk i levende mus blitt utviklet 3,4. For første gang disse endoskopiske teknikker tillater direkte visualisering av endoluminale colonic sykdom patologi som sårtilheling eller tarmbetennelse gi objektiv, real-time status slik at longitudinelle studier i samme dyr ved gjentatte tidspunkter. Bortsett fra slik at gjentatte biopsier i en individuell mus, kan endoskop systemer også brukes til å påvirke en distinkt terapeutisk tumor eller lokalisert inflammasjon ved å tillate direkte anvendelse av et stoff til området av interesse. Videre, som terapeutiske og kontrollstoffer kan leveres direkte til området av interesse, kan dette utføres på samme mus, med unntak av inter-individuell variasjon. Disse systemene har nå vært ansatt for vurdering av tykktarmsbetennelse, sårheling, laparoskopisk leverbiopsi og orthotopic induksjon av leversvulster 8 og tumor utvikling ved hjelp av ulike scoring systemer som murine endoskopisk indeks over kolitt alvorlighetsgrad (MEICS) 5-7. MEICS består av fem parametere for å vurdere betennelse: fortykkelse av tarmveggen, endringer i den vaskulære mønster, nærvær av fibrin, kornete av de mucosal overflate, og avføring konsistens.
I denne protokollen beskriver vi bruk av stive endoskopi i murine modeller av intestinal sårtilheling, betennelse og kreft i tykktarmen. Først demonstrerer vi endoskopisk evaluering av sårtilheling og i tykk betennelser samt langsgående vurdering av kolitt aktivitet og studiet av cancerogenesis i murine colon. Utover det beskrivende bruk av murine endoskopi, vi gir detaljerte instruksjoner om bruk av endoskopisk instrumentering for å få biopsier, og aktuell og intramucosal anvendelse av ulike komponenter av interesse (f.eks legemiddelkandidater eller kreftceller). Til slutt, vi demonstrere bruken av murine fluorescens endoskopi, som sysselsetter avanserte molekylære bildeteknikker, i innstillingen av kolorektal tumorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent av Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) i henhold til tysk Dyrevernloven.
1. Materialer og Forsøksoppsett
- Dyr omsorg
- Bruk kvinnelig eller mannlig mus av noen belastning som veier 20 til 25 g og huse dem i henhold til lokale dyr omsorg lovgivning.
- Mate mus med spesielle chow for gnagere og bruke alfalfa-free chow minst tre dager før fluorescens undersøkelser for å minimere Endoluminal auto-fluorescens.
- Gi Autoclaved drikkevann ad libitum.
- Induksjon av akutt DSS-indusert kolitt
- Tilbered en 3% (w / v) dekstransulfat natrium (DSS, molekylvekt: 36,000-50,000 Da)-løsning ved å oppløse 3 g av DSS i 100 ml vann autoklaveres. Tilby denne løsningen som den eksklusive drikkevann til mus ad libitum og beregne 5 ml DSS-løsning per mus / dag. Feed fortsrol mus med autoklavert vann uten DSS ad libitum ni.
- Induksjon av kolorektal kreft
- Oppløs mutagen azoxymethane (AOM) (FORSIKTIG! Kreftfremkallende og genetisk skade!) I steril isotonisk saltløsning for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml. Påfør en enkelt dose på 10 mg per kg kroppsvekt AOM intra-peritoneally anvendelse av en 1 ml sprøyte (30 G) 10.
- Challenge-mus (unntatt kontroll mus) med repeterende sykluser av 3% (w / v) DSS fra dag 0 til 7, dag 14 til 21, dag 28 til 35 og dag 42 til 49 å indusere inflammatorisk drevet kolorektal cancerogenesis. Mate mus med Autoclaved vann bare i mellom disse utfordringene (se Figur 4A for en detaljert tidsplan). Mate kontroll mus med Autoclaved vann gjennom hele forsøket.
- Fremstilling av fluorescens endoskopi (FE)
- Bruk Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) - dextran (molekylvekt 70 000 Da; FITC: Glukose = 1: 250) for deteDette skjer av adenom ved visuell forbedring av dysplasi assosiert vaskulær mønster.
- Administrer 60 mg FITC-konjugert dekstran fortynnet i 100 mL PBS intravenøst 5 min før fluorescens endoskopisk undersøkelse.
- Anestesi
- Gi kontinuerlig isofluran forsyning for anestesi (1.5 LO 2 / minutt; 1,5-2 vol% isofluran [2-klor-2-(difluormetoksy) -1,1,1-trifluor-etan]). Bruk spesiell veterinær anestesi utstyr med en ansiktsmaske til tett kontroll anestesi.
- Utarbeidelse av klyster
- Innpode 2 ml væske klyster (innhold: dinatrium hydrogen 1,5% (w / v) og natriumdihydrogenfosfat 11% (w / v)) inn i tykktarmen dersom dette er vesentlig fekal lasting er mistanke om at kan tilsløre utsikten.
2. Teknisk utstyr
- Bruk en veterinær endoskopisk arbeidsstasjon som er utviklet og godkjent for bruk av små dyr endoskopi. Koble workstation til en kameraenhet, en xenon lyskilde, en luftpumpe og til en vanlig PC-skjerm for hvitt lys endoskopi. Deretter kobler kameraet og miniatyr stive teleskop (1,9 mm ytre diameter, 10 cm lengde, figur 5).
- Bruk endoskop kappe med arbeidskanalen (figur 5D) ved anvendelse av biopsitang eller injeksjonsrøret. Bruk skjede uten arbeidskanalen for diagnostisk koloskopi.
- Konfigurer innstillingene for lyskilde for fluorescens endoskopi for å opphisse brukte sporstoff (f.eks 490 nm for FITC-konjugert dekstran). I tillegg integrerer en passende båndpassfilter mellom teleskopet og kameraet (f.eks 525 nm for FITC-konjugert dekstran).
- Sett fleksible biopsitang (3 Charr., 28 cm) gjennom arbeidskanalen for endoskopet å få biopsier.
- Introduser fleksible injeksjonsrøret (0,96 mm) gjennom arbeidskanalen for topisk, intramucosal eller en endoluminaledministration av diagnostiske eller terapeutiske midler.
- Bruk et oppvarmbart undersøkelse bord med en temperatur på 42 ° C. Dette hindrer mus blir nedkjølt under eksamen.
3. Anestesi of Animals
- Plasser mus i en liten, men lekkasjesikker boks og administrere isofluran (100% (v / v), 5 vol%, 3 l / min). Vent til musen mister bevisstheten.
- Overfør musen på eksamen bordet for endoskopi. Fortsett isofluran inhalasjon via ansiktsmaske med en dose av 100% v / v, 1,5 vol%, 1,5 L / min. Påfør alltid øye salve for å hindre øye tørrhet mens under anestesi.
- Evaluere effekten av anestesi ved å sjekke reflekser. Sjekk den "snu reflex ': hvis de er tilstrekkelig bedøvet, bør en mus liggende på ryggen ikke snu. Sjekk 'tær reflex': når anestesi er tilstrekkelig, myk klyping i mellom dyrets tær bør ikke føre til tilbaketrekking av benet (stadium avkirurgisk toleranse).
4. Koloskopi
- Lå bedøvet mus utsatt / på ryggen på undersøkelsesbordet.
- Administrer 2 ml klyster via kneppet kanyle inn i tykktarmen hvis det er mistanke om betydelig fekal lasting som kan skjule visningen. Vent til mus for å gjøre sitt fornødne etter administrasjon av klyster. Sett endoskopet svært nøye for å unngå perforering.
- Åpne begge ventiler av kappen med en av dem er forbundet med luftpumpen. Forsegle den andre ventilen med pekefingeren for å dispensere luft. Blås kolon med luft, sakte og forsiktig, spesielt i tilfelle av biopsi eller injeksjon.
- Advance endoskop bare så langt som retten colonic flexure å unngå perforering (4-5 cm fra anus).
- Diagnostisk koloskopi
- Undersøke slimhinnen for inflammatoriske eller ondartede forandringer mens du trekker tilbake endoskopet. Trekk langsomt ved vurdering av hele omkretsen av tarmen. Vurdere intraluminal pathologies ved bruk av egnede etablerte scoring systemer etter behov.
- Til å rettferdig identisk endoskopisk posisjon for bildeopptak under repetitive visualiseringer av sår områder, merk avstanden mellom murine anus og slimhinne lesjon. Dessuten bruker tuppen av biopsitang som en spacer for å oppnå samme avstand mellom endoskopet og såret under bilde oppkjøpet. Såret størrelse er relatert til størrelsen på endoskopet kappe, som består av 3 mm.
MERK: Plasser endoskop i identisk posisjon ved optisk sammenligning med fotodokumentasjon av tidligere undersøkelser. Mål lesjoner i samme vinkel og avstand på hver oppfølging endoskopisk undersøkelse.
- Biopsi prosedyre
- Ta biopsier med hjelp av to etterforskere. Innføre biopsitang nøye gjennom arbeidskanalen til spissen av tangen er synlig på skjermen til den andre etterforsker. Åpne og lukke tang nøye til enugyldig perforering.
- Flytt tang til stedet for patologi.
- Injeksjonsprosedyren
- Utfør injeksjonsprosedyre ved hjelp av to undersøkere. Pre-fill fleksible injeksjonsrøret (0,96 mm) helt med middel som skal administreres. Skyv røret gjennom arbeidskanalen til kanylen (30 G) er synlig på skjermen til den andre etterforsker. Forbered den fine sprøyten og administrere forsiktig ønsket mengde diagnostisk eller terapeutisk middel. Injeksjonsvolumer bør være 50 mL maksimum.
- Sett nålen inn i submocosa i en vinkel på 15-30 grader. Ansiktsskråkant i retning av mucosa. Slimhinnen viser en karakteristisk løfte tegn etter vellykket injeksjon.
- Fluorescens endoskopi (FE)
- Administrer 60 mg FITC-konjugert dekstran fortynnet i 100 mL PBS intravenøst før fluorescens endoskopisk undersøkelse.
- Sjekk den optimale tidspunkt mellom injeksjon avet fluorescerende merket tracer og avbildningsprosedyren som er avhengig av tracer farmakologi. Konfigurere innstillinger av båndpassfiltersystem i henhold til eksitasjon og emisjonsbølgelengde på tracer brukes. Utfør fluorescens endoskopi for ikke-spesifikke blodvolum sporstoff (for eksempel, FITC) umiddelbart etter intravenøs injeksjon av det fluorescerende fargestoff for å vurdere den vaskulære mønster av slimhinnen.
- Tenk bildebehandling flere timer etter tracer program i tilfelle av målrettede tracere eller "smarte sonder 'for å gi et bedre mål til bakgrunnen-ratio.
- Utfør foto, video-dokumentasjon av resultatene.
5. Post-koloskopi
- Separer musen i en ledig bur og legge den på et papir håndkle for å beskytte musen fra aspirere kullet. Varm opp mus med en Red Light lampe for å hindre nedkjøling. Observer musen og ikke la uten tilsyn før det har gjenvunnet tilstrekkeligbevissthet for å opprettholde sternal recumbency. Gang helt bevisst, plasserer du muse tilbake til sine respektive bur.
- Ved slutten av eksperimentet, place mus i en liten, men lekkasjesikker boks og administrere CO 2 (100% (v / v), 100 vol%, 3 l / min). Vent til musen mister fullstendig bevissthet og stopper å puste. Dispatch musen ved nakken brudd. Utføre abdominal laparotomi og eksplanterer tykktarmen. Åpne kolon langs og vaske den for videre histologisk eller molekylær evaluering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo overvåking av intestinal sårtilheling
Under rutinemessig endoskopi, ble det mukosale sår fremkalt mekanisk ved miniatyr biopsitang med en diameter på 3 Fransk (lik 1 mm; figur 1A). Deretter ble sårheling overvåkes av daglige endoskopiske undersøkelser og kvantifisert ved måling av rest såret området ved hjelp av bilderedigeringsprogramvare, for eksempel, ImageJ (Figur 1B). Den enkelte lukking av sår over tid er uttrykt ved kvotienten av selve sårområdet / initial sårområdet. For eksempel, på dag 3 etter å ha viklet generasjon, ble 41% ± 4,1% av sårområdet utvinnes, mens ved dag 7 såret var vanligvis fullstendig helbredet (figur 1C). I tillegg, ved slutten av forsøket, sår kan reseksjon for histologisk evaluering ex vivo. Avbildet er representative bilder av hematoxylin og eosin (H & E) -stained sår senger på day 0 og dag 5 (figur 1D).
Endoskopi-guidet intramucosal injeksjon terapi
For intramucosal anvendelse av farmakologiske midler, er et fleksibelt rør (diameter 0,96 mm) med en kanyle festet til enden (30 g) innføres i arbeidskanalen av endoskopet (figur 2A). Etter intramucosal plassering av nålen, ble et maksimum på 50 mikroliter injisert nøye. En indikasjon på vellykket intramucosal applikasjon, kan løfting av tykktarmsslimhinne lett observeres makroskopisk (figur 2B, C).
In vivo vurdering av eksperimentell kolitt
Etter induksjon av kolitt, mus viste vekttap fra dag 3 med maksimalt tap av kroppsvekt på 19% som oppstår ved dag 7 (figur 3A). I tillegg til daglig måling av kroppsvekt, sykdomsaktivitet ble overvåket ved gjentatte endoscopies og makroskopisk kvantifisering av betennelse ved murine endoskopisk indeks over kolitt alvorlighetsgrad (MEICS). I henhold til tap av kroppsvekt, ble MEICS stillingen økt ved dag 7 etter DSS start indikerer en massiv inflammatorisk skade av tykktarmsslimhinne, som ble bedres ved dag 13 (figur 3B). For ex vivo korrelasjon av histologisk skade, er inflammatoriske endringer av colonic H & E-fargede seksjoner kvantifisert i henhold til Dieleman Score 11. På dag 7 etter DSS start, histologisk skade var signifikant høyere i DSS-behandlede mus sammenlignet med kontroller som reflekteres av epitel denudation, ble slimhinne sår samt økt nøytrofile infiltrasjon og betydelig forbedret på dag 13 (Figur 3C, E). I tillegg histologisk evaluering av slimhinne biopsier, rutinemessig innhentet under endoskopiske undersøkelser, fått bekreftet den avansert stadium av kolitt på dag 7 (Figur 3F-H).
Ca 80 dager etter at tumor induksjon av AOM og tre sykluser av DSS (figur 4A), flere colonic tumorer (figur 4C) samt makroskopiske tegn på kronisk betennelse som granulert slimhinnen (Figur 4B) 10 ble observert med endoskopi. Histologisk evaluering av kolorektal tumorer av H & E farging avslørt adenomer med og uten høyverdige intraepitelial neoplasi. Derfor ligner AOM-DSS-modell til en perfekt modell for å studere molekylære prosesser av carcinogenese 12, samt for å evaluere nye diagnostiske enheter 13. Fluorescens bildebehandling rettet mot spesifikke molekyler tillater in vivo molekylær avbildning med 'fotografiske metoder' 14,15. For å demonstrere gjennomførbarheten av FE, brukte vi FITC, en mye brukt fluorochrome. For spesifikk påvisning FITC, et båndpassfilter-system kombinert med light kilde gitt konkrete eksitasjonsbølgelengde nødvendig (490 nm, figur 4D). For nøyaktig påvisning av FITC-spesifikke emisjonsbølgelengden (525 nm), ble en andre båndpassfilter anbragt mellom kamerahodet og endoskopet (figur 4E). FE uten tracer søknaden ikke påvise noen bestemt signal og ingen interaksjon med colonic vev eller avføring autofluorescence (figur 4F, G). I kontrast, umiddelbart etter intravenøs anvendelse av FITC-dekstran, den fluorokrom kunne observeres på tykktarmsslimhinne, og kan benyttes til vurdering av økt vaskularisering i regioner av kronisk inflammasjon (figur 4H), så vel som ondartet mucosa (figur 4I). Følgelig kvantifisering av fluorescens-intensiteten ved en bildeprogramvaren viste signifikant øket opptak av fluorokrom i ondartet vev sammenlignet med ikke-påvirkede colonic mucosa (Figur 4K).
"Jove_content" fo: keep-together.within-page = "alltid"> 
Figur 1. Endoskopisk overvåking av epitel sårtilheling in vivo samt kvantitative og histologisk vurdering av sårtilheling. Etter generasjon av colonic sår, sår grensen og sårlukking kan lett oppdages. Sårområdet (hvite piler) vurderes under daglig oppfølging endoscopies å kvantitativt følge epithelial sårtilheling (A - C) Ex vivo, sår ble resektert og H & E-farget for histologisk analyse av sårtilheling (D).. Skalaer er definert av avbildet skala bar. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
re 2 "fo: content-width =" 5in "src =" / filer / Ftp_upload / 51875 / 51875fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2. Endos-styrt intramucosal injeksjonsterapi. Under visuell kontroll, er spissen av nålen (A) sakte anbringes i tykktarmsslimhinne, og 50 pl av oppløste stoffer injiseres (B). Deretter kan merket mucosal løfte bli gjenkjent (stjerne) uten noen tegn på akutt blødning (C). Skalaer er definert av avbildet skala bar. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Endoskopisk evaluering av emnet av eksperimentell DSS kolitt. Forløpet av kolitt var evaluered ved endringer i kroppsvekt, endoskopiske undersøkelser, så vel som histologisk analyse av betente colonic seksjoner og endoskopiske biopsier. I tråd med massive tap av kroppsvekt og avansert histologisk skade på dag 7 (A, C, E; forstørrelse 10X), endoskopiske undersøkelser og histologisk evaluering av oppnådde biopsier avbildet tegn på alvorlig betennelse (B, D, G, H; forstørrelsen 5X og 10X), mens på dag 13 etter DSS starte inflammatoriske endringer ble betydelig bedres. Skalaer er definert av avbildet skala bar. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. FE kolorektale svulster. Etter induksjon av kolorektal cancerogenesis av AOM og syklisk DSS administrasjon i 11 uker (A), hvitt lys endoskopi oppdaget granulert slimhinner tyder på kronisk kolitt (B) og en rekke endoluminale lesjoner (C) som ble diagnostisert som adenomer med høyverdig intraepitelial neoplasi av H & E farging ex vivo (G). Mens visualisering av kronisk betennelse (H) og tumorer (I) var lett mulig ved hjelp av FE målrettet FITC, FE uten tracer program tillot ikke definitive svulst deteksjon (F, G). Følgelig kvantifisering av fluorescens-intensiteten var signifikant økt i løpet av ondartet vev sammenlignet med ikke-påvirkede kolon mukosa, vist ved gråskala profiler (E, F). For å bytte til fluorescens modus under hvitt lys colonoscopy er et bestemt båndpassfilter i tillegg koblet til kald-lyskilde for å gi den spesifikke eksitasjonsbølgelengde (for eksempel 490 nm for FITC; D). Dette filteret muliggjør veksling (hvit pil) mellom hvitt lys og fluorescens moduser (D). For å fange opp den spesifikke emisjonsbølgelengde (f.eks 525 nm for FITC), et andre båndpassfilter er anordnet mellom endoskop og kamerahodet ved hjelp av en bajonettkopling (E). Skalaer er definert av avbildet skala bar. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Eksperimentell oppsett av endoskopisk arbeidsstasjonen. Den endoskopisk arbeider stasjon (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epithelial sårheling er en pågående prosess. Kontinuerlig fysiologisk eksfoliering av overflate celler i mage-tarmslimhinnen oppstår som krever hyppig regenerering av epitelceller 16. Følgelig har svekket sårheling en enorm innvirkning på flere sykdommer, inkludert gastrointestinale sår og 17 anastomotic lekkasje 18. Evaluering av molekyl bakgrunn, så vel som potensielle medikamentkandidater for å stimulere epitel helbredelse kan bare ufullstendig utført i cellekultursystemer in vitro 19,20. Dermed er mer sofistikerte forsøksoppsett som murine koloskopi med generasjon definerte slimhinne sår ved en biopsitang for å aktivere pålitelig in vivo evaluering av gastrointestinal sårtilheling og å vurdere mulige interaksjoner mellom tarmbetennelse og sårtilheling prosesser.
I tillegg kan en injeksjonsnål skal brukes for local intramucosal administrasjon av diagnostiske fargestoffer eller potensielle legemiddelkandidater. Dette kan oppnås ved hjelp av et fleksibelt rør (diameter 0,96 mm) med en nål festet til enden kan bli innført gjennom arbeidskanalen. Gitt at en testmiddel samt placebo kontroll kan bli levert i separate inflammatoriske eller neoplastiske lesjoner i samme dyr, gir denne metoden en fordel i forhold til tradisjonelle pålitelighet eksperimentelle innstillinger. En ytterligere anvendelse av lokale injeksjoner er implantering av humane eller murine tumorceller for å generere ortotopiske svulster i det murine colon 21.
Murine modeller av kolitt er nødvendig for å belyse patofysiologi, samt for å evaluere potensielle terapeutiske midler preklinisk. Derfor er nøyaktig overvåking av sykdomsforløpet av største betydning. Konvensjonelt er alvorlighetsgraden av sykdommen som regel vurdert ved indirekte parametre slik som kroppsvekt, haemoccult testing samt analyseav blod og avføring. I kontrast er direkte bestemmelse av kolitt alvorlighetsgrad ofte begrenset til histologisk analyse post mortem, som krever død av dyret. Imidlertid murine kolonoskopi gir direkte visualisering av kolon mukosa av levende mus. Videre er direkte og repeterende overvåkning for funksjonene kolitt mulig, noe som er en forutsetning i eksperimentelle modeller med inhomogen sykdomsdebut, for eksempel, IL-10 mangelfull mus eller i modellen av transfercolitis i RAG-mangelfull mus. Derfor er det etablert seks som lar objektiv kvantifisering av slimhinnebetennelse og serieoppfølgingsundersøkelse av samme dyr en murine endoskopisk indeks over kolitt.
I sammenheng med kolorektal kreftutvikling, koloskopi tilbyr ulike gunstige muligheter. For eksempel, i motsetning til ikke-invasive metoder, er endoskopi første tilnærming for å tillate in vivo-bestemmelse av tumorstørrelseog tumornummer. Videre er bruken av fluorescerende photoprobes rettet mot spesifikke molekyler muliggjør visualisering og kvantifisering av molekylære prosesser. I en translasjonsforskning studie utført av Foersch et al. spesifikk målretting av VEGF-ekspresjon i løpet av malign kolon mukosa ble vist å være mulig og kan brukes til lesjonen karakterisering og prediksjon av behandlingsrespons hos humane pasienter med kolorektal cancer, 22. Videre kan informasjonen fra dette molekylær avbildning tilnærming være i stand til å bli oversatt til bruk i menneskelige pasienter. Dette ville tillate levende karakterisering av mistenkelige lesjoner under endoskopi. Til slutt, såkalte "smart-prober 'øke spesifisiteten av disse tracere ved aktivering av fluoroforene ved enzymatiske prosesser på siden av den målrettede lesjon 23.
Når du utfører murine endoskopi, enkelte trinnene i den gitte protokollen er spesielt kritisk. For eksempel, forskjellige moBruk stammer ulik mottakelighet for anestesi og DSS konsentrasjoner. Derfor kan være nødvendig denne protokollen for å tilpasses lokale innstillinger. Videre er erfaring i å utføre endoskopiske undersøkelser og presis kunnskap om murine anatomi kreves for å utføre optimal murine endoskopi som er trygg og målrettet. Med hensyn til mulige begrensninger i denne teknikken, merker vi at endoskopet systemet som brukes er stiv, og derfor å begrense fremgangsmåten til kolon så langt som den riktige bøyning. Videre er de fleste fluorokromer som gjelder for FE tiden blir evaluert med hensyn til deres sikkerhetsprofil, og derfor samtidig tilgjengelig for murine studier, ennå ikke er godkjent for bruk i menneskelige pasienter.
Følgende er viktige skritt som gjelder de praktiske fremgangsmåten: (1) siden mottakelighet for DSS indusert kolitt kan variere mellom ulike stammer, kan induksjon av akutt DSS kolitt risikere døden av dyr hvis det er advanced alvorlighetsgraden av kolitt. Derfor vurdere vurderer flere DSS konsentrasjoner for å identifisere de mest egnede for en individuell belastning og den spesifikke DSS batch brukt. Endoskopisk undersøkelse kan være vanskelig i nærvær av store intrakolonisk avførings massene. Indusere avføring før prosedyren ved hjelp av rektal anvendelse av 2 ml klyster væske via kneppet kanyle vil forbedre synligheten hvis det er mistanke om betydelig fekal lasting som kan skjule visningen. Hvis det oppstår høye perforering priser under biopsi, redusere lufttilførselen inn i tykktarmen før du skaffer slimhinne biopsier og redusere trykket av biopsitang på slimhinneoverflaten før stengetid grenene.
Tatt sammen, i motsetning til konvensjonelle fremgangsmåter for vurdering av sykdomsaktivitet av eksperimentell kolitt eller cancerogenesis ved indirekte parametre slik som kroppsvekt, forekomst av fecal blod, analyse av perifert blod eller post mortem histologisk analyse, endoscopy-baserte teknikker gjør det mulig levende overvåking av sykdomsforløp med mulighet til å utføre biopsier etter visuell kontroll. I tillegg, sårheling og terapeutisk effekt av topikalt legemiddelkandidater kan bedømmes in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Sonja Dufentester og Elke Weber for ekspert teknisk assistanse. Vi takker Faekah Gohar for korrekturlesing manuskriptet og Stefan Brückner for medisinsk informatikk støtte. Dette arbeidet ble støttet av en tverrfaglig stipend fra Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A94). D. Bettenworth ble støttet av en stipendiatstilling fra Det medisinske fakultet, Westfälische Wilhelms-Universität Münster. M. Brückner ble støttet av en "Gerok" rotasjonsposisjonen til Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1009B8). Vi takker Heike Blum for illustrasjon av musen tegnefilm.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Azoxymethane (AOM) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Falcon Tube 50 ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 | |
| Florene 100 V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| Isopentane (2-Methylbutane) | Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L | |
| Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | |
| Omnican F - canula | Braun, Melsungen, Germany | 9161502 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0.9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 | |
| Equipment | |||
| AIDA Control | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 096020 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 716/40 | |
| Bandpass filter | Semrock, Rochester, USA | HC 809/81 | |
| Biopsy Forceps, 3 Fr., 28 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61071ZJ | |
| Dell Monitor | Dell, Frankfurt am Main, Germany | U2412Mb | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029D | |
| Examination Sheath, 9 Fr. | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 61029C | |
| Fiber Optic Light Cable, 3.5 mm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69495NL | |
| Fluorescein Blue Filter System | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100032 | |
| Fluorescein Barrier Filter | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20100033 | |
| Foot switch | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20010430 | |
| HOPKINS Telescope, 1.9 mm, Length 10 cm | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 1830231 | |
| SCB D-light P | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 133720 | |
| SCB tricam SL II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20 2230 20 | |
| Tubing set instruments VETPUMP II | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69811 | |
| Tricam PDD PAL | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 20221037 | |
| UniVet Porta | Groppler Medizintechnik, Deggendorf, Germany | BKGM 0451 | |
| Vetpump 2 | Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Germany | 69321620 | |
References
- Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 54, 748-755 (2013).
- Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. European journal of cancer. 38, 2173-2188 (2002).
- Huang, E. H., et al. Colonoscopy in mice. Surgical endoscopy. 16, 22-24 (2002).
- Becker, C., et al. In vivo imaging of colitis and colon cancer development in mice using high resolution chromoendoscopy. Gut. 54, 950-954 (2005).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature protocols. 1, 2900-2904 (2006).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139, 1837-1843 (2010).
- Pickert, G., et al. STAT3 links IL-22 signaling in intestinal epithelial cells to mucosal wound healing. The Journal of experimental medicine. 206, 1465-1472 (2009).
- Shapira, Y., et al. Utilization of murine laparoscopy for continuous in-vivo assessment of the liver in multiple disease models. Plos one. 4, e4776 (2009).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature protocols. 2, 541-546 (2007).
- Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nature protocols. 2, 1998-2004 (2007).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clinical and experimental immunology. 114, 385-391 (1998).
- Gao, Y., et al. Colitis-accelerated colorectal cancer and metabolic dysregulation in a mouse model. Carcinogenesis. 34, 1861-1869 (2013).
- Foersch, S., Neufert, C., Neurath, M. F., Waldner, M. J. Endomicroscopic Imaging of COX-2 Activity in Murine Sporadic and Colitis-Associated Colorectal Cancer. Diagnostic and therapeutic endoscopy. 2013, 250641 (2013).
- Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
- Keller, R., Winde, G., Terpe, H. J., Foerster, E. C., Domschke, W. Fluorescence endoscopy using a fluorescein-labeled monoclonal antibody against carcinoembryonic antigen in patients with colorectal carcinoma and adenoma. Endoscopy. 34, 801-807 (2002).
- Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 4, 303-309 (1999).
- Mertz, H. R., Walsh, J. H. Peptic ulcer pathophysiology. The Medical clinics of North America. 75, 799-814 (1991).
- Pantelis, D., et al. The effect of sealing with a fixed combination of collagen matrix-bound coagulation factors on the healing of colonic anastomoses in experimental high-risk mice models. Langenbeck's archives of surgery / Deutsche Gesellschaft fur Chirurgie. 395, 1039-1048 (2010).
- Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70, 369-372 (1973).
- Msaki, A., et al. The role of RelA (p65) threonine 505 phosphorylation in the regulation of cell growth, survival, and migration. Molecular biology of the cell. 22, 3032-3040 (2011).
- Zigmond, E., et al. Utilization of murine colonoscopy for orthotopic implantation of colorectal cancer. PloS one. 6, e28858 (2011).
- Foersch, S., et al. Molecular imaging of VEGF in gastrointestinal cancer in vivo using confocal laser endomicroscopy. Gut. 59, 1046-1055 (2010).
- Mitsunaga, M., et al. Fluorescence endoscopic detection of murine colitis-associated colon cancer by topically applied enzymatically rapid-activatable probe. Gut. 62, 1179-1186 (2013).
