Rapida genotipizzazione degli animali Seguito da Stabilire colture primarie di neuroni del cervello

Summary

Descriviamo le procedure per l'etichettatura e la genotipizzazione topi appena nati e di generare colture neuronali primarie da loro. La genotipizzazione è rapido, efficiente ed affidabile, e consente l'estrazione automatica acidonucleico. Ciò è particolarmente utile per i mouse neonatale letali e le loro culture, che richiedono la preventiva realizzazione di genotipizzazione.

Abstract

Analisi ad alta risoluzione della morfologia e funzione dei neuroni di mammifero richiede spesso la genotipizzazione dei singoli animali seguita dall'analisi di colture primarie di neuroni. Descriviamo una serie di procedure per: etichettatura topi appena nati per essere sottoposti a genotipizzazione, rapida genotipizzazione, e stabilire le culture a bassa densità di neuroni del cervello di questi topi. Topi individuali sono etichettati da tatuaggio, che permette l'identificazione a lungo termine della durata in età adulta. La genotipizzazione del protocollo descritto è veloce ed efficiente, e consente l'estrazione automatica di acidi nucleici con buona affidabilità. Ciò è utile in circostanze in cui il tempo sufficiente per la genotipizzazione convenzionale non è disponibile, per esempio, in topi che soffrono di letalità neonatale. Colture neuronali primarie sono generati a bassa densità, che permette esperimenti di imaging ad alta risoluzione spaziale. Questo metodo di coltura richiede la preparazione di strati di alimentazione gliali prima placcatura neuronale. Il pROTOCOLLO è applicata nella sua interezza ad un modello murino della distonia disturbo del movimento DYT1 (AE-torsinA topi knock-in), e colture neuronali sono preparati dal ippocampo, corteccia cerebrale e striato di questi topi. Questo protocollo può essere applicato a topi con altre mutazioni genetiche, nonché di altre specie animali. Inoltre, i singoli componenti del protocollo possono essere utilizzati per isolati sotto-progetti. Così questo protocollo avrà applicazioni larghe, non solo nel campo delle neuroscienze, ma anche in altri settori delle scienze biologiche e mediche.

Introduction

Modelli di roditori di malattie genetiche sono dimostrati utili per stabilire le funzioni fisiologiche di proteine ​​normali e acidi nucleici, così come le conseguenze fisiopatologiche di difetti di questi. Gli esempi includono topi deficienti per proteine ​​coinvolte in funzioni cellulari chiave, così come i modelli murini di malattie come il morbo di Alzheimer. Tuttavia, alcune manipolazioni genetiche possono portare a letalità neonatale poco o pochi giorni dopo la nascita. In questi casi, colture primarie sono uno strumento importante perché le cellule vive sono disponibili presso i cuccioli embrionali o neonatali prima della morte, possono essere mantenute per almeno un paio di settimane in vitro, e in questo periodo precoce dello sviluppo neuronale può essere seguito da esperimenti biochimici, funzionali e morfologiche. Per le colture primarie, può essere utile al piatto i neuroni a bassa densità; ciò rende possibile visualizzare il somata individuale, dendriti, alberi assonale e nervo Termisegnali ad alta risoluzione spaziale. Tuttavia, la sopravvivenza e la differenziazione dei neuroni a bassa densità richiede tipicamente che sono piastrate su uno strato alimentatore gliali, co-coltura con cellule gliali in assenza di contatto fisico con loro, o coltivati ​​in terreno condizionato dalla glia ^1.

La creazione di colture neuronali bassa densità su strati di alimentazione gliali può dipendere genotipizzazione veloce e affidabile anticipo - entro poche ore a differenza di alcuni giorni. La velocità è particolarmente importante quando il genotipo neuronale deve essere abbinato a quello di uno strato alimentatore gliali preparato. Come esempio più pratico, può essere necessario decidere quali cuccioli di genotipo che da utilizzare nelle culture generano, per ottimizzare l'efficienza di un esperimento.

Qui mostriamo il protocollo di lavoro che è stato usato per un veloce, semplificato e affidabile genotipizzazione del mouse in precedenti pubblicazioni ^2-6. Mouse e codeun kit disponibile in commercio vengono utilizzati. Questo protocollo comprende un'unica fase di estrazione degli acidi nucleici dal tessuto, e non richiede né una purificazione passo-acido nucleico, né l'uso di un tampone di terminazione ('fermata soluzione'). L'affidabilità di questo metodo genotipizzazione è illustrato presentando i risultati di una serie di prove in cui le differenze sono introdotte rispetto alla quantità iniziale di campioni, l'età degli animali e la lunghezza degli ampliconi PCR. Questo kit offre i vantaggi di estrazione e affidabilità automatizzato.

Per motivi di essere completa, l'uso di tatuaggi per l'identificazione a lungo termine dei topi genotipizzati è anche dimostrato. Il tatuaggio viene ottenuto applicando inchiostro tatuaggio al derma della pelle (sotto l'epidermide) ^7. Una procedura è descritta per tatuaggi i cuscinetti delle zampe di topi neonati o di 1 giorno, anche se tatuaggi possono essere applicati ad altre parti del corpo, come code e dei piedi, e Animals di tutte le età. Inoltre, sarà dimostrato procedure per la placcatura e coltivando neuroni di topo a bassa densità, basato sulla preparazione ottimale di diversi tipi di strati di alimentazione gliali ^2,8.

Usiamo un modello genetico del mouse della malattia neurologica ereditaria DYT1 distonia - una malattia autosomica dominante movimento causata da una mutazione nel gene TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) ^9. La proteina codificata, torsinA, appartiene alle "ATPases associati alle diverse attività cellulari" (AAA +) famiglia di proteine, i cui membri generalmente eseguire funzioni chaperone-like, che assiste in: proteine ​​unfolding, proteina-complesso smontaggio, il traffico di membrana, e la fusione delle vescicole ^10-13. I risultati mutazione in un in-frame delezione di un codone dell'acido glutammico, e possono portare alla manifestazione di 'insorgenza precoce generalizzata isolato distonia' ^14,15. Tuttavia, il percorsomeccanismi ophysiological responsabili di questo disturbo rimangono poco conosciuti. In un modello di topo knock-in, l'allele mutante è TOR1A ^tm2Wtd, citato qui di seguito come TOR1A ^AE. Eterozigoti AE-torsinA knock-nei topi sono pazienti umani vitali e geneticamente mimici con DYT1 distonia, mentre omozigote knock-in topi muoiono dopo la nascita ^16,17, con la latenza di morte post-natale colpiti da background genetico ^18. La morte precoce di omozigoti topi knock-in richiede che sia la genotipizzazione degli animali e la creazione di colture neuronali sono concluse rapidamente. Come altro esempio di genotipizzazione, Tfap2a (fattore di trascrizione AP-2α, attivando legame con le proteine ​​2α enhancer) sarà utilizzato. La proteina codificata da questo gene è importante nella regolazione più processi cellulari, quali la proliferazione, la differenziazione, la sopravvivenza e apoptosi ^19.

Protocol

NOTA: Tutte le procedure sugli animali eseguiti in questo studio sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale della University of Iowa.

Identificazione 1. a lungo termine di topi mediante tatuaggio dei cuscinetti delle zampe

1. Immobilizzare una zampa con il pad della zampa (superficie plantare) rivolta verso lo sperimentatore. Tenere la zampa con il pollice e il dito indice. Fare attenzione a non schiacciare la zampa.
   NOTA: l'immobilizzazione Stable è importante garantire che il pigmento tatuaggio è posizionato nel derma del pad zampa, e quindi è permanente ^7.
2. Tampone il pad zampa con il 70% di etanolo su una garza o un tampone.
3. Applicare l'olio della pelle ad un applicatore con punta di cotone, e premere delicatamente la punta contro la superficie del pad zampa più volte. Utilizzare solo una piccola quantità di olio di pelle; quando presente in grande quantità, impedisce il pigmento tatuaggio di raggiungere la pelle.
4. Immergere le punte degli aghi per tatuaggio nell'inchiostro tatuaggio appena primaal tatuaggio. Utilizzare pulita, asettica e aghi tatuaggi appuntiti, per diminuire il dolore e la possibilità di infezione, e anche per aumentare l'efficienza tatuaggi.
5. Mentre la superficie pad zampa è coperto con l'olio della pelle, premere punte degli aghi tatuaggio verticale e leggermente contro la pelle nel centro del pad zampa, e iniettare l'inchiostro più volte. Vedere tabella dei materiali / Attrezzature per informazioni sul sistema tatuaggio elettrico.
6. Spray 70% di etanolo in una garza, premere delicatamente contro la zampa per rimuovere il pigmento tatuaggio in più sulla superficie della pelle, e controllare la qualità del tatuaggio. Controllare che la metà del pad zampa ha una, macchia rotonda scura che si differenzia dal normale pigmentazione della pelle. Se il tatuaggio non è scuro o abbastanza grande per una facile visualizzazione, ripetere i passaggi precedenti tatuaggi.

2. Mice genotipizzazione Newborn Utilizzando una veloce Kit PCR Genotipizzazione

1. Disinfettare l'estremità distale di una coda di topo con il 70% di etanolo, tagliare 5 mm o meno della codapunta e trasferirlo ad un tubo di una striscia 8 tubo del tipo usato per la PCR. Utilizzare una lama di rasoio un-utilizzato per ogni cucciolo di evitare la contaminazione incrociata tra i campioni. In alternativa, utilizzare un paio di forbici, ma in questo caso, con attenzione e rimuovere completamente il tessuto rimanente sulle lame utilizzando 70% di etanolo. Verificare la presenza di sanguinamento. Se si verifica sanguinamento, applicare pressione alla porzione di taglio della coda con una garza fino sanguinamento si è fermato.
2. Aggiungere 200 ml di DNA Extraction Solution ad ogni provetta PCR contenente un esemplare. Vedere tabella dei materiali / Attrezzature per la sua composizione e le informazioni sul kit.
3. Posizionare la striscia tubo in un termociclatore PCR, e inizia l'estrazione del DNA utilizzando il seguente programma: 1 ciclo a 55 ° C per 10 min, 1 ciclo a 95 ° C per 10 min, e mantenimento a 4 ° C.
   NOTA: Questo è lo stesso termociclatore PCR che viene poi utilizzato per la PCR.
4. Dopo l'estrazione del DNA, rimuovere la striscia tubo dal cycler una termicand capovolgere 5 volte.
5. Trasferire 4 ml di soluzione (estratto di DNA) di ciascun campione di una non-utilizzato tube di una striscia a 8-tube, e mescolare con: 10 ml di 2X PCR Ready Mix II, 2 ml di misto in avanti e indietro primer (consigliato a 0,5 m; vedi tabella dei materiali / attrezzature per le sequenze), e 4 ml di priva di nucleasi H ₂ O, per ogni campione. Spin brevemente (ad esempio, 3 sec) utilizzando una centrifuga da tavolo. Tenere le provette su ghiaccio in ogni momento tranne durante la manipolazione.
6. Effettuare cicli termici. Vedere Tabella dei materiali / attrezzature per il programma termico.
7. Rileva i prodotti di DNA amplificati. Caricare la soluzione totale reazione della PCR (20 microlitri) direttamente in un pozzetto di un gel di agarosio. Caricare i marcatori di peso molecolare in un pozzo separato. Applicare un campo elettrico.
8. Acquisire le immagini di fluorescenza di bande sotto la luce ultravioletta.

3. Cultura primario di topo cervello Neurons su Glial Feeder livello

NOTA: Le procedure per la dissezione del cervello e la dissociazione delle cellule (3.1) sono comuni a tutte le procedure successive. Le procedure per le culture del mouse gliali (3.2), culture di ratto gliali (3.3), e colture neuronali di topo (3.4) sono descritti separatamente in seguito.

1. Cervello Dissection e Cellular Dissocaiation
   1. Sacrifica un mouse o piccoli dei ratti per decapitazione, rimuovere rapidamente il cervello, e metterlo nella soluzione Hanks '(vedi Tabella 1 per la composizione) + 20% di siero fetale bovino (FBS) in un piatto 35 mm (tenuti in ghiaccio).
   2. Tagliare il cervello attraverso la linea mediana in due emisferi. Rimuovere la regione di interesse (ad esempio, corteccia cerebrale, striato e nell'ippocampo) da ciascun emisfero del cervello. Rimuovere le meningi e dei grandi vasi sanguigni dalla superficie. Tagliare la regione del cervello in 4-10 fette sottili con una lama chirurgica.
   3. Sciacquare le fettine di cervello in un tubo di centrifugazione 15 ml, una volta wit'soluzione + 20% FBS, poi 3 volte con il Hanks' h Hanks soluzione (cioè, senza siero) (tutti a 4 ° C). Per lavare, aggiungere la soluzione 5-10 ml, lasciare che il cervello fette depositano sul fondo della provetta, aspirare la soluzione dall'alto, e aggiungere una soluzione fresca. Terminare la procedura di lavaggio aspirando la soluzione.
   4. Filtrare 2 ml della soluzione di digestione-tripsina contenente (vedi Tabella 1 per la composizione) usando una siringa 3 ml e un filtro a siringa da 0,2 micron, e aggiungere il filtrato direttamente nel tubo contenente le fette di cervello. Lasciate che la tripsinizzazione proseguire per 13 minuti a temperatura ambiente.
   5. Neutralizzare la soluzione tripsina prima aspirando la maggior parte di esso e poi aggiungendo 7-10 ml di soluzione di Hanks '+ 20% FBS (4 ° C).
   6. Risciacquare le fette di cervello, due volte con Hanks 'soluzione + 20% FBS, e quindi tre volte con il Hanks' soluzione (ovvero senza siero) (tutti a 4 ° C). Terminare la procedura di lavaggio aspirando il solution.
   7. Filtrare 2 ml della soluzione di dissociazione (vedi Tabella 1 per la composizione) usando una siringa 3 ml e un filtro a siringa da 0,2 micron, e aggiungere il filtrato direttamente al tubo con le fette di cervello.
   8. Meccanicamente dissociare le cellule triturando delicatamente 10-20 volte, fino pezzi di tessuto visibili scompaiono. Utilizzare un cotton-collegato, incendio lucidato pipetta Pasteur e evitare di fare bolle durante la triturazione.
   9. Attendere 3 minuti per i piccoli pezzi di stabilirsi.
   10. Trasferire la maggior parte della soluzione (~ 1,5 ml, lasciando qualche soluzione in basso) ad un tubo 15 ml centrifugazione contenente soluzione FBS 3 ml di soluzione Hanks '+ 20% (4 ° C), utilizzando il cotone collegato, antincendio lucidato pipetta Pasteur. Non trasferire tutta la soluzione per l'inserimento di sedimenti sul fondo si traduce tipicamente in un deterioramento della cultura.
   11. Centrifugare per 13 min a ~ 185 g (~ 1.100 rpm) a 4 ° C.
   12. Aspirare il surnatante con delicatezza,aggiungere 1 ml di pre-riscaldato placcatura medio (37 ° C) al pellet e risospendere esso pipettando delicatamente più volte utilizzando il cotone collegato, incendio lucidato pipetta Pasteur.
       NOTA: Tre diversi tipi di placcatura media sono utilizzati per scopi culturali diversi: placcatura medio-1 per le cellule gliali del mouse, placcatura medio-2 per i neuroni di topo, e placcatura medio-3 per i neuroni di ratto e cellule gliali (vedi Tabella 1 per composizioni) .
   13. Estrarre 10 ml di sospensione cellulare, mescolare con 10 ml di 0,4% trypan soluzione blu, e misurare la densità di cellule vive, utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.
2. Culture del mouse gliali
   1. Lavare i coprioggetti per aiutare a stabilire colture sane di cellule di topo.
      1. Immergere vetrini (tondo, diametro 12 mm) nel 70% di acido nitrico in una capsula di Petri di vetro. Proteggere dalla luce utilizzando un foglio di alluminio, e posizionarlo su un orbitale shaker O / N.
      2. Sciacquare il coversli vetrops nella capsula Petri almeno tre volte con acqua distillata. Immergerle in acqua distillata. Porre la capsula in un orbitale shaker O / N.
      3. Asciugare i coprioggetti su un Whatman 150 millimetri carta da filtro nella cappa di sicurezza biologica.
      4. Autoclave i coprioggetti.
      5. Posizionare i coprioggetti in 24 ben piatto cultura.
   2. Label e genotipo topi neonati secondo i punti 1 e 2.
   3. Ottenere le cellule cerebrali dai cuccioli di topo, secondo step 3.1.
      NOTA: L'uso della corteccia cerebrale è tipico per preparare lo strato alimentatore gliali mouse. Tuttavia, altre regioni del cervello, come l'ippocampo e striato, lavoreranno dopo una corretta regolazione della densità delle cellule a causa di diversi numeri e dei rendimenti delle cellule provenienti da diverse regioni.
   4. Aggiungere ~ 4 ml di pre-riscaldato placcatura medio-1 alla sospensione cellulare finale (~ 1 ml). Per pre-riscaldamento coltura, posizionare la soluzione nell'incubatrice coltura (5% CO ₂ -95% O _2, 37 ° C) O / N, perconsentono i valori di temperatura e di pH per stabilizzare.
   5. Trasferire la sospensione cellulare a un pallone di coltura T25 non patinata, con il cotone collegato, incendio lucidato pipetta Pasteur. Porre il pallone nell'incubatrice cultura.
   6. A 1 giorno vitro (DIV), lavare le cellule in coltura nel pallone T25 due volte con placcatura medio-1 (4 ° C). Porre il pallone nuovamente dentro l'incubatrice. Eseguire risciacquo aspirando il mezzo all'interno del pallone completamente con una pipetta Pasteur, aggiungendo ~ 5 ml di mezzo fresco e inclinando leggermente il pallone più volte in un movimento vorticoso.
   7. A 6-9 DIV, (vale a dire, un giorno prima tripsinizzazione e placcatura su vetrini, in fasi 3.2.8-3.2.13), posto a 100 ml di materiale di rivestimento con proteine ​​della matrice extracellulare (vedi Tabella dei materiali / Attrezzature per commenti su il materiale di rivestimento) sui vetrini in un piatto cultura, e posizionare il piatto cultura nell'incubatrice cultura.
   8. A 7-10 DIV, quando le cellule sono 20-40% confluenti (spazialmente continuo), li trypsinize.
      1. Risciacquare il pallone volta, aspirando tutta la soluzione nel matraccio e aggiungendo ~ 13 ml di soluzione di Hanks '(4 ° C), inclinare leggermente il pallone più volte in un moto vorticoso, e aspirare completamente la soluzione.
      2. Aggiungere 40 ml di soluzione di DNasi (concentrazione finale, 750 unità / ml) a 4 ml soluzione tripsina-EDTA, passare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron, e aggiungere il filtrato direttamente alle cellule nel matraccio.
      3. Sia la tripsinizzazione procedere per 13 min a 37 ° C in incubatore.
      4. Neutralizzare la soluzione tripsina aggiungendo 2 ml di 100% FBS (4 ° C) al pallone.
      5. Trasferire le cellule trypsinized ad un tubo 15 ml centrifugazione utilizzando un 5- 10 ml pipetta, aggiungere ~ 4 ml di soluzione di Hanks '+ 20% FBS (4 ° C), centrifugare a ~ 185 ge 4 ° C per 13 min , e aspirare il surnatante.
   9. Risospendere il pellet in 1 ml di pre-warmed placcatura medio-1.
   10. Misurare la densità delle cellule secondo la fase 3.1.13.
   11. Aspirare il materiale di rivestimento completamente dalle vetrini, e piastra ~ 50 ml di cellule gliali risospese su vetrini.
       NOTA: Queste cellule stabiliranno strato alimentatore gliali.
   12. Posizionare il piatto cultura con coprioggetto nell'incubatrice.
   13. 20-60 minuti più tardi, aggiungere 1 ml di pre-riscaldato placcatura medio-1 ad ogni bene, e mettere il piatto posteriore nell'incubatrice. Nota: Mentre viene aggiunto il mezzo di placcatura, sarà utile utilizzare un'altra pipetta per premere verso il basso la periferia del vetrino (dove non ci sono cellule piastrate), in modo che il coprioggetto non galleggiare nel mezzo.
   14. A 1 DIV dello strato alimentatore gliali (cioè sul vetrino di vetro), sostituire il mezzo con 1 ml di pre-riscaldato placcatura medio-1, aspirando tutta la soluzione in un pozzo e poi riempire con terreno fresco.
   15. A 2-3 DIV dello strato alimentatore gliali quando il cells sono 80-100% confluenti, aggiungere inibitore mitotico (10 ml di una miscela di 5-fluoro-2'-deossiuridina + uridina; concentrazioni finali di 81,2 e 204,8 mM, rispettivamente) in ciascun pozzetto, per inibire la replicazione del DNA e quindi sopprimere la proliferazione cellule gliali.
   16. A 7-9 DIV, quando le cellule sono 90-100% confluenti (1-2 hr prima placcatura neuroni sullo strato alimentatore gliali), sostituire il terreno di coltura con pre-riscaldato placcatura medio-2 (37 ° C).
       NOTA: I neuroni saranno placcato lo stesso giorno, con passo 3.4.
3. Culture Rat gliali
   1. Coat un pallone di coltura T25 con lo stesso materiale di rivestimento.
      NOTA: Questo è necessario per la successiva rimozione delle cellule non aderenti al punto 3.3.5.
      1. Aggiungere ml 2,0 del materiale di rivestimento nel pallone, e mettere il pallone in incubatrice cultura.
      2. Dopo 2-3 ore, aspirare il materiale di rivestimento completamente, in modo che il pavimento del pallone diventa secca.
   2. Ottenere le celluledai cuccioli di ratto, in base al punto 3.1.
      NOTA: La regione CA3-CA1 dell'ippocampo viene usato per preparare lo strato alimentatore gliali di ratto. Tuttavia, altre regioni del cervello, come la corteccia cerebrale e striato, lavoreranno dopo aggiustamento per differenze di densità cellulari dovuti a diversi numeri e rese di cellule provenienti da diverse regioni.
   3. Aggiungere ~ 4 ml di pre-riscaldato placcatura medio 3 alla sospensione cellulare finale (~ 1 ml).
   4. Trasferire la sospensione cellulare nel pallone cultura T25 rivestito, utilizzando il cotone collegato, incendio lucidato pipetta Pasteur. Porre il pallone in incubatrice cultura (5% di CO ₂ -95% O _2, 37 ° C).
   5. A 2-3 DIV, quando le cellule sono 20-40% confluenti, rimuovere non aderente o debolmente cellule aderenti, chiudendo il coperchio a tenuta, agitando vigorosamente ~ 10 volte, aspirando la soluzione, e aggiungendo 4-5 ml di placcatura medio-3 (a 4 ° C). Ripetere questa procedura una volta. Esaminare le cellule coltivate in tutto l'intero piano pallone (ad esempio,con microscopio a contrasto di fase) per confermare che quelle che sembrano neuronale (cioè, quelli per cui il bordo esterno del corpo cellulare appare fase luminoso) vengono completamente rimosso. Ripetere la procedura con la frequenza necessaria per eliminare queste cellule, e quindi riportare il pallone al incubatrice.
      NOTA: La forza e il numero totale di "shakes" necessarie possono differire tra i singoli sperimentatori. La cosa importante è non mantenere il numero totale di frullati ad un numero fisso, ma per confermare che le cellule neuronali-simili sono eliminati.
   6. A 6-8 DIV, quando le cellule sono 90-100% confluenti, il passaggio delle cellule gliali di loro trypsinizing come al punto 3.2.8.
   7. Dopo centrifugazione, risospendere il pellet in 1 ml di placcatura medio-3 (4 ° C), aggiungere 10 ml di placcatura medio-3 (4 ° C), trasferire le cellule trypsinized a un pallone T75 un-rivestito, e cultura l'incubatore.
      NOTA: le cellule gliali di ratto saranno diversi passaggi due volte; in contrasto con le cellule gliali del mouse are diversi passaggi solo una volta perché diventano malsano dopo più passaggi. Cellule Rat gliali saranno diversi passaggi in fiasche T75 non rivestiti con qualsiasi materiale di rivestimento. Il rivestimento permette alle cellule di ratto gliali a crescere troppo in fretta e producono molte cellule ciliate (putativi cellule ependimali), che deteriorano la condizione cultura neuronale tardi.
   8. A 17-19 DIV della cultura gliali in una beuta (cioè, 11 giorni dopo passaging e un giorno prima tripsinizzazione e placcatura su coprioggetto da gradini 3.3.9-3.3.14), posizionare 100 ml di materiale di rivestimento su vetrini lavate ( tondo, diametro 12 mm) in un piatto di cultura, e posizionare il piatto cultura nell'incubatrice cultura.
      NOTA: Per le culture gliali di ratto, la differenza non è stata notata nei risultati della coltura, con o senza lavare i coprioggetti.
   9. A 18-20 DIV della cultura gliali in un pallone (cioè 12 giorni dopo passaging), preparare lo strato alimentatore gliali dalle trypsinizing cellule coltivate, secondo step 3.2.8.
   10. Durante la centrifugazione, aspirare il materiale di rivestimento completamente dalle vetrini.
   11. Dopo centrifugazione, risospendere il pellet in 1 ml di placcatura medio-3 (4 ° C), e misurare la densità cellulare, secondo la fase 3.1.13.
   12. Regolare la densità gliali a 10 ⁴ vivo cellule / ml, e piastra 100 microlitri della sospensione cellulare gliale sui vetrini rivestiti.
       NOTA: Queste cellule stabiliranno strato alimentatore gliali.
   13. Posizionare il piatto cultura con lamelle in incubatore per 20-60 min.
   14. Aggiungere 1 ml di placcatura medio-3 (4 ° C) per ciascun bene, e mettere il piatto posteriore nell'incubatrice.
   15. A 3-4 DIV dello strato alimentatore gliali, quando le cellule sul vetrino sono 40-80% confluenti, aggiungere 1 ml di mezzo di crescita pre-riscaldato (vedi Tabella 1 per la composizione) che contiene citosina β-D-arabinofuranoside ( AraC, concentrazione finale di 4 micron) per arrestare la proliferazione gliale cellule. Piastra neurones a 7-9 DIV dello strato alimentatore gliali quando le cellule sono 60-80% confluenti, usando passo 3.4.
4. Culture del mouse neuronali
   1. Label e genotipo topi neonati secondo i punti 1 e 2.
   2. Utilizzare i cuccioli di topo per passo 3.1.
   3. Regolare la densità della sospensione live-cell a ~ 2,0 x 10 ⁵ cellule / ml utilizzando preriscaldata placcatura medio-2 per la placcatura sulle cellule gliali del mouse, o mediante placcatura medio-3 per la placcatura sulle cellule gliali di ratto.
   4. Piastra le cellule sullo strato alimentatore gliali, aggiungendo delicatamente la sospensione cellulare al mezzo di coltura di ogni pozzetto. Nota: Il volume della sospensione cellulare da aggiungere sarà determinato dal numero di celle di destinazione in una cultura ben. Ad esempio, piastra ~ 60 ml di sospensione cellulare per raggiungere 12.000 cellule / pozzetto.
   5. Si noti che nessuna modifica soluzione sono necessari dopo che i neuroni sono placcati. Fare attenzione per evitare l'evaporazione della soluzione dai pozzetti nel corso della coltura, da umidificazione o all'internof incubatore cultura.

Representative Results

Come esempio di applicazione di questo protocollo, risultati rappresentativi sono mostrati per etichettare topi tatuaggi, genotipizzazione affidabile in varie condizioni sperimentali, e stabilendo colture neuronali primarie su strati di alimentazione gliali.

Tatuaggio

Cuccioli appena nati sono stati etichettati sui cuscinetti delle zampe utilizzando un sistema tatuaggi ('Newborn' in Figura 1). Le etichette sono rimasti chiaramente visibili 3 settimane ('3 settimane di età') e 32 settimane di età ('32 settimane di-vecchio '). L'individuo topi può essere identificato in modo univoco da una combinazione di tatuaggi sulle quattro zampe (numeri 1-16) e dalle informazioni sulla gabbia per animali, o schemi di numerazione più complessi (non mostrato).

Genotipizzazione

Un esempio rappresentativo di genotipizzazione è mostrato (Figura 2). Il gene TOR1A di wild-type (TOR1A (TOR1A ^{+ / AE)} e omozigote (TOR1A ^{AE / AE)} AE-torsinA topi knock-in è stato amplificato dal DNA genomico isolato da clip di coda di cuccioli appena nati. Genotyping in questo esempio specifico si basa sulla presenza di un unico sito loxP 34-base-pair nel mutante TOR1A allele dopo successo ricombinazione Cre e la cancellazione di una cassetta di resistenza neomicina ^16,18.

DNA genomico è stato estratto con hands-on minime tempo, e molti campioni sono stati elaborati contemporaneamente. I volumi di estrazione sono stati mantenuti costanti, e quindi non la regolazione del volume è stata necessaria per accogliere i cambiamenti nelle condizioni testate. L'affidabilità di genotipizzazione è stato testato in quattro condizioni, come di seguito dettagliato.

Innanzitutto, l'effetto delle differenze nella quantità di tessuto di base è stato esaminato (Figura 3). Code di diverse lunghezze eranopreparata dal eterozigoti AE-torsinA knock-in topi (TOR1A ^{+ / AE)} all'età dello svezzamento (~ 3 settimane). Lunghezze coda di 2 a 5 mm, la gamma tipicamente raccomandato protocolli di genotipizzazione, dato lo stesso risultato genotipizzazione di alta qualità. Le due bande corrispondono alla wild-type e alleli mutati (TOR1A ⁺ e TOR1A ^AE, rispettivamente).

In secondo luogo, gli effetti della variabilità in età degli animali sono stati esaminati (Figura 4). Tails sono stati ottenuti da neonato, a 3 settimane di età e ~ 24 settimane di età AE-torsinA eterozigoti knock-nei topi (TOR1A ^{+ / AE).} Omozigoti non sono stati utilizzati perché muoiono parecchi giorni dopo la nascita ^16-18. Le due bande attesi per wild-type e geni mutati TOR1A erano visibili indipendentemente dall'età degli animali (Figura 4A). L'applicabilità generale di questo risultato è stato testato con un secondo gene, Tfap2a ¹⁹ in wild-ttopi ATURA (Tfap2a ^{+ / +)} (Figura 4B).

In terzo luogo, gli effetti delle differenze di lunghezza degli amplificati PCR sono stati testati (Figura 5). A questo scopo, diverse coppie di primer sono stati sintetizzati per un dato gene, tale che il DNA amplificati sono di lunghezze diverse coppie di basi. Il gene Tfap2a è stato sempre rilevato con diverse lunghezze ampliconi.

Quarto, due metodi di estrazione del DNA sono stati confrontati (Figura 6). In un metodo, sono stati utilizzati tubi strip PCR e il termociclatore PCR (descritto al punto 2). Questo è un metodo ('Auto' in figura 6) automatizzato parallelo multi-tubo di estrazione. Poiché più tubi possono essere trattati contemporaneamente nel formato a striscia, e una macchina PCR viene utilizzato con un programma di operare in quattro passaggi di temperatura, non vi è alcuna necessità di trasferire i tubi, modificare manualmente la temperatura durante l'estrazione o utilizzare più pezzidi apparecchiature. Così è facile elaborare molti campioni. Questo è stato confrontato con il secondo metodo basato su, estrazione manuale singolo tubo ('Manual' in figura 6). Questo utilizza singoli tubi PCR e macchine non-PCR separate (blocchi di calore e bagni d'acqua) per controllare la temperatura durante l'estrazione del DNA. In questo caso, multiple, tubi singoli sono stati trasferiti ad una nuova temperatura dopo ogni passo, richiede molteplici apparati temperatura controllo. In entrambi i casi, il gene TOR1A stato analizzato nel wild-type, eterozigote e omozigote AE-torsinA knock-nei topi (figura 6A), e il gene Tfap2a stato analizzato in topi wild-type (Figura 6B). I due protocolli di estrazione ha avuto esito genotipizzazione equivalenti.

In sintesi, i risultati presentati nelle figure 3 a 6 dimostrano che il metodo genotipizzazione è robusto, ottenendo risultati affidabili e riproducibili nonostante variations in quantità di tessuto, l'età degli animali, la lunghezza amplicon, e il protocollo di estrazione utilizzato.

Colture neuronali

Per coltura neuroni di topo sullo strato alimentatore gliali del mouse, l'ordine delle procedure è: (tatuaggio neonato topi → genotipizzazione per la cultura gliali →) cultura gliale → tatuaggio neonato topi → genotipizzazione per la cultura neuronale → cultura neuronale. Per le culture stabilite sullo strato alimentatore gliali di ratto, le procedure tra parentesi sono saltati.

Abbiamo esaminato l'effetto di sostegno del pre-seeded strato alimentatore gliali sulla sopravvivenza neuronale e la crescita. I neuroni sono stati ottenuti dalla regione CA3-CA1 dell'ippocampo, la regione del motore di corteccia cerebrale, e striato di topi appena nati wild-type. Essi sono stati placcati a bassa densità su ratto gliale feeder layer che erano stati ottenuti nella regione CA3-CA1 dell'ippocampo e seminato prima di placcatura neuronale, secondolo schema illustrato nella Figura 7 (sintesi semplificato delle procedure). Culture a bassa densità sono ottimali per l'imaging singoli dendriti, somata ^4,6, terminazioni nervose ^2,3,5,8 e alberi assonale ⁵ ad alta risoluzione spaziale. Le cellule ippocampali (contenente sia neuroni e cellule gliali) sono state piastrate su vetrini rivestiti, sia con (Figura 8A) o senza gliale strato alimentatore prestabilito (Figura 8B, C) ​​e osservati con ottica a contrasto di fase. In presenza di uno strato alimentatore gliali quasi confluenti, i neuroni (in ciascun pannello, una freccia indica un neurone rappresentante) sono stati dispersi relativamente 3 e 7 giorni dopo la placcatura (giorni in vitro, DIV) (Figura 8A). Hanno anche mostrato segni di buona salute, come ad esempio un chiaro margine di somata neuronale, dendriti estesi, la mancanza di somata cluster, e la mancanza di neuriti bundle (elevato ingrandimento images in inserti). Al 14 DIV, questi neuroni formano una fitta rete caratterizzata da lunghe neuriti (dendriti e assoni). Si noti che la proliferazione gliale è stato inibito prima neuroni sono placcati, con l'aggiunta di mezzo di crescita contenente la AraC inibitore mitotico (punto 3.3.15).

Al contrario, in assenza dello strato di alimentazione gliale al momento della placcatura neuroni ippocampali, la crescita dei neuroni ippocampali era insufficiente, anche in assenza di AraC. A 3 DIV, cellule gliali (inclusi nelle cellule dell'ippocampo appena placcato) non hanno formato uno strato confluente (asterisco in pannello superiore della figura 8B). Le culture hanno mostrato diversi segni che non sono appropriati per gli studi di imaging ad alta risoluzione, come ampie zone senza cellule gliali sottostanti (asterisco), la presenza di somata cluster e la presenza di neuriti bundle in alcune aree (dati non riportati). Entro il 7 DIV, cellule gliali formano un foglio confluente (pannello centrale della Figura 8C). Carner, i neuroni sono in numero minore rispetto a quando i neuroni sono stati piastrati su uno strato alimentatore gliali prestabilito. I neuroni sopravvissuti anche mancava, neuriti rete formando lunghe (riquadro). Le cellule gliali sono stati più eterogenei in curvatura e spessore rispetto a quelli nella cultura feeder layer, apparendo così fase brillante. Per testare gli effetti di soppressione sui neuroni proliferazione gliale, abbiamo applicato AraC contenenti mezzo di crescita. Quando AraC stato aggiunto il 3 o 7 DIV e le cellule sono state coltivate fino al 14 DIV e osservata in questo giorno (Figura 8B e C, pannelli di fondo), le cellule gliali coperti maggior parte della superficie coprioggetto. Tuttavia, i neuroni erano ancora poco numerosi, soprattutto quando AraC stato applicato a 7 DIV. I neuroni sopravvissuti avevano solo processi brevi e non erano collegati estesamente. Così, alla fine aggiunta di AraC permesso uno strato gliale uniforme per formare, ma non ha promosso la vitalità neuronale o estensione dei neuriti; piuttosto la crescita incontrollata glialeha avuto effetti deleteri sui neuroni.

Questi dati mostrano che lo strato alimentatore gliali è critico per la sopravvivenza e la crescita dei neuroni placcato a bassa densità, e che lo strato gliale deve essere presente al momento della placcatura neuronale che tardi durante la coltura neuronale. Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando colture di corticale cerebrale (Figura 9) e neuroni striatali (Figura 10).

L'osservazione qualitative sulla sopravvivenza neuronale è stata confermata mediante analisi quantitativa. In particolare, il numero di neuroni sopravvissuti a 14 DIV è stato contato, basata sulle immagini a contrasto di fase delle culture (Figura 11). Il numero è stato maggiore per i neuroni in coltura su uno strato alimentatore gliali (es., Placcato sullo strato alimentatore gliali). Il numero era inferiore nel caso di neuroni in coltura in assenza di uno strato alimentatore gliali. Il numero è stato ulteriormente ridotto quando le cellule sono state trattate con AraC asuccessivamente. Queste differenze erano statisticamente significative, e sono stati notati in colture di neuroni ottenuti da tutte e tre le regioni del cervello.

I tipi di cellule sopravvissute sono stati identificati 14 DIV nel topo colture ippocampali piastrate su strato alimentatore ippocampali di ratto. Doppio immunocitochimica è stata effettuata utilizzando anticorpi contro il marcatore neuronale, MAP2 (MAP2), e il marcatore astrociti cellule gliali, proteina acidica fibrillare gliale (GFAP). Le cellule con processi estesi sono stati positivi per MAP2, mentre le cellule dello strato alimentatore gliali sottostante sono stati positivi per GFAP (due campi immagine rappresentativi, Figura 12A). Questa colorazione non era un artefatto di una specifica combinazione di anticorpi primari e secondari, in quanto lo stesso modello è stato ottenuto quando un diverso insieme di anticorpi secondari è stata utilizzata (Figura 12B).

Al contrario, quando la stessa colorazione fu performed sulle culture costituiti solo uno strato alimentatore gliali, cioè in assenza di cellule di topo (aggiunti due campi immagine rappresentativi, Figura 13A), non le cellule erano positive per MAP2. Le cellule dello strato alimentatore erano costantemente positive per GFAP. Per un controllo negativo, entrambi gli anticorpi primari sono stati omessi dalla procedura immunocitochimica (Figura 13B). Nessuna colorazione è stato rilevato in questi campioni, anche se le cellule erano presenti, come evidente dalle ottiche a luce trasmessa (contrasto di interferenza differenziale, DIC) e colorazione nucleare con Hoechst dye. Così, la colorazione non specifica nei canali MAP2 e GFAP era molto debole.

Questi dati sono stati analizzati immunocitochimiche quantitativamente (Figura 14). In ogni immagine 8-bit, intensità è stata misurata e tracciata lungo una linea. Trame sovrapposte rivelano MAP2 colorazione quando le cellule di topo (campioni contenenti neuroni) sono state coltivate su un livello di alimentazione gliale (Neuron +,glia +, anticorpo primario (1 ° Ab) +), che tale colorazione era assente in colture di cellule di alimentazione solo gliale (Neuron -, glia +, 1 ° Ab +). In un controllo negativo senza anticorpi primari, colorazione era trascurabile in colture di cellule di alimentazione solo gliale (Neuron -, glia +, 1 ° Ab -). GFAP colorazione era evidente nello strato alimentatore gliali, indipendentemente dal fatto che cellule di topo sono state piastrate (Neuron +, glia +, 1 ° Ab +) o meno (Neuron -, + glia, 1 ° Ab +). Ancora una volta, la colorazione nel controllo negativo era trascurabile (Neuron -, glia +, 1 ° Ab -). Questi risultati mostrano che lo strato alimentatore gliali ratto è stato composto principalmente di astrociti, e che i neuroni erano presenti solo quando sono stati aggiunti cellule di topo. Essi indicano inoltre che i neuroni presenti in queste culture originati esclusivamente da mouse.

I risultati della sezione del video online mostra anche le immagini DIC e MAP2 di neuroni in coltura placcato su uno strato alimentatore gliali, both preparato dalla regione ippocampale CA3-CA1 di topi wild-type.

Per il controllo dettagliata di coltura cellulare, si raccomanda di misurare la densità di cellule vive, sia per valutare la qualità generale del dissezione cerebrale e gradini dissociazione cellulare, e per la placcatura le cellule ad una densità predeterminato. Di seguito sono elencati quattro serie di misure tipiche di densità. Si noti, tuttavia, che questi numeri possono variare a seconda delle condizioni di coltura e reagenti. Ad esempio, anche i diversi lotti di siero dello stesso fornitore possono influenzare i risultati. Così, questi numeri devono essere considerati un indicatore generale, piuttosto che una linea guida assoluto.

Per dissociazione cellulare (fase 3.1.13), valori tipici per la densità di live-cell ottenuto da un pup sono: ~ 2 x 10 ⁵ cellule / ml (topo corteccia motoria e mouse CA3-CA1 dell'ippocampo), ~ 5 x 10 ⁵ cellule / ml (topo corteccia cerebrale e nell'ippocampo di ratto CA3-CA1), e ~ 1 x 10 ⁶ cells / ml (topo striato). In tutti questi casi, le frazioni di cellule vive era> 90% (viabilità, definito come il rapporto tra il numero di cellule vive per quello del numero totale di cellule). La corteccia motore è genericamente definito come la regione della corteccia cerebrale che giace dorsale immediatamente striato ^20. Per colture ippocampali, i CA3 e CA1 regioni dell'ippocampo corretta sono preferiti. L'intero ippocampo include inoltre il giro dentato, l'inclusione di che porta alla formazione di grandi terminali nervosi di granuli e introduce eterogeneità nelle proprietà sinaptiche ^21. La cultura striatali include il caudato-putamen e globo pallido, ma non comprende il nucleo accumbens, o mediale o nuclei del setto laterale nelle strutture vicine.

Per la cultura del mouse gliale (step 3.2.11), la densità di placcatura è ~ 10.000 cellule gliali su ogni coprioggetto tondo 12-mm, utilizzando ~ 50 microlitri di sospensione cellulare in una densità di ~ 2 x10 ⁵ cellule / ml. Solitamente la densità misurata nel supernatante è relativamente costante e non richiede regolazioni. Per convertire la densità su aree differenti, l'informazione utile è che il coprioggetto ha un diametro di 1,20 cm ed una superficie di 1,13 cm ^2. Così, ~ 10.000 cellule / coverslip = ~ 8.800 cellule / cm ² su un coprioggetto.

Per rat cultura gliale (step 3.3.12), la densità di placcatura è ~ 1000 cellule gliali di ciascun coprioggetto tondo a 12 mm, utilizzando ~ 100 ml di sospensione cellulare con una densità di ~ 1x10 ⁴ cellule / ml. Così, le cellule 1.000 / coverslip = ~ 900 cellule / cm ² su un coprioggetto.

Per il mouse a bassa densità cultura neuronale (fase 3.4.4), la densità di placcatura varia tra 2.000 e 48.000 cellule per pozzetto di una 24-pozzetti. Valori tipici quando placcatura neuroni su cellule di ratto gliali sono: 10,000-24,000 cellule / pozzetto per i neuroni corticali cerebrali, 12.000-24.000 cellule / pozzetto per CA3-CA1 neuroni dell'ippocampo e 24,000-48,000 cellule / pozzetto per neuroni striatali. Quando placcatura sulle cellule gliali di topo, il numero si riduce, ad esempio, le cellule 2.000 / e per CA3-CA1 neuroni dell'ippocampo. Come nota a margine, per la placcatura rat CA3-CA1 neuroni dell'ippocampo su uno strato alimentatore gliali topo, la densità di placcatura è 1,000-6,000 cellule / pozzetto. Per convertire la densità in un pozzo per la densità su un vetrino coprioggetto, l'informazione utile è che il diametro interno e in fondo è 1.56 cm, la sua area è 1.91 cm ^2. Così, per esempio, 12.000 cellule / pozzetto = 7.100 cellule / coprioggetto = 6.300 cellule / cm ² in un coprioggetto. Questi densità sono stati scelti allo scopo di coltura neuroni relativamente sparse per l'imaging cellulare ad alta risoluzione. I ricercatori dovrebbero scegliere i loro numeri che meglio si adattano i loro scopi sperimentali.

Figura 1. cuscinetti delle zampe Tattooed di topi. Ntopi ewborn sono stati etichettati con un tatuaggio i cuscinetti delle zampe. Sono stati fotografati subito dopo il tatuaggio (neonato), a 3 settimane di età (3 settimane di età) e a 32 settimane di età (32 settimane di età). Le etichette sono rimasti ben visibile tutta l'età adulta. Le immagini sono state scattate da diversi animali. Essi non sono visualizzati nella stessa scala. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. La genotipizzazione del wild-type (TOR1A ^{+ / +),} eterozigote (TOR1A ^{+ / AE)} e omozigote (TOR1A ^{AE / AE)} AE-torsinA knock-nei topi. Gli alleli del gene TOR1A sono stati analizzati in wild-type e mutante forme, utilizzando il DNA estratto dalle code di cuccioli appena nati. Tsuggerimenti ail erano ~ 4 mm di lunghezza. DNA era macchiato con SYBR sicuro DNA Gel Stain. Vedere la tabella dei materiali / attrezzature per le informazioni sui primer e programma cicli termici per gene TOR1A. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Rilevamento di DNA genomico nel contesto della variazione della quantità di materiale di partenza. Punte coda di lunghezza diversa sono stati utilizzati. Animali testati sono stati 3 settimane di età, eterozigoti AE-torsinA knock-in topi (TOR1A ^{+ / AE).} Corsie rappresentano le lunghezze di coda di 2, 3, 4 e 5 mm, in duplicato (da sinistra). Le punte di coda sono stati ottenuti da diversi topi. Peso molecolare segnataglie nella corsia più a sinistra rappresentano DNA lunghezze in sPTO di 100 coppie di basi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Rilevamento di DNA genomico nel contesto di variazione età degli animali. Gene (A) TOR1A. Lanes rappresentano suggerimenti di coda ottenuti da eterozigoti AE-torsinA topi knock-in (TOR1A ^{+ / AE)} nelle seguenti fasi: neonati, 3 settimane di età, e ~ 24 settimane di età (in duplicati da sinistra) (B). Tfap2a gene. Lanes rappresentano suggerimenti coda ottenuti da wild-type (Tfap2a ^{+ / +)} topo nelle seguenti fasi: neonato, a 3 settimane di età, e ~ 24 settimane di età (in duplicati da sinistra). Entrambi i geni sono stati amplificati da code ~ 4 mm di lunghezza. Il frammento atteso PCR è 498 bp. Il programma wa PCR s lo stesso di quello utilizzato per gene TOR1A. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Rilevamento di DNA genomico nel contesto della variazione di lunghezza dell'amplicone PCR. Il gene Tfap2a stato analizzato con PCR lunghezze ampliconi di 498 bp (corsie di sinistra), 983 bp (spartitraffico) e il 1990 bp (corsie a destra) duplicati. Il gene è stato amplificato da code di 3 settimane di età i topi. Peso molecolare marcatori dimensioni nei vicoli più a sinistra e più a destra del gel rappresentano lunghezze di DNA a passi di 100 e 200 paia di basi, rispettivamente. Vedere la tabella dei materiali / attrezzature per informazioni sui primer per diversi amplificati. 879fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6. Rilevamento di DNA genomico nel contesto di variazione nel metodo di estrazione del DNA. I risultati per l'uso, di estrazione singolo tubo (manuale), ei metodi di estrazione più canne parallele automatizzati (Auto) vengono confrontati. Quest'ultimo metodo è stato utilizzato in questo rapporto. I geni sono stati amplificati da code ~ 4 mm di lunghezza, raccolti dai neonati. (A) TOR1A gene nei cuccioli appena nati di AE-torsinA knock-nei topi. Lanes rappresentano DNA estratti da wild-type (manuale e automatico), eterozigoti (manuale e automatico), e topi omozigote (manuale e automatico) (da sinistra). (B) Tfap2a gene in 3 settimane di età topi wild-type. Il frammento atteso PCR è 498 bp.jove.com/files/ftp_upload/51879/51879fig6highres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7. semplificata, illustrazione schematica delle procedure di placcatura neuroni del mouse sul mouse (A) e di ratto (B) strati di alimentazione gliali. I numeri di giorni (giorni in vitro) si riferiscono ai giorni cumulativi dopo le cellule gliali vengono prima placcati in cultura fiaschi. Servono solo come una stima approssimativa. Per i dettagli pratici, vedere le procedure di sezione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 8. Effetto di supportodello strato alimentatore gliali sulla crescita dei neuroni dell'ippocampo in una cultura a bassa densità. I neuroni sono stati ottenuti dalla regione CA3-CA1 dell'ippocampo del neonato, topi wild-type. cellule dell'ippocampo (A) del mouse sono stati piastrati su vetrini rivestiti, che era stato pre-seminati con uno strato alimentatore gliali di ratto ottenuti nella regione CA3-CA1 dell'ippocampo. I neuroni sono stati dispersi uniformemente in modo sano. Le culture sono stati osservati a 3, 7 e 14 DIV. Cellule dell'ippocampo (B, C) ​​del mouse sono stati piastrati su vetrini rivestiti, che non avevano strato prestabilito alimentatore. Le culture sono stati osservati a 3 DIV (pannello superiore in B) e 7 DIV (pannello centrale in C) senza trattamento AraC. In altre serie di colture, le cellule sono state trattate con AraC a 3 DIV (pannello inferiore in B) e 7 DIV (pannello inferiore in C), e osservate 14 DIV. Tutte le immagini rappresentano le culture sorelle ottenuti dalla stessa cucciolo, cui i neuroni sono stati placcati lo stesso giorno. Vedere il testo per i dettagli. Per ogni pannello, un exampio di un neurone è indicato da una freccia bianca e ingrandita in un inserto. I neuroni hanno corpi cellulari il cui perimetro appare luminoso se visto dall'ottica a contrasto di fase, e hanno anche processi di spessore. Gli asterischi indicano le aree senza cellule gliali. Le colture sono state ripreso in diretta su un microscopio invertito con ottica a contrasto di fase con 20X lente dell'obiettivo (apertura numerica di 0,45), senza un obiettivo intermedio (cioè, a 1x). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 9. effetto di supporto dello strato alimentatore gliali sulla crescita dei neuroni corticali cerebrali in una cultura bassa densità. Risultati simili come nella figura 8, ma con neuroni ottenuti dalla regione motore ccorteccia erebral. Le condizioni alle etichette AC corrispondono a quelli in figura 8. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 10. Solidali effetto dello strato alimentatore gliali sulla crescita dei neuroni striatali in una cultura bassa densità. Risultati simili come nelle figure 8 e 9, ma con neuroni ottenuti dallo striato. Le condizioni alle etichette AC corrispondono a quelli in figura 8. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 11. Solidali effetto dello strato alimentatore gliali sulla sopravvivenza neuronale. Il numero di neuroni sopravvissuti è stato contato in esperimenti mostrati in Figura 8, utilizzando immagini acquisite da microscopio a contrasto di fase. Immagini per 14 DIV sono mostrati qui di nuovo, ma con punte di freccia che punta a esempi di neuroni contati. Il grafico a barre mostra il numero di neuroni per campo dell'immagine (449,0 x 335,5 micron micron) (media ± errore standard della media, n = 7-24 campi per ogni condizione di cultura). Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative di 'strato alimentatore gliali (-), AraC il 3 DIV' e 'strato alimentatore gliali (-), AraC 7 DIV' da 'strato gliale alimentatore (+)' (* p <0.05, ** p <0.01, di Student t-test non appaiati). I numeri sopra le barre indicano la densità neuronale misurata in montaggi di campi di immagine multipli. Le immagini sono stateacquisito utilizzando una lente obiettivo 20X. Per evitare distorsioni acquisizione, tutte le immagini sono state acquisite lungo una striscia verticale completa, dalla parte superiore alla parte inferiore di un coprioggetto e passante per il centro approssimativo del coprioggetto. Le singole immagini avevano una certa sovrapposizione (ad esempio, 1/6 a 1/4 di un campo immagine in alto e in basso). Due metodi sono stati utilizzati per l'analisi. In uno, i neuroni sono stati contati in alternata immagini per assicurare che i singoli neuroni non sono stati contati più di una volta. I numeri ottenuti sono stati utilizzati per generare il grafico a barre. Nel secondo metodo, un singolo montaggio stata creata dalle singole immagini. Essi sono stati cuciti utilizzando il Microsoft Image Composite Editor o manualmente con Photoshop. I montaggi esclusi anche conteggi multipli degli stessi neuroni. I numeri risultanti sono elencati sopra le barre. In entrambi i metodi, sono stati esclusi ampie zone alla periferia coprioggetto che non contengono cellule. Le cellule sono state contate come neuroni se avessero corpi cellulari che è apparso brillanteal microscopio a contrasto di fase, così come i processi cellulari estesi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 12. individuazione immunocitochimica di tipi di cellule in colture neuronali. La condizione cultura corrisponde all'immagine in basso a sinistra della Figura 8A. I neuroni sono stati ottenuti dalla regione CA3-CA1 dell'ippocampo dei topi wild-type, e placcato su uno strato alimentatore gliali generato dalla regione CA3-CA1 dell'ippocampo dei ratti wild-type. Le cellule in coltura sono stati analizzati mediante immunocitochimica per il marcatore MAP2 neuronale, e la astrociti gliali marker delle cellule GFAP. Contrasto interferenziale differenziale (DIC) microscopia è stata usata per rivelare la morfologia generale dei campi imaged, 14-17giorni dopo i neuroni sono stati placcati sullo strato alimentatore gliali. (A) a tre colori colorazione, compresa controcolorazione con il marcatore nucleare Hoechst 33342 dye. Due campi di immagine rappresentativi sono indicati. (B) Due colori colorazione, con diverse combinazioni di anticorpi secondari coniugati con differenti fluorofori. In questi esperimenti, le cellule coltivate sono state fissate con 4% paraformaldeide e 4% di saccarosio in soluzione di Tyrode (contenente, in mM: 125 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl _2, 2 MgCl _2, 30 D-glucosio, 25 HEPES, pH 7,4 regolato con 5 M NaOH, ~ 310 mOsm senza aggiustamenti) per 30 minuti a 4 ° C. Dopo essere stato lavato con soluzione di Tyrode, furono permeabilizzate con 0.1% Triton X-100 in soluzione di Tyrode per 10 min. Essi sono stati nuovamente lavati con soluzione di Tyrode e quindi bloccate con siero normale di capra 2% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (soluzione bloccante) per 60 minuti a RT. Successivamente sono stati trattati con il poli coniglioclonale anticorpo anti-MAP2 (AB5622; 400x diluizione nel bloccare soluzione), e il mouse monoclonale anti-GFAP cocktail (NE1015; 1,000x diluizione) O / N (15-21 ore) a 4 ° C. A seguito di lavaggi con PBS, le cellule sono state incubate con capra anti-coniglio e anticorpi IgG anti-topo coniugato con Alexa Fluor 405 (500x diluizione in soluzione di blocco), Alexa Fluor 488 (1,000x) o Alexa Fluor 568 dye (500x) per 60 min a RT. Essi sono stati lavati con PBS e osservati direttamente in PBS. In alcune culture, dopo il lavaggio finale delle procedure di cui sopra, le cellule sono state trattate con Hoechst 33342 a 0.5 mg / ml in PBS per 10 minuti a RT, e lavate con PBS prima osservazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figura.

Figura 13. Immuindividuazione nocytochemical di tipi cellulari in colture strato alimentatore gliali. culture sorella del ratto strati di alimentazione gliali come in Figura 12, ma senza la placcatura dei neuroni di topo. (A) colorazione immunocitochimica utilizzando le procedure descritte in Figura 12A. Due campi immagine rappresentativi sono mostrati. (B) colorazione dello strato alimentatore gliali utilizzando le procedure descritte in immunocitochimiche A, ma con gli anticorpi primari omessi. Tutte le immagini MAP2 nelle figure 12A e 13A, B sono stati acquisiti nelle stesse condizioni di imaging, e sono esposte allo stesso contrasto dell'immagine per permettere il confronto di intensità. Le stesse procedure sono state utilizzate per immagini GFAP nelle figure 12A e 13A, B. La cultura strato alimentatore gliali è stato ripreso lo stesso giorno, come le culture in Figura 12. Così gli strati alimentatore gliali in 13 sono stati coltivati ​​in vitro per la stessa quantità di tempo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 14. Intensità di colorazione immunocitochimica. Le linee sono state disegnate sulle immagini mostrate nelle figure 12 e 13, e l'intensità lungo questi stati tracciati. Inserti mostrano immagini nella fila superiore della Figura 12A. Le tre condizioni erano: 1) placcatura di cellule di topo (contenenti neuroni) su uno strato alimentatore ratto e colorazione con gli anticorpi primari (Neuron +, glia +, 1 ° Ab +), 2) solo strato alimentatore gliali (nessuna placcatura neuronale) e colorazione con gli anticorpi primari (Neuron -, glia +, 1 ° Ab +), e 3) mangimi glialeer strato solo (senza placcatura neuronale) e la colorazione senza anticorpi primari (Neuron -, glia +, 1 ° Ab -). Colorazione neuronale (MAP2) era presente solo quando le cellule di topo sono stati placcati (condizioni 1 vs 2), e la colorazione gliale (GFAP) era presente in entrambi i gruppi di culture (condizioni 1 vs 2). La colorazione immunocitochimica era specifico per entrambi gli anticorpi primari (condizioni 1 vs 3). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

SOLUZIONI

Buffer TAE (50x soluzione)

Tris base, 486 g

Acido acetico glaciale, 114,2 ml

0,5 M EDTA, pH 8,0, 200 ml

Aggiungere acqua distillata per portare il volume totale a 2 L

Portare in una cappa.

Diluire 50 volte prima dell'uso.

Soluzione Hanks '

Sali equilibrati Hanks 'senza cloruro di calcio, solfato di magnesio e bicarbonato di sodio (per 1 L)

NaHCO 3, 350 mg (4.17 mM concentrazione finale)

HEPES, 2,38 g (concentrazione finale 10 mM)

Regolare a pH 7,4 con 5 M NaOH.

Regolare osmolarità di 310 mOsm mediante saccarosio (Osmolarità tende a ~ 290 mOsm senza alcuna regolazione).

Aggiungere acqua distillata per portare il volume totale a 1 L

Digestione soluzione (per il trattamento tripsina del tessuto cerebrale)

NaCl, 800,6 mg (concentrazione finale, 137 mM)

KCl, 37.3 mg (fconcentrazione inale, 5 mm)

Na 2 HPO 4 · (7H 2 O), 187,6 mg (concentrazione finale, 7 mm)

HEPES, 595,8 mg (concentrazione finale, 25 mm)

Glucosio, 97.3 mg (concentrazione finale, 5.4 mM)

Regolare a pH 7,2 con 5 M NaOH.

Osmolarità tende a ~ 310 mOsm senza alcuna regolazione.

Aggiungere acqua distillata per portare il volume totale a 100 ml.

Proprio prima dell'uso, aggiungere 20 mg di tripsina (concentrazione finale di 10 mg / ml) e 20 ml di DNasi (concentrazione finale di 750 unità / ml) per 2 ml di soluzione di digestione.

Soluzione dissociazione (per dissociazione meccanica del tessuto cerebrale)

Soluzione Hanks '

MgSO 4 · (7H 2 O), 295,1 mg (concentrazi finaleon, 11.97 mM)

Regolare osmolarità di 310 mOsm con saccarosio.

Il volume totale è di 100 ml.

Proprio prima dell'uso, aggiungere 20 ml di DNasi (concentrazione finale di 750 unità / ml) a 2 ml di soluzione di dissociazione.

Placcatura medio-1 (per le cellule gliali del mouse)

Dulbecco modificato (DMEM), 449,5 ml

MITO + Serum Extender, 0,5 ml

FBS, 50 ml

Il volume totale è di 500 ml.

Placcatura medio-2 (per i neuroni di topo)

Neurobasal-A, 485 ml

B27, 10 ml

Glutamax-I, 5 ml (concentrazione finale, 2 mm)

Il volume totale è di 500 ml.

Placcatura medio-3 (per i neuroni di ratto e cellule gliali)

Media Minimum Essential (MEM senza rosso fenolo)

Glucosio, 2,5 g (concentrazione finale, 27,8 mM)

NaHCO 3, 100 mg (concentrazione finale, 2.38 mM)

Transferrina, 50 mg

FBS, 50 ml

Glutamax-I, 5 ml (concentrazione finale, 2 mm)

L'insulina, 12,5 mg

Il volume totale è di 500 ml.

Terreno di crescita (per i neuroni di ratto e cellule gliali)

MEM (senza rosso fenolo)

Glucosio, 2,5 g (concentrazione finale, 27,8 mM)

NaHCO 3, 100 mg (concentrazione finale, 2.38 mM)

Transferrina, 50 mg

FBS,25 ml

Glutamax-I, 1,25 ml (concentrazione finale, 0.5 mm)

B27 o NS21 {Chen 2008 # 2399}, 10 ml

Β-D-arabinofuranoside citosina (ARAC), 0,56 mg (concentrazione finale, 4 micron)

Il volume totale è di 500 ml.

Osservazioni generali

I nostri terreni di coltura non contengono antibiotici perché potrebbero esercitare effetti citotossici sulle cellule in coltura gliali e neuroni (riferimento 70, 71). Ciò rende particolarmente importante aderire alla sterile procedure di lavoro legati alla cultura.

Vedere la Tabella dei reagenti per le fonti dettagliate dei prodotti chimici.

Tabella 1. Solutions

Discussion

Il protocollo presentato qui comprende procedure per tatuaggi per etichettare / individuare i topi, per la genotipizzazione topi da punte di coda, e per la coltura neuroni del cervello del mouse a bassa densità. In un giro di esperimenti usando 6-8 cuccioli, queste procedure richiedono tipicamente ~ 0,5 ore, ~ 4 ore e ~ 2 ore, rispettivamente, per un totale di 6-7 ore. Questo rende pratico per un singolo sperimentatore per completare tutte le procedure necessarie dal momento della nascita i cuccioli 'del fasciame di colture neuronali - in meno di un giorno lavorativo (con l'eccezione di preparazione preliminare di strati di alimentazione gliali).

Tatuaggio

Identificazione a lungo termine degli animali è necessario per le finalità di allevamento e di studi scientifici, quali analisi di istologia, la funzione delle cellule e il comportamento degli animali. Tatuaare animali neonati è vantaggioso perché può essere eseguita rapidamente e dura per gran parte della vita dell'animale ^7,22-25. Tattooing sui cuscinetti delle zampe può essere migliore di clipping punta ²³ rispetto a preservare comportamenti testabili, ad esempio in sospensione o di presa ^22,26, anche se alcuni studi non hanno osservato tali carenze (ad esempio, ^25). Non ci sono stati casi di madri di rigetto o di cannibalizzare cuccioli dopo il tatuaggio. Per altri metodi di identificazione a lungo termine degli animali, vedi recensioni ^7,23,24.

Genotipizzazione

Una caratteristica critica nel nostro protocollo è l'uso di un metodo di genotipizzazione veloce. Anche se i metodi di genotipizzazione simili sono stati descritti nelle relazioni precedenti (ad esempio, ^27,28), il sistema qui descritto ha almeno due miglioramenti. In primo luogo, può tollerare alcune variazioni nella quantità di tessuto di partenza, età degli animali, e la lunghezza amplicon. Così, genotipizzazione successo può essere ottenuto utilizzando topi giovani esempio 1 giorno e vecchio come 6 mesi di età, e può essere eseguita utilizzando unun'ampia gamma di coppie di primer. In secondo luogo, questo metodo non richiede una soluzione di arresto per la fase di estrazione del DNA. Questo elimina la manipolazione tubo eccessivo e pipettaggio, e permette l'automazione multi-tubo parallelo del processo con una macchina PCR. Il numero di campioni può essere scalato (ad esempio, 96 campioni) ancora trattati in modo semplice e allo stesso tempo. Anche il tipo di campione non è limitato a clip coda; altri tipi di campioni che potrebbero essere utilizzati includono pugni dell'orecchio, ritagli di punta, interi embrioni e tessuti placenta ^2-4,29,30. Diverse specie animali possono anche essere utilizzati. Così le procedure di genotipizzazione sono affidabili (ripetibile a bassa varianza intra-assay) e riproducibile (bassa varianza inter-saggio tra piste o tra laboratori), e hanno il vantaggio di elevata scalabilità.

Si noti che una certa cautela è necessaria per ottenere la qualità attesa dei risultati. Prima, durante l'estrazione del DNA, una grande variazione nel protocollo può degradare i risultati.Per esempio, una riduzione significativa del volume di DNA Extraction Solution (es, da 200 a 100 microlitri al passo 2.2) consente ancora genotipizzazione, ma può ridurre l'affidabilità e in una modifica risultati PCR. In tali condizioni, si consiglia di ridurre il volume del DNA estratto da 4 a 2 microlitri, e aumentare il volume di H ₂ O da 2 a 4 microlitri per compensare la variazione di volume durante le reazioni di PCR (passo 2.5). In secondo luogo, al termine di estrazione del DNA, la soluzione può essere utilizzata per PCR immediata centrifugazione in molti casi, anche se la coda manterrà la sua struttura generale e non sarà completamente decomposto. Tuttavia, l'inversione descritto dei tubi è essenziale al fine di dissociare DNA genomico dal tessuto (passo 2.4). E 'anche importante utilizzare all'inizio, trasparente parte della soluzione, escludendo i detriti sul fondo del tubo, in quanto l'inserimento di quest'ultima porterà a risultati inconcludenti PCR. Questepassi saranno efficaci con il tempo minimo e fatica. Altrettanto buoni risultati possono essere ottenuti vortexando attivamente il campione (al posto delle inversioni), seguita da centrifugazione e l'utilizzo del surnatante. In terzo luogo, dopo l'estrazione del DNA, il DNA può essere conservato per lungo termine (ad esempio> due settimane). Si raccomanda di centrifugare la soluzione utilizzando una microcentrifuga (ad esempio, 3,000-13,000 ga 4 ° C per 2 min), trasferire i supernatanti di nuovi tubi, e conservare a -80 ° C. Quando l'estratto immagazzinato deve essere utilizzato per la genotipizzazione, brevemente centrifugare il campione dopo lo scongelamento, e utilizzare il surnatante.

Colture neuronali

Un'altra caratteristica fondamentale del nostro protocollo è l'uso di uno strato alimentatore gliali stabilire colture neuronali a bassa densità di placcatura. Tipicamente, in colture primarie di neuroni del cervello dei mammiferi, le cellule sono placcati con una densità relativamente elevata, su vetrini rivestiti senza gliastrato alimentatore l (es, ^31-39). Quando la densità di placcatura di neuroni è ridotto utilizzando questo metodo, la mancanza iniziale di foglio gliali porta alla scarsa crescita neuronale ed estensione dendritica (pannelli B, C nelle figure 8-10), come riportato in precedenza ^40-42, probabilmente a causa della scarsa gliale ^43,44 crescita.

, Bassa densità colture neuronali successo possono essere generati da almeno tre grandi tipi di metodi. In un approccio, Neurobasal medio viene utilizzato come mezzo di coltura. Ciò rende possibile neuroni coltura in assenza di uno strato alimentatore gliali, e può essere utilizzato per la bassa densità colture neuronali ^45,46. In un secondo approccio ('Banker-type' e la sua modifica), le cellule gliali sono co-coltura con neuroni nello stesso bene, ma sono fisicamente separati da loro. In questo contesto, le cellule gliali forniscono 'sostegno trofico' di neuroni senza contattando direttamente^{1,41,42,47-49.} Nel terzo approccio, i neuroni sono placcati su uno strato alimentatore gliali prestabilito che supporta la crescita neuronale (ad esempio, ^50-53) (figure 8-10). In particolare, i neuroni del cervello del mouse sono placcati su uno strato alimentatore gliali preparati da topi o ratti ^{8,34,54 41,55,56.}

Preferiamo l'ultimo dei tre approcci alla cultura bassa densità, perché la Neurobasal medio può influenzare la sopravvivenza neuronale ^57, le cellule gliali astrociti sarà essenziale nel regolare le funzioni neuronali ^8,58, e il contatto fisico tra i neuroni e cellule gliali possono essere importante. Le procedure per la coltura delle cellule di topo e nel ratto gliali sono simili ^59,60, ma li hanno modificato leggermente per ospitare per la più rapida crescita in vitro di cellule di ratto contro il mouse gliali. Le procedure per la coltura di cellule di ratto sono stati modificati ^61-63. L'uso di un alimentatore laye glialer per colture neuronali bassa densità rende necessario effettuare una rapida genotipizzazione, al fine di corrispondere il genotipo dello strato alimentatore a quella dei neuroni nel periodo tra le nascite i cuccioli 'e le morti neonatali o la fine della finestra coltura (1 -2 giorni dopo la nascita).

Cultura bassa densità su uno strato alimentatore gliali è anche un metodo importante quando si cerca di neuroni coltura di piccoli nuclei nel cervello (ad esempio, il locus coeruleus-norepinefrina rilascio, e la substantia nigra-dopamina rilascio). Tali nuclei contengono solo un piccolo numero di neuroni e inevitabilmente produrre colture a bassa densità ^64-67.

Colture primarie sono normalmente preparati nel nostro laboratorio dalla regione CA3-CA1 dell'ippocampo, la regione del motore della corteccia cerebrale e striato di topi. Le stesse procedure possono essere utilizzate per preparare colture neuronali rappresenta altre regioni del cervello, per esempio l'intero dell'ippocampo (inclUding giro dentato) e l'intera corteccia cerebrale. Neuroni di ratto da regioni cerebrali, come l'ippocampo e locus coeruleus sono coltivate in modo simile, con lo strato alimentatore gliali di ratto. Questi neuroni in coltura sono normalmente usati nelle 1-4 settimane in vitro, con l'età esatta della cultura a seconda dello scopo dell'esperimento. E 'da notare che alcuni neuroni coltivati ​​su uno strato alimentatore gliali possono sopravvivere per più di 10 settimane ^34,68.

Un potenziale problema di colture neuronali bassa densità è che le proprietà neuronali possono essere diverse da quelle in colture ad alta densità o in neuroni in situ. Confronto di questi sistemi fornisce un'opportunità interessante studiare come neuronale sviluppo e la maturazione sono influenzati da molteplici fattori, come la densità neuronale, fattori solubili secreti dai neuroni, contatto neurone a neurone, e interazioni gliali-neuronale.

In sintesi, il tattooietichettatura topo basato ng è di lunga durata, il metodo genotipizzazione è rapido, e il metodo di coltura consente placcatura neuroni di topo a bassa densità. Il protocollo qui descritto può essere applicato nella sua interezza ad altre specie animali che ospitano altre mutazioni genetiche. Inoltre, le singole fasi del protocollo possono essere utilizzati per altri scopi. Così il protocollo può essere utilizzato in una vasta gamma di applicazioni in base alle esigenze sperimentatori.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS - tattooing
Machine Cleanser	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NMCR3	This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NDAR4	This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NBP01
Skin Prep Applicator	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NSPA1	Q-tip.
Skin Prep solution	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NSP01	This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)	EZ BioResearch LLC	G2001-100
2X PCR Ready Mix II	EZ BioResearch LLC	G2001-100	A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A	EZ BioResearch LLC	G2001-100	Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B	EZ BioResearch LLC	G2001-100	Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial	VWR	BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade	rpi	A20090-500	We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)	Fisher	BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl	Dot Scientific Inc	UG104-96RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl	Dot Scientific Inc	UG2020-RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl	Dot Scientific Inc	UG2812-RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp	EZ BioResearch LLC	L1001	We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp	EZ BioResearch LLC	L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder	GIBCO-Invitrogen	10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml	USA Scientific	1402-2900	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual	rpi	145660	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural	USA Scientific	1605-0000	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO	GIBCO-Invitrogen	S33102
Tris base	rpi	T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice			5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice			5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503-100MG	See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement	GIBCO-Invitrogen	17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated	BD falcon	353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml	BD falcon	353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml	BD falcon	353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml	BD falcon	352095
Countess (cell number counter) chamber slides	GIBCO-Invitrogen	C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)	Sigma-Aldrich	C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm	Pyrex	3160-101
Distilled water	GIBCO-Invitrogen	15230-147
DNase Type II	Sigma-Aldrich	D4527-200KU	Stock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate	GIBCO-Invitrogen	10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size	Nalgene	568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size	Nalgene	569-0020
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO-Invitrogen	26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0	Carolina	633017
GlutaMAX-I	GIBCO-Invitrogen	35050-061
Hanks' Balanced Salts	Sigma-Aldrich	H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration)	Sigma-Aldrich	H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent	Sigma-Aldrich	258148-100 ML
Insulin	Sigma-Aldrich	I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka)	Sigma-Aldrich	63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free	BD Biosciences	356237	This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM)	GIBCO-Invitrogen	51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml	BD Biosciences	355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate	BD falcon	353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate	BD falcon	353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid	GIBCO-Invitrogen	10888-022
Nitric Acid	VWR	bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21	prepared in the lab		Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”	Fisher	13-678-6A	Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”	Fisher	13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Serological pipet, 2 ml	BD falcon	357507
Serological pipet, 5 ml	BD falcon	357543
Serological pipet, 10 ml	BD falcon	357551
Serological pipet, 25 ml	BD falcon	357525
Serological pipet, 50 ml	BD falcon	357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis	Sigma-Aldrich	480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich	Sigma-Aldrich	431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm	Corning	431219
Syringe, 3 ml	BD falcon	309585
Transferrin, Holo, bovine plasma	Calbiochem	616420
Trypan Blue stain, 0.4%	GIBCO-Invitrogen	T10282	This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI	Sigma-Aldrich	T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%	GIBCO-Invitrogen	25200-056
Uridine	Sigma-Aldrich	U3003-5G	Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2	Merck Millipore	AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail	Merck Millipore	NE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMS	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NEO–9	This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GT	BIO–RAD	170–4405	Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800	ProteinSimple	FluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal Cycler	BIO-RAD	PTC-1148EDU	Our PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac Basic	BIO-RAD	164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, Countess	GIBCO-Invitrogen	C10310	This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2	NUAIRE	NU-425-400	This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water Jacket	NUAIRE	NU-4850
Horizontal Clean Bench	NUAIRE	NU-201-330	This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed Shaker	Labnet	S2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifuge	Fisher	46910 (centrifuge)/46922 (rotor)