Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

رابيد التنميط الجيني للحيوانات تلاه إنشاء الثقافات الأولية من الخلايا العصبية في الدماغ

Published: January 29, 2015 doi: 10.3791/51879
Automatic Translation
*1,2, *1, 3, 1
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Psychiatry, University of Iowa Carver College of Medicine, 3EZ BioResearch LLC
* These authors contributed equally

Summary

وصفنا إجراءات لوضع العلامات والتنميط الجيني الفئران حديثي الولادة وتوليد الثقافات العصبية الأولية منها. والتنميط الجيني هو سريع وفعال وموثوق بها، ويسمح لاستخراج-نوكليك حمض الآلي. وهذا مفيد خصوصا بالنسبة للفئران المميتة neonatally وثقافاتهم التي تتطلب استكمال مسبق من التنميط الجيني.

Abstract

وغالبا ما يتطلب تحليل عالية الدقة من التشكل وظيفة الخلايا العصبية الثدييات والتنميط الجيني للحيوانات الفردية تليها تحليل الثقافات الأولية من الخلايا العصبية. نحن تصف مجموعة من الإجراءات ل: وصفها الفئران حديثي الولادة ليتم مرمزة، التنميط الجيني السريع، وإنشاء الثقافات منخفض الكثافة من الخلايا العصبية في الدماغ من هذه الفئران. وصفت الفئران الفردية عن طريق الوشم، والذي يسمح لتحديد المدى الطويل الأمد في مرحلة البلوغ. التنميط الجيني بواسطة بروتوكول وصف سريع وفعال، ويسمح لاستخراج الآلي للحامض النووي مع موثوقية جيدة. وهذا مفيد في ظل الظروف التي تكون فيها الوقت الكافي للالتنميط الجيني التقليدي غير متوفر، على سبيل المثال، في الفئران التي تعاني من الفتك حديثي الولادة. يتم إنشاؤها الثقافات العصبية الأولية في منخفض الكثافة، والتي تمكن تجارب التصوير في قرار مكانية عالية. تتطلب هذه الطريقة ثقافة إعداد طبقات المغذية الدبقية قبل طلاء الخلايا العصبية. عيتم تطبيق rotocol في مجملها إلى نموذج الفأر من خلل التوتر اضطراب حركة DYT1 (ΔE-torsinA الضربة القاضية في الفئران)، ويتم إعداد الثقافات العصبية من الحصين، القشرة الدماغية والجسم المخطط من هذه الفئران. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على الفئران مع طفرات وراثية أخرى، وكذلك للحيوانات من الأنواع الأخرى. وعلاوة على ذلك، والمكونات الفردية للبروتوكول يمكن استخدامها لعزل المشاريع الفرعية. وبالتالي هذا البروتوكول سيكون لها تطبيقات واسعة، ليس فقط في علم الأعصاب ولكن أيضا في مجالات أخرى من مجالات العلوم البيولوجية والطبية.

Introduction

وقد أثبتت نماذج القوارض من الأمراض الوراثية مفيدة في إنشاء الوظائف الفسيولوجية للبروتينات طبيعية والأحماض النووية، وكذلك العواقب المرضية من العيوب في هذه. وتشمل الأمثلة الفئران ناقص لالبروتينات المشاركة في الوظائف الخلوية الرئيسية، وكذلك نماذج الماوس من الاضطرابات مثل مرض الزهايمر. ومع ذلك، يمكن بعض التلاعب الجيني يؤدي إلى الفتك حديثي الولادة بفترة وجيزة أو بعد بضعة أيام من الولادة. في هذه الحالات، والثقافات الخلية الأولية هي أداة مهمة لخلايا حية يمكن الحصول عليها من الجراء الجنينية أو حديثي الولادة قبل الموت، فإنها يمكن أن يستمر على الأقل لبضعة أسابيع في المختبر، وخلال هذا الوقت اللازم لتطوير الخلايا العصبية في وقت مبكر يمكن أن يتبعه الكيمياء الحيوية والوظيفية والمورفولوجية التجارب. لالثقافات الأولية، يمكن أن يكون مفيدا لوحة الخلايا العصبية في منخفض الكثافة. هذا يجعل من الممكن تصور somata الفردي، التشعبات، ومهاوي محور عصبي وtermi العصبيةالاشارات في قرار مكانية عالية. ومع ذلك، فإن البقاء على قيد الحياة والتفريق بين الخلايا العصبية في منخفض الكثافة عادة ما يتطلب أنهم مطلي على طبقة المغذية الدبقية، وشارك في تربيتها مع الخلايا الدبقية في غياب الاتصال الجسدي معهم، أو مثقف في المتوسط ​​مشروطة الدبقية 1.

يمكن إنشاء منخفض الكثافة الثقافات العصبية على طبقات المغذية الدبقية أن يعتمد على التنميط الجيني سريعة وموثوق بها مسبقا - في غضون بضع ساعة وعلى النقيض من بضعة أيام. السرعة هي أهمية خاصة عندما يحتاج النمط الجيني الخلايا العصبية لتكون مطابقة لتلك التي من طبقة المغذية الدبقية أعدت مسبقا. وكمثال عملي أكثر، قد يكون من الضروري أن تقرر أي الجراء منها الوراثي لاستخدامها في توليد الثقافات، لتحسين كفاءة تجربة.

نحن هنا لشرح بروتوكول العمل التي استخدمت لسرعة، مبسط وموثوق بها الماوس التنميط الجيني في المنشورات السابقة 2-6. ذيول الماوس ووتستخدم مجموعة المتاحة تجاريا. ويشمل هذا البروتوكول خطوة واحدة استخراج الأحماض النووية من الأنسجة، ويتطلب يست تنقية خطوة نوكليك حمض ولا استخدام منطقة عازلة إنهاء ('وقف الحل'). ويتضح موثوقية هذه الطريقة التنميط الجيني من خلال تقديم نتائج سلسلة من الاختبارات عندما يتم إدخال الخلافات مع الاحترام لكمية بدءا من العينات، وعمر الحيوانات وطول amplicons PCR. هذه المجموعة تقدم مزايا استخراج الآلي والموثوقية.

من أجل أن تكون شاملة، ويتجلى أيضا استخدام الوشم لتحديد المدى الطويل من الفئران مرمزة. ويتحقق من خلال تطبيق الوشم الحبر الوشم إلى الأدمة من الجلد (تحت البشرة) 7. ووصف إجراءات الوشم منصات مخلب من الفئران حديثي الولادة أو 1 يوم القديمة، على الرغم من أن الوشم يمكن تطبيقها على أجزاء أخرى من الجسم، مثل ذيول وأصابع القدمين، وأنيمالمرض من جميع الأعمار. وبالإضافة إلى ذلك، سيتم عرض إجراءات الطلاء وزراعة الخلايا العصبية الماوس في مناطق ذات كثافة منخفضة، استنادا إلى إعداد الأمثل من أنواع مختلفة من طبقات المغذية الدبقية 2،8.

نحن نستخدم نموذج الجيني الماوس للالموروثة اضطراب عصبي DYT1 خلل التوتر - اضطراب حركة جسمية مهيمنة الناجمة عن طفرة في الجين TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG، p.Glu302del / p.Glu303del) 9. البروتين المشفرة، torsinA، ينتمي إلى "ATPases المرتبطة بأنشطة متنوعة الخلوية" (AAA +) عائلة من البروتينات، التي عموما على أداء مهام مثل كوصي، والمساعدة في الأعضاء: البروتين تتكشف، البروتين معقدة التفكيك، والاتجار الغشاء، والانصهار الحويصلة 10-13. نتائج طفرة في الحذف في إطار كودون لحمض الجلوتاميك، ويمكن أن يؤدي إلى مظهر من مظاهر "المبكر بداية المعمم خلل التوتر معزولة" 14،15. ومع ذلك، فإن مسارآليات ophysiological المسؤولة عن هذا الاضطراب لا تزال غير مفهومة تماما. في نموذج الفأر المغلوب في، أليل متحولة هو Tor1a tm2Wtd، المذكورة فيما بعد باسم Tor1a ΔE. متخالف ΔE-torsinA الضربة القاضية في الفئران هي المرضى من البشر قابلة للحياة وتقليد وراثيا مع DYT1 خلل التوتر، في حين متماثلة اللواقح الضربة القاضية في الفئران تموت بعد الولادة 16،17، مع الكمون حتى الموت بعد الولادة تتأثر الخلفية الوراثية 18. الوفاة المبكرة لمتماثل الفئران الضربة القاضية في يقتضي أن كلا من التنميط الجيني للحيوانات وإنشاء الثقافات العصبية يتم الانتهاء بسرعة. وكمثال آخر على التنميط الجيني، Tfap2a (عامل النسخ AP-2α، وتفعيل محسن البروتين 2α ملزمة) وسوف تستخدم. البروتين المشفرة بواسطة هذا الجين مهم في تنظيم العمليات الخلوية متعددة، مثل انتشار، والتمايز والبقاء وموت الخلايا المبرمج 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوان أجريت في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة ولاية ايوا.

1. تحديد المدى الطويل من الفئران عن طريق الوشم على وسادات باو

  1. شل مخلب مع لوحة مخلب (سطح أخمصي) التي تواجه المجرب. عقد مخلب مع الإبهام والسبابة. يجب الحرص على عدم قرصة مخلب.
    ملاحظة: تجميد مستقرة مهم لضمان أن يتم وضع وشم الصباغ في الأدمة لوحة مخلب، وبالتالي هو دائم 7.
  2. مسحة لوحة مخلب مع 70٪ من الإيثانول على اسفنجة الشاش أو مسحة.
  3. تطبيق زيت الجلد لقضيب من القطن ذات الرؤوس، ثم اضغط بلطف طرف ضد سطح لوحة مخلب عدة مرات. فقط استخدام كمية صغيرة من النفط الجلد، عندما تكون موجودة بكميات كبيرة، فإنه سيتم منع الصباغ الوشم من الوصول إلى الجلد.
  4. تراجع نصائح من إبر الوشم في حبر الوشم فقط قبلإلى الوشم. استخدام نظيفة ومعقمة والإبر الوشم حادة، لتقليل الألم وإمكانية العدوى، وكذلك لزيادة كفاءة الوشم.
  5. في حين يتم تغطية سطح لوحة مخلب مع النفط الجلد، واضغط على نصائح الوشم الإبرة عموديا وبخفة على الجلد في وسط لوحة مخلب، وحقن الحبر عدة مرات. انظر الجدول المواد / معدات للحصول على معلومات حول النظام الوشم الكهربائية.
  6. رذاذ الايثانول 70٪ على اسفنجة شاش، اضغط بلطف ضد مخلب لإزالة الوشم اضافية الصباغ على سطح الجلد، وتفقد نوعية الوشم. تأكد من منتصف لوحة مخلب له، بقعة مستديرة داكنة يختلف عن العادي تصبغ الجلد. إذا كان الوشم ليست مظلمة أو كبيرة بما يكفي لسهولة المشاهدة، كرر الخطوات الوشم السابقة.

2. الفئران انماط الوليد باستخدام PCR التنميط الجيني السريع كيت

  1. تطهير النهاية البعيدة من ذيل الفأر مع الايثانول 70٪، وقطع 5 ملم أو أقل من الذيلتلميح وتحويلها إلى أنبوب من الشريط 8 أنبوب من النوع المستخدم لPCR. استخدام شفرة حلاقة من الامم المتحدة والمستخدمة لكل الجرو لتجنب التلوث المتبادل بين العينات. بدلا من ذلك، استخدم مقصا، ولكن في هذه الحالة، بعناية وبدقة إزالة الأنسجة المتبقية على شفرات باستخدام الايثانول 70٪. التحقق من وجود نزيف. إذا كان النزيف يحدث، ممارسة الضغط على لقطع جزء من الذيل مع اسفنجة شاش حتى يتوقف النزيف.
  2. إضافة 200 ميكرولتر من استخراج الحمض النووي الحل لكل أنبوب PCR يحتوي على العينة. انظر الجدول المواد / المعدات اللازمة لتكوينها والمعلومات حول عدة.
  3. ضع الشريط أنبوب إلى cycler الحرارية PCR، والبدء في استخراج الحمض النووي باستخدام البرنامج التالي: 1 دورة في 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 1 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وعقد في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: هذا هو نفس PCR cycler الحرارية التي يتم استخدامها لاحقا لPCR.
  4. بعد الانتهاء من استخراج الحمض النووي، وإزالة الشريط أنبوب من الحرارية cycler على لالثانية عكس 5 مرات.
  5. نقل 4 ميكرولتر من محلول (استخراج DNA) من كل عينة إلى الامم المتحدة وتستخدم أنبوب من الشريط 8 أنبوب، وتخلط مع: 10 ميكرولتر من 2X PCR للخرسانة الجاهزة II، 2 ميكرولتر من مختلطة إلى الأمام وعكس الاشعال (موصى به في 0.5 ميكرومتر؛ انظر جدول المواد / معدات لمتواليات)، و 4 ميكرولتر من nuclease خالية H 2 O، لكل عينة. تدور لفترة وجيزة (على سبيل المثال، 3 ثانية) باستخدام جهاز للطرد المركزي فوق المنضدة. إبقاء الأنابيب على الجليد في جميع الأوقات إلا عندما المناولة.
  6. أداء الدراجات الحرارية. شاهد جدول المواد / معدات لبرنامج الحراري.
  7. كشف المنتجات تضخيم الحمض النووي. تحميل حلا شاملا رد فعل من (ميكرولتر 20) PCR مباشرة في بئر من agarose هلام. تحميل علامات الوزن الجزيئي في بئر منفصل. تطبيق حقل كهربائي.
  8. الحصول على صور مضان من العصابات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

3. الثقافة الابتدائية من الفأر الدماغ العصبيةالصورة على الدبقية طبقة الطاعم

ملاحظة: إجراءات تشريح الدماغ والتفكك الخلية (3.1) هي مشتركة بين جميع الإجراءات اللاحقة. يتم وصف إجراءات الثقافات الماوس الدبقية (3.2)، والثقافات الدبقية الفئران (3.3)، والماوس الثقافات العصبية (3.4) بشكل منفصل بعد ذلك.

  1. الدماغ تشريح والخلوية Dissocaiation
    1. تضحية واحدة الماوس أو الفئران الجرو بقطع الرأس، بسرعة إزالة الدماغ، ووضعه في حل هانكس "(انظر الجدول رقم 1 لتكوين) + 20٪ مصل الجنين البقري (FBS) في صحن 35 ملم (أبقى على الجليد).
    2. قطع الدماغ من خلال خط الوسط إلى نصفين. إزالة المنطقة ذات الاهتمام (على سبيل المثال، قشرة المخ، والمخطط الحصين) من كل نصف الكرة الأرضية من الدماغ. إزالة السحايا والأوعية الدموية الرئيسية من على سطح الأرض. قطع منطقة في الدماغ إلى 4-10 شرائح رقيقة باستخدام شفرة جراحية.
    3. شطف شرائح الدماغ في أنبوب الطرد المركزي 15 مل، مرة واحدة خفة دمح هانكس "حل + 20٪ FBS، ثم 3 مرات مع هانكس" الحل (أي بدون المصل) (كل في 4 درجات مئوية). لشطف، إضافة 5-10 حل مل، والسماح للدماغ شرائح تستقر في أسفل الأنبوب، نضح الحل من أعلى، وإضافة حل جديد. الانتهاء من إجراء الشطف بواسطة الشفط الحل.
    4. تصفية 2 مل من محلول الهضم التي تحتوي على التربسين (انظر الجدول رقم 1 لتكوين) باستخدام حقنة 3 مل ومرشح حقنة 0.2 ميكرون، وإضافة الترشيح مباشرة في الأنبوب الذي يحتوي على شرائح الدماغ. السماح للtrypsinization المضي قدما لمدة 13 دقيقة في RT.
    5. تحييد الحل التربسين أولا بواسطة الشفط أكثر من ذلك ومن ثم عن طريق إضافة 7-10 مل من هانكس "حل + 20٪ FBS (4 ° C).
    6. شطف شرائح الدماغ، مرتين مع هانكس "حل + 20٪ FBS، ثم ثلاث مرات مع هانكس" الحل (أي من دون المصل) (كل في 4 درجات مئوية). الانتهاء من إجراء الشطف بواسطة الشفط وsolutأيون.
    7. تصفية 2 مل من محلول التفكك (انظر الجدول رقم 1 لتكوين) باستخدام حقنة 3 مل ومرشح حقنة 0.2 ميكرون، وإضافة الترشيح مباشرة إلى أنبوب مع شرائح الدماغ.
    8. ميكانيكيا فصل الخلايا عن طريق الطحن بلطف 10-20 مرات، حتى قطعة نسيج مرئية تختفي. استخدام-توصيله القطن، مصقول النار ماصة باستير وتجنب الوقوع في فقاعات خلال سحن.
    9. انتظر 3 دقائق لقطع صغيرة ليستقر.
    10. نقل الغالبية من الحل (~ 1.5 مل، وترك بعض الحلول في أسفل) إلى أنبوب 15 مل الطرد المركزي التي تحتوي على 3 مل من محلول هانكس '+ 20٪ محلول FBS (4 ° C)، وذلك باستخدام-توصيله القطن، النارية مصقول ماصة باستير. لا نقل عن الحل لأن إدراج أي الرواسب في قاع النتائج عادة في تدهور الثقافة.
    11. أجهزة الطرد المركزي لمدة 13 دقيقة في ~ 185 غرام (~ 1،100 دورة في الدقيقة) في 4 درجات مئوية.
    12. نضح طاف بلطف،إضافة 1 مل من الطلاء المتوسطة (37 ° C) إلى بيليه، و resuspend من قبل pipetting بلطف عدة مرات باستخدام-توصيله القطن، مصقول النار ماصة باستير قبل تحسنت.
      ملاحظة: يتم استخدام ثلاثة أنواع مختلفة من الطلاء وسائل الإعلام لأغراض ثقافة مختلفة: تصفيح المتوسطة 1 للخلايا الدبقية الماوس، والطلاء متوسطة 2 لالخلايا العصبية الماوس، والطلاء متوسطة 3 لالخلايا العصبية الفئران والخلايا الدبقية (انظر الجدول 1 للتركيبات) .
    13. إخراج 10 ميكرولتر من تعليق خلية، ومزجها مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ التريبان حل الأزرق، وقياس كثافة الخلايا الحية، وذلك باستخدام إما عدادة الكريات أو عداد خلية الآلي.
  2. الثقافات الماوس الدبقية
    1. غسل لل coverslips للمساعدة في إنشاء ثقافات صحية من خلايا فأر.
      1. تزج coverslips الزجاج (الجولة، 12 مم) في حامض النتريك 70٪ في طبق بتري الزجاج. يحفظ بعيدا عن الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم، ووضعه على المداري شاكر O / N.
      2. شطف الزجاج coversliملاحظة في طبق بتري ثلاث مرات على الأقل مع الماء المقطر. تزج في الماء المقطر. وضع طبق على شاكر يا المداري / N.
      3. تجفيف coverslips على 150 مم ورق الترشيح هتما في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
      4. الأوتوكلاف لل coverslips.
      5. ضع لل coverslips في صحن ثقافة 24-جيدا.
    2. التسمية وراثى الفئران حديثي الولادة وفقا لالخطوتين 1 و 2.
    3. الحصول على خلايا المخ من الجراء الماوس، وفقا لخطوة 3.1.
      ملاحظة: استخدام قشرة الدماغ هو نموذجي لإعداد طبقة الماوس الدبقية المغذية. ومع ذلك، مناطق أخرى من الدماغ، مثل الحصين والمخطط، ستعمل بعد التعديل السليم للكثافة الخلية نظرا لأعداد وعائدات من الخلايا من مختلف المناطق المختلفة.
    4. إضافة ~ 4 مل من قبل تحسنت تصفيح المتوسط ​​1 إلى تعليق خلية النهائي (~ 1 مل). لمرحلة ما قبل ارتفاع درجات الحرارة وسائل الإعلام والثقافة، ووضع الحل في الحاضنة الثقافة (5٪ CO 2 -95٪ O 2، 37 ° C) O / N، لالسماح للقيم درجة الحرارة ودرجة الحموضة لتحقيق الاستقرار.
    5. نقل تعليق خلية إلى غير المصقول ثقافة T25 قارورة، وذلك باستخدام-توصيله القطن، مصقول النار ماصة باستير. ضع قارورة في حاضنة الثقافة.
    6. في 1 يوم في المختبر (DIV)، وشطف الخلايا المستزرعة في قارورة T25 مرتين مع تصفيح متوسطة 1 (4 ° C). ضع قارورة مرة أخرى في الحاضنة. أداء الشطف بواسطة الشفط المتوسطة داخل قارورة تماما مع ماصة باستور، مضيفا ~ 5 مل من المتوسط ​​الطازجة وإمالة بلطف القارورة عدة مرات في حركة دوامات.
    7. في 6-9 DIV، (أي قبل يوم واحد trypsinization والطلاء coverslips على، في خطوات 3.2.8-3.2.13)، وضع 100 ميكرولتر من مواد الطلاء مع البروتينات المصفوفة خارج الخلية (انظر جدول المواد / معدات تعليقات حول مادة الطلاء) على coverslips الزجاج في طبق ثقافة، ووضع الطبق الثقافة في حاضنة الثقافة.
    8. في 7-10 DIV، عندما كانت الخلايا 20-40٪ متموجة (مستمر مكانيا)، يعرض للتريبسين لهم.
      1. شطف القارورة مرة واحدة، عن طريق الشفط عن الحل داخل القارورة وإضافة ~ 13 مل من محلول هانكس "(4 ° C)، إمالة بلطف القارورة عدة مرات في حركة دوامات، ونضح الحل تماما.
      2. إضافة 40 ميكرولتر من الدناز الحل (تركيز النهائي، 750 وحدة / مل) إلى 4 مل التربسين-EDTA الحل، لتمرير حل من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون، وإضافة الترشيح مباشرة إلى الخلايا في قارورة.
      3. السماح للtrypsinization المضي قدما لمدة 13 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
      4. تحييد الحل التربسين بإضافة 2 مل من 100٪ FBS (4 ° C) إلى القارورة.
      5. نقل الخلايا trypsinized إلى أنبوب 15 مل الطرد المركزي باستخدام 5- إلى 10 مل ماصة، إضافة ~ 4 مل من محلول هانكس '+ 20٪ FBS (4 ° C)، الطرد المركزي في ~ 185 غرام و 4 درجة مئوية لمدة 13 دقيقة ، ونضح طاف.
    9. resuspend الكرية في 1 مل من قبل WARMEد الطلاء المتوسطة-1.
    10. قياس كثافة الخلايا وفقا لخطوة 3.1.13.
    11. نضح في مواد الطلاء تماما من coverslips الزجاج، وصفيحة ~ 50 ميكرولتر من الخلايا الدبقية معلق coverslips على.
      ملاحظة: هذه الخلايا سوف تنشئ طبقة المغذية الدبقية.
    12. مكان الطبق الثقافة مع coverslips في الحاضنة.
    13. في وقت لاحق 20-60 دقيقة، إضافة 1 مل من قبل تحسنت تصفيح المتوسط ​​1 إلى كل بئر، ووضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة. ملاحظة: في حين يتم إضافة المتوسطة تصفيح، وسوف يكون من المفيد استخدام ماصة أخرى إلى الضغط باستمرار على المحيط الخارجي للساترة (حيث هناك خلايا مطلي)، بحيث ساترة لا تطفو على المدى المتوسط.
    14. في 1 DIV طبقة المغذية الدبقية (أي على ساترة الزجاج)، استبدل المتوسطة مع 1 مل من الطلاء قبل تحسنت المتوسطة-1، بواسطة الشفط كل من الحل في بئر ثم ملئه مع المتوسط ​​الطازجة.
    15. في 2-3 DIV طبقة المغذية الدبقية عندما سلليرة سورية هي 80-100٪ متموجة، إضافة مثبط الإنقسامية (10 ميكرولتر من خليط من 5 الفلورية 2'-deoxyuridine + يوريدين، تركيزات النهائية من 81.2 و204.8 ميكرومتر، على التوالي) إلى كل بئر، لمنع تكاثر الحمض النووي، وبالتالي ل قمع انتشار الخلايا الدبقية.
    16. في 7-9 DIV، عندما كانت الخلايا 90-100٪ متموجة (1-2 ساعة قبل الطلاء الخلايا العصبية في طبقة المغذية الدبقية)، استبدال مستنبت مع الطلاء قبل تحسنت المتوسطة 2 (37 ° C).
      سيتم مطلي الخلايا العصبية في نفس اليوم، وذلك باستخدام الخطوة 3.4: ملاحظة.
  3. الثقافات الفئران الدبقية
    1. معطف ثقافة قارورة T25 مع نفس مواد الطلاء.
      ملاحظة: هذا أمر ضروري لإزالة لاحقة من الخلايا غير ملتصقة في الخطوة 3.3.5.
      1. إضافة 2.0 مل من مواد الطلاء إلى القارورة، ووضع القارورة في الحاضنة الثقافة.
      2. بعد 2-3 ساعة، نضح مواد الطلاء تماما، مثل أن الكلمة القارورة يصبح الجاف.
    2. الحصول على خلايامن الفئران الوليدة، وفقا إلى الخطوة 3.1.
      وتستخدم المنطقة CA3-CA1 من الحصين لإعداد طبقة الفئران الدبقية المغذية: ملاحظة. ومع ذلك، مناطق أخرى من الدماغ، مثل قشرة الدماغ والجسم المخطط، ستعمل بعد تعديله طبقا للاختلافات في كثافة الخلية نظرا لأعداد وعائدات من الخلايا من مختلف المناطق المختلفة.
    3. إضافة ~ 4 مل من قبل تحسنت تصفيح المتوسط ​​3 إلى تعليق خلية النهائي (~ 1 مل).
    4. نقل تعليق خلية في قارورة المغلفة ثقافة T25، وذلك باستخدام-توصيله القطن، مصقول النار ماصة باستير. ضع قارورة في حاضنة الثقافة (5٪ CO 2 -95٪ O 2، 37 ° C).
    5. في 2-3 DIV، عندما الخلايا هي 20-40٪ متموجة، وإزالة غير ملتصقة أو ضعيفة الخلايا الملتصقة، عن طريق إغلاق الغطاء بإحكام، والهز القارورة بقوة ~ 10 مرات، الشفط الحل، وإضافة 4-5 مل من الطلاء متوسطة 3 (في 4 درجات مئوية). كرر هذا الإجراء مرة واحدة. فحص الخلايا المستزرعة عبر الكلمة قارورة كامل (على سبيل المثال،باستخدام المجهر المرحلة على النقيض) للتأكد من أن تلك التي تظهر العصبية (أي تلك التي الحافة الخارجية من جسم الخلية يظهر على مرحلة مشرقة) يتم إزالتها تماما. كرر الإجراء كلما كان ذلك ضروريا لإزالة هذه الخلايا، ومن ثم العودة القارورة إلى حاضنة.
      ملاحظة: القوة والعدد الإجمالي لل"يهز" المطلوبة قد تختلف بين المجربون الفردية. الشيء المهم هو ليس للحفاظ على العدد الكلي للهزات لعدد محدد، ولكن لتأكيد أن الخلايا العصبية التي تشبه الخلايا والقضاء عليها.
    6. في 6-8 DIV، عندما الخلايا هي 90-100٪ متموجة، مرور الخلايا الدبقية التي كتبها trypsinizing لهم كما في الخطوة 3.2.8.
    7. بعد الطرد المركزي، resuspend الكرية في 1 مل من الطلاء المتوسطة 3 (4 ° C)، إضافة 10 مل من الطلاء المتوسطة 3 (4 ° C)، ونقل الخلايا trypsinized إلى الامم المتحدة والمغلفة T75 قارورة، والثقافة لها في الحاضنة.
      ملاحظة: سيتم passaged الخلايا الدبقية الفئران مرتين. في المقابل الخلايا الدبقية الماوس عالبريد passaged مرة واحدة فقط لأنها تصبح غير صحية بعد ممرات متعددة. سيتم passaged الخلايا الدبقية الفئران في قوارير T75 التي لم يتم المغلفة مع أي مواد الطلاء. طلاء يسمح الخلايا الدبقية الفئران أن ينمو بسرعة كبيرة جدا وتنتج العديد من الخلايا المهدبة (خلايا البطانة العصبية المفترضة)، والتي سوف تتدهور حالة ثقافة العصبية في وقت لاحق.
    8. في 17-19 DIV الثقافة الدبقية في قارورة (أي 11 يوما بعد الركض وقبل trypsinization يوم واحد والطلاء على coverslips خطوات 3.3.9-3.3.14)، وضع 100 ميكرولتر من مواد الطلاء على coverslips الزجاج غير مغسولة ( الجولة، 12 مم) في طبق ثقافة، ووضع الطبق الثقافة في حاضنة الثقافة.
      ملاحظة: للحصول على الثقافات الدبقية الفئران، لم يلاحظ فرق في النتائج الثقافة مع أو بدون غسل لل coverslips.
    9. في 18-20 DIV الثقافة الدبقية في قارورة (أي بعد 12 يوما من الركض)، وإعداد طبقة المغذية الدبقية التي كتبها trypsinizing في الخلايا المستزرعة، وفقا لشارعالجيش الشعبي 3.2.8.
    10. أثناء الطرد المركزي، ونضح مواد الطلاء تماما من coverslips الزجاج.
    11. بعد الطرد المركزي، resuspend الكرية في 1 مل من الطلاء المتوسطة 3 (4 ° C)، وقياس كثافة الخلايا، وفقا لخطوة 3.1.13.
    12. ضبط كثافة الدبقية إلى 10 4 الخلايا الحية / مل، ولوحة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية الدبقية على coverslips الزجاج المطلي.
      ملاحظة: هذه الخلايا سوف تنشئ طبقة المغذية الدبقية.
    13. مكان الطبق الثقافة مع coverslips في الحاضنة لمدة 20-60 دقيقة.
    14. إضافة 1 مل من الطلاء المتوسطة 3 (4 ° C) إلى كل بئر، ووضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة.
    15. في 3-4 DIV طبقة المغذية الدبقية، عندما الخلايا على ساترة هي 40-80٪ متموجة، إضافة 1 مل من وسط النمو قبل تحسنت (انظر الجدول رقم 1 لتكوين) الذي يحتوي على السيتوزين β-D-arabinofuranoside ( أراك، تركيز النهائي من 4 ميكرومتر) لوقف انتشار الخلايا الدبقية. لوحة الخلايا العصبيةالصورة في 7-9 DIV طبقة المغذية الدبقية عندما الخلايا هي 60-80٪ متموجة، وذلك باستخدام الخطوة 3.4.
  4. الثقافات الماوس العصبية
    1. التسمية وراثى الفئران حديثي الولادة وفقا لالخطوتين 1 و 2.
    2. استخدام الماوس الجراء للخطوة 3.1.
    3. ضبط كثافة تعليق الخلية الحية إلى ~ 2.0 × 10 5 خلية / مل باستخدام الطلاء متوسطة 2 لتصفيح على الخلايا الدبقية الماوس، أو استخدام قبل تحسنت الطلاء متوسطة 3 لتصفيح على الخلايا الدبقية الفئران.
    4. لوحة الخلايا على طبقة المغذية الدبقية، وذلك بإضافة بلطف تعليق الخلية إلى مستنبت من كل بئر. ملاحظة: سيتم تحديد حجم تعليق الخلية التي يمكن ان تضاف من قبل العدد المستهدف من الخلايا في الثقافة أيضا. على سبيل المثال، لوحة ~ 60 ميكرولتر من تعليق خلية لتحقيق 12،000 خلية / جيدا.
    5. لاحظ أن أي تغييرات حل ضرورية بعد أن يتم مطلي الخلايا العصبية. كن حذرا لتجنب التبخر من الحل من الآبار على مدى الثقافة، من خلال ترطيب داخل سو حاضنة الثقافة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كمثال لتطبيق هذا البروتوكول، وتظهر نتائج ممثلة لوصفها الفئران عن طريق الوشم، والتنميط الجيني يمكن الاعتماد عليها تحت ظروف تجريبية مختلفة، وإنشاء الثقافات العصبية الأولية على طبقات المغذية الدبقية.

الوشم

وصفت الجراء حديثي الولادة على منصات مخلب باستخدام نظام الوشم ('الوليد' في الشكل 1). ظلت التسميات واضحة للعيان في 3 أسابيع ('من العمر 3 أسابيع') و 32 أسابيع من العمر ('32 -week من العمر '). الفئران الفردية يمكن تحديدها بشكل فريد من خلال مزيج من الوشم على أربعة الكفوف (أرقام 1-16) والمعلومات حول قفص الحيوان، أو أنظمة ترقيم أكثر تعقيدا (لا يظهر).

التنميط الجيني

وأظهرت إحدى مثال ممثل التنميط الجيني (الشكل 2). الجين Tor1a البرية من نوع (Tor1a (Tor1a + / ΔE) ومتماثلة اللواقح (Tor1a ΔE / ΔE) ΔE-torsinA الضربة القاضية في الفئران من الحمض النووي الجيني معزولة عن مقاطع ذيل الجراء حديثي الولادة. ويستند التنميط الجيني في هذا المثال معينة على وجود واحد الموقع loxP-34 قاعدة الزوج في Tor1a أليل متحولة بعد نجاح إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية والحذف من بالنيوميسين المقاومة كاسيت 16،18.

تم استخراج DNA الجينوم مع الحد الأدنى من التدريب العملي على الوقت، وتمت معالجة العديد من العينات في وقت واحد. وأبقى حجم استخراج المستمر، وبالتالي فإن أي تعديل من حجم اللازمة لاستيعاب التغيرات في الظروف التي تم اختبارها. تم اختبار موثوقية التنميط الجيني تحت أربعة شروط، كما هو مفصل أدناه.

أولا، تم فحص تأثير الاختلافات في كمية بدءا الأنسجة (الشكل 3). وكانت ذيول أطوال مختلفةأعدت من متخالف ΔE-torsinA الضربة القاضية في الفئران (Tor1a + / ΔE) في سن الفطام (~ 3 أسابيع). أطوال الذيل من 2 إلى 5 ملم، ومجموعة الموصى بها عادة في بروتوكولات التنميط الجيني، أعطى نفس التنميط الجيني نتيجة لجودة عالية. العصابات اثنين تتوافق مع من النوع البري والأليلات تحور (Tor1a + وTor1a ΔE، على التوالي).

ثانيا، تم فحص آثار التقلبات في سن الحيوان (الشكل 4). وقد تم الحصول على ذيول من الأطفال حديثي الولادة، البالغ من العمر 3 أسابيع و~ عمره 24 أسابيع ΔE-torsinA متخالف الضربة القاضية في الفئران (Tor1a + / ΔE). لم تستخدم أصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل لأنها تموت عدة أيام بعد الولادة 16-18. وكانت العصابات اثنين المتوقعة للمن النوع البري والجينات Tor1a تحور واضحة بغض النظر عن العمر الحيوان (الشكل 4A). تم اختبار مدى انطباق العام لهذه النتيجة باستخدام الجين الثاني، Tfap2a 19 في البرية-Tالفئران [يب] (Tfap2a + / +) (الشكل 4B).

ثالثا، تم اختبار آثار الاختلافات في طول amplicons PCR (الشكل 5). لهذا الغرض، تم تصنيعه أزواج التمهيدي مختلفة لجين معين، مثل أن السلطات الوطنية المعينة تضخيم ذات أطوال مختلفة زوج قاعدة. تم الكشف عن الجين Tfap2a باستمرار مع أطوال amplicon مختلفة.

رابعا، وتمت مقارنة طريقتين استخراج الحمض النووي (الشكل 6). في أسلوب واحد، تم استخدام أنابيب PCR الشريط وcycler الحرارية PCR (موضح في الخطوة 2). هذا هو الآلي، مواز متعددة أنبوب طريقة استخراج ('السيارات' في الشكل 6). لأنه يمكن التعامل مع أنابيب متعددة في وقت واحد في شكل شريط، ويستخدم جهاز PCR مع برنامج للعمل في أربع خطوات درجة الحرارة، وليس هناك حاجة لنقل أنابيب، يدويا تغيير درجة الحرارة خلال استخراج أو استخدام أجزاء متعددةمن المعدات. وبالتالي فمن السهل لمعالجة العديد من العينات. تم مقارنة ذلك مع الطريقة الثانية تعتمد على اليدوي، واحد أنبوب استخراج ('دليل' في الشكل 6). هذا يستخدم أنابيب الفردية PCR وآلات غير PCR منفصلة (كتل الحرارة وحمامات المياه) للتحكم في درجة الحرارة خلال استخراج الحمض النووي. في هذه الحالة، تم نقل متعددة، وأنابيب واحدة إلى درجة حرارة جديدة بعد كل خطوة، والتي تتطلب متعددة الأجهزة-التحكم في درجة الحرارة. في كلتا الحالتين، تم تحليل الجينات Tor1a في البرية من نوع، متخالف وΔE-torsinA متماثل الضربة القاضية في الفئران (الشكل 6A)، وتم تحليل الجينات Tfap2a في البرية من نوع الفئران (الشكل 6B). البروتوكولات استخراج اثنين أسفرت عن نتائج التنميط الجيني ما يعادلها.

وباختصار، فإن النتائج المقدمة في أرقام 3 إلى 6 تثبت أن طريقة التنميط الجيني هو قوي، وتحقيق نتائج موثوقة وقابلة للتكرار على الرغم من فاriations في كمية الأنسجة، وعمر الحيوان، وطول amplicon، وبروتوكول استخراج المستخدمة.

الثقافات العصبية

لزراعة الخلايا العصبية الماوس على الطبقة المغذية الماوس الدبقية، وترتيب الإجراءات هو: (الوشم حديثي الولادة الفئران → التنميط الجيني للثقافة الدبقية →) ثقافة الدبقية → الوشم حديثي الولادة الفئران → التنميط الجيني للثقافة العصبية → ثقافة العصبية. للثقافات أنشئت على الطبقة المغذية الدبقية الفئران، والإجراءات بين قوسين هي تخطي.

درسنا تأثير داعم للطبقة المغذية الدبقية قبل المصنفة على بقاء الخلايا العصبية والنمو. وقد تم الحصول على الخلايا العصبية من المنطقة CA3-CA1 من الحصين، ومنطقة المحرك من القشرة الدماغية، والمخطط لحديثي الولادة الفئران من النوع البري. كانت مطلية أنها في كثافة منخفضة على طبقة المغذية الدبقية الفئران التي تم الحصول عليها من منطقة CA3-CA1 من الحصين والمصنف قبل طلاء الخلايا العصبية، وفقا لمخطط موضح في الشكل 7 (ملخص مبسط للإجراءات). ثقافات منخفض الكثافة هي المثلى للتصوير من التشعبات الفردية، somata 4،6، والمحطات العصبية 2،3،5،8 ومهاوي محور عصبي 5 في قرار مكانية عالية. كانت مطلية خلايا قرن آمون (التي تحتوي على كل من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية) على coverslips الزجاج المطلي، إما مع (الشكل 8A) أو بدون طبقة المغذية الدبقية محددة مسبقا (الشكل 8B، C) ويلاحظ مع البصريات على النقيض من المرحلة. في وجود طبقة المغذية الدبقية متكدسة تقريبا، الخلايا العصبية (في كل لوحة، رأس السهم يشير أحد الخلايا العصبية ممثل) وفرقت نسبيا بعد الطلاء (أيام في المختبر، DIV) (الشكل 8A) 3 و 7 أيام. كما اظهرت علامات الصحة الجيدة، مثل بهامش واضح للsomata الخلايا العصبية، التشعبات الموسعة، عدم وجود somata عنقودية، وعدم وجود neurites التي المجمعة (عالية التكبير ايماجوفاق في إدراجات). في 14 DIV، هذه الخلايا العصبية شكلت شبكة كثيفة تتميز neurites التي طويلة (التشعبات والمحاور). لاحظ أن انتشار الدبقية كان مستعمل كانت مطلية الخلايا العصبية، وذلك بإضافة المتوسطة النمو التي تحتوي على أراك الإنقسامية المانع (الخطوة 3.3.15).

في المقابل، في غياب الطبقة المغذية الدبقية في وقت طلاء الخلايا العصبية قرن آمون، وقد ضعف نمو الخلايا العصبية الحصين مثقف، حتى في غياب أراك. في 3 DIV، والخلايا الدبقية (المدرجة في خلايا قرن آمون مطلية حديثا) لم تشكل ورقة متموجة (النجمة في لوحة العليا من الشكل 8B). وأظهرت ثقافات عدة علامات ليست مناسبة للدراسات التصوير عالية الدقة، مثل مناطق واسعة دون الخلايا الدبقية الأساسية (النجمة)، وجود somata تتجمع وجود neurites التي المجمعة في بعض المناطق (لا تظهر البيانات). بنسبة 7 DIV، الخلايا الدبقية شكلت ورقة متموجة (لوحة المتوسطة من الشكل 8C). Howevإيه، كانت الخلايا العصبية أقل في عدد من عندما كانت مطلية الخلايا العصبية في طبقة المغذية الدبقية مقررة سلفا. يفتقر إلى الخلايا العصبية على قيد الحياة أيضا، neurites التي تشكيل شبكة طويلة (الشكل). وكانت الخلايا الدبقية أكثر غير متجانسة في انحناء وسماكة من تلك الموجودة في الثقافة طبقة المغذية، وبالتالي الظهور على مرحلة مشرقة. من أجل اختبار تأثير قمع انتشار الدبقية على الخلايا العصبية، طبقنا أراك التي تحتوي على النمو المتوسطة. عندما أضيف أراك في 3 أو 7 DIV وكانت الخلايا مثقف حتى 14 DIV، ولاحظ في هذا اليوم (الشكل 8B وC، لوحات أسفل)، والخلايا الدبقية غطت معظم سطح ساترة. ومع ذلك، لا تزال الخلايا العصبية قليلة العدد، وخصوصا عندما تم تطبيق أراك في 7 DIV. وكانت الخلايا العصبية على قيد الحياة عمليات قصيرة فقط، ولم إتصال على نطاق واسع. وهكذا، إضافة متأخرة من أراك سمحت طبقة الدبقية موحدة لتشكيل لكنها لم تعزز بقاء الخلايا العصبية أو تمديد Neurite النوعي. بدلا من النمو غير المنضبط الدبقيةكان لها آثار ضارة على الخلايا العصبية.

وتشير هذه البيانات إلى أن طبقة المغذية الدبقية هو أمر حاسم لبقاء ونمو الخلايا العصبية مطلي في منخفض الكثافة، وأن طبقة الدبقية يجب أن تكون موجودة في ذلك الوقت من الطلاء العصبية وليس آجلا خلال ثقافة العصبية. وقد تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام ثقافات القشرية الدماغية (الشكل 9) والخلايا العصبية الجسم المخطط (الشكل 10).

وأكد الملاحظة النوعية حول بقاء الخلايا العصبية عن طريق التحليل الكمي. على وجه التحديد، وقد أحصى عدد الباقين على قيد الحياة الخلايا العصبية في 14 DIV، استنادا إلى الصور على النقيض من المرحلة الثقافات (الشكل 11). وكان عدد أكبر للالخلايا العصبية مثقف على طبقة المغذية الدبقية (أي.، مطلي على الطبقة المغذية الدبقية). وكان عدد أقل من ذلك في حالة الخلايا العصبية مثقف في حالة عدم وجود طبقة المغذية الدبقية. تم تخفيض عدد أبعد من ذلك عندما تم علاج الخلايا مع أراك فيوقت لاحق. وكانت هذه فروق ذات دلالة إحصائية، ووحظت في الثقافات من الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها من جميع مناطق الدماغ الثلاثة.

تم تحديد أنواع الخلايا على قيد الحياة في 14 DIV في الماوس الثقافات الحصين مطلي على طبقة الفئران الحصين المغذية. تم إجراء المزدوج مناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد علامة الخلايا العصبية، والبروتين المرتبط أنيبيب 2 (MAP2)، ونجمي علامة الخلية الدبقية، الدبقية ييفي الحمضية البروتين (GFAP). كانت الخلايا مع العمليات الممتدة إيجابية لMAP2، في حين كانت الخلايا في الطبقة المغذية الدبقية الكامنة إيجابية لGFAP (حقلين صورة تمثيلية، الشكل 12A). وكان هذا تلطيخ يست قطعة أثرية من تركيبة معينة من الأجسام المضادة الأولية والثانوية، لأنه تم الحصول على نفس النمط عندما تم استخدام مجموعة مختلفة من الأجسام المضادة الثانوية (الشكل 12B).

في المقابل، عندما تم PERFO نفس تلطيخrmed على الثقافات التي تتكون من سوى طبقة المغذية الدبقية، أي في غياب خلايا فأر المضافة (حقلين صورة تمثيلية، الشكل 13A)، لم تكن هناك أية خلايا إيجابية لMAP2. وكانت خلايا الطبقة المغذية باستمرار إيجابية لGFAP. لسيطرة سلبية، حذفت كل من الأجسام المضادة الأولية من الإجراء immunocytochemical (الشكل 13B). تم الكشف عن أي تلطيخ في هذه العينات، على الرغم من أن الخلايا كانت موجودة، كما يتضح من البصريات الخفيفة التي تنتقل عن طريق (على النقيض تدخل الفرق، DIC) وتلطيخ النووي مع هويشت صبغ. وهكذا، كان تلطيخ غير محددة في القنوات MAP2 وGFAP ضعيف جدا.

وقد تم تحليل هذه البيانات immunocytochemical أيضا من الناحية الكمية (الشكل 14). في كل صورة 8 بت، وقد تم قياس كثافة وتآمر على طول الخط. المؤامرات مضافين تكشف MAP2 تلطيخ عندما كانت خلايا فأر (عينات تحتوي على الخلايا العصبية) مثقف على طبقة المغذية الدبقية (الخلية العصبية +،الدبقية +، الأجسام المضادة الأولية (1 ° أب) +)، في حين أن هذا تلطيخ كان غائبا في ثقافات الخلايا المغذية الدبقية وحدها (الخلية العصبية -، الدبقية +، 1 ° أب +). في سيطرة سلبية دون الأجسام المضادة الأولية، وتلطيخ يذكر في ثقافات الخلايا المغذية الدبقية وحدها (الخلية العصبية -، الدبقية +، 1 ° أب -). كان GFAP تلطيخ واضح في الطبقة المغذية الدبقية، بغض النظر عما إذا كانت مطلية خلايا فأر (الخلية العصبية +، الدبقية +، 1 ° أب +) أو لا (الخلية العصبية -، الدبقية +، 1 ° أب +). مرة أخرى، كان تلطيخ في السيطرة السلبية يكاد يذكر (الخلية العصبية -، الدبقية +، 1 ° أب -). وتشير هذه النتائج إلى أن طبقة الفئران المغذية الدبقية كان يتألف في معظمه من الخلايا النجمية، وأن الخلايا العصبية كانت موجودة فقط عندما أضيفت خلايا فأر. أنها تشير أيضا إلى أن الخلايا العصبية الموجودة في هذه الثقافات نشأت فقط من الماوس.

ويبين القسم نتائج الفيديو على الانترنت أيضا مدينة دبي للإنترنت وMAP2 الصور من الخلايا العصبية مثقف مطلي على طبقة المغذية الدبقية، بوعشر أعدت من المنطقة CA3-CA1 الحصين البرية من نوع الفئران.

من أجل السيطرة مفصلة لزراعة الخلايا، فمن المستحسن لقياس كثافة الخلايا الحية، سواء لتقييم الجودة العامة للتشريح الدماغ والخطوات التفكك الخلوية، وطلاء الخلايا في كثافة محددة مسبقا. وفيما يلي أربع مجموعات من قياسات كثافة نموذجية. نلاحظ، مع ذلك، أن هذه الأرقام يمكن أن تختلف تبعا لظروف ثقافة والكواشف. على سبيل المثال، يمكن حتى الكثير مختلفة من المصل من نفس البائع يؤثر على النتائج. وبالتالي، ينبغي اعتبار هذه الأرقام مؤشر العام، بدلا من المبدأ التوجيهي المطلق.

لتفارق الخلوي (الخطوة 3.1.13)، القيم النموذجية لكثافة الخلايا الحية تم الحصول عليها من الجرو واحدة هي: ~ 2 × 10 5 خلية / مل (الماوس القشرة الحركية والفأر CA3-CA1 الحصين)، ~ 5 × 10 5 خلايا / مل (الماوس القشرة الدماغية والفئران الحصين CA3-CA1)، و~ 1 × 10 6 جells / مل (الماوس المخطط). في كل هذه الحالات، كانت أجزاء من الخلايا الحية> 90٪ (قابلية، الذي يعرف بأنه نسبة عدد الخلايا الحية إلى أن من العدد الكلي للخلايا). يتم تعريف القشرة الحركية بشكل عام بأنها منطقة القشرة الدماغية التي تقع الظهرية فورا إلى المخطط 20. للثقافات الحصين، السليم ويفضل المناطق CA3 وCA1 من الحصين. الحصين كله وتشمل بالإضافة إلى التلفيف المسنن، وإدراج الأمر الذي يؤدي إلى تشكيل محطات الأعصاب كبيرة من الخلايا الحبيبية ويدخل عدم التجانس في خصائص متشابك 21. وتشمل الثقافة الجسم المخطط والمذنبة-putamen والكرة الشاحبة، ولكن لا تشمل النواة المتكئة، أو وسطي أو نوى الحاجز الأفقي في الهياكل القريبة.

للثقافة الماوس الدبقية (الخطوة 3.2.11)، وكثافة تصفيح ~ 10،000 الخلايا الدبقية على كل 12 ملم ساترة مستديرة، وذلك باستخدام ~ 50 ميكرولتر من تعليق خلية في كثافة ~ 2 ×10 5 خلية / مل. عادة كثافة يقاس في طاف هو ثابت نسبيا ولا تتطلب التعديل. لتحويل الكثافة على مناطق مختلفة، ومعلومات مفيدة هي أن ساترة التي يبلغ قطرها 1.20 سم، وتبلغ مساحتها 1.13 سم 2. وهكذا، ~ 10،000 خلية / ساترة = ~ 8،800 خلية / سم 2 على ساترة.

لالفئران ثقافة الدبقية (الخطوة 3.3.12)، وكثافة تصفيح ~ 1،000 الخلايا الدبقية على كل 12 ملم ساترة مستديرة، وذلك باستخدام ~ 100 ميكرولتر من تعليق خلية في كثافة ~ 1X10 4 خلية / مل. وهكذا، 1،000 خلية / ساترة = ~ 900 خلية / سم 2 على ساترة.

لمنخفض الكثافة الماوس ثقافة العصبية (الخطوة 3.4.4)، وكثافة الطلاء تتراوح بين 2،000 و 48،000 خلايا لكل بئر من 24 لوحة جيدا. القيم النموذجية عندما تصفيح الخلايا العصبية على الخلايا الدبقية الفئران هي: 10،000-24،000 خلية / جيدا لالعصبونات القشرية الدماغية، 12،000-24،000 خلية / جيدا لCA3-CA1 الخلايا العصبية قرن آمون و24،000-48،000 خلايا / جيد للعصبونات الجسم المخطط. عندما الطلاء على الخلايا الدبقية الماوس، يتم تقليل عدد، على سبيل المثال، 2،000 خلية / جيدا لCA3-CA1 الخلايا العصبية قرن آمون. كملاحظة جانبية، لتصفيح الفئران CA3-CA1 الخلايا العصبية قرن آمون على طبقة المغذية الدبقية الفئران، وكثافة تصفيح 1،000-6،000 خلايا / جيد. لتحويل كثافة في بئر لكثافة على ساترة، ومعلومات مفيدة هي أن قطر جيدا الداخلي في أسفل هو و1.56 سم مساحتها 1.91 سم 2. وهكذا، على سبيل المثال، 12،000 خلية / جيدا = 7،100 خلية / ساترة = 6،300 خلية / سم 2 على ساترة. وقد تم اختيار هذه الكثافات بهدف زراعة الخلايا العصبية متفرق نسبيا عالية الدقة التصوير الخلوية. يجب اختيار الباحثين أعدادهم التي تناسب أفضل أهدافهم التجريبية.

الشكل (1)
الشكل 1. مخلب منصات وشم من الفئران. Nوصفت الفئران ewborn التي كتبها الوشم منصات مخلب. تم تصويرها مباشرة بعد الوشم (حديثي الولادة)، في 3 أسابيع من العمر (عمره 3 أسابيع) وفي 32 أسبوعا من العمر (عمره 32 أسابيع). ظلت التسميات مرئية بسهولة طوال فترة البلوغ. وقد أخذت صور من الحيوانات المختلفة. لا تظهر أنها في نفس النطاق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. انماط البرية من نوع (Tor1a + / +)، متخالف (Tor1a + / ΔE) ومتماثلة اللواقح (Tor1a ΔE / ΔE) ΔE-torsinA الضربة القاضية في الفئران. وقد تم تحليل الأليلات الجينات Tor1a في البرية من نوع ومتحولة أشكال، ضغطها باستخدام الحمض النووي من ذيول الجراء حديثي الولادة. تيوكانت نصائح تزعج ~ 4 ملم في الطول. كانت ملطخة الحمض النووي DNA باستخدام SYBR الآمن جل وصمة عار. انظر جدول المواد / معدات لمعلومات حول الاشعال وبرنامج ركوب الدراجات الحرارية لTor1a الجين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
واستخدمت الشكل 3. الكشف عن الحمض النووي الجيني في سياق الاختلاف في كمية بدءا المادية. نصائح ذيل أطوال مختلفة. وكانت الحيوانات المختبرة عمرها 3 أسابيع، متخالف ΔE-torsinA الضربة القاضية في الفئران (Tor1a + / ΔE). تمثل ممرات أطوال ذيل 2 و 3 و 4 و 5 ملم، في نسختين (من اليسار). تم الحصول على نصائح من ذيل الفئران مختلفة. علامات حجم الوزن الجزيئي في أقصى اليسار حارة تمثل DNA أطوال في الصورةteps من 100 زوج من القواعد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4. الكشف عن الحمض النووي الجيني في سياق التباين في سن الحيوان. (A) Tor1a الجين. تمثل ممرات نصائح ذيل تم الحصول عليها من متخالف ΔE-torsinA الضربة القاضية في الفئران (Tor1a + / ΔE) في المراحل التالية: الأطفال حديثي الولادة، 3 أسابيع من العمر، و~ عمرها 24 أسابيع (في مكررة من اليسار) (B). Tfap2a الجين. تمثل ممرات نصائح ذيل تم الحصول عليها من البرية من نوع (Tfap2a + / +) الفئران في المراحل التالية: الأطفال حديثي الولادة، عمرها 3 أسابيع، و~ عمرها 24 أسبوع (في مكررة من اليسار). تم تضخيم كل من الجينات من ذيول ~ 4 ملم في الطول. وPCR جزء المتوقع هو 498 نقطة أساس. برنامج وا PCR نفس الشيء الذي استعمل لTor1a الجين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. الكشف عن الحمض النووي الجيني في سياق الاختلاف في طول amplicon PCR. تم تحليل الجينات Tfap2a مع PCR أطوال amplicon من 498 سنة مضت (الممرات الأيسر)، 983 سنة مضت (الممرات الوسطى) و 1990 سنة مضت (الممرات اليمنى) في التكرارات. تم تضخيم هذا الجين من ذيول الفئران عمرها 3 أسابيع. علامات حجم الوزن الجزيئي في أقصى اليسار وأقصى اليمين الممرات من هلام تمثل أطوال DNA في خطوات 100 و 200 زوجا قاعدة، على التوالي. انظر جدول المواد / معدات حصول على معلومات حول الاشعال لamplicons مختلفة. 879fig5highres.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6. الكشف عن الحمض النووي الجيني في سياق الاختلاف في طريقة استخراج الحمض النووي. نتائج للدليل، تتم مقارنة استخراج أنبوب واحد (دليل) والآلي، وبالتوازي مع أساليب الاستخراج متعددة أنبوب (السيارات). تم استخدام الأسلوب الأخير في هذا التقرير. وتضخمت جينات من ذيول ~ 4 ملم في الطول، والتي تم جمعها من الأطفال حديثي الولادة. (A) Tor1a الجينات في الجراء حديثي الولادة من ΔE-torsinA تدق في الفئران. تمثل ممرات السلطات الوطنية المعينة المستخرجة من النوع البري (اليدوي والآلي)، متخالف (اليدوي والآلي)، والفئران متماثل (اليدوي والآلي) (من اليسار). (ب) Tfap2a الجينات في عمرها 3 أسابيع الفئران من النوع البري. وPCR جزء المتوقع هو 498 نقطة أساس.jove.com/files/ftp_upload/51879/51879fig6highres.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7. المبسطة، والتوضيح التخطيطي من الإجراءات لطلاء الخلايا العصبية الماوس على الماوس (A) والفئران (B) طبقات المغذية الدبقية، وعدد أيام (أيام في المختبر) الرجوع إلى أيام التراكمية بعد ومطلي الخلايا الدبقية أولا في الثقافة قوارير. أنها تخدم فقط كتقدير تقريبي. للحصول على تفاصيل العملية، راجع إجراءات القسم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 8
الرقم 8. تأثير داعمةمن طبقة المغذية الدبقية على نمو الخلايا العصبية قرن آمون في ثقافة منخفض الكثافة. تم الحصول على الخلايا العصبية من المنطقة CA3-CA1 من الحصين من حديثي الولادة، من النوع البري الفئران. كانت مطلية خلايا قرن آمون (A) ماوس على coverslips الزجاج المطلي، والتي قد المصنف قبل بطبقة المغذية الدبقية الفئران التي تم الحصول عليها من منطقة CA3-CA1 من الحصين. وفرقت الخلايا العصبية بالتساوي بطريقة صحية. وقد لوحظت الثقافات في 3 و 7 و 14 DIV. كانت مطلية خلايا قرن آمون (B، C) ماوس على coverslips الزجاج المطلي، والتي ليس لديها طبقة محددة سلفا المغذية. وقد لوحظت الثقافات في 3 DIV (اللوحة العلوية في B) و 7 DIV (لوحة المتوسطة في C) من دون علاج أراك. في مجموعات أخرى من الثقافات، تم علاج الخلايا مع أراك في 3 DIV (اللوحة السفلية في B) و 7 DIV (اللوحة السفلية في C)، ولاحظ في 14 DIV. جميع الصور تمثل الثقافات الشقيقة تم الحصول عليها من نفس الجرو، التي كانت مطلية في نفس اليوم الخلايا العصبية. انظر النص لمزيد من التفاصيل. لكل لوحة، وهو رئيس سابقافرة من الخلايا العصبية هو مبين من قبل رأس السهم الأبيض وتضخيم في أقحم. الخلايا العصبية لديهم أجسام الخلايا الذي يظهر مشرق عندما ينظر اليها من قبل البصريات على النقيض من المرحلة محيط، ولديهم أيضا عمليات سميكة. العلامات النجمية تشير إلى المناطق دون الخلايا الدبقية. تم تصوير الثقافات يعيش على مجهر مقلوب باستخدام البصريات المرحلة على النقيض مع 20X عدسة الهدف (الفتحة العددية 0.45) من دون عدسة المتوسطة (أي في 1X). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 9
الرقم 9. تأثير داعمة للطبقة المغذية الدبقية على نمو الخلايا العصبية القشرية الدماغية في ثقافة منخفض الكثافة. نتائج مماثلة كما في الشكل 8، ولكن مع الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها من منطقة المحرك من جالقشرة erebral. الظروف تسميات AC مماثلة لتلك في الشكل 8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 10
الشكل 10. تأثير داعمة للطبقة المغذية الدبقية على نمو الخلايا العصبية في الجسم المخطط ثقافة منخفض الكثافة. نتائج مماثلة كما في أرقام 8 و 9، ولكن مع الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها من المخطط. الظروف تسميات AC مماثلة لتلك في الشكل 8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 11. تأثير داعمة للطبقة المغذية الدبقية على بقاء الخلايا العصبية. تم حساب عدد الخلايا العصبية على قيد الحياة في التجارب هو موضح في الشكل 8، وذلك باستخدام الصور التي حصل عليها على النقيض من المرحلة المجهري. يتم عرض الصور لمدة 14 DIV هنا مرة أخرى، ولكن مع رؤوس سهام تشير إلى أمثلة من الخلايا العصبية فرزها. ويبين الرسم البياني شريط عدد الخلايا العصبية في حقل صورة (449.0 ميكرون س 335.5 ميكرون) (يعني ± الخطأ المعياري للمتوسط، ن = 7-24 الحقول لكل حالة الثقافة). العلامات النجمية تشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية من 'طبقة المغذية الدبقية (-)، أراك في 3 DIV "و" الطبقة المغذية الدبقية (-)، أراك في 7 DIV' من 'طبقة الدبقية المغذية (+) "(* P <0.05، ** ف <0.01، طالب أونبايريد تي -test). الأرقام المذكورة أعلاه أشرطة تدل على كثافة الخلايا العصبية في قياس المونتاج حقول صورة متعددة. كانت الصورحصلت باستخدام 20X عدسة الهدف. لتجنب اكتساب التحيز، تم الحصول على جميع الصور على طول الشريط الرأسي الكامل، من أعلى إلى أسفل ساترة وتمر من خلال مركز التقريبي للساترة. وكانت الصور الفردية بعض التداخل (على سبيل المثال، 1/6 إلى 1/4 من حقل صورة في أعلى وأسفل). واستخدمت طريقتين للتحليل. في واحد، احصي الخلايا العصبية في بالتناوب الصور للتأكد من أن الخلايا العصبية الفردية ولم يحتسب أكثر من مرة. استخدمت الأرقام الناتجة لتوليد الرسم البياني شريط. في الطريقة الثانية، تم إنشاء المونتاج واحد من الصور الفردية. تم مخيط أنها باستخدام مايكروسوفت محرر الصور المركبة أو يدويا باستخدام برنامج فوتوشوب. استبعاد المونتاج أيضا تهم متعددة من نفس الخلايا العصبية. يتم سرد الأرقام الناتجة فوق القضبان. في كلتا الطريقتين، تم استبعاد مناطق واسعة في محيط ساترة التي لم تحتوي على أي خلايا. احصي الخلايا كما الخلايا العصبية إذا كانت لديهم أجسام الخلايا التي ظهرت مشرقبواسطة المجهر المرحلة على النقيض، فضلا عن العمليات الخلوية طويلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 12
الرقم 12. Immunocytochemical تحديد أنواع الخلايا في الثقافات العصبية. يناظر الشرط الثقافة إلى الصورة من الأسفل الأيسر من الشكل 8A. وقد تم الحصول على الخلايا العصبية من المنطقة CA3-CA1 من الحصين البرية من نوع الفئران، ومطلي على طبقة المغذية الدبقية المتولدة من المنطقة CA3-CA1 من الحصين البرية من نوع الفئران. وقد تم تحليل الخلايا المستزرعة التي كتبها مناعية للعلامة MAP2 الخلايا العصبية، ونجمي الخلايا الدبقية علامة الخلية GFAP. التفاضلية تدخل النقيض كان يستخدم (DIC) المجهري للكشف عن التشكل العام للحقول تصويرها، 14-17بعد أيام من الخلايا العصبية كانت مطلية على طبقة المغذية الدبقية. (A) ثلاثة ألوان تلطيخ، بما في ذلك counterstaining مع علامة النووية هويشت 33342 صبغ. وتظهر حقلين صورة تمثيلية. (B) اللونين تلطيخ، مع مجموعات مختلفة من الأجسام المضادة الثانوية مترافق مع fluorophores مختلفة. في هذه التجارب، تم إصلاح الخلايا المستزرعة مع بارافورمالدهيد 4٪ والسكروز 4٪ في محلول تايرود (التي تحتوي على، في ملي: 125 كلوريد الصوديوم، 2 بوكل، 2 CaCl 2، 2 MgCl 2، 30 D-الجلوكوز، 25 HEPES، ودرجة الحموضة 7.4 تعديل مع 5 M هيدروكسيد الصوديوم، ~ 310 الميلي أسمول دون تعديل) لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. بعد غسلها بمحلول تايرود، كانوا permeabilized مع 0.1٪ تريتون X-100 في حل تايرود لمدة 10 دقيقة. تم غسلها مرة أخرى مع الحل تايرود ثم سدت مع 2٪ مصل الماعز العادي في المياه المالحة الفوسفات مخزنة (PBS) (حل حجب) لمدة 60 دقيقة في RT. بعد ذلك كانوا يعاملون مع بولي أرنبنسيلي الأجسام المضادة لمكافحة MAP2 (AB5622، 400X التخفيف في عرقلة الحل)، والماوس وحيدة النسيلة المضادة للGFAP كوكتيل (NE1015، 1،000x تمييع) O / N (15-21 ساعة) في 4 درجات مئوية. وبعد يغسل مع PBS، حضنت الخلايا مع الماعز المضادة للأرنب والمضادة للماوس مفتش الأضداد مترافق مع اليكسا فلور 405 (500X التخفيف في حل حجب)، اليكسا فلور 488 (1،000x) أو فلور اليكسا 568 صبغ (500X) لمدة 60 دقيقة في RT. تم غسلها مع برنامج تلفزيوني والملاحظة المباشرة في برنامج تلفزيوني. في بعض الثقافات، وبعد غسل النهائي في الإجراءات المذكورة أعلاه، تم علاج الخلايا مع هويشت 33342 عند 0.5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT، وغسلها مع برنامج تلفزيوني قبل مراقبة. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 13
الرقم 13. Immuتحديد nocytochemical من أنواع الخلايا الدبقية الثقافات في طبقة وحدة التغذية. الأخت الثقافات من الفئران طبقات المغذية الدبقية كما في الشكل 12، ولكن من دون الطلاء من الخلايا العصبية الماوس. (A) تلطيخ باستخدام إجراءات immunocytochemical هو موضح في الشكل 12A. وتظهر حقلين صورة تمثيلية. (B) تلطيخ طبقة المغذية الدبقية باستخدام إجراءات immunocytochemical وصفها في A، ولكن مع الأجسام المضادة الأولية حذف. تم الحصول على جميع الصور MAP2 في أرقام 12A و13A، B في ظل ظروف التصوير نفسها، وتظهر في نفس الصورة النقيض للسماح المقارنة بين شدة. واستخدمت نفس الإجراءات للصور GFAP في أرقام 12A و13A، B. تم تصوير ثقافة الطبقة المغذية الدبقية على نفس يوم الثقافات في الشكل (12). وهكذا فإن طبقات المغذية الدبقية في 13 مثقف في المختبر لنفس المقدار من الوقت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 14
الرقم 14. كثافة تلطيخ immunocytochemical. ووضعت خطوط على الصور المعروضة في أرقام 12 و 13، وتآمر كثافة على طول هذه. وتبين إدراجات الصور في الصف العلوي من الشكل 12A. وكانت الشروط الثلاثة: 1) الطلاء من خلايا فأر (التي تحتوي على الخلايا العصبية) على طبقة المغذية الفئران وتلطيخ مع الأجسام المضادة الأولية (الخلية العصبية +، الدبقية +، 1 ° أب +)، 2) طبقة المغذية الدبقية فقط (وليس طلاء الخلايا العصبية) وتلطيخ مع الأجسام المضادة الأولية (الخلية العصبية -، الدبقية +، 1 ° أب +)، و 3) تغذية الدبقيةإيه طبقة فقط (وليس طلاء الخلايا العصبية) وتلطيخ دون الأجسام المضادة الأولية (الخلية العصبية -، الدبقية +، 1 ° أب -). كان تلطيخ الخلايا العصبية (MAP2) الحالي فقط عندما كانت مطلية خلايا فأر (شروط 1 مقابل 2)، وكان تلطيخ الدبقية (GFAP) موجودة في كلتا المجموعتين من الثقافات (شروط 1 مقابل 2). وكان تلطيخ immunocytochemical محددة لكلا الأجسام المضادة الأولية (شروط 1 مقابل 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

SOLUTIONS
TAE عازلة (50X الحل)
قاعدة تريس، 486 غرام
حمض الخليك الجليدي، 114.2 مل
0.5 M EDTA، ودرجة الحموضة 8.0، 200 مل
إضافة الماء المقطر لجلب الحجم الإجمالي إلى 2 L
الماكياج في غطاء الدخان الكيميائية.
تمييع 50 أضعاف قبل الاستخدام.
حل هانكس "
أملاح المتوازنة هانكس "، دون كلوريد الكالسيوم وسلفات المغنيسيوم وبيكربونات الصوديوم (لمدة 1 L)
NaHCO 3، 350 ملغ (تركيز النهائي 4.17 ملي)
HEPES، 2.38 ز (تركيز النهائي، 10 ملي)
ضبط لدرجة الحموضة 7.4 باستخدام 5 M هيدروكسيد الصوديوم.
ضبط الأسمولية إلى 310 الميلي أسمول استخدام السكروز (الأسمولية يميل إلى ~ 290 الميلي أسمول دون أي تعديل).
إضافة الماء المقطر لجلب الحجم الإجمالي إلى 1 L
حل الهضم (لتلقي العلاج التربسين من أنسجة المخ)
كلوريد الصوديوم، 800.6 ملغ (تركيز النهائي، 137 ملي)
بوكل، 37.3 ملغ (وتركيز إينال، 5 ملي)
نا 2 هبو 4 · (7H 2 O)، 187.6 ملغ (تركيز النهائي، 7 ملم)
HEPES، 595.8 ملغ (تركيز النهائي، 25 مم)
الجلوكوز، 97.3 ملغ (تركيز النهائي، 5.4 ملي)
ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام 5 M هيدروكسيد الصوديوم.
الأسمولية تميل إلى ~ 310 الميلي أسمول دون أي تعديل.
إضافة الماء المقطر لجلب الحجم الإجمالي إلى 100 مل.
الحق قبل الاستخدام، وإضافة 20 ملغ من التربسين (تركيز النهائي من 10 ملغ / مل) و 20 ميكرولتر من الدناز (تركيز النهائي من 750 وحدة / مل) إلى 2 مل من محلول الهضم.
الحل تفارق (لتفارق الميكانيكية للأنسجة المخ)
حل هانكس "
MgSO 4 · (7H 2 O)، 295.1 ملغ (concentrati النهائيعلى، 11.97 ملي)
ضبط الأسمولية إلى 310 الميلي أسمول استخدام السكروز.
إجمالي حجم 100 مل.
الحق قبل الاستخدام، وإضافة 20 ميكرولتر من الدناز (تركيز النهائي من 750 وحدة / مل) إلى 2 مل من محلول التفكك.
تصفيح متوسطة 1 (للخلايا الدبقية الماوس)
Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM)، 449.5 مل
MITO + سيروم موسع، 0.5 مل
FBS، 50 مل
إجمالي حجم 500 مل.
تصفيح المتوسطة 2 (لالخلايا العصبية الماوس)
Neurobasal-A، 485 مل
B27، 10 مل
GlutaMAX-I، 5 مل (تركيز النهائي، 2 مم)
إجمالي حجم 500 مل.
تصفيح متوسطة 3 (للالخلايا العصبية الفئران والخلايا الدبقية)
وسائل الإعلام الحد الأدنى الأساسي (MEM، دون أحمر الفينول)
الجلوكوز، 2.5 غرام (تركيز النهائي، 27.8 مم)
NaHCO 3، 100 ملغ (تركيز النهائي، 2.38 ملي)
ترانسفيرين، 50 ملغ
FBS، 50 مل
GlutaMAX-I، 5 مل (تركيز النهائي، 2 مم)
الأنسولين، 12.5 ملغ
إجمالي حجم 500 مل.
متوسطة النمو (للالخلايا العصبية الفئران والخلايا الدبقية)
MEM (بدون أحمر الفينول)
الجلوكوز، 2.5 غرام (تركيز النهائي، 27.8 مم)
NaHCO 3، 100 ملغ (تركيز النهائي، 2.38 ملي)
ترانسفيرين، 50 ملغ
FBS،25 مل
GlutaMAX-I، 1.25 مل (تركيز النهائي، 0.5 ملي)
B27 أو NS21 {تشن، 2008 # 2399}، 10 مل
β-D-arabinofuranoside السيتوزين (أراك)، 0.56 ملغ (تركيز النهائي، 4 ميكرومتر)
إجمالي حجم 500 مل.
التعليقات العامة
وسائل الإعلام ثقافتنا لا تحتوي على المضادات الحيوية لأنها يمكن أن تمارس الآثار السامة للخلايا على الخلايا المستزرعة الدبقية والخلايا العصبية (المرجع 70، 71). هذا يجعل من المهم وخصوصا على الانضمام إلى عقيمة الإجراءات في العمل ذات الصلة الثقافة.
انظر جدول الكواشف لمصادر التفصيلية للمواد الكيميائية.

الجدول 1. حلول

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول المعروضة هنا يشمل إجراءات الوشم لتسمية / تحديد الفئران، لالتنميط الجيني الفئران من نصائح الذيل، وزراعة الخلايا العصبية مخ الفأر في منخفض الكثافة. في جولة واحدة من التجارب باستخدام 6-8 الجراء، وعادة ما تتطلب هذه الإجراءات ~ 0.5 ساعة، ~ 4 ساعة و ~ 2 ساعة، على التوالي، في ما مجموعه 6-7 ساعة. هذا يجعل من عملية لالمجرب واحد لاستكمال جميع الإجراءات اللازمة من وقت ولادة الجراء "إلى الطلاء من الثقافات العصبية - في أقل من يوم عمل واحد (باستثناء إعداد مسبق من طبقات المغذية الدبقية).

الوشم

تحديد المدى الطويل من الحيوانات ضروري لأغراض التكاثر والدراسات العلمية مثل تحليل الأنسجة، وظيفة الخلية وسلوك الحيوان. الوشم الحيوانات حديثة الولادة هو مفيد لأنه يمكن تنفيذها بسرعة ويدوم لفترة طويلة من حياة الحيوان 7،22-25. تييمكن attooing على منصات مخلب يكون أفضل من اصبع القدم لقطة 23 فيما يتعلق بالحفاظ على سلوكيات قابلة للاختبار، على سبيل المثال في تعليق أو التي تجتاح 22،26، على الرغم من أن بعض الدراسات لم يلاحظ هذا القصور (على سبيل المثال، 25). لم تكن هناك حالات من الأمهات رفض أو تفكيكها الجراء بعد الوشم. للحصول على طرق أخرى لإثبات الهوية على المدى الطويل للحيوانات، انظر أحدث التعليقات 7،23،24.

التنميط الجيني

وهناك ميزة حاسمة في بروتوكول لدينا هو استخدام طريقة التنميط الجيني السريع. على الرغم من أن وصفت أساليب التنميط الجيني مماثلة في التقارير السابقة (على سبيل المثال، 27،28)، ونظام الموصوفة هنا اثنين على الأقل من التحسينات. أولا، يمكن أن تتسامح مع بعض الاختلافات في كمية بدءا الأنسجة، وعمر الحيوانات، وطول amplicon. وبالتالي، لا يمكن أن يتحقق التنميط الجيني ناجحة باستخدام الفئران الشابة مثل 1 يوم وقديمة قدم 6 أشهر من العمر، ويمكن القيام بها باستخداممجموعة واسعة من أزواج التمهيدي. الثانية، وهذه الطريقة لا تتطلب الحل محطة للخطوة استخراج الحمض النووي. هذا يلغي التعامل أنبوب المفرط وpipetting ل، ويسمح مواز الأتمتة متعددة أنبوب للعملية مع جهاز PCR. يمكن تحجيم عدد من العينات لأعلى (على سبيل المثال، 96 عينات) بعد تجهيزها بسهولة في وقت واحد. أيضا نوع العينة لا يقتصر على مقاطع الذيل. أنواع العينة الأخرى التي يمكن استخدامها وتشمل اللكمات الأذن، قصاصات اصبع القدم والأجنة المبكرة كلها، والأنسجة المشيمة 2-4،29،30. ويمكن أيضا أن تستخدم أنواع الحيوانات المختلفة. وبالتالي فإن إجراءات التنميط الجيني يمكن الاعتماد عليها (للتكرار مع انخفاض داخل فحص التباين) وقابلة للتكرار (منخفض التباين بين الفحص بين أشواط أو بين المختبرات)، ولها ميزة قابلية عالية.

لاحظ أن بعض الحذر مطلوب لتحقيق الجودة المتوقعة من النتائج. أولا، خلال استخراج الحمض النووي، وتفاوت كبير في البروتوكول يمكن أن تتحلل النتائج.على سبيل المثال، انخفاض كبير في حجم استخراج الحمض النووي الحل (على سبيل المثال، 200-100 ميكرولتر في الخطوة 2.2) لا يزال يسمح التنميط الجيني، لكنها يمكن أن تقلل من الموثوقية ويؤدي إلى تباين في نتائج PCR. في ظل هذه الظروف، فمن المستحسن للحد من حجم استخراج DNA 4-2 ميكرولتر، وزيادة حجم H 2 O من 2 إلى 4 ميكرولتر للتعويض عن تغيير الصوت أثناء ردود الفعل PCR (الخطوة 2.5). ثانيا، في نهاية استخراج الحمض النووي، والحل يمكن استخدامها لPCR فورا دون الطرد المركزي في معظم الحالات، على الرغم من أن الذيل ستحتفظ هيكلها العام ولن تتحلل تماما. ومع ذلك، فإن انعكاس وصف من الأنابيب ضروري لغرض الانفصال الجيني DNA من الأنسجة (الخطوة 2.4). ومن المهم أيضا استخدام الجزء العلوي، وجزء واضح من الحل، باستثناء الحطام في الجزء السفلي من الأنبوب، لأن إدراج هذا الأخير سوف يؤدي إلى نتائج غير حاسمة PCR. هذهسوف الخطوات تكون فعالة مع الحد الأدنى من الوقت والجهد. على قدم المساواة نتائج جيدة ويمكن الحصول على قبل vortexing بنشاط العينة (بدلا من العكس)، يليه الطرد المركزي واستخدام طاف. ثالثا، بعد استخراج الحمض النووي، ويمكن تخزين الحمض النووي على المدى الطويل (على سبيل المثال،> أسبوعين). فمن المستحسن أن أجهزة الطرد المركزي الحل باستخدام ميكروسنتريفوج (على سبيل المثال، 3،000-13،000 غرام عند 4 درجات مئوية لمدة 2 دقيقة)، ونقل supernatants لأنابيب جديدة، وتخزينها في -80 ° C. عندما استخراج تخزينها لاستخدامها لالتنميط الجيني، أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة العينة بعد ذوبان الجليد، واستخدام طاف.

الثقافات العصبية

ميزة حاسمة أخرى من بروتوكول لدينا هو استخدام طبقة المغذية الدبقية لإنشاء الثقافات العصبية في مناطق ذات كثافة الطلاء منخفضة. عادة، في الثقافات الأولية من الخلايا العصبية في الدماغ في الثدييات، ومطلي الخلايا مع كثافة عالية نسبيا، coverslips على المغلفة دون الدبقيةطبقة المغذية ل (على سبيل المثال، 31-39). عندما يتم خفض كثافة الطلاء من الخلايا العصبية باستخدام هذه الطريقة، وعدم الأولي ورقة الدبقية يؤدي إلى ضعف نمو الخلايا العصبية والإرشاد شجيري (لوحات B، C في أرقام 8-10)، كما ذكرت سابقا 40-42، وربما بسبب ضعف الدبقية 43،44 النمو.

يمكن أن تتولد ناجحة، منخفض الكثافة الثقافات العصبية لا يقل عن ثلاثة أنواع واسعة من الأساليب. في نهج واحد، ويستخدم Neurobasal المتوسطة كوسيلة الثقافة. هذا يجعل من الممكن الخلايا العصبية الثقافة في ظل عدم وجود طبقة المغذية الدبقية، ويمكن استخدامها لمنخفض الكثافة الثقافات العصبية 45،46. في النهج الثاني ('من نوع بانكر "وتعديله)، الخلايا الدبقية هي شارك في تربيتها مع الخلايا العصبية في نفس البئر ولكن يتم فصل جسديا منها. في هذا السياق توفر الخلايا الدبقية "دعم غذائي" إلى الخلايا العصبية من دون الاتصال بهم مباشرة1،41،42،47-49. في نهج ثالث، ومطلي الخلايا العصبية على طبقة المغذية الدبقية محددة مسبقا التي تدعم نمو الخلايا العصبية (على سبيل المثال، 50-53) (أرقام 8-10). على وجه التحديد، ومطلي الخلايا العصبية في الدماغ الماوس على طبقة المغذية الدبقية المحضرة من الفئران 8،34،54 أو الفئران 41،55،56.

نحن نفضل الأخير من النهج الثلاثة للثقافة منخفض الكثافة، لأن Neurobasal المتوسطة يمكن أن تؤثر على بقاء الخلايا العصبية 57، فإن الخلايا الدبقية نجمي يكون أساسيا في تنظيم وظائف الخلايا العصبية 8،58، والاتصال الجسدي بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية قد يكون أهمية. إجراءات لزراعة الخلايا الدبقية الماوس والفئران متشابهة 59،60، لكننا قد عدلت عليها قليلا لاستيعاب لنمو أكثر سرعة في المختبر من خلايا فأر فأر مقابل الدبقية. تم تعديل إجراءات لزراعة الخلايا الفئران 61-63. استخدام المغذية لاي الدبقيةص لمنخفض الكثافة الثقافات العصبية يجعل من الضروري لأداء التنميط الجيني السريع، وذلك لتتناسب مع التركيب الوراثي للطبقة المغذية إلى أن من الخلايا العصبية في غضون الفترة بين الولادات الجراء "وفيات حديثي الولادة أو نهاية نافذة الثقافة (1 -2 أيام بعد الولادة).

ثقافة منخفض الكثافة على طبقة المغذية الدبقية هي أيضا وسيلة هامة عند واحد يحاول أن الخلايا العصبية ثقافة نواة صغيرة في الدماغ (على سبيل المثال، بين الافراج عن بافراز coeruleus مكان، وبين الافراج عن الدوبامين المادة السوداء). تلك النواة تحتوي إلا على عدد صغير من الخلايا العصبية، وسوف تسفر لا محالة الثقافات منخفض الكثافة 64-67.

يتم إعداد الثقافات الأولية بشكل روتيني في مختبرنا من المنطقة CA3-CA1 من الحصين، ومنطقة المحرك من القشرة الدماغية والجسم المخطط من الفئران. ويمكن استخدام نفس الإجراءات لإعداد الثقافات العصبية التي تمثل مناطق الدماغ الأخرى، على سبيل المثال الحصين كله (بما فيuding التلفيف المسنن) والقشرة المخية بأكملها. الخلايا العصبية الفئران من مناطق الدماغ مثل الحصين وcoeruleus موضع يتم تربيتها بطريقة مماثلة، وذلك باستخدام طبقة الفئران الدبقية المغذية. وعادة ما تستخدم هذه الخلايا العصبية مثقف في 1-4 أسابيع في المختبر، مع سن الدقيق للثقافة اعتمادا على الغرض من التجربة. ومن الجدير بالملاحظة أن بعض الخلايا العصبية مثقف على طبقة المغذية الدبقية يمكن البقاء على قيد الحياة لأكثر من 10 أسابيع 34،68.

مشكلة واحدة محتملة من منخفض الكثافة الثقافات العصبية هي أن خصائص الخلايا العصبية يمكن أن تكون مختلفة عن تلك الموجودة في الثقافات عالية الكثافة أو في الخلايا العصبية في الموقع. المقارنة بين هذه النظم توفر فرصة مثيرة للاهتمام لدراسة كيفية تطوير ونضوج الخلايا العصبية تتأثر بعوامل متعددة، مثل كثافة الخلايا العصبية، والعوامل القابلة للذوبان يفرز من الخلايا العصبية، الخلايا العصبية الاتصال إلى الخلايا العصبية، والتفاعلات الدبقية العصبية.

وباختصار، فإن tattooiوضع العلامات الماوس مقرها نانوغرام هو طويلة الأمد، وطريقة التنميط الجيني سريعا، ويسمح للثقافة طريقة لطلاء الخلايا العصبية الماوس في منخفض الكثافة. بروتوكول الموصوفة هنا يمكن تطبيقها في مجملها إلى الأنواع الحيوانية الأخرى بإيواء الطفرات الوراثية الأخرى. وعلاوة على ذلك، الخطوات الفردية للبروتوكول يمكن أن تستخدم لأغراض أخرى. وهكذا فإن بروتوكول يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات على أساس الاحتياجات المجربون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS - tattooing
Machine Cleanser Animal Identification and Marking Systems, Inc. NMCR3 This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent Animal Identification and Marking Systems, Inc. NDAR4 This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment Animal Identification and Marking Systems, Inc. NBP01
Skin Prep Applicator Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSPA1 Q-tip.
Skin Prep solution Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSP01 This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format) EZ BioResearch LLC G2001-100
2X PCR Ready Mix II EZ BioResearch LLC G2001-100 A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial VWR BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade rpi A20090-500  We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA) Fisher BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl Dot Scientific Inc UG104-96RS  Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl Dot Scientific Inc UG2020-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl Dot Scientific Inc UG2812-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp EZ BioResearch LLC L1001 We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp EZ BioResearch LLC L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder GIBCO-Invitrogen 10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml  USA Scientific 1402-2900 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual  rpi 145660 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural USA Scientific 1605-0000 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO GIBCO-Invitrogen S33102
Tris base rpi T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100MG See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement GIBCO-Invitrogen 17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated BD falcon 353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml BD falcon 353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml BD falcon 353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml BD falcon 352095
Countess (cell number counter) chamber slides GIBCO-Invitrogen C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride) Sigma-Aldrich C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC) Sigma-Aldrich G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm Pyrex 3160-101
Distilled water GIBCO-Invitrogen 15230-147
DNase Type II Sigma-Aldrich D4527-200KU Stock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate GIBCO-Invitrogen 10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 569-0020
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO-Invitrogen 26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0 Carolina 633017
GlutaMAX-I GIBCO-Invitrogen 35050-061
Hanks' Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma-Aldrich H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent Sigma-Aldrich 258148-100 ML
Insulin Sigma-Aldrich I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka) Sigma-Aldrich 63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free BD Biosciences 356237 This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM) GIBCO-Invitrogen 51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml BD Biosciences 355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate BD falcon 353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate BD falcon 353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid GIBCO-Invitrogen 10888-022
Nitric Acid VWR bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21  prepared in the lab Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”  Fisher 13-678-6A Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”  Fisher 13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0% Sigma-Aldrich P9333-500G
Serological pipet, 2 ml BD falcon 357507
Serological pipet, 5 ml  BD falcon 357543
Serological pipet, 10 ml BD falcon 357551
Serological pipet, 25 ml BD falcon 357525
Serological pipet, 50 ml  BD falcon 357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis Sigma-Aldrich 480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich Sigma-Aldrich 431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC) Sigma-Aldrich S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm Corning 431219
Syringe, 3 ml BD falcon 309585
Transferrin, Holo, bovine plasma Calbiochem 616420
Trypan Blue stain, 0.4% GIBCO-Invitrogen T10282 This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI Sigma-Aldrich T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%  GIBCO-Invitrogen 25200-056
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2 Merck Millipore AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail Merck Millipore NE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMS Animal Identification and Marking Systems, Inc. NEO–9 This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GT BIO–RAD 170–4405 Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800 ProteinSimple FluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal Cycler BIO-RAD PTC-1148EDU Our PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac Basic BIO-RAD 164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, Countess GIBCO-Invitrogen C10310 This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2 NUAIRE NU-425-400 This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water Jacket NUAIRE NU-4850
Horizontal Clean Bench NUAIRE NU-201-330 This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed Shaker Labnet S2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifuge Fisher 46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793 (2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034 (2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245 (2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. , e626 (2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. , e3844 (2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87 (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895 (2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. , e2373 (2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. , e2389 (2011).
  36. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. , e3634 (2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. , e3965 (2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012 (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. , e3257 (2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. , e2111 (2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633 (2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M. Ch. 18. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).

Tags

علم الأعصاب، العدد 95، AP2، التنميط الجيني، طبقة المغذية الدبقية، وذيل الماوس، ثقافة العصبية، واستخراج النووي الحمضية، PCR، والوشم، torsinA
رابيد التنميط الجيني للحيوانات تلاه إنشاء الثقافات الأولية من الخلايا العصبية في الدماغ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., … More

Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter