Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Rapid Genotypebestemmelse af dyr Efterfulgt af Etablering primære kulturer af hjerneneuroner

doi: 10.3791/51879 Published: January 29, 2015
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver procedurer for mærkning og genotypebestemmelse nyfødte mus og generere primære neuronale kulturer fra dem. Genotypebestemmelse er hurtig, effektiv og pålidelig og giver mulighed for automatiseret nukleinsyre-ekstraktion. Dette er især nyttigt for neonatally dødbringende mus og deres kulturer, der kræver forudgående afslutning af genotypning.

Abstract

Høj opløsning analyse af morfologi og funktion af pattedyr neuroner kræver ofte genotypebestemmelse af de enkelte dyr, efterfulgt af en analyse af primære kulturer af neuroner. Vi beskriver en række procedurer for: mærkning nyfødte mus, der skal genotypebestemmes, hurtig genotypning, og oprettelse af lav densitet kulturer af hjernens neuroner fra disse mus. Individuelle mus er mærket med tatovering, der giver mulighed for langvarig identifikation varig ind i voksenalderen. Genotypebestemmelse af den beskrevne protokol er hurtig og effektiv, og giver mulighed for automatiseret ekstraktion af nukleinsyre med god pålidelighed. Dette er nyttigt under omstændigheder, hvor tilstrækkelig tid til konventionel genotypning ikke er tilgængelig, f.eks, i mus, der lider af neonatal dødelighed. Primære neuronale kulturer genereres ved lav densitet, hvilket muliggør billeddannelse eksperimenter ved høj rumlig opløsning. Denne kultur fremgangsmåde kræver fremstilling af gliale fødelag før neuronal plating. Protokol anvendes i sin helhed til en musemodel af bevægelsen uorden DYT1 dystoni (AE-Torsina knock-i mus), og neuronkulturer fremstilles fra hippocampus, cerebral cortex og striatum af disse mus. Denne protokol kan anvendes til mus med andre genetiske mutationer, såvel som andre dyr. Desuden kan de enkelte komponenter i protokol bruges til isolerede delprojekter. Således denne protokol vil have brede programmer, ikke kun i neurovidenskab, men også på andre områder af biologiske og medicinske videnskaber.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Gnavermodeller for genetiske sygdomme har vist sig nyttige for fysiologiske funktioner normale proteiner og nukleinsyrer samt de patofysiologiske konsekvenser af defekter i disse. Eksempler indbefatter mus deficiente for proteiner involveret i vigtige cellulære funktioner, samt musemodeller for lidelser, såsom Alzheimers sygdom. Imidlertid kan visse genetiske manipulationer føre til neonatal letalitet kort eller nogle få dage efter fødslen. I disse tilfælde primære cellekulturer er et vigtigt redskab, fordi levende celler kan opnås fra de embryonale eller neonatale hvalpe før døden, kan de opretholdes i mindst et par uger in vitro, og i denne periode tidlige neuronal udvikling kan følges af biokemiske, funktionelle og morfologiske forsøg. For de primære kulturer, kan det være gavnligt at pladen neuroner ved lav densitet; dette gør det muligt at visualisere den enkelte somata, dendritter, axonale aksler og nerve terminaler med høj rumlig opløsning. Imidlertid kræver typisk overlevelse og differentiering af neuroner ved lav densitet, at de er belagt på en glial fødelag, co-dyrket med gliaceller i fravær af fysisk kontakt med dem eller dyrket i medium konditioneret med glia 1.

Etableringen af ​​low-density neuronale kulturer på gliale fødelag kan være afhængig af hurtig og pålidelig genotypebestemmelse forhånd - inden for et par timer i modsætning til et par dage. Hastighed er især vigtigt, når den neuronale genotype skal modsvares med den for en glial fødelag forberedt på forhånd. Som et mere praktisk eksempel kan det være nødvendigt at bestemme, hvilke unger af hvilken genotype til anvendelse ved generering kulturer, for at optimere effektiviteten af ​​et eksperiment.

Her demonstrere vi arbejder protokol, der er blevet brugt til hurtig, forenklet og pålidelig mus genotypning i tidligere udgivelser 2-6. Mus haler oget kommercielt tilgængeligt kit anvendes. Denne protokol omfatter enkelt-trins ekstraktion af nukleinsyrer fra vævet, og som hverken kræver en nukleinsyre-oprensningstrin eller anvendelse af en afslutning buffer ("stop opløsning"). Pålideligheden af ​​denne genotypebestemmelse metode illustreres ved at præsentere resultaterne af en række tests, hvor forskellene bliver introduceret i forhold til grundbeløbet for prøverne, at dyrenes alder og længden af ​​PCR-amplikonerne. Dette sæt giver fordelene ved automatiseret ekstraktion og pålidelighed.

Af hensyn til at være omfattende, er anvendelsen af ​​tatovering langsigtet identifikation af genotypede mus også påvist. Tatovering opnås ved at anvende tatovering blæk til dermis i huden (under epidermis) 7. En fremgangsmåde er beskrevet til tatovering af trædepuder på nyfødte eller 1 dag gamle mus, selv om tatoveringer kan anvendes på andre dele af kroppen, såsom haler og tæer, og Animals i alle aldre. Desuden vil procedurer påvises for udpladning og dyrkning mus neuroner ved en lav massefylde, baseret på optimeret fremstilling af forskellige typer af glia fødelag 2,8.

Vi bruger en genetisk musemodel af den nedarvede neurologiske lidelse DYT1 dystoni - en autosomal dominerende bevægelse lidelse forårsaget af en mutation i genet TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. Det kodede protein, Torsina, tilhører de "ATPaser forbundet med diverse cellulære aktiviteter" (AAA +) familie af proteiner, hvis medlemmer normalt udfører chaperone-lignende funktioner, som bistår i: proteinudfoldning, protein-kompleks demontering, membran handel og vesikelfusion 10-13. De mutationen resulterer i en i-ramme deletion af en codon for glutaminsyre, og kan føre til manifestation af 'tidlig debut generaliseret isoleret dystoni' 14,15. Men stienophysiological mekanismer, der er ansvarlige for denne lidelse er fortsat dårligt forstået. I en knock-in musemodel, mutantallelen er Tor1a tm2Wtd, nævnt i det følgende som Tor1a AE. Heterozygot AE-Torsina knock-i mus er levedygtige og genetisk efterligne menneskelige patienter med DYT1 dystoni, hvorimod homozygot knock-i mus dør efter fødslen 16,17, med latenstiden til postnatal død påvirket af genetisk baggrund 18. Den tidlige død homozygot knock-i mus kræver, at både genotypebestemmelse af dyr og etablering af neuronale kulturer afsluttes hurtigt. Som et andet eksempel på genotypebestemmelse Tfap2a (transkriptionsfaktor AP-2α, aktiverende enhancer protein 2α) vil blive anvendt. Proteinet kodet af dette gen er vigtig i reguleringen af flere cellulære processer, såsom proliferation, differentiering, overlevelse og apoptose 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BEMÆRK: Alle dyreforsøg udført i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Iowa.

1. Langsigtet Identifikation af mus under anvendelse tatoveret trædepuder

  1. Immobilisere en pote med paw pad (plantare overflade) vendende eksperimentatoren. Hold pote med tommel- og pegefinger. Pas på ikke at klemme poten.
    BEMÆRK: Stabil immobilisering er vigtigt at sikre, at tatovering pigment placeres i dermis af poten pad, og er således permanent 7.
  2. Aftør pote puden med 70% ethanol på en gaze svamp eller vatpind.
  3. Påfør huden olie til en bomuld spids applikator, og tryk forsigtigt spidsen mod overfladen af ​​paw pad flere gange. Brug kun en lille mængde af hudfedt; når de findes i store mængder, vil det forhindre tatovering pigment i at nå huden.
  4. Dyp spidsen af ​​tatovering nåle ind i tatovering blæk lige førtil tatovering. Brug rent aseptisk og skarpe tatovering nåle, for at mindske smerte og mulighed for infektion og også at øge tatovering effektivitet.
  5. Mens pote pad overflade er dækket med huden olie, skal du trykke på tatovering nål tips lodret og let mod huden i midten af ​​poten pad, og injicere blæk flere gange. Se tabel for Materialer / Udstyr til oplysninger om elektrisk tatovering system.
  6. Spray 70% ethanol på en gaze svamp, tryk forsigtigt den mod poten for at fjerne ekstra tatovering pigment på hudoverfladen, og inspicere kvaliteten af ​​tatovering. Kontroller, at midten af ​​pote pad har en mørk, rund plet, der adskiller sig fra normal hud pigmentering. Hvis tatoveringen ikke er mørk eller stor nok til nem visning, skal du gentage de tidligere tatovering trin.

2. Genotypebestemmelse nyfødte mus Brug af en Fast PCR Genotypebestemmelse Kit

  1. Desinficere den distale ende af en mus hale med 70% ethanol, skæres 5 mm eller mindre af halentip og overføre det til et rør af et 8-rør strimmel af den type, der anvendes til PCR. Brug en un-brugt barberblad for hver hvalp at undgå krydskontaminering mellem prøver. Alternativt bruge en saks, men i dette tilfælde, omhyggeligt og grundigt at fjerne de resterende væv på vingerne ved hjælp af 70% ethanol. Check for blødning. Hvis der opstår blødning, lægge pres på den udskårne del af halen med en gaze svamp, indtil blødningen er stoppet.
  2. Tilsæt 200 pi DNA Extraction Solution hvert PCR-rør indeholdende en prøve. Se tabel for Materialer / Udstyr til dets sammensætning og oplysninger om sættet.
  3. Glasset anbringes strimlen i en PCR thermocycler og starte DNA-ekstraktion ved anvendelse af følgende program: 1 cyklus ved 55 ° C i 10 minutter, 1 cyklus ved 95 ° C i 10 minutter, og holde ved 4 ° C.
    BEMÆRK: Dette er det samme PCR thermal cycler, der senere anvendes til PCR.
  4. Efter at DNA-ekstraktion er færdig, skal du fjerne røret strimmel fra den termiske cycler and invertere 5 gange.
  5. Overfør 4 pi af opløsningen (dna-ekstrakt) af hver prøve til en un-anvendte rør af en 8-rør strimler, og blandes med: 10 pi 2X PCR Ready Mix II, 2 pi af blandet frem & reverse primere (anbefales 0,5 um; se tabel Materialer / Udstyr til sekvenser), og 4 pi nuklease-fri H 2 O, for hver prøve. Spin kortvarigt (f.eks 3 sek) ved anvendelse af en tabel-top centrifuge. Hold rørene på is hele tiden, undtagen når håndtering.
  6. Udfør termisk cykling. Se Tabel over Materials / Udstyr til den termiske program.
  7. Detect de amplificerede DNA-produkter. Læg samlede reaktionsopløsning fra PCR (20 pi) direkte ind i en brønd i en agarosegel. Læg molekylvægtmarkører i en separat brønd. Påfør et elektrisk felt.
  8. Anskaf fluorescens billeder af bands under ultraviolet lys.

3. Primær Culture of Mouse Brain Neurons på Glial feederlag

BEMÆRK: Procedurerne for hjernen dissektion og celledissociering (3.1) er fælles for alle de efterfølgende procedurer. Procedurerne for mus glial kulturer (3.2), rotte gliale kulturer (3.3) og mus neuronkulturer (3.4) er beskrevet særskilt bagefter.

  1. Brain Dissektion og Cellular Dissocaiation
    1. Ofre en mus eller rotte pup ved halshugning, hurtigt fjerne hjernen, og placere den i Hanks 'opløsning (se tabel 1 for sammensætning) + 20% føtalt bovint serum (FBS) i en 35 mm skål (holdt på is).
    2. Skær hjernen gennem midterlinjen i to halvkugler. Fjern regionen af interesse (f.eks cerebral cortex, striatum og hippocampus) fra hver hjernehalvdel. Fjern meninges og store blodkar fra overfladen. Skær hjernen regionen i 4-10 tynde skiver ved hjælp af en kirurgisk kniv.
    3. Skyl hjerneskiver i et 15 ml centrifugerør, når with Hanks 'opløsning + 20% FBS, derefter 3 gange med Hanks' opløsning (dvs. uden serum) (alle ved 4 ° C). At skylle, tilsættes opløsning 5-10 ml, lad hjerneskiver sig på bunden af ​​røret, aspireres opløsningen fra toppen, og tilføje en frisk opløsning. Afslut skylning procedure ved at aspirere løsningen.
    4. Filter 2 ml trypsin-holdige fordøjelse opløsning (se tabel 1 for sammensætning) anvendelse af en 3 ml sprøjte og et 0,2 um sprøjtefilter, og tilsæt filtratet direkte ind i rør indeholdende hjernen skiver. Lad trypsinisering fortsætte i 13 min ved stuetemperatur.
    5. Neutraliseres trypsin løsning først ved sugning mest af det og derefter ved tilsætning af 7-10 ml af Hanks 'opløsning + 20% FBS (4 ° C).
    6. Skyl hjernen skiver, to gange med Hanks opløsning + 20% FBS, og derefter tre gange med den Hanks opløsning (dvs. uden serum) (alle ved 4 ° C). Afslut skylning procedure ved at aspirere den solution.
    7. Filter 2 ml af dissociation opløsning (se tabel 1 for sammensætning) ved hjælp af en 3 ml sprøjte og en 0,2 um sprøjtefilter, og tilsæt filtratet direkte til røret med hjernen skiver.
    8. Mekanisk dissociere cellerne ved forsigtigt triturering 10-20 gange, indtil synlige vævsstykker forsvinde. Brug en bomuld-sluttet, brand-poleret Pasteur pipette og undgå at lave bobler under findeling.
    9. Vent 3 min til små stykker for at slå sig ned.
    10. Overfør størstedelen af ​​opløsningen (~ 1,5 ml, hvorefter nogle løsning forneden) til et 15 ml centrifugerør, der indeholder 3 ml Hanks opløsning + 20% FBS-opløsning (4 ° C) ved anvendelse af bomuld sluttet, brand- poleret Pasteur pipette. Overfør ikke hele opløsningen fordi Inkluderingen af ​​disse sediment i bunden typisk resulterer i forringelse af kulturen.
    11. Centrifuger i 13 minutter ved ~ 185 g (~ 1.100 rpm) ved 4 ° C.
    12. Aspirer supernatanten forsigtigt,tilsættes 1 ml forvarmet udpladningsmedium (37 ° C) til pelleten, og resuspender det ved forsigtigt at pipettere flere gange ved hjælp af bomuld sluttet, flammepoleret Pasteur-pipette.
      BEMÆRK: Tre forskellige typer plating medier anvendes til forskellige kultur formål: udpladningsmedium-1 for mus gliaceller, udpladningsmedium-2 for mus neuroner, og udpladningsmedium-3 for rotte neuroner og gliaceller (se tabel 1 for kompositioner) .
    13. Tag 10 pi af cellesuspensionen, bland det med 10 pi 0,4% trypanblåt-opløsning og måle tætheden af ​​levende celler under anvendelse af enten et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller.
  2. Mus Glia kulturer
    1. Vask dækglas at etablere sunde kulturer af museceller.
      1. Nedsænk dækglas (runde, diameter 12 mm) i 70% salpetersyre i et glas petriskål. Beskyt mod lys ved hjælp af aluminiumsfolie, og læg den på en orbitalryster O / N.
      2. Skyl glasset coverslips i petriskålen mindst tre gange med destilleret vand. Fordyb dem i destilleret vand. Skålen på en orbitalryster O / N.
      3. Tør dækglassene på et Whatman 150 mm filterpapir i biologisk sikkerhedsskab.
      4. Autoklaver dækglassene.
      5. Placer dækglas i 24-brønds dyrkningsplade.
    2. Label og genotype nyfødte mus ifølge trin 1 og 2.
    3. Opnå hjerneceller fra museunger, ifølge trin 3.1.
      BEMÆRK: Anvendelse af hjernebarken er typisk til fremstilling af musen gliale fødelag. Men andre hjerneregioner, såsom hippocampus og striatum, vil arbejde efter korrekt tilpasning af celledensitet på grund af forskellige numre og udbyttet af celler fra forskellige regioner.
    4. Tilføj ~ 4 ml forvarmet udpladningsmedium-1 til den endelige cellesuspension (~ 1 ml). For præ-opvarmning dyrkningsmedier placere opløsningen i kultur inkubator (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N tiltillade temperatur- og pH-værdier for at stabilisere sig.
    5. Overfør cellesuspensionen til en ubelagt T25 dyrkningskolbe ved hjælp af bomuld sluttet, flammepoleret Pasteur-pipette. Placer kolben i kulturen inkubator.
    6. Ved 1 dag i vitro (DIV), skylles de dyrkede celler i T25 kolbe to gange med udpladningsmedium-1 (4 ° C). Kolben anbringes tilbage i inkubatoren. Udfør skylning ved at aspirere mediet inde i kolben fuldstændigt med en Pasteur-pipette, tilføjer ~ 5 ml frisk medium og forsigtigt vippe kolben flere gange i en hvirvlende bevægelse.
    7. Ved 6-9 DIV, (dvs. en dag før trypsinisering og udpladning på dækglas, i trin 3.2.8-3.2.13), placere 100 pi af coatingmaterialet med ekstracellulære matrixproteiner (se tabel Materialer / Udstyr til kommentarer coatingmaterialet) på dækglas i en dyrkningsskål og placere dyrkningsskålen i kulturen inkubator.
    8. Ved 7-10 DIV, når cellerne er 20-40% sammenflydende (rumligt kontinuerlig), Trypsinisér dem.
      1. Kolben skylles én gang, ved at aspirere hele opløsningen i kolben og tilsætning ~ 13 ml Hanks opløsning (4 ° C) forsigtigt vippe kolben flere gange i en hvirvlende bevægelse, og aspireres opløsningen helt.
      2. Tilsæt 40 ​​pi DNase opløsning (slutkoncentration 750 enheder / ml) til 4 ml Trypsin-EDTA-opløsning, passere opløsningen gennem et 0,2 um sprøjtefilter, og tilsæt filtratet direkte til cellerne i kolben.
      3. Lad trypsinisering fortsætte i 13 min ved 37 ° C i inkubatoren.
      4. Neutraliseres trypsin opløsning ved tilsætning af 2 ml 100% FBS (4 ° C) til kolben.
      5. Overfør trypsiniserede celler til et 15 ml centrifugerør under anvendelse af en 5- til 10-ml pipette tilsættes ~ 4 ml Hanks 'opløsning + 20% FBS (4 ° C), centrifugeres ved ~ 185 g og 4 ° C i 13 min og aspireres supernatanten.
    9. Pellet resuspenderes i 1 ml pre-Warmed plating medium-1.
    10. Mål tætheden af ​​celler ifølge trin 3.1.13.
    11. Aspirer coatingmaterialet fuldstændigt fra de dækglas, og pladen ~ 50 pi af den resuspenderede gliaceller på dækglas.
      BEMÆRK: Disse celler vil etablere glia feeder lag.
    12. Placer dyrkningsskålen med dækglas i inkubatoren.
    13. 20-60 min senere, tilsættes 1 ml forvarmet udpladningsmedium-1 til hver brønd, og placer fadet tilbage i inkubatoren. Bemærk: Når tilsættes plating medium, vil det være nyttigt at anvende en anden pipette til at trykke ned på periferien af ​​dækglasset (hvor der ikke er udpladede celler), således at dækglasset ikke vil flyde i mediet.
    14. Ved 1 DIV af glial fødelag (dvs. på dækglas), udskiftes mediet med 1 ml forvarmet udpladningsmedium-1, ved at aspirere hele opløsningen i en brønd og derefter fylde den med frisk medium.
    15. 2-3 DIV af glial fødelag når cells er 80-100% sammenflydende, tilsættes mitotisk inhibitor (10 pi af en blanding af 5-fluor-2'-deoxyuridin + uridin; slutkoncentrationer på 81,2 og 204,8 uM) til hver brønd, til at inhibere DNA-replikation og derfor undertrykke glial-celleproliferation.
    16. Ved 7-9 DIV, når cellerne er 90-100% sammenflydende (1-2 timer før udpladning neuroner på glial fødelag), udskiftes dyrkningsmediet med forvarmet udpladningsmedium-2 (37 ° C).
      BEMÆRK: Neuroner vil blive udpladet på samme dag under anvendelse af trin 3.4.
  3. Rat Glia kulturer
    1. Coat T25 dyrkningskolbe med samme coatingmateriale.
      BEMÆRK: Dette er nødvendigt til senere fjernelse af ikke-adhærente celler i trin 3.3.5.
      1. Tilsæt 2,0 ml af coatingmaterialet til kolben, og kolben i kulturen inkubator sted.
      2. Efter 2-3 timer, aspireres coatingmaterialet fuldstændigt, således at gulvet i kolben bliver tør.
    2. Anskaf cellernefra rotteunger, ifølge trin 3.1.
      BEMÆRK: CA3-CA1-regionen af ​​hippocampus anvendes til fremstilling af rotte gliale fødelag. Men andre hjerneregioner, såsom hjernebarken og striatum, vil arbejde efter justering for forskelle i celledensitet på grund af forskellige antal og udbyttet af celler fra forskellige regioner.
    3. Tilføj ~ 4 ml forvarmet udpladningsmedium-3 til den endelige cellesuspension (~ 1 ml).
    4. Overfør cellesuspensionen i det overtrukne T25 dyrkningskolbe ved hjælp af bomuld sluttet, flammepoleret Pasteur-pipette. Kolben anbringes i kulturen inkubator (5% CO2 -95% O 2, 37 ° C).
    5. 2-3 DIV, når cellerne er 20-40% sammenflydende, fjernes ikke-klæbende eller svagt adhærerende celler, ved at lukke låget tæt rystes kraftigt ~ 10 gange, opsugning af opløsningen og tilsætning af 4-5 ml plating medium-3 (ved 4 ° C). Gentag denne procedure en gang. Undersøg de dyrkede celler på tværs af hele kolben gulvet (fxhjælp fasekontrastmikroskop) for at bekræfte, at dem, der vises neuronal (dvs. dem, for hvilke den ydre rand af cellen krop vises fase-lys) er fuldstændigt fjernet. Gentag proceduren så ofte som nødvendigt for at fjerne disse celler og derefter kolben tilbage til inkubatoren.
      BEMÆRK: styrke og det samlede antal »shakes« kræves kan variere mellem de enkelte eksperimentatorer. Det vigtige er ikke at holde det samlede antal shakes til et bestemt antal, men at bekræfte, at neuron-lignende celler elimineres.
    6. Ved 6-8 DIV, hvor cellerne er 90-100% sammenflydende, passage de gliaceller ved trypsinbehandling dem som i trin 3.2.8.
    7. Efter centrifugering pellet resuspenderes i 1 ml udpladningsmedium-3 (4 ° C), tilsættes 10 ml udpladningsmedium-3 (4 ° C), overføre trypsinerede celler til en un-belagt T75 kolbe og kultur dem i inkubatoren.
      BEMÆRK: rotte gliale celler vil blive passeret to gange; i modsætning muse glialceller are passage kun én gang, fordi de bliver usund efter multiple passager. Rat glialceller vil blive passeret i T75 kolber, der ikke er belagt med et coatingmateriale. Belægningen giver rotte gliaceller at vokse for hurtigt, og giver mange cilierede celler (formodede ependymceller), som vil forringe neuronal kultur tilstand senere.
    8. Ved 17-19 DIV af glial kultur i en kolbe (dvs. 11 dage efter passage og en dag før trypsinisering og udpladning på dækglas ved trin 3.3.9-3.3.14) anbringes 100 pi af coatingmaterialet på uvaskede dækglas ( runde, diameter 12 mm) i en dyrkningsskål og placere dyrkningsskålen i kulturen inkubator.
      BEMÆRK: rotte gliale kulturer blev en forskel ikke bemærket i kultur resultater de med eller uden vask af dækglas.
    9. Ved 18-20 DIV af glial kultur i en kolbe (dvs. 12 dage efter passage), forberede glial feeder lag ved trypsinbehandling de dyrkede celler, ifølge step 3.2.8.
    10. Under centrifugering aspireres coatingmaterialet helt fra dækglas.
    11. Efter centrifugering pellet resuspenderes i 1 ml udpladningsmedium-3 (4 ° C), og måle celledensiteten, ifølge trin 3.1.13.
    12. Juster glial densitet til 10 4 levende celler / ml, og pladen 100 pi af glial cellesuspension på den belagte dækglas.
      BEMÆRK: Disse celler vil etablere glia feeder lag.
    13. Placer dyrkningsskålen med dækglas i inkubatoren i 20-60 min.
    14. Der tilsættes 1 ml udpladningsmedium-3 (4 ° C) til hver brønd, og anbring skålen tilbage i inkubatoren.
    15. Ved 3-4 DIV af glial feeder lag, når cellerne på dækglasset er 40-80% sammenflydende, tilsættes 1 ml af forvarmet vækstmedium (se tabel 1 for sammensætning), som indeholder cytosin β-D-arabinofuranosid ( AraC, slutkoncentration af 4 uM) for at stoppe glia-celle-proliferation. Plate neurons ved 7-9 DIV af glial fødelag når cellerne er 60-80% sammenflydende ved hjælp trin 3.4.
  4. Mus neuronkulturer
    1. Label og genotype nyfødte mus ifølge trin 1 og 2.
    2. Brug musen hvalpe til trin 3.1.
    3. Juster tætheden af levende cellesuspension til ~ 2,0 x 10 5 celler / ml ved hjælp af forvarmet udpladningsmedium-2 for udpladning på mus gliaceller, eller ved hjælp udpladningsmedium-3 for udpladning på rotte gliaceller.
    4. Plate cellerne på glial fødelag, ved forsigtigt at tilsætte cellesuspensionen til dyrkningsmediet af hver brønd. Bemærk: Mængden af ​​cellesuspensionen skal tilsættes, vil blive bestemt af målet antallet af celler i en kultur godt. For eksempel plade ~ 60 pi cellesuspension for at opnå 12.000 celler / brønd.
    5. Bemærk, at ingen løsning ændringer er nødvendige efter de neuroner er belagt. Vær omhyggelig med at undgå fordampning af opløsningen fra brøndene i løbet af kultur, ved at befugte den indvendige of kulturen inkubator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Som et eksempel på anvendelsen af ​​denne protokol, er repræsentative resultater vist for mærkning mus ved tatovering, pålidelig genotypning under forskellige eksperimentelle betingelser, og oprettelse primære neuronale kulturer på gliale feeder lag.

Tatovering

Nyfødte unger blev mærket på trædepuder ved hjælp af en tatovering-system ("Newborn" i figur 1). Etiketterne forblev tydeligt efter 3 uger (3 uger gamle) og 32 ugers alderen ('32 -Uge-gamle "). Den enkelte mus kan identificeres entydigt ved en kombination af tatoveringer på de fire poter (numre 1-16) og af information om dyret bur, eller mere komplekse nummereringssystemer (ikke vist).

Genotypebestemmelse

Et repræsentativt eksempel på genotypebestemmelse er vist (figur 2). Den Tor1a genet af vildtype (Tor1a (Tor1a + / AE) og homozygote (Tor1a AE / AE) AE-Torsina knock-in-mus amplificeret fra det genomiske DNA isoleret fra hale klip af nyfødte hvalpe. Genotypebestemmelse i dette specifikke eksempel er baseret på tilstedeværelsen af en enkelt 34-basepar loxP site i mutant Tor1a allel efter vellykket Cre rekombination og sletning af en neomycinresistens kassette 16,18.

Genomisk DNA blev ekstraheret med minimale hands-on tid og mange prøver blev behandlet samtidig. De udledte mængder blev holdt konstant, og derfor ingen justering af volumen var nødvendig for at rumme ændringer i testede betingelser. Pålideligheden af ​​genotypning blev testet under fire betingelser, som beskrevet nedenfor.

Først blev virkningen af forskelle i mængden af udgangsmateriale undersøgte væv (figur 3). Haler af forskellige længder blevfremstillet ud fra heterozygote AE-Torsina knock-i mus (Tor1a + / AE) ved fravænning alder (~ 3 uger). Tail længder på 2 til 5 mm, området anbefales typisk i protokoller til genotypebestemmelse, gav samme resultat genotypebestemmelse af høj kvalitet. De to bånd svarer til vildtype og muterede alleler (Tor1a + og Tor1a AE, henholdsvis).

For det andet blev virkningerne af variation i dyrenes alder undersøgt (figur 4). Tails blev opnået fra nyfødte, 3 uger gamle og ~ 24 uger gamle heterozygot AE-Torsina knock-i mus (Tor1a + / AE). Homozygote blev ikke anvendt, fordi de dør flere dage efter fødslen 16-18. De to forventede bånd til vildtype og muteret Tor1a gener var synlige uanset dyrs alder (figur 4A). Den generelle anvendelighed af dette resultat blev testet under anvendelse af et andet gen, Tfap2a 19 i vild-type mus (Tfap2a + / +) (figur 4b).

For det tredje blev virkningen af forskelle i længden af PCR amplikoner afprøvet (figur 5). Til dette formål blev forskellige primerpar syntetiseret til en givet gen, således at de amplificerede DNA'er er af forskellige basepar længder. Den Tfap2a genet blev konsekvent detekteret med forskellige amplicon længder.

For det fjerde blev to DNA ekstraktionsmetoder sammenlignet (figur 6). I en fremgangsmåde blev PCR bånd rør og PCR thermocycler anvendes (beskrevet i trin 2). Dette er et automatisk, parallel multi-rør ekstraktionsmetode ("Auto" i figur 6). Fordi flere rør kan håndteres samtidigt i strimler format, og en PCR-maskine anvendes med et program til at operere i fire temperatur trin, er der ikke behov for at overføre rørene manuelt ændre temperaturen under udvinding eller bruge flere stykkerudstyr. Det er således let at behandle mange prøver. Dette blev sammenlignet med den anden metode baseret på manuel, single-rør udvinding ('Manual' i figur 6). Dette bruger individuelle PCR rør og separat ikke-PCR maskiner (varme blokke og vandbade) til at styre temperaturen under DNA-ekstraktion. I dette tilfælde blev der flere, enlige rør flyttet til en ny temperatur efter hvert trin, der kræver flere temperaturstyrende apparater. I begge tilfælde blev Tor1a gen analyseres i vildtype, heterozygote og homozygote AE-Torsina knock-in-mus (figur 6A) og Tfap2a genet blev analyseret i vildtype-mus (figur 6B). De to ekstraktionsprotokoller gav tilsvarende genotype resultater.

Sammenfattende resultaterne præsenteret i figur 3 til 6 viser, at genotypebestemmelse metode er robust, opnåelse af pålidelige og reproducerbare resultater på trods af variations i væv beløb, dyr alder, amplikon længde, og udvindingen anvendte protokol.

Neuronkulturer

Til dyrkning mus neuroner på musen glial feeder lag, rækkefølgen af ​​de procedurer, er: (tatovering nyfødte mus → genotypning for glia kultur →) glial kultur → tatovering nyfødte mus → genotypning for neuronal kultur → neuronal kultur. For kulturer etableret på rotte gliale feeder lag, procedurerne i parentes er sprunget over.

Vi undersøgte den understøttende virkning af pre-seeded glial fødelag på neuronal overlevelse og vækst. Neuroner blev opnået fra CA3-CA1-regionen af ​​hippocampus, motoren region af cerebral cortex og striatum af nyfødte vildtypemus. De blev udpladet ved lav densitet på rotte gliale fødelag, der var blevet opnået fra CA3-CA1-regionen i hippocampus og podet før neuronal plating, ifølgeskemaet illustreret i figur 7 (forenklet sammendrag af procedurer). Kulturer Low-density er optimale for billeddannelse af individuelle dendritter, Somata 4,6, nerveender 2,3,5,8 og axonale aksler 5 ved høj rumlig opløsning. De hippocampale celler (indeholdende både neuroner og gliaceller) blev udpladet på overtrukne dækglas, enten med (figur 8A) eller uden en forud fastsat glial fødelag (figur 8B, C) ​​og observeret med fasekontrast optik. I nærvær af en næsten sammenflydende glial fødelag, neuronerne (i hvert panel, en pilespids angiver en repræsentant neuron) blev relativt dispergeret 3 og 7 dage efter udpladning (dage in vitro, DIV) (figur 8A). De viste også tegn på godt helbred, såsom en klar margin på neuronal somata, udvidede dendritter, manglende grupperet somata, og mangel på bundtede neuritter (høj forstørrelse images i mellemværker). Ved 14 DIV, disse neuroner dannet et tæt netværk præget af lange neuritter (dendritter og axoner). Bemærk, at glial proliferation blev inhiberet før neuroner blev udpladet ved tilsætning af vækstmedium indeholdende den mitotiske inhibitor AraC (trin 3.3.15).

I modsætning hertil i fravær af glial fødelag på tidspunktet for udpladning hippocampale neuroner, væksten af ​​dyrkede hippocampale neuroner var forringet, selv i fravær af AraC. Ved 3 DIV, har gliaceller (inkluderet i de nyligt forgyldt hippocampus celler) ikke dannede en sammenflydende ark (stjerne i øverste panel i figur 8B). Kulturerne viste flere tegn på, at der ikke er egnet til høj opløsning billeddannelse undersøgelser, såsom store områder uden underliggende gliaceller (stjerne), tilstedeværelsen af ​​klynger somata og tilstedeværelsen af ​​bundtede neuritter på nogle områder (data ikke vist). Ved 7 DIV, glialceller dannet et sammenflydende ark (midterste panel i fig 8C). HowevER, neuroner var færre end når neuronerne blev udpladet på en forud fastsat glial fødelag. De overlevende neuroner også manglede lange, netværk-dannende neuritter (indsat). De gliaceller var mere heterogen i krumning og tykkelse end i feeder lag kultur, således vises fase-lyse. For at teste virkningerne af undertrykke glial proliferation på neuroner, anvendt vi AraC indeholdende vækstmedium. Når AraC blev tilsat på 3 eller 7 DIV, og cellerne blev dyrket indtil 14 DIV og observeres på denne dag (figur 8B og C, bundpaneler), gliaceller dækkede det meste af dækglasset overflade. Men neuroner stadig få i antal, især når AraC blev anvendt ved 7 DIV. De overlevende neuroner havde kun korte processer og ikke var udførligt tilsluttet. Således sen tilsætning af AraC have en ensartet glial lag for at danne, men ikke fremmer neuronal levedygtighed eller neurit udvidelse; snarere ukontrolleret glial væksthavde skadelige virkninger på neuroner.

Disse data viser, at glial fødelag er kritisk for overlevelse og vækst af neuroner udpladet ved lav densitet, og at glial lag skal være til stede på tidspunktet for neuronal plating snarere end senere under neuronal kultur. Lignende resultater blev opnået under anvendelse af kulturer af cerebral cortical (figur 9) og striatale neuroner (Figur 10).

Den kvalitative bemærkning om neuronal overlevelse blev bekræftet ved kvantitativ analyse. Specifikt blev antallet af overlevende neuroner ved 14 DIV talt, baseret på fase-kontrast billeder af kulturer (figur 11). Antallet var størst for neuroner dyrket på en glial fødelag (dvs.., Belagte på glial fødelag). Antallet var lavere i tilfælde af neuroner dyrket i fravær af en glial fødelag. Antallet blev reduceret yderligere, når cellerne blev behandlet med AraC ved ensenere tidspunkt. Disse forskelle var statistisk signifikante, og der blev konstateret i kulturer af neuroner opnået fra alle tre hjerneregioner.

De typer af overlevende celler blev identificeret ved 14 DIV i musen hippocampale kulturer udpladet på rotte hippocampale fødelag. Dobbelt-immuncytokemi blev udført under anvendelse af antistoffer mod den neuronale markør, mikrotubulus-associeret protein 2 (MAP2), og astrocytisk glial celle markør, glial fibrillært surt protein (GFAP). Cellerne med udvidede processer var positive for MAP2, mens cellerne i det underliggende glial fødelag var positive for GFAP (to repræsentative billedfelter, Figur 12A). Denne farvning var ikke et artefakt af en specifik kombination af primære og sekundære antistoffer, fordi den samme mønster blev opnået, når et andet sæt af sekundære antistoffer blev anvendt (Figur 12B).

I modsætning hertil, når den samme farvning blev PERFORMED på kulturerne kun består af en glial fødelag, dvs i fravær af tilsatte museceller (to repræsentative billedfelter, figur 13A), ingen celler var positive for MAP2. Cellerne i fødelag var konsekvent positive for GFAP. For en negativ kontrol blev begge primære antistoffer udeladt fra immuncytokemisk procedure (figur 13B). Ingen farvning blev påvist i disse prøver, skønt celler var til stede, som det fremgår af det transmitterede lys optik (kontrast forskellen interferens, DIC) og nuklear farvning med Hoechst-farvestof. Således kan de ikke-specifik farvning i MAP2 og GFAP kanaler var meget svag.

Disse immuncytokemiske data blev også analyseret kvantitativt (figur 14). I hver 8-bit billede, blev intensitet målt og plottet langs en linje. Overlejrede plots viser MAP2 farvning når museceller (prøver indeholdende neuroner) blev dyrket på en glial fødelag (Neuron +,glia +, primært antistof (1 ° Ab) +), en sådan farvning var fraværende i kulturer af glial feeder celler alene (Neuron -, glia +, 1 ° Ab +). Ved en negativ kontrol uden primære antistoffer, farvning var ubetydelig i kulturer af glial fødeceller alene (Neuron -, glia + 1 ° Ab -). GFAP-farvning var synlig i glial fødelag, uanset om museceller blev udpladet (Neuron +, glia + 1 ° Ab +) eller ikke (Neuron -, glia + 1 ° Ab +). Igen farvning i den negative kontrol var ubetydelig (Neuron -, glia + 1 ° Ab -). Disse resultater viser, at rotte gliale fødelag bestod hovedsagelig af astrocytter, og at neuroner var til stede, når museceller blev tilsat. De angiver også, at de neuroner til stede i disse kulturer udelukkende stammer fra mus.

Afsnittet Resultater af online video viser også DIC og MAP2 billeder af dyrkede neuroner belagt på en glial feeder lag, Both fremstillet ud fra CA3-CA1 hippocampale region af vild-type mus.

For detaljeret styring af cellekultur, anbefales det at måle tætheden af ​​levende celler, både for at vurdere den generelle kvalitet af hjernen dissektion og cellulære dissociation skridt, og for udpladning af cellerne på forudbestemte tæthed. Anført nedenfor er fire sæt af typiske tæthed målinger. Bemærk dog, at disse tal kan variere afhængigt af dyrkningsbetingelser og reagenser. For eksempel kan endda forskellige partier af serum fra den samme leverandør påvirke resultaterne. Således bør disse tal betragtes som en generel indikator, snarere end en absolut retningslinje.

For cellulær dissociation (trin 3.1.13), typiske værdier for levende celledensitet opnået fra en pup er: ~ 2 x 10 5 celler / ml (mus motor cortex og muse CA3-CA1 hippocampus), ~ 5 x 10 5-celler / ml (mus cerebral cortex og rotte-CA3-CA1 hippocampus) og ~ 1 x 10 6 Calen / ml (mus striatum). I alle disse tilfælde, fraktionerne af levende celler var> 90% (levedygtighed, defineret som forholdet mellem antallet af levende celler til at af det samlede antal celler). Motoren cortex er løst defineret som det område af hjernebarken, der ligger umiddelbart dorsal til striatum 20. For hippocampus kulturer, CA3 og CA1 regioner i hippocampus korrekt foretrækkes. Hele hippocampus omfatter desuden den tandede gyrus, inddragelse af hvilket fører til dannelse af store nerve terminaler granulerede celler og indfører heterogenitet i synaptiske egenskaber 21. Den striatale kultur omfatter caudatus-putamen og globus pallidus, men omfatter ikke nucleus accumbens, eller mediale eller laterale septumdefekter kerner i de nærliggende strukturer.

For mus glial kultur (trin 3.2.11), klædningen tæthed er ~ 10.000 gliaceller på hver 12 mm runde dækglas, der anvender ~ 50 pi cellesuspension ved en densitet på ~ 2 x10 5 celler / ml. Normalt densitet målt i supernatanten er relativt konstant og ikke kræver justering. For at konvertere densitet i forskellige områder, de nyttige oplysninger er, at dækglasset har en diameter på 1,20 cm og et areal på 1,13 cm2. Således ~ 10.000 celler / dækglas = ~ 8.800 celler / cm2 på et dækglas.

For rotte glial kultur (trin 3.3.12), klædningen tæthed er ~ 1.000 gliaceller på hver 12 mm runde dækglas under anvendelse af ~ 100 pi cellesuspension ved en densitet på ~ 1x10 4 celler / ml. Således 1.000 celler / dækglas = ~ 900 celler / cm2 på et dækglas.

For lav densitet mus neuronal kultur (trin 3.4.4), klædningen tæthed varierer mellem 2.000 og 48.000 celler per brønd af en 24-brønds plade. Typiske værdier, når plating neuroner på rotter gliaceller er: 10,000-24,000 celler / brønd for cerebrale corticale neuroner, 12,000-24,000 celler / brønd for CA3-CA1 hippocampale neuroner og 24,000-48,000 celler / brønd i striatale neuroner. Når udpladning på muse gliaceller er antallet reduceres, fx 2.000 celler / brønd for CA3-CA1 hippocampale neuroner. Som en side bemærkning, for plating rotte CA3-CA1 hippocampusneuroner på en rotte glial fødelag, klædningen tæthed er 1,000-6,000 celler / brønd. Til omdannelse af densitet i en brønd til densiteten på et dækglas, de nyttige oplysninger er, at det indre og diameter ved bunden er 1,56 cm og dens område er 1,91 cm2. Således, for eksempel 12.000 celler / brønd = 7.100 celler / dækglas = 6.300 celler / cm2 på et dækglas. Disse tætheder blev valgt med det formål at dyrke relativt sparsomme neuroner for høj opløsning cellulær billeddannelse. Forskerne skal vælge deres numre, der bedst passer til deres eksperimentelle mål.

Figur 1
Figur 1. Tattooed trædepuder af mus. Newborn mus blev mærket ved tatoveret trædepuder. De blev fotograferet umiddelbart efter tatovering (nyfødte) ved 3 ugers alderen (3 uger gamle) og ved 32 uger (32 uger gamle). Etiketterne forblev let synlige gennem hele voksenlivet. Billeder blev taget fra forskellige dyr. De vises ikke på samme skala. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Genotypebestemmelse af vildtype (Tor1a + / +), heterozygote (Tor1a + / AE) og homozygote (Tor1a AE / AE) AE-Torsina knock-i mus. De Tor1a gen alleler blev analyseret i vildtype og mutant former, under anvendelse af DNA ekstraheret fra halerne af nyfødte hvalpe. Tail tip var ~ 4 mm i længden. DNA blev farvet ved anvendelse SYBR Safe DNA Gel Stain. Se tabellen for Materialer / Udstyr til oplysninger om primere og termisk cykling program for Tor1a gen. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Påvisning af genomisk DNA i forbindelse med variation i mængden af udgangsmateriale. Halespidser af forskellige længder blev anvendt. Testede dyr var 3 uger gamle, heterozygot AE-Torsina knock-i mus (Tor1a + / AE). Lanes repræsenterer hale længder på 2, 3, 4 og 5 mm, i to eksemplarer (fra venstre). De halespidser blev opnået fra forskellige mus. Molekylvægt størrelse markører i den yderste venstre bane repræsenterer DNA længder i sbeskæftigelsespagter på 100 basepar. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Detektion af genomisk DNA i forbindelse med variation i dyr alder. (A) Tor1a genet. Lanes repræsenterer hale tips opnået fra heterozygote AE-Torsina knock-i mus (Tor1a + / AE) på følgende faser: nyfødte, 3 uger gamle, og ~ 24 uger gamle (i dubletter fra venstre) (B). Tfap2a genet. Lanes repræsenterer hale tips opnået fra vildtype (Tfap2a + / +) mus ved følgende faser: nyfødte, 3 uger gamle, og ~ 24 uger gamle (i dubletter fra venstre). Begge gener blev amplificeret fra haler ~ 4 mm i længden. Den forventede PCR-fragment er 498 bp. PCR program wa er den samme som den, der anvendes til Tor1a gen. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Påvisning af genomisk DNA i forbindelse med variation i længden af PCR-amplikon. The Tfap2a genet blev analyseret med PCR amplicon længder af 498 bp (venstre bane), 983 bp (midtersporene) og 1990 bp (højre baner) i dubletter. Genet blev amplificeret fra haler af 3 uger gamle mus. Molekylvægt størrelsesmarkører i længst til venstre og længst til højre baner af gelen repræsentere DNA længder i trin på 100 og 200 basepar hhv. Se tabellen for Materialer / Udstyr til oplysninger om primere til forskellige amplikoner. 879fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Påvisning af genomisk DNA i forbindelse med variation i DNA-ekstraktion metode. Resultater for denne vejledning er single-rør udvinding (Manual), og de ​​automatiserede, parallelle multi-rør ekstraktionsmetoder (Auto) sammenlignes. Sidstnævnte metode blev anvendt i denne rapport. Gener blev amplificeret fra haler ~ 4 mm i længden, indsamlet fra nyfødte. (A) Tor1a gen i de nyfødte unger i AE-Torsina knock-i mus. Lanes repræsenterer DNA'er ekstraheret fra vildtype (manuel og automatiseret), heterozygote (manuel og automatiseret) og homozygote mus (manuel og automatiseret) (fra venstre). (B) Tfap2a gen i 3 uger gamle vildtype-mus. Den forventede PCR-fragment er 498 bp.jove.com/files/ftp_upload/51879/51879fig6highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 7
Figur 7. Forenklet, skematisk illustration af fremgangsmåderne ved plettering mus neuroner på mus (A) og rotte (B) gliøse fødelag. Antallet af dage (dage in vitro) henviser til de kumulative dage efter gliaceller er først belagt i kultur kolber. De tjener kun som et groft estimat. For praktiske detaljer, se Procedurer afsnittet. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 8
Figur 8. Understøttende virkningaf glial fødelag på vækst af hippocampale neuroner i en lav-densitet kultur. Neuroner blev opnået fra CA3-CA1-regionen af hippocampus fra nyfødte, vildtypemus. (A) Mouse hippocampale celler blev udpladet på overtrukne dækglas, som var blevet præ-podet med en rotte gliale fødelag opnået fra CA3-CA1-regionen i hippocampus. Neuroner blev dispergeret jævnt i en sund måde. Kulturer blev observeret ved 3, 7 og 14 DIV. (B, C) ​​mus hippocampus celler blev udsået på coatede dækglas, som ikke havde nogen på forhånd fastlagt fødelag. Kulturer blev observeret ved 3 DIV (øverste panel i B) og 7 DIV (midterste panel i C) uden AraC behandling. I andre sæt af kulturer, blev cellerne behandlet med AraC ved 3 DIV (nederste panel i B) og 7 DIV (nederste panel i C), og observeres ved 14 DIV. Alle billeder repræsenterer søster kulturer opnået fra samme pup, hvis neuroner blev udpladet på samme dag. Se tekst for detaljer. For hvert panel, en exrigelig af en neuron er angivet med en hvid pilespids og forstørret i en indsat. Neuroner har celle organer, hvis omkreds fremtræder lyst, når de ses ved fase-kontrast optik, og de har også tykke processer. Stjerner angiver områder uden gliaceller. Kulturerne blev afbildet live på et omvendt mikroskop ved hjælp fasekontrastoptik med 20X objektiv (numerisk åbning på 0,45) uden en mellemliggende linse (dvs. på 1x). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 9
Figur 9. Understøttende virkning glial fødelag på vækst af cerebrale corticale neuroner i en lav-densitet kultur. Lignende resultater som i figur 8, men med neuroner opnået fra motoren region Cerebral cortex. De betingelser, etiketter AC svarer til dem i figur 8. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 10
Figur 10. Understøttende virkning glial fødelag på vækst af striatale neuroner i en lav-densitet kultur. Lignende resultater som i figur 8 og 9, men med neuroner opnået fra striatum. De betingelser, etiketter AC svarer til dem i figur 8. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 11. Understøttende virkning glial fødelag på neuronal overlevelse. Antallet af overlevende neuroner blev talt i eksperimenterne vist i figur 8, ved hjælp af billeder, der er erhvervet ved fasekontrastmikroskopi. Billeder til 14 DIV vises her igen, men med pilespidser peger på eksempler på optalte neuroner. Søjlediagrammet viser antallet af neuroner pr billedfelt (449,0 um x 335,5 um) (gennemsnit ± standardafvigelse på middelværdien, n = 7-24 felter for hver kultur tilstand). Stjerner angiver statistisk signifikante forskelle i »Glial fødelag (-), AraC den 3. DIV" og "Glial feeder lag (-), AraC den 7. DIV" fra "Glial feeder lag (+)« (* p <0,05, ** p <0,01, uparret Students t-test). Tallene over søjlerne angiver neuronal tæthed målt i montager af flere billedfelter. Billeder bleverhvervet ved anvendelse af en 20X objektiv. For at undgå erhvervelse bias, blev alle billeder opnået langs en fuld vertikal strimmel, fra toppen til bunden af ​​et dækglas og går gennem det omtrentlige centrum af dækglasset. Individuelle billeder havde en vis overlapning (f.eks 1/6 til 1/4 af et billede feltet øverst og nederst). To metoder blev anvendt til analysen. I den ene blev neuroner talt i skiftende billeder at sikre, at individuelle neuroner ikke blev talt mere end én gang. De resulterende tal blev anvendt til at generere søjlediagram. Ved den anden metode blev en enkelt montage skabt af de enkelte billeder. De blev syet ved hjælp af Microsoft Image Composite Editor eller manuelt ved hjælp af Photoshop. De montager ligeledes udelukket flere tællinger af de samme neuroner. De resulterende tal er anført ovenfor søjlerne. I begge metoder blev store områder på dækglasset periferi, som ikke indeholdt nogen celler udelukket. Cellerne blev talt som neuroner, hvis de havde cellelegemer, der optrådte lyseved fasekontrastmikroskopi, samt udvidede cellulære processer. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 12
Figur 12. Immuncytokemisk identifikation af celletyper i neuronale kulturer. Kulturen tilstand svarer til nederste venstre billede af figur 8A. Neuroner blev opnået fra CA3-CA1-regionen af ​​hippocampus fra vildtypemus og udpladet på en glial fødelag dannet fra CA3-CA1-regionen af ​​hippocampus fra vildtype-rotter. De dyrkede celler blev analyseret ved immuncytokemi for neuronal markør MAP2 og astrocytisk glial celle markør GFAP. Differential kontrast interferens (DIC) mikroskopi blev anvendt til at afsløre den generelle morfologi af det afbildede områder, 14-17dage efter neuroner udpladet på glial fødelag. (A) Tre-farvning, herunder modfarvning med den nukleare markør Hoechst 33342 farvestof. To repræsentative billedfelter er vist. (B) To farvning med forskellige kombinationer af sekundære antistoffer konjugeret med forskellige fluoroforer. I disse forsøg blev de dyrkede celler fikseret med 4% paraformaldehyd og 4% sucrose i Tyrode opløsning (indeholdende, i mM: 125 NaCI, 2 KCI, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 30 D-glucose, 25 HEPES, pH 7,4 justeres med 5 M NaOH, ~ 310 mOsm uden justering) i 30 minutter ved 4 ° C. Efter at være blevet vasket med Tyrode opløsning, blev de permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 i Tyrode opløsning i 10 min. De blev igen vasket med Tyrode opløsning og derefter blokeret med 2% normalt gedeserum i phosphatbufret saltvand (PBS) (blokerende opløsning) i 60 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev de behandlet med kanin polyklonale anti-MAP2 antistof (AB5622; 400x fortynding i blokeringsopløsning) og muse-monoklonalt anti-GFAP cocktail (NE1015; 1.000 x fortynding) O / N (15-21 timer) ved 4 ° C. Efter vask med PBS blev cellerne inkuberet med gede-anti-kanin og anti-muse-IgG-antistof konjugeret med Alexa Fluor 405 (500x fortynding i blokeringsopløsning), Alexa Fluor 488 (1.000 x) eller Alexa Fluor 568 farvestof (500x) i 60 min ved stuetemperatur. De blev vasket med PBS og iagttaget direkte i PBS. I nogle kulturer, efter den sidste vask i ovennævnte procedurer blev cellerne behandlet med Hoechst 33342 på 0,5 ug / ml i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur og vasket med PBS før observation. Klik her for at se en større udgave af dette figur.

Figur 13
Figur 13. IMMUnocytochemical identifikation af celletyper i gliale fødelag kulturer. Sister kulturer af rotte gliale fødelag som i figur 12, men uden udpladning af muse neuroner. (A) Farvning ved hjælp af immuncytokemiske procedurerne beskrevet i figur 12A. To repræsentative billedfelter er vist. (B) farvning af glial feeder lag ved hjælp af immuncytokemiske beskrevet i A, men med de primære antistoffer udeladt. Alle MAP2 billeder i 12A og 13A, B er erhvervet under de samme imaging betingelser, og er vist på det samme billede kontrast at kunne sammenligne intensitet. De samme procedurer blev anvendt til GFAP billeder i 12A og 13A, B. Glial fødelag kultur blev afbildet på samme dag som de kulturer i figur 12. Således gliale fødelag i 13 blev dyrket in vitro for den samme mængde tid. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 14
Figur 14. Intensitet af immuncytokemisk farvning. Linjer var trukket på de billeder, der er vist i figur 12 og 13, og intensiteten langs disse blev afbildet. Mellemværker viser billeder i den øverste række i figur 12A. De tre betingelser var: 1) udpladning af museceller (neuroner) på en rotte fødelag og farvning med de primære antistoffer (Neuron +, glia + 1 ° Ab +), 2) kun glial fødelag (ingen neuronal plating) og farvning med de primære antistoffer (Neuron -, glia + 1 ° Ab +), og 3) glial foderER lag kun (ingen neuronal plating) og farvning uden primære antistoffer (Neuron -, glia + 1 ° Ab -). Neuronal farvning (MAP2) var til stede, når muse celler blev belagt (vilkår 1 vs 2), og glia farvning (GFAP) var til stede i begge sæt kulturer (vilkår 1 vs 2). Den immuncytokemisk farvning var specifik for både primære antistoffer (betingelser 1 vs 3). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

LØSNINGER
TAE buffer (50x opløsning)
Tris-base, 486 g
Eddikesyre, 114,2 ml
0,5 M EDTA, pH 8,0, 200 ml
Tilføj destilleret vand for at bringe den samlede volumen til 2 L
Der fyldes op i stinkskab.
Fortynd 50-fold før brug.
Hanks 'opløsning
Hanks Balanced Salts, uden calciumchlorid, magnesiumsulfat og natriumbicarbonat (1 L)
NaHCO3, 350 mg (slutkoncentration 4,17 mM)
HEPES, 2,38 g (slutkoncentration 10 mM)
Juster til pH 7,4 ved anvendelse af 5 M NaOH.
Juster osmolaritet til 310 mOsm hjælp saccharose (Osmolaritet tendens til ~ 290 mOsm uden justering).
Tilføj destilleret vand for at bringe den samlede volumen til 1 L
Fordøjelse opløsning (for trypsinbehandling af hjernevæv)
NaCl, 800,6 mg (slutkoncentration 137 mM)
KCI, 37,3 mg (fginal koncentration, 5 mM)
Na 2 HPO 4 · (7H 2 O), 187,6 mg (slutkoncentration 7 mM)
HEPES, 595,8 mg (slutkoncentration 25 mM)
Glucose, 97,3 mg (slutkoncentration 5,4 mM)
Juster til pH 7,2 ved anvendelse af 5 M NaOH.
Osmolaritet tendens til ~ 310 mOsm uden justering.
Tilføj destilleret vand for at bringe samlet volumen på 100 ml.
Lige før anvendelse, tilsættes 20 mg trypsin (slutkoncentration på 10 mg / ml) og 20 pi DNase (slutkoncentration på 750 enheder / ml) til 2 ml fordøjelse opløsning.
Dissociation opløsning (til mekanisk dissociering af hjernevæv)
Hanks 'opløsning
MgSO4 · (7H 2 O), 295,1 mg (endelig Concentratipå, 11,97 mM)
Juster osmolaritet til 310 mOsm anvendelse af sucrose.
Samlet volumen er 100 ml.
Lige før anvendelse, tilsættes 20 pi DNase (slutkoncentration på 750 enheder / ml) til 2 ml dissociation opløsning.
Udpladningsmedium-1 (for muse gliaceller)
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), 449,5 ml
MITO + Serum Extender 0,5 ml
FBS, 50 ml
Samlet volumen er 500 ml.
Udpladningsmedium-2 (for mus neuroner)
Neurobasal-A, 485 ml
B27, 10 ml
GlutaMAX-I, 5 ml (slutkoncentration 2 mM)
Samlet volumen er 500 ml.
Udpladningsmedium-3 (for rotte neuroner og gliaceller)
Minimum Essential Media (MEM uden phenolrødt)
Glucose, 2,5 g (slutkoncentration, 27,8 mM)
NaHCO3, 100 mg (slutkoncentration, 2,38 mM)
Transferrin, 50 mg
FBS, 50 ml
GlutaMAX-I, 5 ml (slutkoncentration 2 mM)
Insulin, 12,5 mg
Samlet volumen er 500 ml.
Vækstmedium (for rotte neuroner og gliaceller)
MEM (uden phenolrødt)
Glucose, 2,5 g (slutkoncentration, 27,8 mM)
NaHCO3, 100 mg (slutkoncentration, 2,38 mM)
Transferrin, 50 mg
FBS,25 ml
GlutaMAX-I, 1,25 ml (slutkoncentration 0,5 mM)
B27 eller NS21 {Chen, 2008 # 2399}, 10 ml
Cytosin β-D-arabinofuranosid (AraC), 0,56 mg (slutkoncentration 4 uM)
Samlet volumen er 500 ml.
Generelle bemærkninger
Vores kultur medier indeholder ikke antibiotika, fordi de kunne udøve cytotoksiske virkninger på dyrkede gliaceller og neuroner (henvisning 70, 71). Dette gør det særligt vigtigt at holde sig til sterile procedurer i kultur-relateret arbejde.
Se tabellen af reagenser til de detaljerede kilder til kemikalier.

Tabel 1. Opløsninger

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollen præsenteres her indeholder procedurer til tatovering at mærke / identificere mus, for genotype mus fra hale tips, og for dyrkning mus hjernen neuroner ved lav tæthed. I en runde af forsøg med 6-8 unger, disse procedurer kræver typisk ~ 0,5 timer, ~ 4 timer og ~ 2 timer, henholdsvis på i alt 6-7 timer. Dette gør det praktisk for en enkelt eksperimentatoren at udfylde alle de nødvendige procedurer fra tidspunktet for hvalpenes fødsel til plettering af neuronale kulturer - på mindre end en enkelt arbejdsdag (med undtagelse af forudgående forberedelse af gliale feeder lag).

Tatovering

Er nødvendig med henblik på avl og videnskabelige undersøgelser sådanne langsigtede identifikation af dyr, som analyser af histologi, cellefunktion og dyrs adfærd. Tatovering nyfødte dyr er fordelagtig, fordi den kan udføres hurtigt og varer for meget af dyrets levetid 7,22-25. Tattooing på trædepuder kan være bedre end tå klipning 23 med hensyn til at bevare testbare adfærd, for eksempel i suspension eller gribende 22,26, selv om nogle undersøgelser ikke konstateret sådanne mangler (fx 25). Der var ingen tilfælde af mødre afvise eller cannibalizing unger efter tatovering. For andre metoder til langsigtet identifikation af dyr, se seneste anmeldelser 7,23,24.

Genotypebestemmelse

Et afgørende træk ved vores protokol er anvendelsen af ​​et hurtigt genotypebestemmelse metode. Skønt tilsvarende genotype metoder er beskrevet i tidligere rapporter (fx 27,28), den her beskrevne system har mindst to forbedringer. For det første kan det tåle visse udsving i mængden af ​​start væv, dyrenes alder, og amplikon længde. Således kan vellykket genotypebestemmelse opnås ved anvendelse af mus så unge som 1 dag og så gammel som 6 måneder gammel, og kan udføres ved anvendelse af enbred vifte af primerpar. For det andet er denne metode ikke kræver et stop løsning for DNA ekstraktion. Dette eliminerer megen håndtering og pipettering rør og tillader parallel multi-rør automatisering af processen med en PCR-maskine. Antallet af prøver kan skaleres op (f.eks 96 prøver) endnu forarbejdes nemt og samtidigt. Også prøvetype er ikke begrænset til hale clips; andre prøvetyper, der kunne anvendes, omfatter øre slag, toe udklip, hele tidlige embryoner, og placenta væv 2-4,29,30. Kan også anvendes forskellige dyrearter. Således genotype procedurer er pålidelige (gentages med lav intra-assay varians) og reproducerbar (lav inter-assay variation mellem kørsler eller mellem laboratorier), og har den fordel, høj skalerbarhed.

Bemærk, at en vis forsigtighed er nødvendig for at opnå den forventede kvalitet af resultaterne. Først under DNA ekstraktion, kan en stor variation i protokollen forringe resultaterne.For eksempel, en væsentlig reduktion i mængden af DNA Extraction Solution (fx 200-100 pi i trin 2.2) tillader stadig genotypebestemmelse, men det kan reducere pålideligheden og resultere i variation i PCR-resultater. Under sådanne betingelser, anbefales det at reducere mængden af DNA ekstrakt 4-2 pi, og øge mængden af H 2 O 2 til 4 pi for at kompensere for den mængde ændring under PCR-reaktioner (trin 2.5). For det andet, ved slutningen af ​​DNA-ekstraktion, kan opløsningen anvendes til PCR umiddelbart uden centrifugering i de fleste tilfælde, selv om halen vil bevare sin overordnede struktur og vil ikke blive helt nedbrudt. Det er afgørende med henblik på at adskille genomisk DNA fra vævet (trin 2.4) beskrevet inversion af rørene. Det er også vigtigt at bruge toppen, klar del af løsningen, bortset fra rester i bunden af ​​røret, fordi optagelsen af ​​sidstnævnte vil føre til ufyldestgørende PCR resultater. Disseskridt vil være effektiv med minimal tid og kræfter. Lige så gode resultater kan opnås ved aktivt vortex prøven (i stedet for inversioner) efterfulgt af centrifugering og brugen af ​​supernatanten. For det tredje, efter DNA-ekstraktion, DNA'et kan opbevares i lang sigt (f.eks> anden uge). Det anbefales at centrifugere opløsningen under anvendelse af en mikrocentrifuge (fx 3,000-13,000 g ved 4 ° C i 2 minutter), overføres supernatanterne til nye rør og opbevares ved -80 ° C. Når den lagrede ekstrakt skal anvendes til genotypebestemmelse kortvarigt centrifugeres prøven efter optøning og bruge supernatanten.

Neuronkulturer

Et andet vigtigt træk af vores protokol er anvendelsen af ​​en glial fødelag at etablere neuronale kulturer ved en lav udpladningsdensitet. Typisk, i primære kulturer af pattedyrs hjerne neuroner, udplades cellerne med en relativ høj tæthed på overtrukne dækglas uden glial fødelag (fx 31-39). Når udpladningsdensitet af neuroner er reduceret ved hjælp af denne metode, den indledende manglende glial ark fører til dårlig neuronal vækst og dendritiske udvidelse (panelerne B, C i figur 8-10), som tidligere rapporteret 40-42, sandsynligvis på grund af dårlig glial vækst 43,44.

Succesfulde lav densitet neuronale kulturer kan genereres ved mindst tre brede typer af metoder. I en fremgangsmåde, der Neurobasal Medium anvendes som dyrkningsmedium. Dette gør det muligt at dyrke neuroner i fraværet af en glial fødelag, og kan anvendes til lav densitet neuronkulturer 45,46. I en anden fremgangsmåde (Banker-type "og modifikation), glialceller er co-dyrket med neuroner i samme godt, men er fysisk adskilt fra dem. I den forbindelse gliaceller fremskaffe "trofisk støtte" til neuroner uden at kontakte dem direkte1,41,42,47-49. I den tredje metode, der neuroner belagt på en forud fastsat glial fødelag der understøtter neuronal vækst (f.eks 50-53) (figur 8-10). Specifikt muse hjerne neuroner udpladet på en glial fødelag fremstillet fra mus 8,34,54 eller rotter 41,55,56.

Vi foretrækker den sidste af de tre tilgange til lav densitet kultur, fordi Neurobasal Medium kan påvirke neuronal overlevelse 57 vil de astrocytiske glialceller være afgørende i reguleringen neuronale funktioner 8,58, og fysisk kontakt mellem neuroner og gliaceller kan være vigtig. Procedurerne for dyrkning af mus og rotter gliaceller ligner 59,60, men vi har ændret dem lidt til at rumme for hurtigere in vitro væksten af rotte vs. muse gliaceller. Procedurerne for rotte cellekultur blev ændret fra 61 til 63. Anvendelsen af ​​en glial feeder Layer for lav densitet neuronkulturer gør det nødvendigt at foretage en hurtig genotypebestemmelse, for at matche genotypen af ​​feeder lag med den for neuronerne i perioden mellem hvalpene 'fødsler og de neonatale dødsfald eller slutningen af ​​kultur vindue (1 -2 postnatale dage).

Low-density kultur på en glial fødelag er også en vigtig metode, når man forsøger at dyrke neuroner af små kerner i hjernen (f.eks noradrenalin-frigivende locus coeruleus og dopamin-frigivende substantia nigra). Disse kerner indeholder kun et lille antal af neuroner og vil uundgåeligt give lav massefylde kulturer 64-67.

Primære kulturer rutinemæssigt fremstillet i vores laboratorium fra CA3-CA1-regionen af ​​hippocampus, motoren region af cerebral cortex og striatum af mus. De samme fremgangsmåder kan anvendes til fremstilling af neuronale kulturer repræsenterer andre hjerneregioner, for eksempel hele hippocampus (inkluding gyrus dentatus), og hele hjernebarken. Rotte neuroner fra hjernen regioner, såsom hippocampus og locus coeruleus dyrkes på lignende måde under anvendelse af rotte gliale fødelag. Disse dyrkede neuroner anvendes sædvanligvis på 1-4 uger in vitro, med den nøjagtige alder af kulturen afhængigt af formålet med forsøget. Det er at bemærke, at nogle neuroner dyrket på en glial feeder lag kan overleve i mere end 10 uger 34,68.

Et potentielt problem med lav massefylde neuronale kulturer er, at neuronale egenskaber kan være forskellige fra dem i kulturer med høj densitet eller i neuroner in situ. Sammenligning af disse systemer giver en interessant mulighed for at undersøge, hvordan neuronal udvikling og modning påvirkes af flere faktorer, såsom neuronal tæthed, de opløselige faktorer secerneres fra neuroner, neuron-til-neuron kontakt, og glia-neuronale interaktioner.

Sammenfattende tattooing-baserede mus mærkning er langtidsholdbare, genotypebestemmelse metode er hurtig, og kulturen muliggør, plettering mus neuroner ved lav densitet. Den her beskrevne protokol kan anvendes i sin helhed til andre dyrearter, der huser andre genetiske mutationer. Desuden kan de enkelte trin i protokollen anvendes til andre formål. Således protokol kan anvendes i en bred vifte af anvendelser baseret på eksperimentatorens behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS - tattooing
Machine Cleanser Animal Identification and Marking Systems, Inc. NMCR3 This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent Animal Identification and Marking Systems, Inc. NDAR4 This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment Animal Identification and Marking Systems, Inc. NBP01
Skin Prep Applicator Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSPA1 Q-tip.
Skin Prep solution Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSP01 This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format) EZ BioResearch LLC G2001-100
2X PCR Ready Mix II EZ BioResearch LLC G2001-100 A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial VWR BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade rpi A20090-500  We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA) Fisher BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl Dot Scientific Inc UG104-96RS  Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl Dot Scientific Inc UG2020-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl Dot Scientific Inc UG2812-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp EZ BioResearch LLC L1001 We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp EZ BioResearch LLC L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder GIBCO-Invitrogen 10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml  USA Scientific 1402-2900 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual  rpi 145660 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural USA Scientific 1605-0000 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO GIBCO-Invitrogen S33102
Tris base rpi T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100MG See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement GIBCO-Invitrogen 17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated BD falcon 353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml BD falcon 353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml BD falcon 353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml BD falcon 352095
Countess (cell number counter) chamber slides GIBCO-Invitrogen C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride) Sigma-Aldrich C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC) Sigma-Aldrich G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm Pyrex 3160-101
Distilled water GIBCO-Invitrogen 15230-147
DNase Type II Sigma-Aldrich D4527-200KU Stock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate GIBCO-Invitrogen 10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 569-0020
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO-Invitrogen 26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0 Carolina 633017
GlutaMAX-I GIBCO-Invitrogen 35050-061
Hanks' Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma-Aldrich H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent Sigma-Aldrich 258148-100 ML
Insulin Sigma-Aldrich I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka) Sigma-Aldrich 63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free BD Biosciences 356237 This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM) GIBCO-Invitrogen 51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml BD Biosciences 355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate BD falcon 353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate BD falcon 353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid GIBCO-Invitrogen 10888-022
Nitric Acid VWR bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21  prepared in the lab Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”  Fisher 13-678-6A Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”  Fisher 13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0% Sigma-Aldrich P9333-500G
Serological pipet, 2 ml BD falcon 357507
Serological pipet, 5 ml  BD falcon 357543
Serological pipet, 10 ml BD falcon 357551
Serological pipet, 25 ml BD falcon 357525
Serological pipet, 50 ml  BD falcon 357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis Sigma-Aldrich 480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich Sigma-Aldrich 431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC) Sigma-Aldrich S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm Corning 431219
Syringe, 3 ml BD falcon 309585
Transferrin, Holo, bovine plasma Calbiochem 616420
Trypan Blue stain, 0.4% GIBCO-Invitrogen T10282 This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI Sigma-Aldrich T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%  GIBCO-Invitrogen 25200-056
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2 Merck Millipore AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail Merck Millipore NE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMS Animal Identification and Marking Systems, Inc. NEO–9 This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GT BIO–RAD 170–4405 Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800 ProteinSimple FluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal Cycler BIO-RAD PTC-1148EDU Our PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac Basic BIO-RAD 164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, Countess GIBCO-Invitrogen C10310 This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2 NUAIRE NU-425-400 This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water Jacket NUAIRE NU-4850
Horizontal Clean Bench NUAIRE NU-201-330 This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed Shaker Labnet S2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifuge Fisher 46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793 (2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034 (2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245 (2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. e626 (2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. e3844 (2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87, (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895 (2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. e2373 (2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. e2389 (2011).
  36. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. e3634 (2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. e3965 (2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. e3257 (2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. e2111 (2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633 (2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M. Ch. 18. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).
Rapid Genotypebestemmelse af dyr Efterfulgt af Etablering primære kulturer af hjerneneuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).More

Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter