Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Rapid Genotyping av Dyr Fulgt av Etablering Primære Kulturer av hjernens nerveceller

doi: 10.3791/51879 Published: January 29, 2015
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver prosedyrer for merking og genotyping nyfødte mus og generere primære nevronkulturer fra dem. Den genotyping er rask, effektiv og pålitelig, og gir mulighet for automatisert nukleinsyre-syre utvinning. Dette er spesielt nyttig for neonatally dødelige mus og deres kulturer som krever forutgående gjennomføring av genotyping.

Abstract

Høy oppløsning analyse av morfologi og funksjon av nerveceller fra pattedyr krever ofte genotyping av individuelle dyr, fulgt av analyse av primære kulturer av neuroner. Vi beskriver et sett av prosedyrer for: merking nyfødte mus for å bli genotypet, rask genotyping, og etablering av lav tetthet kulturer av hjernens nerveceller fra disse musene. Individuelle mus er merket med tatovering, som gir mulighet for langsiktig identifikasjon varig inn i voksenlivet. Genotyping av den beskrevne protokoll er rask og effektiv og gir mulighet for automatisert uttrekking av nukleinsyre med god pålitelighet. Dette er nyttig under omstendigheter der tilstrekkelig tid for konvensjonell genotyping ikke er tilgjengelig, for eksempel, i mus som lider av neonatal dødelighet. Primære nevronale kulturer blir generert ved lav tetthet, noe som gjør det mulig for bildebehandling eksperimenter med høy romlig oppløsning. Denne kulturen metoden krever utarbeidelse av gliaceller næringslag før nevronale plating. Protocol tilføres i sin helhet til en musemodell av bevegelsesforstyrrelse DYT1 dystoni (AE-Torsina knock-in-mus), og nevronale kulturer fremstilt fra hippocampus, cerebral cortex og striatum fra disse musene. Denne protokollen kan anvendes på mus med andre genetiske mutasjoner, så vel som til dyr av andre arter. Videre kan de enkelte komponenter av den protokoll benyttes for isolerte underprosjekter. Derfor er denne protokollen vil ha brede programmer, ikke bare i nevrovitenskap, men også i andre felt av biologiske og medisinske fag.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Gnagermodeller av genetiske sykdommer har vist seg nyttig i å etablere de fysiologiske funksjonene til normale proteiner og nukleinsyrer, så vel som de patofysiologiske konsekvenser av defekter i disse. Eksempler inkluderer mus som mangler for proteiner som er involvert i viktige cellefunksjoner i tillegg til musemodeller av lidelser så som Alzheimers sykdom. Imidlertid kan visse genetiske manipulasjoner føre til neonatal dødelighet kort tid eller et par dager etter fødselen. I disse tilfellene, primære cellekulturer er et viktig verktøy fordi levende celler kan fås fra de embryonale eller neonatale unger før døden, de kan opprettholdes i minst et par uker in vitro, og i løpet av denne tiden tidlig neuronal utvikling kan følges av biokjemiske, funksjonelle og morfologiske eksperimenter. For de primære kulturer, kan det være gunstig å plate nervecellene ved lav tetthet; Dette gjør det mulig å visualisere den enkelte somata, dendritter, aksonal aksler og nerveklemlene på høy romlig oppløsning. Imidlertid overlevelse og differensiering av nerveceller med lav tetthet krever typisk at de er belagt på en glial mateslag, ko-dyrket med gliaceller i fravær av fysisk kontakt med dem, og dyrket i medium kondisjonert ved en gliaceller.

Etableringen av lav tetthet nevronale kulturer på glial næringslag kan være avhengig av en rask og pålitelig genotyping forhånd - i løpet av få timer, i motsetning til noen få dager. Hastighet er spesielt viktig når det nevronale genotype må matches til det av en glial mater lag forberedt på forhånd. Som en mer praktisk eksempel, kan det være nødvendig å bestemme hvilke unger som genotype til bruk ved generering av kulturer, for å optimalisere effektiviteten av et eksperiment.

Her demonstrerer vi arbeidsprotokollen som har vært brukt for rask, forenklet og pålitelig mus genotyping i tidligere publikasjoner 2-6. Musehaler oget kommersielt tilgjengelig kit benyttes. Denne protokollen innbefatter ett-trinns ekstrahering av nukleinsyrer fra vevet, og krever heller ikke en nukleinsyre-syre rensetrinn eller anvendelse av en termineringsbuffer ("stopp-løsning"). Påliteligheten av denne genotyping fremgangsmåte er illustrert ved å presentere resultatene av en serie tester ved forskjeller blir innført med hensyn til utgangsmengden av prøvene, i en alder av dyrene og lengden av PCR-amplikoner. Dette settet tilbyr fordelene ved automatisert utvinning og pålitelighet.

For å få til å være omfattende, er bruken av tatovering for langsiktig identifikasjon av genotypede mus også demonstrert. Tatovering oppnås ved å påføre tatovering blekk til dermis av huden (under epidermis) 7. En fremgangsmåte er beskrevet for tatovering poten pads av nyfødte eller en dag gamle mus, selv om tatovering kan anvendes på andre deler av kroppen, slik som haler og tær, og å Animals i alle aldre. I tillegg vil fremgangsmåten bli demonstrert for plating og dyrking mus neuroner ved en lav densitet, basert på optimal fremstilling av forskjellige typer av glial næringslag 2,8.

Vi bruker en genetisk musemodell for den arvet nevrologisk lidelse DYT1 dystoni - en autosomal-dominant bevegelse lidelse forårsaket av en mutasjon i genet TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. Den kodede protein, Torsina, tilhører de "ATPaser forbundet med ulike cellulære aktiviteter" (AAA +) familie av proteiner, hvis medlemmer generelt utføre anstand-lignende funksjoner, bistå i: protein utfolder seg, protein-kompleks demontering, membran menneskehandel, og vesikkelfusjon 10-13. Mutasjonen resulterer i en i-ramme sletting av et kodon for glutaminsyre, og kan føre til manifestasjon av "early-onset generalisert isolert dystoni '14,15. Imidlertid banenophysiological mekanismene som er ansvarlig for denne lidelsen er fortsatt dårlig forstått. I en knock-in mus modell, er mutant allel Tor1a tm2Wtd, nevnt heretter som Tor1a AE. Heterozygot AE-Torsina knock-in mus er levedyktige og genetisk ligne menneskelige pasienter med DYT1 dystoni, mens homozygot knock-in mus dør etter fødselen 16,17, med ventetid til postnatal død påvirket av genetisk bakgrunn 18. Tidlige død homozygot knock-in mus krever at både genotyping av dyr og etablering av nevrale kulturer er gjennomført raskt. Som et annet eksempel på genotyping, Tfap2a (transkripsjonsfaktor AP-2α, aktive enhancer bindende protein 2α) vil bli brukt. Proteinet kodet for av dette genet er viktige i regulering av flere cellulære prosesser, for eksempel proliferasjon, differensiering, overlevelse og apoptose 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MERK: Alle dyr prosedyrer utført i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Iowa.

1. Langsiktig Identifikasjon av Mus Bruke Tatovering poten Pads

  1. Immobilisere en pote med labben pad (plantar overflate) vendt eksperimentator. Hold poten med tommelen og pekefingeren. Vær forsiktig så du ikke klemme labben.
    MERK: Stabil immobilisering er viktig for å sikre at tatoveringen pigment er plassert inn i dermis av poten pad, og dermed er permanent 7.
  2. Vattpinne labben pad med 70% etanol på et gasbind svamp eller bomullspinne.
  3. Påfør huden olje til en bomull-tipped applikator, og trykk forsiktig tuppen mot overflaten av pote pad flere ganger. Bruk kun en liten mengde hud olje; når de er tilstede i store mengder, vil det hindre tatoveringen pigment fra å nå huden.
  4. Dypp tuppen av tatovering nåler inn i tatovering blekk like førtil tatovering. Bruk rent, aseptisk og skarpe tatoveringsnåler, for å redusere smerte og muligheten for infeksjon, og også for å øke tatovering effektivitet.
  5. Mens pote pad overflaten er dekket med huden olje, trykker tatovering nål tips vertikalt og lett mot huden i sentrum av poten pad, og sprøyte blekket flere ganger. Se tabell av materialer / utstyr for informasjon om elektrisk tatovering system.
  6. Spray 70% etanol på et gasbind svamp, og trykk den mot labben for å fjerne ekstra tatovering pigment på hudoverflaten, og inspisere kvaliteten på tatovering. Sjekk at midten av pote puten har en mørk, rund flekk som avviker fra normal hud pigmentering. Hvis tatoveringen er ikke mørk eller stor nok for enkel visning, gjentar de tidligere tatoverings trinn.

2. Genotyping Nyfødte Mus bruker en rask PCR Genotyping Kit

  1. Desinfisere den distale ende av en musehale med 70% etanol, kuttes 5 mm eller mindre av halenspissen og overføre den til et rør med en 8-rør strimmel av den type som benyttes for PCR. Bruk en un-used barberblad for hver valp for å unngå kryssforurensning mellom prøver. Alternativt kan benytte en saks, men i dette tilfellet, forsiktig og grundig fjerning av det gjenværende vev på bladene ved hjelp av 70% etanol. Sjekk for blødning. Hvis blødningen oppstår, legg press kuttet del av halen med et gasbind svamp inntil blødningen har stoppet.
  2. Tilsett 200 ul av DNA-ekstraksjon løsning i hver PCR-rør inneholdende en prøve. Se tabell av materialer / utstyr for dens sammensetning og informasjon om settet.
  3. Plasser røret strimmelen inn i en PCR-thermal cycler og starte DNA-ekstraksjon ved bruk av følgende program: 1 syklus ved 55 ° C i 10 minutter, en syklus på 95 ° C i 10 minutter, og holdt ved 4 ° C.
    MERK: Dette er den samme PCR termosykler som er senere brukt for PCR.
  4. Etter at DNA-ekstraksjon er ferdig, fjerner røret stripe fra termosykleren ennd invertere fem ganger.
  5. Overføring 4 ul av løsningen (DNA-ekstrakt) av hver prøve til en un-anvendes rør av en 8-t-stripen, og bland med: 10 ul av 2X PCR ferdigblandet II, 2 ul av blandet forover og revers primere (anbefales ved 0,5 mikrometer, se tabell for material / Utstyr for sekvenser), og 4 pl nukleasefritt H 2 O, for hver prøve. Spin kort (f.eks 3 sek) med en table-top sentrifuge. Hold rørene på is til alle tider unntatt ved håndtering.
  6. Utføre termisk sykling. Se Table of Materials / Utstyr for termisk program.
  7. Oppdage de amplifiserte DNA-produkter. Legg den totale reaksjonsoppløsning fra PCR (20 ul) direkte inn i en brønn av en agarosegel. Laste molekylvektmarkører i en separat brønn. Påfør et elektrisk felt.
  8. Erverve fluorescens bilder av bandene under ultrafiolett lys.

3. Primær Culture of Mouse Brain Neurons på Glial Feeder Layer

MERK: Prosedyrene for hjernen disseksjon og celledissosiasjon (3.1) er felles for alle de påfølgende prosedyrer. Prosedyrene for mus gliaceller kulturer (3,2), rotte gliaceller kulturer (3.3), og muse nevrale kulturer (3.4) beskrives separat etterpå.

  1. Brain Dissection og Cellular Dissocaiation
    1. Ofre en mus eller rotte valp ved halshogging, raskt fjerne hjernen, og plassere den i Hanks 'løsning (se tabell 1 for komposisjon) + 20% føtalt bovint serum (FBS) i et 35 mm tallerken (holdt på is).
    2. Skjær hjernen gjennom midtlinjen i to halvkuler. Fjern regionen av interesse (f.eks cerebral cortex, striatum og hippocampus) fra hver halvkule av hjernen. Fjern hjernehinnene og store blodårer fra overflaten. Skjær hjernen regionen inn 4-10 tynne skiver ved hjelp av en kirurgisk kniv.
    3. Skyll hjernen skiver i en 15 ml sentrifuge tube, når viddh Hanks 'oppløsning + 20% FBS, deretter 3 ganger med Hanks' oppløsning (det vil si, uten serum) (alle ved 4 ° C). Å skylle, tilsett 5-10 ml oppløsning, la hjernen skiver bosette i bunnen av røret, aspirer løsning fra toppen, og legge til en ny løsning. Ferdig skylleprosedyren ved å aspirere løsningen.
    4. Filtrer 2 ml av trypsin-inneholdende fordøyelsen løsning (se tabell 1 for blanding) ved bruk av en 3 ml sprøyte og en 0,2 um sprøytefilter, og tilsett filtratet direkte inn i rør inneholdende de hjerneskiver. La trypsinisering forløpe i 13 min ved RT.
    5. Nøytralisere trypsin løsningen først ved å suge det meste av det, og deretter ved tilsetning av 7-10 ml av Hanks 'oppløsning + 20% FBS (4 ° C).
    6. Skyll hjerneskiver, to ganger med Hanks 'oppløsning + 20% FBS, og deretter tre ganger med Hanks' oppløsning (dvs. uten serum) (alle ved 4 ° C). Ferdig skylleprosedyren ved aspirasjon av solution.
    7. Filtrer 2 ml av dissosiasjon løsning (se tabell 1 for blanding) ved bruk av en 3 ml sprøyte og en 0,2 um sprøytefilter, og tilsett filtratet direkte til røret med hjerneskiver.
    8. Mekanisk dissosiere cellene ved forsiktig triturering 10-20 ganger, til synlige vev stykker forsvinne. Bruk en bomulls-plugget, brann-polert Pasteur pipette og unngå å lage bobler under utgnidning.
    9. Vent 3 min for små biter for å slå seg ned.
    10. Overføre størstedelen av den oppløsning (~ 1,5 ml, slik at noen løsning på bunnen) til et 15 ml sentrifuge rør som inneholder 3 ml Hanks 'oppløsning + 20% FBS-oppløsning (4 ° C), ved bruk av bomull-plugget, heli- polert Pasteur pipette. Ikke overføre all løsning fordi inkludering av noen sediment på bunnen vanligvis resulterer i forringelse av kulturen.
    11. Sentrifuger i 13 minutter ved ~ 185 g (~ 1100 rpm) ved 4 ° C.
    12. Aspirer supernatanten forsiktig,tilsett 1 ml forvarmet pletteringsmedium (37 ° C) til pelleten, og resuspender den ved forsiktig pipettering flere ganger ved bruk av bomull-plugget, flammebehandlet Pasteur pipette.
      MERK: Tre forskjellige typer plating medier brukes til ulike kultur formål: plating medium-en for mus gliaceller, plating medium-2 for mus nevroner, og plating medium-3 for rotte nevroner og gliaceller (se tabell 1 for komposisjoner) .
    13. Ta ut 10 ul av cellesuspensjonen, blandes med 10 ul av 0,4% trypanblått-oppløsning, og måle tettheten av levende celler, enten ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisk celleteller.
  2. Mus Glial kulturer
    1. Vask Dekk å bidra til å etablere sunne kulturer av museceller.
      1. Dyppe dekkglass (rund, 12 mm diameter) i 70% salpetersyre i et glasspetriskål. Beskytt mot lys ved hjelp av aluminiumsfolie, og legg den på en orbitalrister O / N.
      2. Skyll glasset coverslips i petriskål minst tre ganger med destillert vann. Fordype dem i destillert vann. Sett fatet på en orbitalrister O / N.
      3. Tørk Dekk på et Whatman 150 mm filterpapir i den biologiske sikkerhetsskap.
      4. Autoklavere Dekk.
      5. Plasser Dekk i 24-brønnen kultur parabolen.
    2. Label og genotype nyfødte mus i henhold til trinn 1 og 2.
    3. Få hjerneceller fra mus unger, i henhold til trinn 3.1.
      MERK: Bruk av hjernebarken er typisk for utarbeidelse av mus glial mater lag. Men andre områder av hjernen, for eksempel hippocampus og striatum, vil fungere etter riktig justering av celletetthet på grunn av forskjellige tall og avkastning av celler fra ulike regioner.
    4. Legg ~ 4 ml forvarmet pletteringsmedium-en til den endelige cellesuspensjon (~ 1 ml). For pre-oppvarming kultur media, legger løsningen i kulturinkubatoren (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, tiltillate temperatur- og pH-verdier til å stabilisere seg.
    5. Overfør cellesuspensjonen til en ubelagt T25 kulturflaske ved bruk av bomull-plugget, flammebehandlet Pasteur pipette. Plassere kolben i kultur inkubator.
    6. På 1 dag in vitro (DIV), skylles de dyrkede celler i T25-kolbe to ganger med pletteringsmedium-1 (4 ° C). Plasser flasken tilbake i inkubatoren. Utføre skyllingen ved å aspirere mediet inne i kolben helt med en Pasteur-pipette, og legger til ~ 5 ml friskt medium og forsiktig vipping av kolben flere ganger i en virvlende bevegelse.
    7. På 6-9 DIV, (dvs. en dag før trypsinering og platekledning på dekkglass, i trinn 3.2.8-3.2.13), plasserer 100 mL av belegg materiale med ekstracellulære matrix proteiner (se tabell av materiell / utstyr for kommentarer om belegget materiale) på dekkglass i en kultur tallerken, og legg dyrkningsskålen i kulturinkubatoren.
    8. Ved 7-10 DIV, når cellene er 20-40% sammenflytende (romlig kontinuerlig), trypsineres dem.
      1. Skyll kolben en gang, ved å suge all oppløsningen i kolben og tilsetning av ~ 13 ml av Hanks 'oppløsning (4 ° C), forsiktig vippe kolben flere ganger i en virvlende bevegelse, og suge løsningen helt.
      2. Legg 40 ul av DNase-oppløsning (sluttkonsentrasjon, 750 enheter / ml) til 4 ml Trypsin-EDTA-løsning, passerer oppløsningen gjennom en 0,2 um sprøytefilter, og tilsett filtratet direkte til cellene i kolben.
      3. La trypsinisering forløpe i 13 min ved 37 ° C i inkubatoren.
      4. Nøytralisere trypsin-løsning ved å tilsette 2 ml av 100% FBS (4 ° C) til kolben.
      5. Overfør cellene trypsinert til et 15 ml rør sentrifugering ved anvendelse av en 5- til 10-ml pipette, tilsett ~ 4 ml av Hanks 'oppløsning + 20% FBS (4 ° C), sentrifuger ved ~ 185 g og 4 ° C i 13 min og supernatanten aspireres.
    9. Resuspender pelleten i 1 ml av pre-Warmed plette medium-1.
    10. Måle tettheten av cellene i henhold til trinn 3.1.13.
    11. Aspirere beleggmaterialet fullstendig fra dekkglass, og platen ~ 50 ul av de resuspenderte gliaceller på dekkglass.
      MERK: Disse cellene vil etablere glial mater lag.
    12. Plasser kultur fatet med dekk i inkubatoren.
    13. 20-60 min senere, tilsett 1 ml forvarmet plating medium-en til hver brønn, og sett formen tilbake i inkubatoren. Merk: Når pletteringsmedium blir tilsatt, vil det være nyttig å bruke en pipette for å trykke ned omkretsen av dekkglass (der det ikke er belagt celler), slik at dekk ikke flyter i mediet.
    14. Ved en DIV av glial matelaget (det vil si, på den glass dekkglass), erstatte mediet med 1 ml forvarmet pletteringsmedium-en, ved å suge all oppløsning i en brønn, og så fylle den med friskt medium.
    15. 2-3 DIV av glial mater lag når cells er 80-100% konfluent, tilsett mitotisk inhibitor (10 ul av en blanding av 5-fluor-2'-deoksyuridin + uridin; sluttkonsentrasjoner på 81,2 og 204,8 mM, respektivt) til hver brønn, for å inhibere DNA-replikasjon og derfor undertrykke glial-celleproliferasjon.
    16. Ved 7-9 DIV, når cellene er 90-100% sammenflytende (1-2 timer før utplating neuroner på glial matesjikt) må kulturmediet med forvarmet pletteringsmedium-2 (37 ° C).
      MERK: Nerveceller vil bli belagt på samme dag, ved hjelp av trinn 3.4.
  3. Rotte Glial kulturer
    1. Belegge en T25 kulturflaske med samme beleggmateriale.
      MERK: Dette er nødvendig for senere fjerning av ikke-adherente celler i trinn 3.3.5.
      1. Tilsett 2,0 ml av beleggmaterialet til kolben, og plassere kolben i kulturinkubator.
      2. Etter 2-3 timer, aspirere beleggmaterialet fullstendig, slik at bunnen av kolben blir tørr.
    2. Skaff cellenefra rotteunger, i henhold til trinn 3.1.
      MERK: CA3-CA1 regionen av hippocampus anvendes for fremstilling av rotte-glial matersjikt. Imidlertid kan andre hjerneregioner, slik som cerebral cortex og striatum, vil arbeide etter å ha justert for forskjeller i celletetthet på grunn av forskjellig antall og utbytter av celler fra forskjellige regioner.
    3. Legg ~ 4 ml forvarmet pletteringsmedium-3 til den endelige cellesuspensjon (~ 1 ml).
    4. Overfør cellesuspensjonen inn i den belagte T25 kulturflaske ved bruk av bomull-plugget, flammebehandlet Pasteur pipette. Plassere kolben i kultur inkubator (5% CO2 -95% O 2, 37 ° C).
    5. 2-3 DIV, når cellene er 20-40% konfluent, fjerne ikke-adherente eller svakt adherente celler, ved å lukke lokket tett, risting kolben kraftig ~ 10 ganger, aspirering av oppløsningen og tilsetning av 4-5 ml av plette medium-3 (ved 4 ° C). Gjenta denne prosedyren en gang. Undersøke de dyrkede celler i hele kolbe etasje (f.eksved hjelp av fasekontrastmikroskop) for å bekrefte at de som vises neuronal (dvs. de for hvilke den ytre kanten av cellelegemet vises fase-lys) er fullstendig fjernet. Gjenta prosedyren så ofte som nødvendig for å fjerne disse cellene, og deretter returnere flasken til inkubatoren.
      MERK: styrke og det totale antallet 'rister' kreves kan variere mellom individuelle forskere. Det viktigste er ikke å holde det totale antall shakes til et bestemt antall, men for å bekrefte at nervelignende celler er eliminert.
    6. Ved 6-8 DIV, når cellene er 90-100% konfluent, passasjen gliacellene ved trypsinizing dem som i trinn 3.2.8.
    7. Etter sentrifugering, resuspender pelleten i 1 ml av pletteringsmedium-3 (4 ° C) tilsettes 10 ml av pletteringsmedium-3 (4 ° C), overfører de trypsinert celler til en un-belagt T75-kolbe og kulturen dem i inkubatoren.
      MERK: Rotte gliacellene skal passeres to ganger; i motsetning til mus gliacellene are passaged bare en gang fordi de blir usunn etter flere passasjer. Rotte gliaceller vil bli passert i T75-kolber som ikke er belagt med en hvilken som helst beleggmateriale. Belegget gjør rotte gliaceller å vokse for fort og gi mange cilierte celler (antatte ependymal celler), som vil forringes nevronale kultur tilstand senere.
    8. Ved 17-19 DIV glial kultur i en kolbe (dvs. 11 dager etter passering og én dag før trypsinering og belegging på dekkglass ved trinn 3.3.9-3.3.14), plassere 100 pl av beleggmaterialet på uvaskede dekkglass ( runde, 12 mm diameter) i en kultur tallerken, og legg dyrkningsskålen i kulturinkubatoren.
      MERK: For rotte gliaceller kulturer, ble en forskjell ikke lagt merke til i kultur resultater med eller uten å vaske glassene.
    9. På 18-20 DIV av glial kultur i en kolbe (dvs. 12 dager etter passaging), forberede glial mater lag ved trypsinizing de dyrkede celler, ifølge step 3.2.8.
    10. Under sentrifugering, aspirere beleggmaterialet fullstendig fra dekkglass.
    11. Etter sentrifugering, resuspender pelleten i 1 ml av pletteringsmedium-3 (4 ° C), og måle celletettheten, ifølge trinn 3.1.13.
    12. Juster glial tettheten til 10 4 levende celler / ml, og plate 100 ul av glial cellesuspensjonen på de belagte dekkglass.
      MERK: Disse cellene vil etablere glial mater lag.
    13. Plasser kultur fatet med dekk inn i inkubator for 20-60 min.
    14. Tilsett 1 ml plating medium-3 (4 ° C) til hver brønn, og sett formen tilbake i inkubatoren.
    15. 3-4 DIV av glial matersjikt, når cellene på dekkglass er 40-80% konfluent, tilsett 1 ml av den forvarmede vekstmedium (se tabell 1 for blanding) som inneholder cytosin β-D-arabinofuranoside ( AraC, sluttkonsentrasjon på 4 pM) for å stoppe glial-celleproliferasjon. Plate nevrons ved 7-9 DIV av glial matersjikt når cellene er 60-80% konfluent, ved hjelp av trinn 3.4.
  4. Mus Nevronale kulturer
    1. Label og genotype nyfødte mus i henhold til trinn 1 og 2.
    2. Bruk museunger for trinn 3.1.
    3. Juster tettheten av levende cellesuspensjon til ~ 2,0 x 10 5 celler / ml ved hjelp av forvarmet plating medium-2 for plating på mus gliaceller, eller ved hjelp av plating medium-3 for plating på rotte gliaceller.
    4. Plate cellene på glial matersjikt, ved forsiktig tilsetning av cellesuspensjonen i kulturmediet for hver brønn. Merk: Volumet av cellesuspensjonen som skal tilsettes vil være bestemt av målet antall celler i et kulturbrønn. For eksempel plate ~ 60 ul av cellesuspensjonen for å oppnå 12 000 celler / brønn.
    5. Legg merke til at ingen løsning endringer er nødvendig etter nervecellene er belagt. Vær forsiktig for å unngå fordamping av løsningen fra brønnene i løpet av kultur, ved fukting innsiden of kulturinkubatoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Som et eksempel på anvendelse av denne protokollen, er representative resultatene vist for merking mus ved tatovering, pålitelig genotyping under ulike eksperimentelle forhold, og etablere primære nevrale kulturer på gliale næringslag.

Tatovering

Nyfødte valper ble merket på tredeputene med en tatovering system ('Newborn "i figur 1). Etikettene forble klart synlig 3 uker ('3-ukers-gamle ") og 32 ukers alder ('32 -week gamle'). Den individuelle mus kan identifiseres ved en kombinasjon av tatovering på de fire poter (tallene 1 til 16), og ved informasjonen om dyrets bur, eller mer komplekse nummereringsordningene (ikke vist).

Genotyping

Ett representativt eksempel på genotyping er vist (figur 2). Den Tor1a genet av vill-type (Tor1a (Tor1a + / AE) og homozygot (Tor1a AE / AE) AE-Torsina knock-in mus forsterket fra genomisk DNA isolert fra hale klipp av nyfødte valper. Genotyping i dette spesifikke eksemplet er basert på tilstedeværelsen av et enkelt 34-basepar loxP området i det mutante allelet Tor1a etter vellykket Cre rekombinasjon og sletting av en neomycinresistens kassetten 16,18.

Genomisk DNA ble ekstrahert med minimal hands-on tid, og mange prøver ble behandlet samtidig. Uttrekksvolum ble holdt konstant, og derfor ingen justering av volumet var nødvendig for å imøtekomme endringer i betingelsene som ble testet. Påliteligheten av genotyping ble testet under fire forhold, som beskrevet nedenfor.

Først, ble effekten av forskjeller i mengden av utgangsvevet undersøkes (figur 3). Haler av ulike lengder varforberedt fra heterozygot AE-Torsina knock-in mus (Tor1a + / AE) på avvenning alder (~ 3 uker). Hale lengder på 2 til 5 mm, idet området typisk anbefalt i genotyping protokoller, ga den samme genotyping resultat av høy kvalitet. De to bånd tilsvarer villtype og muterte alleler (Tor1a + og Tor1a AE, henholdsvis).

Sekund, ble effekten av variasjon i dyre alder undersøkes (figur 4). Haler ble hentet fra nyfødt, 3 uker gamle og ~ 24 uker gamle heterozygot AE-Torsina knock-in mus (Tor1a + / AE). Homozygoter ble ikke brukt fordi de dør flere dager etter fødselen 16-18. De to forventede band for villtype og muterte Tor1a gener var synlige uansett dyr alder (Figur 4A). Den generelle anvendelighet av dette resultatet ble testet ved hjelp av et andre gen, Tfap2a 19 i vill-type mus (Tfap2a + / +) (figur 4b).

For det tredje ble virkningene av forskjeller i lengden av PCR-amplikoner testet (figur 5). For dette formål ble forskjellige primerpar syntetisert for et gitt gen, slik at det amplifiserte DNA er av forskjellige lengder basepar. Den Tfap2a genet ble konsekvent påvist med forskjellige amplicon lengder.

For det fjerde, ble to DNA-ekstraksjonsmetoder sammenlignet (figur 6). I en metode, ble PCR-bånd rør og PCR thermal cycler brukes (som er beskrevet i trinn 2). Dette er en automatisert, parallell med flere rør utvinningsmetoden ("Auto" i figur 6). Fordi flere rør kan håndteres samtidig i strimmelen format, og en PCR maskinen brukes med et program for å operere i fire trinn temperatur, er det ikke nødvendig å overføre rør, manuelt endre temperaturen i løpet av ekstraksjon eller bruk av flere stykkerav utstyr. Dermed er det lett å behandle flere prøver. Dette ble sammenlignet med den andre metoden basert på manuell, single-tube utvinning (Manuell i figur 6). Dette bruker individuelle PCR rør og separate ikke-PCR-maskiner (varmeblokker og vannbad) for å kontrollere temperaturen i løpet av DNA-ekstraksjon. I dette tilfelle ble bare en, enkelt rør flyttet til en ny temperatur etter hvert trinn, noe som krever flere temperaturregulerende anordninger. I begge tilfeller ble den Tor1a genet analysert i vill-type, heterozygot og homozygot AE-Torsina knock-in-mus (figur 6A), og Tfap2a genet ble analysert i villtype-mus (figur 6B). De to utvinning protokoller gitt tilsvar genotyping resultater.

Som en oppsummering av resultatene er presentert i figurene 3 til 6 viser at genotyping fremgangsmåte er robust, oppnå pålitelige og reproduserbare resultater på tross av variations i vev beløp, alder på dyr, amplicon lengde, og utvinning protokollen som brukes.

Nevrale kulturer

For dyrking av muse nevroner på musen glial mater lag, rekkefølgen av prosedyrene er: (tatovering nyfødte mus → genotyping for glial kultur →) glial kultur → tatovering nyfødte mus → genotyping for neuronal kultur → neuronal kultur. For kulturer etablert på rotte glial mater lag, prosedyrene i parentes er hoppet over.

Vi undersøkte støttende effekten av pre-seeded glial mater lag på neuronal overlevelse og vekst. Nerveceller ble oppnådd fra CA3-CA1 regionen av hippocampus, motor regionen i cerebral cortex og striatum av nyfødte villtype-mus. De ble sådd ut ved lav tetthet på rotte glial matersjikt som hadde blitt oppnådd fra CA3-CA1 regionen av hippocampus og podet før neuronal plating, ifølgeordningen som er vist på figur 7 (forenklet oppsummering av fremgangsmåten). Lav tetthet kulturer er optimal for avbildning av individuelle dendritter, somata 4,6, nerveterminaler 2,3,5,8 og aksonale sjakter 5 med høy romlig oppløsning. De hippokampale celler (inneholdende både neuroner og gliaceller) ble sådd ut på belagte dekkglass, enten med (figur 8A) eller uten et på forhånd fastsatt glial matersjikt (figur 8B, C) ​​og observert med optikk fase-kontrast. I nærvær av en nesten sammenflytende glial mateslag, neuronene (i hvert panel, indikerer en pilspiss en representativ neuron) ble relativt dispergert 3 og 7 dager etter plating (dager in vitro, DIV) (figur 8A). De viste også tegn på god helse, som for eksempel en klar margin av nevronale somata, utvidet dendritter, mangel på klynget somata, og en mangel på buntet neuritter (høy forstørrelse images i innfellinger). På 14 DIV, disse nevronene dannet et tett nettverk preget av lange neuritter (dendritter og aksoner). Legg merke til at glial proliferasjon ble inhibert før neuroner ble sådd ut, ved tilsetning av vekstmedium inneholdende den mitotisk inhibitor AraC (trinn 3.3.15).

I motsetning til dette, i fravær av glial mateslag ved plating hippokampale neuroner, ble veksten av dyrkede hippocampale neuroner svekket, selv i fravær av AraC. Ved 3 DIV, har gliacellene (inkludert i de nylig belagt hippocampus celler) ikke dannet en konfluent ark (stjerne i toppen panel av figur 8B). Kulturene viste flere tegn som ikke passer seg for høyoppløselig bildediagnostikk, som for eksempel store områder uten underliggende gliacellene (stjerne), tilstedeværelse av klynget somata og tilstedeværelsen av buntet neuritter i enkelte områder (data ikke vist). Ved 7 DIV, gliaceller dannet en konfluent ark (midten panel av figur 8C). Howeveh, nevroner var færre i antall enn når nevronene ble sådd ut på en pre-etablert glial mater lag. De overlevende nevroner manglet også lange, nettverksdannende neuritter (innfelt). Gliacellene var mer heterogen i krumning og tykkelse enn de i matersjikt kultur, således som vises fase-lyse. For å teste effekten av å undertrykke glial proliferasjon av nerveceller, søkte vi AraC-inneholdende vekstmedium. Når AraC ble tilsatt på 3 eller 7 DIV, og cellene ble dyrket inntil 14 DIV og observert på denne dagen (figur 8B og C, bunnpaneler), gliacellene dekket mesteparten av dekkflaten. Imidlertid neuronene var fremdeles få i antall, spesielt når AraC ble påført på 7 DIV. De overlevende nevroner hadde bare korte prosesser og ble ikke i stor utstrekning tilkoblet. Dermed blir sen tillegg av AraC tillatt en uniform glial laget for å lage, men ikke fremme neuronal levedyktighet eller neurite forlengelse; snarere den ukontrollerte glial veksthadde skadelige virkninger på nerveceller.

Disse data viser at den glial mateslag er kritisk for overlevelsen og veksten av neuroner belagt ved lav tetthet, og at den glial sjikt må være til stede på tidspunktet for neuronal plette heller enn senere under neuronal kultur. Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av kulturer av cerebral kortikale (figur 9) og striatum-neuroner (figur 10).

Kvalitativ observasjon om neuronoverlevelse ble bekreftet av kvantitativ analyse. Nærmere bestemt, ble antall overlevende nevroner i 14 DIV telles, basert på bilder fasekontrast av kulturene (figur 11). Tallet var størst for nerveceller dyrket på en glial mater lag (ie., Belegg på glial mater lag). Antallet var lavere i tilfelle av nerveceller dyrket i fravær av en glial matersjikt. Antallet ble redusert ytterligere når cellene ble behandlet med AraC ved ensenere tid. Disse forskjellene var statistisk signifikant, og ble notert i kulturer av nevroner hentet fra alle tre områder av hjernen.

De typer av overlevende celler ble identifisert ved 14 DIV i mus hippocampale kulturer belagt på rotte hippocampus matersjikt. Dobbelt immunocytokjemi ble utført ved bruk av antistoffer mot neuronal markør, mikrotubuli-assosiert protein 2 (MAP2), og astrocytic glial cellemarkør, glial fibrillært surt protein (GFAP). Cellene med utvidet prosesser var positive for MAP2, mens cellene i det underliggende glial matersjikt var positive for GFAP (to representative bildefelt, figur 12A). Denne fargingen var ikke et produkt av en bestemt kombinasjon av primære og sekundære antistoffer, fordi det samme mønster ble oppnådd når et annet sett av sekundære antistoffer ble benyttet (Figur 12B).

I motsetning til dette, når den samme farging ble PERFORMED på kulturer som består av bare en glial mateslag, dvs. i fravær av tilsatt museceller (to representative bildefelt, figur 13A), ingen celler var positive for MAP2. Cellene i matersjikt var konsistent positiv for GFAP. For en negativ kontroll, ble både primære antistoffer utelatt fra immunocytokjemisk prosedyre (figur 13B). Ingen farging ble påvist i disse eksemplene, selv om celler var tilstede, som det fremgår av de utsendte lys kontrast optikk (differensial forstyrrelser, DIC) og kjerne farving med Hoechst fargestoff. Således, ikke-spesifikk farging i MAP2 og GFAP kanaler var meget svak.

Disse immunocytokjemiske data ble også analysert kvantitativt (figur 14). I hver 8-bits bilde, ble intensiteten målt og plottet langs en linje. Kledde tomter avsløre MAP2 flekker når museceller (prøver som inneholder nevroner) ble dyrket på en glial mater lag (Neuron +,gliaceller +, primære antistoff (1 ° Ab) +), mens en slik farging var fraværende i kulturer av glial feeder-celler alene (Neuron -, gliaceller +, 1 ° Ab +). I en negativ kontroll uten primære antistoffer, farging var ubetydelig i kulturer av glial mateceller alene (Neuron -, gliaceller +, 1 ° Ab -). GFAP farging var synlig i glial mateslag, uavhengig av om museceller ble platet ut (Neuron +, gliaceller +, 1 ° Ab +) eller ikke (Neuron -, gliaceller +, 1 ° Ab +). Igjen, farging i den negative kontroll var neglisjerbar (Neuron -, gliaceller +, 1 ° Ab -). Disse resultater viser at rotten glial matersjikt var sammensatt hovedsakelig av astrocytter, og at neuronene var tilstede bare når museceller ble tilsatt. De indikerer også at nervecellene som finnes i disse kulturene stammer utelukkende fra mus.

Resultatene delen av online video viser også DIC og MAP2 bilder av dyrkede nerveceller belagt på en glial mater lag, Both fremstilt fra CA3-CA1 hippocampal regionen av villtype-mus.

For detaljert kontroll av cellekultur, er det anbefalt å måle tettheten av levende celler, både for å vurdere den generelle kvalitet av hjernen disseksjon og cellulære dissosiasjon trinn, og for plating av cellene på forhånd bestemt tetthet. Nedenfor er fire sett med typiske tetthetsmålinger. Vær imidlertid oppmerksom på at disse tallene kan variere avhengig av dyrkningsforhold og reagenser. For eksempel, kan til og med forskjellige massevis av serum fra samme leverandør påvirke resultatene. Derfor bør disse tallene betraktes som en generell indikator, i stedet for en absolutt retningslinje.

For mobil dissosiasjon (trinn 3.1.13), typiske verdier for live-celle tetthet hentet fra en valp er: ~ 2 x 10 5 celler / ml (mus motor cortex og mus CA3-CA1 hippocampus), ~ 5 x 10 5 celler / ml (mus hjernebarken og rotte CA3-CA1 hippocampus), og ~ 1 x 10 6 cells / ml (mus striatum). I alle disse tilfeller er de fraksjoner av levende celler var> 90% (levedyktighet, definert som forholdet mellom antall levende celler til at av det totale antall celler). Motoren cortex er løst definert som det område av cerebral cortex som ligger umiddelbart dorsal til striatum 20. For hippocampale kulturer, CA3 og CA1 regioner av hippocampus riktig er foretrukket. Hele hippocampus innbefatter i tillegg dentate gyrus, inkludering av noe som fører til dannelse av store nerveterminaler av granule celler og introduserer heterogenitet i synaptiske egenskaper 21. De striatale kultur omfatter caudatus-putamen og globus pallidus, men inkluderer ikke nucleus accumbens, eller mediale eller laterale septal kjerner i de nærliggende strukturer.

For mus glial kultur (trinn 3.2.11), er pletteringstetthet ~ 10000 gliaceller på hver 12 mm runde dekkglass, ved hjelp av ~ 50 ul av cellesuspensjonen til en tetthet på ~ 2 x10 5 celler / ml. Vanligvis er tettheten målt i supernatanten er forholdsvis konstant, og krever ikke justering. For å konvertere den tetthet over forskjellige områder, er den nyttig informasjon som dekkglass har en diameter på 1,20 cm og et areal på 1,13 cm2. Således ~ 10.000 celler / dekk = ~ 8800 celler / cm2 på et dekkglass.

For rotte glial kultur (trinn 3.3.12), er den plette tetthet ~ 1000 gliaceller på hver 12 mm runde dekkglass, ved hjelp av ~ 100 ul av cellesuspensjonen til en tetthet på 1x10 ~ 4 celler / ml. Således 1000 celler / dekk = ~ 900 celler / cm2 på et dekkglass.

For lav tetthet mus neuronal kultur (trinn 3.4.4), varierer beleggtetthet mellom 2000 og 48 000 celler per brønn i en 24-brønners plate. Typiske verdier når plating nevroner på rotte gliaceller er: 10,000-24,000 celler / brønn for cerebral kortikale nevroner, 12,000-24,000 celler / brønn for CA3-CA1 hippocampus nevroner og 24,000-48,000 celler / godt for striatale nevroner. Ved utsåing på mus gliaceller, er antallet redusert, f.eks 2.000 celler / brønn i CA3-CA1-neuronene i hippocampus. Som en side note, for plating rotte CA3-CA1 hippocampus nevroner på en rotte glial mater lag, er det plating tettheten 1,000-6,000 celler / brønn. For omdannelse av tettheten i en brønn til tettheten på et dekkglass, er den nyttig informasjon som den innvendige brønndiameter ved bunnen er 1,56 cm, og dens område er 1,91 cm2. Således, for eksempel, 12 000 celler / brønn = 7100 celler / dekk = 6300 celler / cm2 på et dekkglass. Disse densiteter ble valgt med sikte på å dyrke relativt glissen neuroner for høy oppløsning cellulær avbildning. Forskere bør velge sine tall som best passer deres eksperimentelle mål.

Figur 1
Figur 1. Tattooed paw pads av mus. Newborn mus ble merket med tatovering labben pads. De ble fotografert umiddelbart etter tatovering (nyfødt), ved 3 ukers alder (3 uker gamle), og ved 32 ukers alder (32 uker gammel). Etikettene forble lett synlig gjennom hele voksenlivet. Bilder ble tatt fra forskjellige dyr. De vises ikke på samme skala. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. genotyping av villtype (Tor1a + / +), heterozygotisk (Tor1a + / AE) og homozygot (Tor1a AE / AE) AE-Torsina knock-i mus. De Tor1a genet alleler ble analysert i villtype og mutant former, ved hjelp av DNA ekstrahert fra haler av nyfødte valper. Tail tipsene var ~ 4 mm i lengde. DNA ble farget med SYBR Sikker DNA Gel Stain. Se Table of Materials / Utstyr for informasjon om primere og termisk sykling program for Tor1a genet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Påvisning av genomisk DNA i sammenheng med variasjon i mengden av utgangsmateriale. Hale spisser av forskjellig lengde ble anvendt. Testede dyr var tre uker gammel, heterozygot AE-Torsina knock-in mus (Tor1a + / AE). Baner representerer hale lengder på 2, 3, 4 og 5 mm, i duplikat (fra venstre). Hale tips ble oppnådd fra forskjellige mus. Molekylær-vekt størrelsesmarkører i den ytterste venstre kjørefelt representerer DNA lengder i sTeps av 100 basepar. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Påvisning av genomisk DNA i sammenheng med variasjon i dyre alder. (A) Tor1a genet. Lanes representerer halen tips hentet fra heterozygot AE-Torsina knock-in mus (Tor1a + / AE) på følgende stadier: nyfødt, 3 uker gamle, og ~ 24 uker gamle (i duplikater fra venstre) (B). Tfap2a genet. Lanes representerer halen tips hentet fra villtype (Tfap2a + / +) mus på følgende stadier: nyfødt, 3 uker gamle, og ~ 24 uker gamle (i duplikater fra venstre). Begge genene ble amplifisert fra haler ~ 4 mm i lengde. Den forventede PCR fragmentet er 498 bp. PCR program wa er den samme som brukes for Tor1a genet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Påvisning av genomisk DNA i sammenheng med variasjonen i lengden av PCR-amplikon. Den Tfap2a-genet ble analysert med PCR-amplikon lengder på 498 bp (venstre baner), 983 bp (middel baner) og 1990 bp (høyre) i baner duplikater. Genet ble amplifisert fra haler av 3 uker gamle mus. Molekylær-vekt størrelsesmarkører i lengst til venstre og lengst til høyre baner av gelen representerer DNA-lengder i trinn på 100 og 200 basepar, henholdsvis. Se Table of Materials / Utstyr for informasjon om primere for forskjellige amplikonene. 879fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Påvisning av genomisk DNA i sammenheng med variasjon i DNA-ekstraksjon metode. Outcomes for håndboken er single-tube utvinning (manuell) og automatiserte, parallelle multi tube utvinning metoder (Auto) sammenlignet. Den sistnevnte metode ble benyttet i denne rapporten. Gener ble forsterket fra haler ~ 4 mm i lengde, samlet inn fra nyfødte. (A) Tor1a genet i de nyfødte valper av AE-Torsina knock-in mus. Lanes representerer DNA hentet fra villtype (manuell og automatisk), heterozygot (manuell og automatisk), og homozygot mus (manuell og automatisk) (fra venstre). (B) Tfap2a genet i 3-ukers gamle villtype mus. Den forventede PCR fragmentet er 498 bp.jove.com/files/ftp_upload/51879/51879fig6highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. forenklet, skjematisk illustrasjon av fremgangsmåtene for plating mus nevroner i mus (A) og rotte (B) glial næringslag. Tallene dager (dager in vitro) refererer til de kumulative dager etter gliacellene er først belagt i kultur kolber. De tjener bare som et grovt anslag. Av praktiske detaljer, se Prosedyrer delen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8
Figur 8. Støttende effektglial mater lag på vekst av hippokampale neuroner i en lav-tetthet kulturen. Nerveceller ble oppnådd fra CA3-CA1 regionen av hippocampus av nyfødte, villtype-mus. (A) Mus hippokampale celler ble sådd ut på belagte dekkglass, noe hadde blitt forhånds podet med en rotte glial matersjikt oppnådd fra CA3-CA1 regionen av hippocampus. Nevronene ble spredt jevnt på en sunn måte. Kulturer ble observert ved 3, 7 og 14 DIV. (B, C) ​​Mus hippokampale celler ble sådd ut på belagte dekkglass, som ikke hadde noen forhåndsetablert lag mater. Kulturer ble observert ved 3 DIV (toppanelet i B) og 7 DIV (midtpanelet i C) uten AraC behandling. I andre sett av kulturer, ble cellene behandlet med AraC i 3 DIV (nedre panel i B) og 7 DIV (nedre panel i C), og observert ved 14 DIV. Alle bildene representerer søster kulturer hentet fra den samme valp, hvis nevronene ble belagt på samme dag. Se teksten for detaljer. For hvert panel, en exrikelig av et nevron er angitt med en hvit pilspiss og forstørret i et innfelt. Nerveceller har celle organer som omkretsen ser lyse når sett av optikk fase kontrast, og de har også tykke prosesser. Stjernene indikerer områder uten gliaceller. Kulturene ble fotografert live på en invertert mikroskop ved hjelp av optikk fase kontrast med 20X objektiv (numerisk apertur på 0,45) uten mellom objektiv (dvs. på 1x). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 9
Figur 9. støttende effekten av glial matersjikt på veksten av cerebrale cortikale neuroner i en lav-tetthet kulturen. Lignende resultater som i figur 8, men med neuroner oppnådd fra motoren regionen i cerebral cortex. Vilkårene etter etiketter AC tilsvarer de i Figur 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 10
Figur 10. støttende effekten av glial matersjikt på veksten av striatum-neuroner i en lav tetthet kulturen. Lignende resultater som i figurene 8 og 9, men med neuroner oppnådd fra striatum. Vilkårene etter etiketter AC tilsvarer de i Figur 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 11. støttende effekten av glial matersjikt på neuronal overlevelse. Antallet overlevende neuroner ble tellet i de eksperimenter som er vist i figur 8, ved hjelp av bilder som overtas av fasekontrastmikroskopi. Bilder for 14 DIV Her vises igjen, men med pilspisser peker på eksempler på telte nevroner. Stolpediagrammet viser antall neuroner pr bildefelt (449,0 um x 335,5 mm) (gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet n = 7-24 felt for hver kultur tilstand). Stjernene angir statistisk signifikante forskjeller fra 'Glial mater lag (-), AraC på 3 DIV »og« Glial mater lag (-), AraC på 7 DIV' fra 'Glial mater lag (+)' (* p <0,05, ** p <0,01, uparet Student t-test). Tallene ovenfor viser linjene nevronale tetthet målt i montasjer av flere bildefelt. Bildene bleanskaffet ved hjelp av en 20X objektiv. For å unngå skjevhet anskaffelse, ble alle bildene fremskaffet langs en hel vertikal stripe, fra toppen til bunnen av et dekkglass, og passerer gjennom det omtrentlige sentrum av dekkglass. Individuelle bilder hadde noen overlapping (f.eks, 1/6 til 1/4 av et bildefelt på topp og bunn). To metoder ble anvendt for analysen. I den ene ble neuroner tellet i vekslende bilder for å sikre at de enkelte neuroner ikke ble tellet mer enn en gang. De resulterende tall ble brukt til å generere den søylediagram. I den andre fremgangsmåte, ble en enkel montasje opprettet fra de enkelte bilder. De ble sydd ved hjelp av Microsoft Image Composite Editor eller manuelt ved hjelp av Photoshop. De montasjer også ekskludert flere tellinger av de samme nerveceller. Numrene er oppført over stengene. I begge metodene, ble store områder på dekk periferien som ikke inneholdt noen celler ekskludert. Celler ble regnet som nevroner hvis de hadde celle organer som dukket opp lysav fasekontrastmikroskopi, samt utvidet cellulære prosesser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 12
Figur 12. immunocytokjemisk identifikasjon av celletyper i nevronale kulturer. Korresponderer Kulturen tilstanden til nederste venstre bilde av figur 8A. Nerveceller ble oppnådd fra CA3-CA1 regionen av hippocampus av villtype-mus, og belagt på en glial matesjikt generert fra CA3-CA1 regionen av hippocampus av villtype-rotter. De dyrkede celler ble analysert ved immunocytokjemi for neuronal markør MAP2, og astrocytic glial cellemarkør GFAP. Differensial interferens kontrast (DIC) mikroskopi ble benyttet for å vise den generelle morfologi av de avbildede feltene 14-17dager etter at nevronene ble belagt på glial mater lag. (A) Tre-farge flekker, inkludert kontra med atom markør Hoechst 33342 fargestoff. To representative bildefelt vises. (B) To-farge flekker, med ulike kombinasjoner av sekundære antistoffer konjugert med forskjellige fluorophores. I disse eksperimentene, ble de dyrkede celler fiksert med 4% paraformaldehyd og 4% sukrose i Tyrodes løsning (inneholdende i mM: 125 NaCl, 2 KCl, 2 CaCI2, 2 MgCI2, 30 D-glukose, 25 HEPES, pH 7.4 justeres med 5 M NaOH, ~ 310 mOsm uten justering) i 30 min ved 4 ° C. Etter å ha blitt vasket med Tyrodes løsning, ble de permeabilisert med 0,1% Triton X-100 i Tyrodes løsning i 10 min. De ble på nytt vasket med Tyrodes løsning og deretter blokkert med 2% normalt geiteserum i fosfat-bufret saltvann (PBS) (blokkering løsning) i 60 minutter ved RT. Deretter ble de behandlet med kanin polyklonale anti-MAP2 antistoff (AB5622; 400x fortynning i blokkeringsløsning), og muse-monoklonalt anti-GFAP cocktail (NE1015; 1,000x fortynning) O / N (15-21 timer) ved 4 ° C. Etter vaskinger med PBS, ble cellene inkubert med geite-anti-kanin og anti-mus IgG-antistoff konjugert med Alexa Fluor 405 (500x fortynning i blokkeringsløsning), Alexa Fluor 488 (1,000x) eller Alexa Fluor 568 fargestoff (500x) i 60 min ved RT. De ble vasket med PBS og observert direkte i PBS. I noen kulturer, etter siste vask i prosedyrene ovenfor, ble cellene behandlet med Hoechst 33342 0.5 mikrogram / ​​ml i PBS i 10 min ved RT, og vasket med PBS før observasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette figur.

Figur 13
Figur 13. immunofluorescensnocytochemical identifisering av celletyper i glial matelagskulturer. søster kulturer av rotte glial næringslag som i figur 12, men uten plettering av mus neuroner. (A) farging ved hjelp av immunocytokjemiske fremgangsmåtene beskrevet i figur 12A. To representative bildefelt vises. (B) Farging av glial mater lag ved hjelp av immunocytokjemiske prosedyrer beskrevet i A, men med de primære antistoffer utelatt. Alle MAP2 bilder i figurene 12A og 13A, B ble ervervet under samme bildeforhold, og vises på samme bildekontrast for å tillate sammenligning av intensitet. De samme fremgangsmåter ble anvendt for GFAP bilder i figurene 12A og 13A, B. Den glial matesjikt kultur ble fotografert på den samme dag som de kulturer i figur 12. Således kan de glial næringslag i 13 ble dyrket in vitro for samme tidsperiode. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 14
Figur 14. Intensitet av immunocytokjemisk farging. Lines ble trukket på bildene som vises i figurene 12 og 13, og intensiteten langs disse ble plottet. Innfellinger vise bilder i den øverste raden i figur 12A. De tre betingelser var: 1) plettering av museceller (inneholdende nevroner) på en rotte matersjikt og farging med de primære antistoffer (Neuron, gliaceller + +, 1 ° Ab +), 2) glial matersjikt bare (ikke neuronal plating) og farging med de primære antistoffer (Neuron -, gliaceller +, 1 ° Ab +), og 3) glial mateer laget bare (ingen nevronale plating) og flekker uten primære antistoffer (Neuron -, gliaceller +, 1 ° Ab -). Neuronal farging (MAP2) var til stede bare når museceller ble platet ut (forhold 1 vs 2), og glial-farging (GFAP) var til stede i begge sett av kulturer (forhold 1 vs 2). Den immunocytokjemisk farging var spesifikke for både primære antistoffer (vilkår 1 vs 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

LØSNINGER
TAE buffer (50x løsning)
Tris base, 486 g
Iseddik 114,2 ml
0,5 M EDTA, pH 8,0, 200 ml
Tilsett destillert vann for å bringe totalvolumet til 2 L
Utgjør i avtrekksskap.
Fortynne 50 ganger før bruk.
Hanks 'løsning
Hanks balanserte salter, uten kalsiumklorid, magnesiumsulfat og natriumbikarbonat (1 L)
NaHCO3, 350 mg (sluttkonsentrasjon 4,17 mM)
HEPES, 2,38 g (sluttkonsentrasjon 10 mM)
Juster til pH 7,4 ved anvendelse av 5 M NaOH.
Juster osmolaritet til 310 mOsm hjelp sukrose (Osmolaritet tendens til ~ 290 mOsm uten justering).
Tilsett destillert vann for å bringe totalvolumet til 1 L
Fordøyelse løsning (for trypsin behandling av hjernevev)
NaCl, 800,6 mg (sluttkonsentrasjon, 137 mM)
KCl, 37,3 mg (fInal konsentrasjon, 5 mm)
Na2 HPO 4 · (7H 2-O), 187,6 mg (sluttkonsentrasjon, 7 mM)
HEPES, 595,8 mg (sluttkonsentrasjon 25 mM)
Glukose, 97,3 mg (sluttkonsentrasjon, 5,4 mM)
Juster til pH 7,2 ved anvendelse av 5 M NaOH.
Osmolaritet tendens til ~ 310 mOsm uten justering.
Tilsett destillert vann for å bringe totalvolumet til 100 ml.
Rett før bruk, tilsett 20 mg trypsin (sluttkonsentrasjon på 10 mg / ml) og 20 pl av DNase (endelig konsentrasjon på 750 enheter / ml) til 2 ml av fordøyelsen løsning.
Dissosiasjon oppløsning (for mekanisk dissosiasjon av hjernevev)
Hanks 'løsning
MgSO4 · (7H 2-O), 295,1 mg (slutt concentratipå, 11.97 mM)
Juster osmolaritet til 310 mOsm hjelp sukrose.
Totalt volum er 100 ml.
Rett før bruk, tilsett 20 pl av DNase (endelig konsentrasjon på 750 enheter / ml) i 2 ml dissosiasjon løsning.
Plating medium-en (for mus gliaceller)
Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM), 449,5 ml
MITO + Serum Extender, 0,5 ml
FBS, 50 ml
Totalt volum er 500 ml.
Plating medium-2 (for mus nevroner)
Neurobasal-A, 485 ml
B27, 10 ml
Glutamax-I, 5 ml (sluttkonsentrasjon 2 mM)
Totalt volum er 500 ml.
Pletteringsmedium-3 (for rotte-neuroner og gliaceller)
Minimum Essential Media (MEM, uten fenolrød)
Glukose, 2,5 g (sluttkonsentrasjon, 27.8 mM)
NaHCO3, 100 mg (sluttkonsentrasjon 2,38 mM)
Transferrin, 50 mg
FBS, 50 ml
Glutamax-I, 5 ml (sluttkonsentrasjon 2 mM)
Insulin, 12,5 mg
Totalt volum er 500 ml.
Vekstmedium (for rotte neuroner og gliaceller)
MEM (uten fenolrødt)
Glukose, 2,5 g (sluttkonsentrasjon, 27.8 mM)
NaHCO3, 100 mg (sluttkonsentrasjon 2,38 mM)
Transferrin, 50 mg
FBS,25 ml
Glutamax-I, 1,25 ml (sluttkonsentrasjon, 0,5 mM)
B27 eller NS21 {Chen, 2008 # 2399}, 10 ml
Cytosin β-D-arabinofuranoside (AraC), 0,56 mg (sluttkonsentrasjon, 4 pM)
Totalt volum er 500 ml.
Generelle kommentarer
Vår kultur media inneholder ikke antibiotika fordi de kunne utøve cytotoksiske effekter på dyrkede gliaceller og nevroner (referanse 70, 71). Dette gjør det spesielt viktig å overholde sterile prosedyrer i kultur-relatert arbeid.
Se tabell av reagenser for de detaljerte kilder til kjemikalier.

Tabell 1. Solutions

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollen som presenteres her inkluderer prosedyrer for tatovering å merke / identifisere mus, for genotyping mus fra halen tips, og for dyrking mus hjernens nerveceller ved lav tetthet. I en runde av forsøk under anvendelse av 6-8 unger disse fremgangsmåter krever typisk ~ 0,5 timer, 4 timer og ~ ~ 2 timer, henholdsvis, ved en total på 6-7 timer. Dette gjør det praktisk for en enkelt experimenter å fullføre alle de prosedyrer som er nødvendige fra tidspunktet for valpene 'fødsel til plating av nevronale kulturer - i mindre enn en enkelt arbeidsdag (med unntak av forberedelser før avreise av gliaceller næringslag).

Tatovering

Langtids identifikasjon av dyr er nødvendig for det formål å avl og vitenskapelige studier slik som analyser av histologi, cellefunksjon og dyrs atferd. Tatovering nyfødte dyr er fordelaktig fordi den kan utføres hurtig og varer i mye av dyrets liv 7,22-25. Tattooing på tredeputene kan være bedre enn tå klipping 23 med hensyn til å bevare testbare atferd, for eksempel i suspensjon eller gripende 22,26, selv om enkelte studier ikke har registrert slike mangler (f.eks 25). Det var ingen tilfeller av mødre avvise eller cannibalizing valper etter tatovering. For andre metoder for langsiktig identifikasjon av dyr, se siste anmeldelser 7,23,24.

Genotyping

Et kritisk trekk ved vår protokoll er bruken av en rask metode for genotyping. Selv om tilsvarende genotype-metoder ble beskrevet i tidligere rapporter (f.eks 27,28), at systemet som beskrives her har minst to forbedringer. For det første kan det tolerere visse variasjoner i mengden av utgangs vev, alder på dyr, og fragment lengde. Således kan vellykket genotyping oppnås ved bruk av mus så små som 1 dag og like gammel som 6 måneder, og kan utføres ved anvendelse av enbredt spekter av primerpar. Sekund, ikke denne metoden krever en stopp løsning for DNA-ekstraksjon trinn. Dette eliminerer overdreven røret håndtering og pipettering, og tillater parallell med flere rør automatisering av prosessen med en PCR-maskin. Antallet av prøver kan skaleres opp (for eksempel 96 prøver) ennå behandles lett og samtidig. Også den prøvetype ikke er begrenset til hale klipp; andre prøvetyper som kan brukes inkluderer ørehull, toe utklipp, hele tidlige embryoer, og placenta vev 2-4,29,30. Forskjellige dyrearter kan også anvendes. Dermed genotyping prosedyrer er pålitelig (repeterbare med lav intra-assay varians) og reproduserbar (lav inter-assay varians mellom kjøringer eller mellom laboratorier), og har fordelen av høy skalerbarhet.

Vær oppmerksom på at en viss forsiktighet er nødvendig for å oppnå den forventede resultatkvalitet. Først i løpet av DNA-ekstraksjon, kan en stor variasjon i protokollen degradere resultatene.For eksempel kan en betydelig reduksjon i volumet av DNA ekstraksjonsløsning (f.eks, 200-100 ul i trinn 2.2) fremdeles tillater genotyping, men det kan redusere påliteligheten og resultere i variasjoner i PCR-resultater. Under slike forhold, er det anbefalt å redusere volumet av DNA-ekstrakt 4-2 ul, og øke volumet av H2O fra 2 til 4 ul for å kompensere for volumendringen i løpet av PCR-reaksjoner (trinn 2.5). For det andre, ved enden av DNA-ekstraksjon, løsningen kan brukes til PCR umiddelbart uten sentrifugering i de fleste tilfeller, selv om halen vil beholde sin generelle strukturen og vil ikke bli fullstendig nedbrutt. Det er imidlertid viktig for det formål å dissosiere genomisk DNA fra vevet (trinn 2.4) den beskrevne inversjon av rørene. Det er også viktig å bruke den øvre, klar del av løsningen, med unntak av rester på bunnen av røret, fordi inkludering av sistnevnte vil føre til mangelfulle PCR-resultater. Dissetrinn vil være effektivt med minimal tid og krefter. Like gode resultater kan oppnås ved aktivt virvling av prøven (i stedet for de inversjoner) etterfulgt av sentrifugering og behandling av supernatanten. For det tredje, når DNA-ekstraksjon, DNA kan lagres i lang sikt (f.eks,> to uker). Det anbefales å sentrifugere oppløsningen ved hjelp av en mikrosentrifuge (f.eks 3,000-13,000 g ved 4 ° C i 2 minutter), overføre supernatantene til nye rør, og lagre dem ved -80 ° C. Når det lagrede ekstrakt skal brukes for genotyping, kort sentrifugere prøven etter tining, og bruke supernatanten.

Nevrale kulturer

Et annet kritisk trekk ved vår protokoll er bruken av en glial matersjikt for å etablere nevronale kulturer med lav tetthet plating. Vanligvis, i primære kulturer av pattedyrhjernenerveceller, blir cellene belagt med en forholdsvis høy densitet, på belagte dekkglass uten gliacellerl mater lag (f.eks 31-39). Når pletteringstetthet av neuroner er redusert ved hjelp av denne metode, fører den første manglende glial arket til dårlig neuronal vekst og dendrittiske forlengelse (panelene B, Cfigur 8-10) som rapportert tidligere 40-42, sannsynligvis på grunn av dårlig glial vekst 43,44.

Vellykkede, lav tetthet nevronale kulturer kan bli generert ved hjelp av minst tre hovedtyper av fremgangsmåter. I en metode, er Neurobasal medium anvendes som et kulturmedium. Dette gjør det mulig å dyrkningsnerveceller i fravær av en glial matersjikt, og kan brukes for lav tetthet nevronale kulturer 45,46. I en annen tilnærming ('Banker-type' og dens modifikasjon), gliacellene er ko-dyrket med nevroner i den samme brønnen, men er fysisk adskilt fra dem. I denne sammenheng gliacellene gi "trofisk støtte" til nerveceller uten å kontakte dem direkte1,41,42,47-49. I den tredje tilnærming, er nevroner belagt på en pre-etablert glial mater lag som støtter neuronal vekst (f.eks 50-53) (figur 8-10). Spesielt er mus hjernens nerveceller belagt på en glial mater lag forberedt fra mus 8,34,54 eller rotter 41,55,56.

Vi foretrekker den siste av de tre tilnærminger til lav tetthet kulturen, fordi Neurobasal medium kan påvirke neuronal overlevelse 57, vil astrocytic gliaceller være viktig ved regulering av nevronale funksjoner 8,58, og den fysiske kontakt mellom neuroner og gliaceller kan bli viktig. Prosedyrene for dyrking mus og rotte gliaceller er lik 59,60, men vi har modifisert dem litt for å få plass til de mer raske in vitro vekst av rotte vs. mus gliaceller. Prosedyrene for rottecellekultur ble endret 61-63. Bruken av en glial mater layer for lav tetthet nevronale kulturer gjør det nødvendig å utføre raske genotyping, for å matche genotype av materen lag som i nervecellene i perioden mellom valpene 'fødsler og dødsfall blant nyfødte eller slutten av kultur vinduet (1 -2 dager etter fødsel).

Lav tetthet kulturen på en glial matersjikt er også en viktig fremgangsmåte når man forsøker å kultur neuroner av små kjerner i hjernen (f.eks noradrenalin-frigjøring locus coeruleus og dopamin-frigjørende substantia nigra). Disse kjerner inneholde bare et lite antall av neuroner, og vil uunngåelig gi lav tetthet kulturer 64-67.

Primære kulturer blir rutinemessig fremstilt i vårt laboratorium fra CA3-CA1 regionen av hippocampus, motorområdet av cerebral cortex og striatum hos mus. De samme fremgangsmåter kan anvendes for å fremstille nevronale kulturer som representerer andre hjerneregioner, f.eks hele hippocampus (inkluding dentate gyrus) og hele cerebral cortex. Rotte nerveceller fra hjerneregioner som hippocampus og locus coeruleus dyrket på lignende måte, ved bruk av rotte-glial matersjikt. Disse dyrkede neuroner er vanligvis brukt på 1-4 uker in vitro, med den nøyaktige alder av kulturen, avhengig av hensikten med forsøket. Det er verdt å merke seg at noen nerveceller dyrket på en glial mater lag kan overleve i mer enn 10 uker 34,68.

Et potensielt problem med lav tetthet nevronale kulturer er at de neuronale egenskaper kan være forskjellig fra de i høy tetthet kulturer eller i nerveceller in situ. Sammenligning av disse systemer gir en interessant mulighet for å studere hvordan nevronal utvikling og modning er påvirket av flere faktorer, slik som den neuronal tetthet, de oppløselige faktorer utskilt fra neuroner, neuron-til-neuron kontakt og glial-neuronal interaksjoner.

Oppsummert tattooing-basert etikette mus er langvarig, er genotyping metoden hurtig, og dyrkningsmetoden gjør det mulig for plating mus neuroner ved lav tetthet. Protokollen er beskrevet her kan anvendes i sin helhet for andre dyrearter skjuler andre genetiske mutasjoner. Videre kan de enkelte trinnene i protokollen bli brukt til andre formål. Dermed protokollen kan brukes i et bredt spekter av applikasjoner basert på experimenters behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS - tattooing
Machine Cleanser Animal Identification and Marking Systems, Inc. NMCR3 This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent Animal Identification and Marking Systems, Inc. NDAR4 This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment Animal Identification and Marking Systems, Inc. NBP01
Skin Prep Applicator Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSPA1 Q-tip.
Skin Prep solution Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSP01 This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format) EZ BioResearch LLC G2001-100
2X PCR Ready Mix II EZ BioResearch LLC G2001-100 A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial VWR BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade rpi A20090-500  We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA) Fisher BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl Dot Scientific Inc UG104-96RS  Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl Dot Scientific Inc UG2020-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl Dot Scientific Inc UG2812-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp EZ BioResearch LLC L1001 We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp EZ BioResearch LLC L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder GIBCO-Invitrogen 10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml  USA Scientific 1402-2900 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual  rpi 145660 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural USA Scientific 1605-0000 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO GIBCO-Invitrogen S33102
Tris base rpi T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100MG See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement GIBCO-Invitrogen 17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated BD falcon 353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml BD falcon 353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml BD falcon 353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml BD falcon 352095
Countess (cell number counter) chamber slides GIBCO-Invitrogen C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride) Sigma-Aldrich C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC) Sigma-Aldrich G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm Pyrex 3160-101
Distilled water GIBCO-Invitrogen 15230-147
DNase Type II Sigma-Aldrich D4527-200KU Stock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate GIBCO-Invitrogen 10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 569-0020
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO-Invitrogen 26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0 Carolina 633017
GlutaMAX-I GIBCO-Invitrogen 35050-061
Hanks' Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma-Aldrich H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent Sigma-Aldrich 258148-100 ML
Insulin Sigma-Aldrich I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka) Sigma-Aldrich 63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free BD Biosciences 356237 This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM) GIBCO-Invitrogen 51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml BD Biosciences 355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate BD falcon 353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate BD falcon 353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid GIBCO-Invitrogen 10888-022
Nitric Acid VWR bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21  prepared in the lab Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”  Fisher 13-678-6A Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”  Fisher 13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0% Sigma-Aldrich P9333-500G
Serological pipet, 2 ml BD falcon 357507
Serological pipet, 5 ml  BD falcon 357543
Serological pipet, 10 ml BD falcon 357551
Serological pipet, 25 ml BD falcon 357525
Serological pipet, 50 ml  BD falcon 357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis Sigma-Aldrich 480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich Sigma-Aldrich 431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC) Sigma-Aldrich S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm Corning 431219
Syringe, 3 ml BD falcon 309585
Transferrin, Holo, bovine plasma Calbiochem 616420
Trypan Blue stain, 0.4% GIBCO-Invitrogen T10282 This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI Sigma-Aldrich T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%  GIBCO-Invitrogen 25200-056
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2 Merck Millipore AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail Merck Millipore NE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMS Animal Identification and Marking Systems, Inc. NEO–9 This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GT BIO–RAD 170–4405 Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800 ProteinSimple FluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal Cycler BIO-RAD PTC-1148EDU Our PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac Basic BIO-RAD 164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, Countess GIBCO-Invitrogen C10310 This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2 NUAIRE NU-425-400 This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water Jacket NUAIRE NU-4850
Horizontal Clean Bench NUAIRE NU-201-330 This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed Shaker Labnet S2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifuge Fisher 46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793 (2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034 (2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245 (2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. e626 (2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. e3844 (2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87, (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895 (2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. e2373 (2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. e2389 (2011).
  36. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. e3634 (2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. e3965 (2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. e3257 (2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. e2111 (2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633 (2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M. Ch. 18. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).
Rapid Genotyping av Dyr Fulgt av Etablering Primære Kulturer av hjernens nerveceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).More

Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter