Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Snabb Genotypning av djur Följt av Etablera Primära kulturer av hjärnans nervceller

Published: January 29, 2015 doi: 10.3791/51879
Automatic Translation
*1,2, *1, 3, 1
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Psychiatry, University of Iowa Carver College of Medicine, 3EZ BioResearch LLC
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver rutiner för märkning och genotypning nyfödda möss och generera primära neuronala kulturer från dem. Den genotypning är snabb, effektiv och tillförlitlig, och möjliggör automatiserad nukleinsyra-sur extraktion. Detta är särskilt användbart för neonatalt dödliga möss och deras kulturer som kräver förhands avslutad genotypning.

Abstract

Högupplöst analys av morfologi och funktion av däggdjurs neuroner kräver ofta genotypning av enskilda djur följt av analys av primärkulturer av nervceller. Vi beskriver en rad förfaranden för: märkning nyfödda möss som ska genotypats, snabb genotypning, och etablera låg densitet kulturer av hjärnans nervceller från dessa möss. Individuella möss är märkta med tatuering, vilket möjliggör långsiktig identifiering varar i vuxen ålder. Genotypning av den beskrivna protokollet är snabb och effektiv, och möjliggör automatisk extraktion av nukleinsyra med god tillförlitlighet. Detta är användbart under omständigheter där tillräcklig tid för konventionell genotypning är inte tillgänglig, t.ex., i möss som lider av neonatal dödlighet. Primära neuronala kulturer genereras vid låg densitet, vilket möjliggör avbildning experiment vid hög rumslig upplösning. Denna kultur metoden kräver beredning av gliaceller feeder lager före neuronal plätering. Den protocol tillämpas i sin helhet till en musmodell av rörelsestörning DYT1 dystoni (AE-Torsina knock-in möss) och neuronala kulturer framställs av hippocampus, hjärnbarken och striatum av dessa möss. Detta protokoll kan tillämpas på möss med andra genetiska mutationer, samt andra djurarter. Dessutom kan enskilda komponenterna i det protokoll användas för isolerade delprojekt. Detta protokoll kommer således att ha breda program, inte bara i neurovetenskap men även inom andra områden för biologiska och medicinska vetenskaper.

Introduction

Gnagarmodeller av genetiska sjukdomar har visat sig användbara i att fastställa de fysiologiska funktionerna av normala proteiner och nukleinsyror, liksom de patofysiologiska följderna av defekter i dessa. Exempel inkluderar mus med brist på proteiner involverade i viktiga cellulära funktioner, samt musmodeller av sjukdomar som Alzheimers sjukdom. Dock kan vissa genetiska manipulationer leda till neonatal dödlighet inom kort eller ett par dagar efter födseln. I dessa fall, primära cellkulturer är ett viktigt verktyg eftersom levande celler kan erhållas från de embryonala eller neonatala valpar före döden, kan de hållas i minst ett par veckor in vitro, och under denna tid tidiga neuronala utvecklingen kan följas av biokemiska, funktionella och morfologiska experiment. För de primära kulturer, kan det vara fördelaktigt att plätera nervceller vid låg densitet; Detta gör det möjligt att visualisera den enskilde somata, dendriter, axonal axlar och nerv terminaler vid hög spatial upplösning. Emellertid kräver överlevnad och differentiering av neuroner vid låg densitet typiskt att de stryks ut på en glial matarskikt, samodlades med gliaceller i frånvaro av fysisk kontakt med dem, eller odlades i medium betingad av Glia 1.

Inrättandet av låg densitet neuronala kulturer på gliaceller feeder lager kan vara beroende av snabb och tillförlitlig genotypning förhand - inom några timmar i motsats till ett par dagar. Snabbhet är särskilt viktigt när det neuronala genotyp måste matchas till det av en gliaceller feeder lager förberett i förväg. Som ett mer praktiskt exempel, kan det vara nödvändigt att bestämma vilket ungar av vilka genotyp till användning vid generering kulturer, för att optimera effektiviteten i ett experiment.

Här kan vi visa arbetsprotokoll som har använts för snabb, förenklad och tillförlitlig mus genotypning i tidigare publikationer 2-6. Mus svansar ochett kommersiellt tillgängligt kit används. Detta protokoll innehåller ett steg extraktion av nukleinsyror från vävnaden, och kräver varken en nukleinsyra-syrareningssteg eller användning av en uppsägning buffert ("stop lösning"). Tillförlitligheten denna genotypning metod illustreras genom att presentera resultatet av en serie tester när skillnaderna införs med avseende på utgångsbeloppet för prover, ålder djuren och längden av PCR amplikoner. Detta kit erbjuder fördelarna med automatiserad extraktion och tillförlitlighet.

För tydlighetens vara heltäckande, är användningen av tatuering för långsiktig identifiering av genotypade mössen också visat. Tatuering uppnås genom applicering av tatuering bläck till dermis i huden (under epidermis) 7. Ett förfarande beskrivs för att tatuering paw kuddar av nyfödda eller en dag gamla möss, fastän tatueringar kan tillämpas på andra delar av kroppen, såsom svansar och tår, och att Animals i alla åldrar. Dessutom kommer förfaranden att demonstreras för plätering och odling mus nervceller vid en låg densitet, baserat på optimerad framställning av olika typer av gliala matarskikt 2,8.

Vi använder en genetisk musmodell av ärftlig neurologisk sjukdom DYT1 dystoni - en autosomalt dominant rörelse sjukdom som orsakas av en mutation i genen TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG, p.Glu302del / p.Glu303del) 9. Den kodade proteinet, Torsina, tillhör de "ATPaser förknippade med olika cellulära aktiviteter" (AAA +) familj av proteiner, vars medlemmar vanligtvis utför eskortering liknande funktioner, hjälpa till: protein utspelas, protein-komplex demontering, membran trafficking och vesikelfusion 10-13. De mutation resulterar i en in-frame radering av ett kodon för glutaminsyra, och kan leda till manifestation av "tidig debut gener isolerade dystoni" 14,15. Men vägenophysiological mekanismer som ansvarar för denna sjukdom är fortfarande dåligt kända. I en knock-in musmodell är den mutanta allelen Tor1a tm2Wtd, nämns nedan som Tor1a AE. Heterozygot AE-Torsina knock-in möss är livskraftiga och genetiskt härma mänskliga patienter med DYT1 dystoni, medan homozygota knock-i möss dör efter födseln 16,17, med latensen till postnatal död påverkas av genetisk bakgrund 18. Den tidiga död homozygot knock-i möss kräver att både genotypning av djur och inrättandet av neuronala kulturer snabbt klar. Som ett annat exempel på genotypning, Tfap2a (transkriptionsfaktor AP-2α, aktiverande förstärkare bindande protein 2α) kommer att användas. Proteinet kodat av denna gen är viktig vid reglering av flera cellulära processer, såsom proliferation, differentiering, överlevnad och apoptos 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Alla djurförsök som utförs i denna studie har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Iowa.

1. Långsiktigt Identifiering av möss Använda Tatuering tassen Pads

  1. Immobilisera en tass med tassen pad (plantar yta) vänd försöks. Håll tassen med tummen och pekfingret. Var noga med att inte klämma tassen.
    OBS: Stabil immobilisering är viktigt att säkerställa att tatuering pigmentet placeras in i dermis av tassen dynan, och därmed är permanent 7.
  2. Tvätta tassen pad med 70% etanol på en gasbinda svamp eller trasa.
  3. Applicera hudfett till en bomullspinne och tryck försiktigt spetsen mot ytan av tassen pad flera gånger. Använd endast en liten mängd av hud olja; när de är närvarande i stora mängder, kommer det att förhindra tatuering pigment från att nå huden.
  4. Doppa spetsarna på tatuering nålar in i tatuering bläck precis företill tatuering. Använd ren, aseptisk och vassa tatueringsnålar, för att minska smärta och risken för infektion, och också för att öka tatuering effektiviteten.
  5. Medan tassen dynan yta är täckt med huden olja, trycker de tatuering nålspetsar vertikalt och lätt mot huden i centrum av tassen dynan, och injicera bläcket flera gånger. Se tabell över material / utrustning för information om elektrisk tatuering systemet.
  6. Spray 70% etanol på en gasbinda svamp, tryck den mot tassen för att ta bort extra tatuering pigment på hudytan, och inspektera kvaliteten på tatueringen. Kontrollera att mitten av tassen pad har en mörk, rund fläck som skiljer sig från normal hud pigmentering. Om tatueringen inte är mörkt eller tillräckligt stor för enkel visning, upprepa de tidigare tatueringssteg.

2. Genotypning Nyfödda möss Använda en snabb PCR Genotypning Kit

  1. Desinficera den distala änden av en mus svans med 70% etanol, skär 5 mm eller mindre av svansentippa och överföra den till ett rör av ett 8-tub remsa av den typ som används för PCR. Använd en un-used rakblad för varje valp för att undvika korskontaminering mellan prover. Alternativt kan du använda en sax, men i detta fall, försiktigt och noggrant bort kvarvarande vävnad på bladen som använder 70% etanol. Kontrollera om blödning. Om blödning uppstår, tryck mot skurna delen av svansen med en gasbinda svamp tills blödningen har slutat.
  2. Lägg 200 pl av DNA-extraktion lösning till varje PCR-rör innehållande ett prov. Se tabell över material / utrustning för dess sammansättning och information om satsen.
  3. Placera röret remsan i en PCR-anordning för cyklisk värmebehandling, och starta DNA-extraktion med användning av följande program: 1 cykel vid 55 ° C under 10 min, en cykel vid 95 ° C under 10 min och hållning vid 4 ° C.
    OBS: Detta är samma PCR termisk cykler som senare används för PCR.
  4. Efter DNA-extraktion är klar, ta bort röret remsan från apparaten and invertera 5 gånger.
  5. Överför 4 pl av lösningen (DNA-extrakt) av varje prov till en oanvända rör av en 8-tube remsa, och blanda med: 10 ul 2X PCR Ready Mix II, 2 pl blandad framåt & bakåt primers (rekommenderas vid 0,5 uM; se tabell av material / utrustning för sekvenser), och 4 | il av nukleasfritt H2O, för varje prov. Spin kort (t.ex. 3 sek) med en bordscentrifug. Håll rören på is hela tiden utom vid hantering.
  6. Utför termisk cykling. Se Tabell över Materials / Utrustning för värmeprogrammet.
  7. Detektera de amplifierade DNA-produkterna. Ladda den totala reaktionslösningen från PCR (20 | il) direkt i en brunn av en agarosgel. Fyll på molekylviktsmarkörer i en separat brunn. Applicera ett elektriskt fält.
  8. Förvärva fluorescens bilder av banden under ultraviolett ljus.

3. Primär kultur av Mouse Brain Neurons på Glial Feeder Layer

OBS! Metoderna för hjärnan dissekering och cell dissociation (3.1) är gemensamma för alla efterföljande förfaranden. Förfarandena för musen gliaceller kulturer (3,2), rått gliaceller kulturer (3,3), och mus neuronala kulturer (3,4) beskrivs separat efteråt.

  1. Brain Dissection och Cellular Dissocaiation
    1. Offra en mus eller råtta pup genom halshuggning, snabbt avlägsna hjärnan, och placera den i Hanks lösning (se tabell 1 för sammansättningen) + 20% fetalt bovint serum (FBS) i en 35 mm skål (hålls på is).
    2. Skär hjärnan genom mittlinjen i två halvklot. Avlägsna regionen av intresse (t.ex., hjärnbark, striatum och hippocampus) från varje hemisfär i hjärnan. Ta hjärnhinnorna och större blodkärl från ytan. Skär hjärnan regionen till 4-10 tunna skivor med en kirurgisk kniv.
    3. Skölj hjärnan skivor i en 15 ml centrifugrör, när with Hanks lösning + 20% FBS, sedan tre gånger med Hanks lösning (dvs utan serum) (alla vid 4 ° C). För att skölja, tillsätt 5-10 ml lösning, låt hjärnan skivor avsätts i botten av röret, aspirera lösningen från toppen, och lägga till en färsk lösning. Avsluta sköljningsförfarandet genom att aspirera lösningen.
    4. Filter 2 ml av trypsin-innehållande digere lösning (se tabell 1 för sammansättningen) med användning av en 3 ml spruta och en 0,2 | im sprutfilter och lägga filtratet direkt in i röret innehållande hjärnan skivor. Låt trypsinization fortgå under 13 min vid RT.
    5. Neutralisera trypsinlösning först genom att aspirera de flesta av det och därefter genom tillsats av 7-10 ml Hanks lösning + 20% FBS (4 ° C).
    6. Skölj hjärnan skivor, två gånger med Hanks lösning + 20% FBS, och därefter tre gånger med Hanks lösning (dvs utan serum) (alla vid 4 ° C). Avsluta sköljningsförfarandet genom att aspirera den solutjon.
    7. Filter 2 ml dissociationslösningen (se tabell 1 för sammansättningen) med användning av en 3 ml spruta och en 0,2 | im sprutfilter och lägga filtratet direkt till röret med hjärnan skivor.
    8. Mekaniskt dissociera cellerna genom att försiktigt finfördelning 10-20 gånger, tills synliga vävnadsbitar försvinner. Använd en bomulls inkopplad, brand-polerat pasteurpipett och undvika att göra bubblor under rivning.
    9. Vänta 3 min för små bitar att bosätta sig.
    10. Överför majoriteten av lösningen (~ 1,5 ml, vilket lämnar en del lösning på botten) till en 15 ml centrifugeringsrör som innehåller 3 ml Hanks lösning + 20% FBS-lösning (4 ° C), med användning av det bomulls inkopplad, brand- polerad pasteurpipett. Häll inte över all lösning eftersom ett införande av något sediment på botten resulterar typiskt i en försämring av kulturen.
    11. Centrifugera i 13 minuter vid ~ 185 g (~ 1100 rpm) vid 4 ° C.
    12. Aspirera supematanten försiktigt,tillsätt 1 ml förvärmda plätering medium (37 ° C) till pellets, och suspendera det genom att försiktigt pipettera flera gånger med bomull-ansluten, brand-polerat pasteurpipett.
      NOTERA: Tre olika typer av plätering media används för olika odlingsändamål: plätering medel en för mus gliaceller, plätering medellång 2 för mus neuroner, och plätering medel 3 för rått-neuroner och gliaceller (se tabell 1 för kompositioner) .
    13. Ta ut 10 ul av cellsuspensionen, blanda det med 10 | il av 0,4% lösning av trypanblått, och mäta densiteten av levande celler, med användning av antingen en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare.
  2. Mus Glial Kulturer
    1. Tvätta täckglasen för att bidra till att skapa sunda kulturer av musceller.
      1. Doppa täckglas av glas (rund, 12 mm i diameter) i 70% salpetersyra i en glaspetriskål. Skyddas från ljus med hjälp av aluminiumfolie och placera den på en orbitalskakare O / N.
      2. Skölj glaset coverslips i petriskålen minst tre gånger med destillerat vatten. Fördjupa dem i destillerat vatten. Placera skålen på en orbitalskakare O / N.
      3. Torka täck på en Whatman 150 mm filterpapper i den biologiska säkerhetsskåp.
      4. Autoklav täck.
      5. Placera täckglasen till 24 brunnars odlingsskål.
    2. Märknings och genotyp-nyfödda möss enligt steg 1 och 2.
    3. Skaffa hjärncellerna från musungar, enligt steg 3.1.
      OBS: Användning av hjärnbarken är typiskt för beredning musen gliaceller matarskikt. Emellertid kan andra hjärnregioner, såsom hippocampus och striatum, kommer att arbeta efter korrekt justering av celldensitet på grund av olika antal och utbyten av celler från olika regioner.
    4. Lägg ~ 4 ml förvärmda plätering medel 1 till slut cellsuspensionen (~ 1 ml). För förvärmningsknappen odlingsmedier, placera lösningen i odlings inkubator (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, för atttillåta värdena temperatur- och pH stabiliseras.
    5. Överför cellsuspensionen till en obelagd T25 odlingskolv, med hjälp av bomulls inkopplad, brand-polerat pasteurpipett. Placera kolven i kulturen inkubatorn.
    6. Vid 1 dag in vitro (DIV), skölj de odlade cellerna i T25 kolven två gånger med plätering medel 1 (4 ° C). Placera kolven tillbaka i inkubatorn. Utför sköljning genom att aspirera mediet inuti kolven helt med en pasteurpipett, lägga ~ 5 ml färskt medium och sakta vända kolven flera gånger i en virvlande rörelse.
    7. Vid 6-9 DIV, (dvs, en dag före trypsinering och plätering på täck, i steg 3.2.8-3.2.13), placera 100 pl av beläggningsmaterialet med extracellulära matrixproteiner (se tabell för material / Utrustning för kommentarer om beläggningsmaterialet) på glastäckglas i en odlingsskål och placera odlingsskål i odlingsinkubator.
    8. Vid 7-10 DIV, när cellerna är 20-40% sammanflytande (rumsligt kontinuerliga), trypsinize dem.
      1. Skölj kolven en gång, genom att aspirera all lösning inom kolven och lägga ~ 13 ml Hanks lösning (4 ° C), försiktigt luta kolven flera gånger i en virvlande rörelse, och aspirera lösningen helt.
      2. Lägg 40 | il DNas-lösning (slutlig koncentration, 750 enheter / ml) till 4 ml Trypsin-EDTA-lösning, passera lösningen genom ett 0,2 | im sprutfilter och lägga filtratet direkt till cellerna i kolven.
      3. Låt trypsinization fortgå i 13 minuter vid 37 ° C i inkubatorn.
      4. Neutralisera trypsinlösning genom tillsats 2 ml 100% FBS (4 ° C) till kolven.
      5. Överför de trypsiniserade cellerna till en 15 ml centrifugeringsrör med användning av en 5- till 10-ml pipett, tillsätt ~ 4 ml Hanks lösning + 20% FBS (4 ° C), centrifugera vid ~ 185 g och 4 ° C under 13 min och aspirera supernatanten.
    9. Återsuspendera pelleten i 1 ml av pre-warmed plätering medel 1.
    10. Mät densiteten av cellerna enligt steg 3.1.13.
    11. Aspirera beläggningsmaterialet fullständigt från glastäckglas, och plattan ~ 50 | il av de återsuspenderade gliaceller på täckglas.
      OBS: Dessa celler kommer att fastställa gliaceller matarskikt.
    12. Placera kulturen skålen med täckglas i inkubatorn.
    13. 20-60 minuter senare, tillsätt 1 ml förvärmda plätering medel 1 till varje brunn, och placera skålen tillbaka i inkubatorn. Observera: Medan plätering medium tillsätts, kommer det att vara till hjälp att använda en annan pipett för att trycka ner periferin av täckglas (där det inte finns några pläterade celler), så att täckglaset inte kommer att flyta i mediet.
    14. Vid 1 DIV av gliaceller matarskikt (dvs, på glastäck), byt mediet med 1 ml förvärmda plätering medel 1, genom att aspirera all lösning i en brunn och sedan fylla den med nytt medium.
    15. Vid 2-3 DIV av gliaceller matarskiktet när cells är 80-100% konfluenta, till mitosinhibitor (10 ul av en blandning av 5-fluor-2'-deoxiuridin + uridin; slutkoncentrationer av 81,2 och 204,8 | iM, respektive) till varje brunn, för att inhibera DNA-replikation och därmed till trycka glia-celltillväxt.
    16. Vid 7-9 DIV, när cellerna är 90-100% sammanflytande (1-2 tim innan plattor nervceller på gliaceller feeder skiktet), byt odlingsmediet med förvärmda plätering medel 2 (37 ° C).
      OBS: nervceller kommer att pläterade på samma dag, med hjälp av steg 3.4.
  3. Råtta Glial Kulturer
    1. Coat en T25 odlingskolv med samma beläggningsmaterial.
      OBS: Detta är nödvändigt för senare borttagning av icke-vidhäftande celler i steg 3.3.5.
      1. Lägg 2,0 ml av beläggningsmaterialet till kolven, och placera kolven i odlingsinkubator.
      2. Efter 2-3 h, aspirera beläggningsmaterialet fullständigt, så att golvet i kolven blir torr.
    2. Skaffa cellernafrån råttungar, enligt steg 3,1.
      OBS: CA3-CA1-regionen av hippocampus används för framställning av rått gliaceller matarskikt. Emellertid kan andra hjärnregioner, såsom hjärnbarken och striatum, kommer att arbeta efter justering för skillnader i celldensitet på grund av olika antal och utbyten av celler från olika regioner.
    3. Lägg ~ 4 ml förvärmda plätering medel 3 till den slutliga cellsuspensionen (~ 1 ml).
    4. Överför cellsuspensionen i belagda T25 kultur kolv, med hjälp av bomulls inkopplad, brand-polerat pasteurpipett. Placera kolven i odlings inkubator (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C).
    5. Vid 2-3 DIV, när cellerna är 20-40% sammanflytande, avlägsna icke vidhäftande eller svagt vidhäftande celler, genom att stänga locket ordentligt och skaka kolven kraftigt ~ 10 gånger, aspire lösningen och tillsätta 4-5 ml plätering medellång 3 (vid 4 ° C). Upprepa denna procedur en gång. Undersök de odlade cellerna i hela kolven golvet (t.ex.använder faskontrastmikroskop) för att bekräfta att de som verkar neuronal (dvs, de för vilka den yttre kanten av cellkroppen visas fas-ljus) är helt bort. Upprepa proceduren så ofta som krävs för att undanröja dessa celler, och sedan tillbaka kolven till inkubatorn.
      OBS: Styrkan och det totala antalet "shakes" krävs kan variera mellan enskilda praktiker. Det viktiga är inte att hålla det totala antalet shakes till ett visst antal, men för att bekräfta att neuronliknande celler elimineras.
    6. Vid 6-8 DIV, när cellerna är 90-100% sammanflytande, passage gliaceller genom trypsinizing dem som i steg 3.2.8.
    7. Efter centrifugering, suspendera pelleten i 1 ml plätering medel 3 (4 ° C), tillsätt 10 ml plätering medel 3 (4 ° C), överföra trypsinerade cellerna till en FN-belagd T75 kolv, och kultur dem i inkubatorn.
      OBS: Rat gliaceller kommer att passe två gånger; i kontrast musen gliaceller are passe bara en gång eftersom de blir ohälsosamt efter flera passager. Rat gliaceller kommer att passera i T75-kolvar som inte är belagda med något beläggningsmaterial. Beläggningen gör rått gliaceller att växa för snabbt och ger många cilieceller (förmodade ependymalceller), som kommer att försämra neuronala kultur villkoret senare.
    8. Vid 17-19 DIV av gliaceller kultur i en kolv (dvs 11 dagar efter passage och en dag före trypsinering och plätering på täckglas av stegen 3.3.9-3.3.14), placera 100 pl av beläggningsmaterialet på otvättade täckglas ( rund, 12 mm i diameter) i en odlingsskål och placera odlingsskål i odlingsinkubator.
      OBS: För rått gliaceller kulturer, var en skillnad inte märkt i kultur resultat med eller utan tvätta täck.
    9. Vid 18-20 DIV av gliaceller kultur i en kolv (dvs 12 dagar efter passage), förbereda gliaceller feeder lager genom trypsinizing de odlade cellerna, enligt step 3.2.8.
    10. Under centrifugering, aspirera beläggningsmaterialet fullständigt från glastäckglas.
    11. Efter centrifugering resuspendera pelleten i 1 ml utstrykning medellång 3 (4 ° C) och mäta celldensitet, enligt steg 3.1.13.
    12. Justera gliaceller tätheten till 10 4 levande celler / ml, och plattan 100 | il av gliaceller fjädring på de belagda glastäck.
      OBS: Dessa celler kommer att fastställa gliaceller matarskikt.
    13. Placera kulturen skålen med täck i inkubatorn under 20-60 minuter.
    14. Tillsätt 1 ml utstrykning medellång 3 (4 ° C) till varje brunn, och placera skålen tillbaka i inkubatorn.
    15. Vid 3-4 DIV av gliaceller feeder lagret, när cellerna på täck är 40-80% sammanflytande, tillsätt 1 ml av den förvärmda odlingsmedium (se tabell 1 för sammansättning) som innehåller cytosin β-D-arabinofuranosid ( AraC, slutlig koncentration av 4 M) för att stoppa gliaceller-celltillväxt. Plate neurons vid 7-9 DIV av gliaceller feeder lagret när cellerna är 60-80% sammanflytande, med hjälp av steg 3.4.
  4. Mus neuronala kulturer
    1. Märknings och genotyp-nyfödda möss enligt steg 1 och 2.
    2. Använd musen valpar för steg 3.1.
    3. Justera densiteten av levande cellsuspension till ~ 2.0 x 10 5 celler / ml med hjälp förvärmda plätering medel 2 för plätering på mus gliaceller, eller använda plätering medel 3 för plätering på rått gliaceller.
    4. Plate cellerna på gliaceller matarskikt, genom att försiktigt tillsats av cellsuspension till odlingsmediet av varje brunn. Obs! Volymen av cellsuspensionen som skall tillsättas kommer att bestämmas av målet antalet celler i en odlingsbrunn. Exempelvis platta ~ 60 | il av cellsuspension för att uppnå 12.000 celler / brunn.
    5. Observera att inga förändringar lösnings är nödvändigt efter de nervceller pläterade. Var noga med att undvika avdunstning av lösningen från brunnarna under loppet av kultur, genom att befukta den inre of odlingsinkubator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som ett exempel på tillämpningen av detta protokoll, är representativa resultat visas för märkning möss genom tatuering, tillförlitlig genotypning under olika experimentella förhållanden, och upprättande av primära neuronala kulturer på gliaceller feeder lager.

Tatuering

Nyfödda valpar märktes på trampdynor med en tatuering-system ("Newborn" i figur 1). Etiketterna förblev väl synlig på 3 veckor ('3 veckor gamla) och 32 veckors ålder ('32 veckors gamla "). Den individuella möss kan identifieras genom en kombination av tatueringar på de fyra tassar (nummer 1-16) och av information om djurets buren, eller mer komplexa nummerplaner (visas ej).

Genotypning

Ett representativt exempel på genotypning visas (Figur 2). Den Tor1a genen av vildtyp (Tor1a (Tor1a + / AE) och homozygota (Tor1a AE / AE) AE-Torsina knock-in-möss amplifierades från genomiskt DNA isolerat från svans klipp av nyfödda ungar. Genotypning i detta specifika exemplet är baserat på förekomsten av en enda 34-baspar loxP plats i mutant Tor1a allelen efter framgångsrik Cre rekombination och radering av en neomycinresistens kassett 16,18.

Iskt DNA extraherades med minimala praktisk tid, och många prover behandlas samtidigt. De utvinningsvolymerna hölls konstant, och därför behövdes ingen justering av volymen för att tillgodose de förändrade villkoren testade. Tillförlitligheten av genotypning testades under fyra villkor, enligt nedan.

Först undersöktes effekten av skillnader i mängden av utgångsvävnad undersöks (Figur 3). Tails av olika längd varframställts från heterozygota AE-Torsina knock-i möss (Tor1a + / AE) på avvänjningsåldern (~ 3 veckor). Tail längder av 2 till 5 mm, avståndet vanligtvis rekommenderat i protokoll för gentypning, gav samma genotypning resultat av hög kvalitet. De två banden motsvarar vildtyp och muterade alleler (Tor1a + och Tor1a AE, respektive).

För det andra, var effekterna av variationer i djur ålder undersöktes (Figur 4). Tails erhölls från nyfödd, 3 veckor gamla och ~ 24 veckor gamla heterozygot AE-Torsina knock-i möss (Tor1a + / AE). Homozygoter användes inte eftersom de dör flera dagar efter födseln 16-18. De två förväntade banden för vildtyp och muterade Tor1a generna var synliga oavsett djur ålder (Figur 4A). Den allmänna tillämpligheten av detta resultat testades med hjälp av en andra gen, Tfap2a 19 i vild-tYP-möss (Tfap2a + / +) (Figur 4B).

För det tredje var effekterna av skillnaderna i längden på PCR amplikoner testade (Figur 5). För detta ändamål undersöktes olika primerpar syntetiseras för en given gen, så att de amplifierade DNA: n är av olika baspars längder. Den Tfap2a genen gående detekteras med olika amplikon längder.

För det fjärde var två DNA-extraktionsmetoder jämfördes (figur 6). I en metod, var PCR-remsor rör och PCR termisk cykler användas (beskriven i steg 2). Detta är en automatiserad, parallell flerrörs extraktionsmetod ("Auto" i figur 6). Eftersom flera rör kan hanteras samtidigt i remsformat, och en PCR-maskin används med ett program för att arbeta i fyra temperatursteg, finns det inget behov av att överföra rören, manuellt ändra temperaturen under extraktionen eller använda flera bitarav utrustning. Därför är det lätt att bearbeta många prover. Detta jämfördes med den andra metoden bygger på manuell, enkelrörs utvinning ("Manual" i figur 6). Detta använder individuella PCR-rör och separata icke-PCR maskiner (värmeblock och vattenbad) för att reglera temperaturen under DNA-extraktion. I detta fall var flera, enstaka rör flyttat till en ny temperatur efter varje steg, som kräver flera temperaturkontrollerande apparater. I båda fallen var den Tor1a genen analyseras i vildtyp, heterozygota och homozygota AE-Torsina knock-in-möss (figur 6A), och Tfap2a genen analyserades i vildtyp möss (figur 6B). De två utsugsprotokollen gav likvärdiga genotypning resultat.

Sammanfattningsvis visar resultaten som presenteras i Figurerna 3-6 demonstrerar att genotypning metod är robust, uppnå pålitliga och reproducerbara resultat trots variations i vävnadsbelopp, djur ålder, amplikon längd och utvinning protokoll som används.

Neuronala kulturer

För odling mus nervceller på musen gliaceller feeder lager, är ordningen av förfarandena: (tatuering nyfödda möss → genotypning för gliaceller kultur →) gliaceller kultur → tatuering nyfödda möss → genotypning för neuronal kultur → neuronal kultur. För kulturer etablerade på råtta gliaceller feeder lager, förfarandena inom parentes hoppas över.

Vi undersökte den stödjande effekten av pre-seeded glia matarskikt på neuronal överlevnad och tillväxt. Neuroner erhölls från CA3-CA1-regionen av hippocampus, motorregionen av hjärnbarken, och striatum av nyfödda möss av vildtyp. De ströks vid låg densitet på råtta gliaceller feeder lager som hade erhållits från CA3-CA1 regionen hippocampus och seedade före neuronal plätering, enligtordningen som visas i fig 7 (förenklad sammanfattning av förfarandena). Låg-densitetskulturer är optimala för avbildning av individuella dendriter, somata 4,6, nervterminaler 2,3,5,8 och axonala axlar 5 vid hög rumslig upplösning. De hippocampala celler (innehållande både neuroner och gliaceller) ströks ut på belagda glastäckglas, antingen med (fig 8A) eller utan ett i förväg upprättat glia matarskikt (figur 8B, C) ​​och observerades med faskontrastoptik. I närvaro av en nästan sammanflytande glial matarskikt, nervceller (i varje panel, indikerar ett pilhuvud en representativ neuron) var relativt dispergerades 3 och 7 dagar efter utstrykning (dagar in vitro, DIV) (figur 8A). De visade också tecken på god hälsa, till exempel en tydlig marginal på neuronal somata, utökade dendriter, brist på klustrade somata, och en brist på buntade neuriter (hög förstoring images i inläggningar). Vid 14 DIV, dessa nervceller bildas ett tätt nätverk kännetecknas av långa neuriter (dendriter och axoner). Observera att gliaceller spridning hämmades innan nervceller ströks, genom att tillsätta tillväxtmedium innehållande mitosinhibitor AraC (steg 3.3.15).

I motsats, i frånvaro av gliaceller matarskikt vid tidpunkten för plätering hippocampusneuroner, var tillväxten av de odlade hippocampusneuroner försämras, även i frånvaro av AraC. Vid 3 DIV, har gliaceller (ingår i de nyligen pläterade hippocampus celler) inte bildat ett sammanflytande ark (asterisk i övre panel figur 8B). Kulturerna visade flera tecken som inte är lämpliga för högupplösta imaging studier, såsom stora områden utan underliggande gliaceller (asterisk), förekomsten av klustrade somata och förekomsten av sampaketerade neuriter i vissa områden (data visas ej). Av 7 DIV, gliaceller bildade ett sammanhängande ark (mitten panel av figur 8C). However, neuroner var färre i antal än när de nervceller ströks på en i förväg fastställd gliaceller feeder lager. De överlevande nervceller saknade också långa, nätverksbildande neuriter (infälld). De gliaceller var mer heterogena i krökning och tjocklek än de i matarskikt kulturen, vilket visas fas-ljus. För att testa effekterna av trycka gliaceller spridning på nervceller, tillämpade vi AraC-innehållande tillväxtmedium. När AraC lades på 3 eller 7 DIV och cellerna odlades fram 14 DIV och uppmärksammas på denna dag (figur 8B och C, bottenpaneler), gliaceller täckte större delen av täckytan. Emellertid neuronema var fortfarande få till antalet, speciellt när AraC applicerades vid 7 DIV. De överlevande nervceller hade bara korta processer och var inte i stor utsträckning anslutna. Således sent tillägg av AraC tillät ett enhetligt gliaceller skikt för att bilda men inte främjar neuronal viabilitet eller neuritbildning; snarare den okontrollerade gliaceller tillväxthade skadliga effekter på nervceller.

Dessa data visar att gliaceller feeder skiktet är avgörande för överlevnad och tillväxt av nervceller pläterade vid låg densitet, och att gliaceller lagret måste vara närvarande vid tidpunkten för neuronal plätering snarare än senare under neuronal kultur. Liknande resultat erhölls med användning kulturer av cerebral kortikal (Figur 9) och striatum neuroner (Figur 10).

Den kvalitativa observationen om neuronal överlevnad bekräftades genom kvantitativ analys. Specifikt var antalet överlevande nervceller vid 14 DIV räknade, baserad på fas-kontrast bilder av kulturer (Figur 11). Numret var störst för nervceller odlade på en gliaceller feeder lager (dvs., Pläterade på gliaceller feeder lagret). Antalet var lägre i fallet med neuroner som odlats i frånvaro av ett glialt matarskikt. Antalet reducerades ytterligare då cellerna behandlades med AraC vid ensenare tid. Dessa skillnader var statistiskt signifikanta, och noterades i odlingar av neuroner erhållna från alla tre områden i hjärnan.

De typer av överlevande celler identifierades vid 14 DIV i musen hippocampus kulturer pläterade på råtta hippocampus matarskikt. Dubbel-immunocytokemi genomfördes med användning av antikroppar mot den neuronala markören, mikrotubulus-associerat protein 2 (MAP2), och den astrocytiska glial cellmarkör, gliafibrillärt surt protein (GFAP). Cellerna med förlängda processer var positiva för MAP2, medan cellerna i det underliggande gliaceller matarskikt var positiva för GFAP (två representativa bildfält, figur 12A). Denna färgning var inte en artefakt av en specifik kombination av primära och sekundära antikroppar, eftersom samma mönster erhölls när en olik uppsättning av sekundära antikroppar användes (Figur 12B).

När däremot samma färgning performed på kulturerna som består av endast en gliaceller feeder lager, dvs i frånvaro av tillsatta musceller (två representativa bild fält, figur 13A), inga celler var positiva för MAP2. Cellerna i matarskikt var genomgående positiva för GFAP. För en negativ kontroll, var både primära antikroppar utelämnas från immuncytokemiska förfarandet (Figur 13B). Ingen färgning detekterades i dessa prover, även om cellerna var närvarande, såsom framgår av det transmitterade ljuset optik (differentialinterferenskontrast, DIC) och nukleär färgning med Hoechst-färgämne. Vilka icke-specifik färgning i MAP2 och GFAP kanaler var mycket svag.

Dessa immunocytokemiska uppgifter analyserades också kvantitativt (Figur 14). I varje 8-bitars bild, var intensitet mäts och ritas längs en linje. Lagrade tomter avslöjar MAP2 färgning när musceller (prover innehållande nervceller) odlades på en gliaceller feeder lager (Neuron +,glia +, primär antikropp (1 ° Ab) +), medan en sådan färgning var frånvarande i kulturer av enbart gliaceller feeder celler (Neuron -, glia +, 1 ° Ab +). I en negativ kontroll utan primära antikroppar, färgning var försumbar i kulturer av enbart gliaceller feeder celler (Neuron -, glia +, 1 ° Ab -). GFAP färgning var uppenbar i gliaceller matarskikt, oavsett om musceller ströks (Neuron +, glia +, 1 ° Ab +) eller inte (Neuron -, glia +, 1 ° Ab +). Återigen, färgning i den negativa kontrollen var försumbar (Neuron -, glia +, 1 ° Ab -). Dessa resultat visar att rått-gliaceller matarskikt bestod mestadels av astrocyter, och att neuronema var närvarande endast när musceller sattes. De pekar också på att de nervceller som finns i dessa kulturer härstammar enbart från mus.

Den Resultat sektionen online video visar också DIC och MAP2 bilder av odlade nervceller pläterade på en gliaceller feeder lager, both ställas av CA3-CA1 hippocampus regionen vildtypsmöss.

För detaljerad kontroll av cellodling, rekommenderas att mäta tätheten av levande celler, både för att bedöma den allmänna kvaliteten på hjärnan dissekering och cellulära dissociation steg och för plätering av cellerna vid den förutbestämda täthet. Nedan listas fyra uppsättningar av typiska densitetsmätningar. Observera dock att dessa siffror kan variera beroende på odlingsbetingelser och reagens. Till exempel, kan till och med olika satser av serum från samma leverantör kan påverka resultaten. Sålunda bör dessa siffror betraktas som en allmän indikator, snarare än en absolut riktlinje.

För cellulära dissociation (steg 3.1.13), typiska värden för live-celltäthet erhålls från en valp är: ~ 2 x 10 5 celler / ml (mus motor cortex och mus CA3-CA1 hippocampus), ~ 5 x 10 5 celler / ml (mus hjärnbarken och råtta CA3-CA1 hippocampus), och ~ 1 x 10 6 calnar / ml (mus striatum). I alla dessa fall, fraktionerna av levande celler var> 90% (viabilitet, definierad som förhållandet mellan antalet levande celler till att av det totala antalet celler). Den motoriska cortex är löst definieras som den region av hjärnbarken som ligger omedelbart dorsala till striatum 20. För hippocampus kulturer, de CA3 och CA1 regioner i hippocampus korrekt är att föredra. Hela hippocampus inkluderar dessutom gyrus dentatus, införandet av vilket leder till bildning av stora nervterminaler av granulat celler och introducerar heterogenitet i synaptiska egenskaper 21. Den striatum kulturen innehåller caudatus-putamen och globus pallidus, men inkluderar inte nucleus accumbens, eller mediala eller laterala septala kärnor i de närliggande strukturer.

För mus gliaceller kultur (steg 3.2.11), är plätering tätheten ~ 10000 gliaceller på varje 12-mm runda täckglas med användning av ~ 50 | il av cellsuspension vid en densitet av ~ 2 x10 5 celler / ml. Vanligtvis densiteten mätt i supernatanten är relativt konstant och inte kräver justering. Att konvertera densiteten över olika områden, är den användbar information som täck har en diameter på 1,20 cm och en yta på 1,13 cm2. Således ~ 10.000 celler / täck = ~ 8.800 celler / cm2 på ett täckglas.

För råtta gliaceller kulturen (steg 3.3.12), är plätering tätheten ~ 1000 gliaceller på varje 12-mm runda täckglas med användning av ~ 100 | il av cellsuspension vid en densitet av ~ 1x10 4 celler / ml. Således 1.000 celler / täck = ~ 900 celler / cm2 på ett täckglas.

För låg densitet mus neuronal kultur (steg 3.4.4), sträcker plätering tätheten mellan 2.000 och 48.000 celler per brunn i en 24-brunnsplatta. Typiska värden vid plätering nervceller på rått gliaceller är: 10,000-24,000 celler / brunn för cerebrala kortikala neuroner, 12,000-24,000 celler / brunn för CA3-CA1 hippocampusneuroner och 24,000-48,000 celler / brunn för striatala neuroner. När plätering på mus gliaceller är antalet minskas, t.ex., 2000 celler / brunn för CA3-CA1 hippocampusneuroner. Som en sida noterar, för plätering råtta CA3-CA1 hippocampusneuroner på en råtta gliaceller feeder lager, är plätering tätheten 1,000-6,000 celler / brunn. För omvandling densiteten i en brunn till densiteten på en täck är användbar information som den interna såväl diameter vid botten är 1,56 cm och dess område är 1,91 cm 2. Således kan till exempel, 12000 celler / brunn = 7100 celler / täckglas = 6300 celler / cm 2 på ett täckglas. Dessa densiteter valdes i syfte att odla relativt glesa nervceller för högupplösta cellulär avbildning. Forskare bör välja sina siffror som bäst passar deras experimentella syften.

Figur 1
Figur 1. Tatuerade trampdynor hos möss. Newborn möss märktes genom att tatuera de trampdynor. De fotograferades omedelbart efter tatuering (nyfödda), vid 3 veckors ålder (3 veckor gamla) och vid 32 veckors ålder (32 veckor gamla). Etiketterna förblev väl synlig under hela vuxenlivet. Bilder togs från olika djur. De visas inte i samma skala. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Genotypning av vildtyp (Tor1a + / +), heterozygota (Tor1a + / AE) och homozygota (Tor1a AE / AE) AE-Torsina knock-in-möss. De Tor1a genen alleler analyserades i vildtyp och mutant former, med DNA som extraherats från svansarna av nyfödda ungar. TAil tips var ~ 4 mm i längd. DNA färgades med hjälp SYBR Säker DNA Gel Stain. Se Tabell över Materials / Utrustning för information om primers och termisk cykling program för Tor1a gen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Detektion av genomiskt DNA i samband med variation i mängden av utgångsmaterial. Tail spetsar av olika längder användes. Testade djur var 3 veckor gamla, heterozygot AE-Torsina knock-i möss (Tor1a + / AE). Lanes representerar svans längderna 2, 3, 4 och 5 mm, i två exemplar (från vänster). De tail tips erhölls från olika möss. Molekylvikt storleksmarkörer i den vänstra körfältet representerar DNA Längder i spakterna av 100 baspar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Detektion av genomiskt DNA i samband med variationen i djur ålder. (A) Tor1a-genen. Lanes representerar svans tips erhållits från heterozygot AE-Torsina knock-i möss (Tor1a + / AE) i följande etapper: nyfödda, 3 veckor gamla, och ~ 24 veckor gamla (i dubbletter från vänster) (B). Tfap2a genen. Lanes representerar svans tips erhållits från vildtyp (Tfap2a + / +) möss vid följande steg: nyfödda, 3 veckor gamla, och ~ 24 veckor gamla (i dubbletter från vänster). Båda generna amplifierades från svansar ~ 4 mm i längd. Den förväntade PCR-fragmentet är 498 bp. PCR-programmet wa är den samma som används för Tor1a gen. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. Detektion av genomiskt DNA i samband med variationen i längden av PCR-amplikonet. Den Tfap2a genen analyserades med PCR-amplikon längder av 498 bp (vänster körfält), 983 bp (mittfiler) och 1990 bp (högra banor) i dubbletter. Genen amplifierades från svansar av 3 veckor gamla möss. Molekylvikt storleksmarkörer i längst till vänster och längst till höger körfält gelen representerar DNA längder i steg om 100 och 200 baspar, respektive. Se Tabell över Materials / Utrustning för information om primers för olika amplikoner. 879fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. Upptäckt av genomiskt DNA i samband med variationen i DNA-extraktion metod. Utfall manualen, är enkelrörs utvinning (manuell) och de automatiserade, parallella flerrörs extraktionsmetoder (Auto) jämförs. Den sistnämnda metoden användes i hela denna rapport. Gener förstärktes från svansar ~ 4 mm i längd, som samlats in från nyfödda. (A) Tor1a genen i de nyfödda ungar av AE-Torsina knock-i möss. Lanes representerar DNA: extraherade från vildtypen (manuell och automatisk), heterozygot (manuell och automatisk), och homozygot möss (manuell och automatisk) (från vänster). (B) Tfap2a genen i 3 veckor gamla vildtypsmöss. Den förväntade PCR-fragmentet är 498 bp.jove.com/files/ftp_upload/51879/51879fig6highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7
Figur 7. Förenklad, schematisk illustration av förfaranden för plätering mus nervceller på musen (A) och råtta (B) gliaceller feeder lager. Siffrorna dagar (dagar in vitro) hänvisar till de kumulativa dagar efter gliaceller först pläterade i kultur kolvar. De tjänar bara som en grov uppskattning. För praktiska detaljer, se Rutiner avsnittet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8
Figur 8. Stödjande effektav gliaceller matarskikt på tillväxt av hippocampala neuroner i en låg densitet kultur. Neuroner erhölls från CA3-CA1-regionen av hippocampus hos nyfödd, vildtypsmöss. (A) mus hippocampala celler ströks ut på belagda glastäckglas, vilket hade varit pre-seedade med en råtta gliaceller feeder lager erhålls från CA3-CA1 regionen hippocampus. Nervceller skingrades jämnt på ett sunt sätt. Kulturer observerades vid 3, 7 och 14 DIV. (B, C) ​​Mouse hippocampus celler ströks på belagda glastäck, som inte hade någon i förväg fastställd matarskikt. Kulturer observerades vid 3 DIV (övre panelen i B) och 7 DIV (mittpanelen i C) utan AraC behandling. I andra uppsättningar kulturer, behandlades cellerna med AraC vid 3 DIV (nedre panelen i B) och 7 DIV (nedre panelen i C), och observerades vid 14 DIV. Alla bilder representerar systerkulturer erhålls från samma valp, vars nervceller ströks på samma dag. Se text för detaljer. För varje panel, en exriklig av en neuron indikeras av en vit pilspets och förstorat i en infälld. Nervceller har cellkroppar vars omkrets verkar ljust när de ses genom faskontrastoptik, och de har också tjocka processer. Asterisker indikerar områden utan gliaceller. Kulturerna avbildades live på ett inverterat mikroskop med hjälp faskontrastoptik med 20X objektiv (numerisk apertur på 0,45) utan en mellanliggande lins (dvs, på 1x). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 9
Figur 9. Stödjande verkan av gliaceller matarskikt på tillväxt av cerebrala kortikala neuroner i en låg densitet kultur. Liknande resultat som i figur 8, men med neuroner som erhålls från motorn regionen av cerebral cortex. De villkor enligt etiketterna AC motsvarar de i figur 8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 10
Figur 10. Stödjande verkan av gliaceller matarskikt på tillväxt av striatala neuroner i en låg densitet kultur. Liknande resultat som i figurerna 8 och 9, men med nervceller erhållna från striatum. De villkor enligt etiketterna AC motsvarar de i figur 8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 11. Stödjande verkan av gliaceller matarskikt på neuronal överlevnad. Antalet överlevande neuroner räknades i de experiment som visas i fig 8, med användning av bilder som förvärvats av faskontrastmikroskopi. Bilder för 14 DIV visas här igen, men med pilspetsar pekar på exempel på räknade nervceller. Stapeldiagrammet visar antalet neuroner per bildfält (449,0 nm x 335,5 nm) (medelvärde ± standardfel av medelvärdet, n = 7-24 fält för varje odlingstillstånd). Asterisker indikerar statistiskt signifikanta skillnader i 'Gliaceller matarskikt (-), AraC på 3 DIV "och" Gliaceller matarskikt (-), AraC på 7 DIV "från" Gliaceller matarskikt (+) "(* p <0,05, ** p <0,01, oparade Students t-test). Siffrorna ovanför staplarna anger neuronal densitet mätt i montage av flera bildfält. Bilder varförvärvats med hjälp av en 20X objektiv. För att undvika förvärvs partiskhet, alla bilder som förvärvats längs en fullständig vertikal remsa, från toppen till botten av ett täckglas och passerar genom mittpunkten för täckglas. Individuella bilder hade viss överlappning (t.ex., 1/6 till 4/1 av ett bildfält i toppen och botten). Två metoder användes för analysen. I en, var nervceller räknades i alternerande bilder för att se till att enskilda nervceller inte räknades mer än en gång. De resulterande numren användes för att generera den stapeldiagram. I den andra metoden, erhölls en enda montage skapas från de enskilda bilderna. De sydde med Microsoft Image Composite Editor eller manuellt med hjälp av Photoshop. De montage utesluts också flera fall av samma nervceller. De resulterande numren listas ovanför staplarna. I båda metoderna var stora områden vid täck periferin som inte innehöll några celler uteslutas. Celler räknades som nervceller om de hade cellkroppar som verkade ljustgenom faskontrastmikroskopi, samt utökade cellulära processer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 12
Figur 12. Immunocytokemisk identifiering av celltyper i neuronala kulturer. Kulturen förhållande som är det nedre vänstra bilden i figur 8A. Neuroner erhölls från CA3-CA1-regionen av hippocampus hos vildtypsmöss, och ströks ut på en glia matarskikt genereras från CA3-CA1-regionen av hippocampus av vildtyp råttor. De odlade cellerna analyserades genom immuncytokemi för den neuronala markören MAP2 och astrocytiska gliaceller markör GFAP. Differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi användes för att avslöja den allmänna morfologi avbildade fält, 14-17dagar efter nervceller ströks på gliaceller feeder skiktet. (A) Tre färger färgning, inklusive motfärgning med nukleär markör Hoechst 33342 färgämne. Två representativa bildfält visas. (B) Tvåfärgad färgning, med olika kombinationer av sekundära antikroppar konjugerade med olika fluoroforer. I dessa experiment var de odlade cellerna fixerades med 4% paraformaldehyd och 4% sackaros i Tyrodes lösning (innehållande, i mM: 125 NaCI, 2 KCI, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 30 D-glukos, 25 HEPES, pH 7,4 justerad med 5 M NaOH, ~ 310 mOsm utan justering) under 30 min vid 4 ° C. Efter att ha tvättats med Tyrodes lösning, de permeabiliserades med 0,1% Triton X-100 i Tyrodes lösning för 10 minuter. De tvättades igen med Tyrodes lösning och blockerades sedan med 2% normalt getserum i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (blockeringslösning) under 60 min vid RT. Därefter behandlades de med kaninen polyklonal anti-MAP2-antikropp (AB5622; 400x utspädning i blockeringslösning), och mus-monoklonal anti-GFAP cocktail (NE1015; 1,000x utspädning) O / N (15-21 h) vid 4 ° C. Efter tvättningar med PBS, inkuberades cellerna med get-anti-kanin och anti-mus-IgG-antikropp konjugerad med Alexa Fluor 405 (500x utspädning i blockeringslösning), Alexa Fluor 488 (1,000x) eller Alexa Fluor 568-färgämne (500x) för 60 min vid RT. De tvättades med PBS och observeras direkt i PBS. I vissa kulturer, efter den sista tvätten i ovanstående förfaranden, behandlades cellerna med Hoechst 33342 vid 0,5 ng / ml i PBS i 10 min vid RT, och tvättas med PBS före observation. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 13
Figur 13. Immunocytochemical identifiering av celltyper i gliala matarskikt kulturer. syster kulturer av rått gliala matarskikt som i figur 12, men utan plätering av mus-neuroner. (A) färgning med användning av de immunocytokemiska förfaranden som beskrivs i figur 12A. Två representativa bildfält visas. (B) Färgning av gliaceller matarskikt med användning av de immunocytokemiska förfaranden som beskrivs i A, men med de primära antikropparna utelämnas. Alla MAP2 bilder i figurerna 12A och 13A, B förvärvades under samma avbildningsförhållanden, och visas på samma bildkontrast för att möjliggöra en jämförelse av intensitet. Samma förfaranden användes för GFAP bilder i figurerna 12A och 13A, B. Det gliaceller feeder lagret kultur avbildades på samma dag som de kulturer i figur 12. Således de gliaceller feeder lager i 13 odlades in vitro vid samma tid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 14
Figur 14. Intensitet immunocytokemisk färgning. Linjer drogs på bilderna som visas i figurerna 12 och 13, och intensiteten längs dessa avsattes. Inläggningar visar bilder i den översta raden i figur 12A. De tre villkor var: 1) plätering av musceller (innehållande neuroner) på en råtta matarskikt och färgning med de primära antikroppar (Neuron +, glia +, 1 ° Ab +), 2) gliaceller feeder lager endast (ingen neuronal plätering) och färgning med de primära antikroppar (Neuron -, glia +, 1 ° Ab +), och 3) gliaceller foderer lagret endast (ingen neuronal plätering) och färgning utan primära antikroppar (Neuron -, glia +, 1 ° Ab -). Neuronal färgning (MAP2) var närvarande endast när musceller ströks (villkor 1 vs 2), och gliaceller färgning (GFAP) var närvarande i båda uppsättningarna av kulturer (villkor 1 vs 2). Den immunocytokemisk färgning var specifik för både primära antikroppar (villkor 1 vs 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

LÖSNINGAR
TAE-buffert (50x lösning)
Tris-bas, 486 g
Isättika, 114,2 ml
0,5 M EDTA, pH 8,0, 200 ml
Tillsätt destillerat vatten för att bringa totala volymen till 2 L
Gör upp i en kemisk draghuv.
Späd 50-faldigt före användning.
Hanks lösning
Hanks balanserade salter, utan kalciumklorid, magnesiumsulfat och natriumbikarbonat (för 1 liter)
NaHCO 3, 350 mg (slutlig koncentration 4,17 mM)
HEPES, 2,38 g (slutlig koncentration, 10 mM)
Justera till pH 7,4 med användning av 5 M NaOH.
Justera osmolaritet till 310 mOsm använder sackaros (Osmolaritet tenderar att ~ 290 mOsm utan justering).
Tillsätt destillerat vatten för att bringa den totala volymen till 1 L
Uppslutning lösning (för trypsinbehandling av hjärnvävnad)
NaCl, 800,6 mg (slutlig koncentration, 137 mM)
KCl, 37,3 mg (fginalets koncentration, 5 mM)
Na 2 HPO 4 · (7H 2 O), 187,6 mg (slutlig koncentration, 7 mM)
HEPES, 595,8 mg (slutlig koncentration, 25 mM)
Glukos, 97,3 mg (slutlig koncentration, 5,4 mM)
Justera till pH 7,2 med användning av 5 M NaOH.
Osmolaritet tenderar att ~ 310 mOsm utan justering.
Tillsätt destillerat vatten för att bringa den totala volymen till 100 ml.
Precis innan användning, tillsätt 20 mg trypsin (slutlig koncentration av 10 mg / ml) och 20 pl DNas (slutlig koncentration av 750 enheter / ml) till 2 ml matsmältningen lösning.
Dissociation lösning (för mekanisk dissociation av hjärnvävnad)
Hanks lösning
MgSO 4 · (7H 2 O), 295,1 mg (slutlig concentratipå, 11,97 mM)
Justera osmolaritet till 310 mOsm använder sackaros.
Total volym är 100 ml.
Precis innan användning, tillsätt 20 pl DNas (slutlig koncentration av 750 enheter / ml) till 2 ml dissociation lösning.
Bordläggningen medel 1 (för mus gliaceller)
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), 449,5 ml
MITO + Serum Extender, 0,5 ml
FBS, 50 ml
Total volym är 500 ml.
Bordläggningen medel 2 (för mus neuroner)
Neuro-A, 485 ml
B27, 10 ml
GlutaMAX-I, 5 ml (slutlig koncentration, 2 mM)
Total volym är 500 ml.
Plätering medellång 3 (för rått-neuroner och gliaceller)
Minimum Essential Media (MEM, utan fenolrött)
Glukos, 2.5 g (slutkoncentration, 27,8 mM)
NaHCO 3, 100 mg (slutlig koncentration, 2,38 mM)
Transferrin, 50 mg
FBS, 50 ml
GlutaMAX-I, 5 ml (slutlig koncentration, 2 mM)
Insulin, 12,5 mg
Total volym är 500 ml.
Tillväxtmedium (för rått-neuroner och gliaceller)
MEM (utan fenolrött)
Glukos, 2.5 g (slutkoncentration, 27,8 mM)
NaHCO 3, 100 mg (slutlig koncentration, 2,38 mM)
Transferrin, 50 mg
FBS,25 ml
GlutaMAX-I, 1,25 ml (slutlig koncentration, 0,5 mM)
B27 eller NS21 {Chen, 2008 # 2399}, 10 ml
Cytosine β-D-arabinofuranosid (AraC), 0,56 mg (slutlig koncentration, 4 | iM)
Total volym är 500 ml.
Allmänna kommentarer
Våra odlingsmedia innehåller inte antibiotika eftersom de kunde utöva cytotoxiska effekter på odlade gliaceller och nervceller (referens 70, 71). Detta gör det särskilt viktigt att hålla sig till sterila förfaranden i kultur-relaterat arbete.
Se tabell av reagenser för de detaljerade källor kemikalier.

Tabell 1. Lösningar

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet presenteras här ingår förfaranden för tatuering att märka / identifiera möss, för genotypning möss från svans tips och för odling mus hjärnans nervceller vid låg densitet. I en omgång av experiment med 6-8 valpar, dessa förfaranden kräver normalt ~ 0,5 h, ~ 4 timmar och ~ 2 tim respektive till totalt 6-7 tim. Detta gör det praktiskt för en enda försöks att slutföra alla nödvändiga förfaranden från tiden för valparna "födelse till plätering av neuronala kulturer - på mindre än en enda arbetsdag (med undantag för föregående beredning av gliaceller feeder lager).

Tatuering

Långsiktig identifiering av djur är nödvändigt för de ändamål för avel och vetenskapliga studier sådana analyser av histologi, cellfunktion och djurs beteende. Tatuering nyfödda djur är fördelaktigt eftersom det kan ske snabbt och varar i en stor del av djurets liv 7,22-25. Tattooing på trampdynor kan vara bättre än tå klippning 23 med avseende på att bevara testbara beteenden, till exempel i suspension eller gripande 22,26, även om vissa studier inte har noterat sådana brister (t.ex. 25). Det fanns inga fall av mödrar avslag eller cannibalizing valpar efter tatuering. För andra metoder för långsiktig identifiering av djur, se senaste omdömena 7,23,24.

Genotypning

Ett kritiskt inslag i våra protokoll är användningen av en snabb genotypning metod. Även om liknande genotypning metoder som beskrivs i tidigare rapporter (t.ex. 27,28), det system som beskrivs här har åtminstone två förbättringar. För det första kan man tolerera vissa variationer i mängden av utgångsvävnad, ålder av djur, och amplicon längd. Sålunda kan man uppnå framgångsrik genotypning användning av möss så unga som en dag och så gamla som sex månader gamla, och kan utföras med användning av enbrett spektrum av primerpar. För det andra innebär denna metod inte kräver en samlad lösning för DNA extraktionen. Detta eliminerar överdriven hantering och pipetteringsröret, och möjliggör parallell flerrörs automatisering av processen med en PCR-maskin. Antalet exemplar kan skalas upp (t.ex. 96 prover) ännu bearbetas lätt och samtidigt. Även den typ av prov är inte begränsad till svans klämmor; andra provtyper som kan användas innefattar öron slag, tå urklipp, hela tidiga embryon, och moderkakan vävnad 2-4,29,30. Olika djurarter kan också användas. Således genotypning förfaranden är tillförlitliga (repeterbara med låg intra-assay varians) och reproducerbar (låg interanalys variansen mellan körningar eller mellan laboratorier), och har fördelen av hög skalbarhet.

Observera att viss försiktighet krävs för att uppnå den förväntade kvaliteten på resultaten. Först under DNA-extraktion, kan en stor variation i protokollet försämra resultatet.Till exempel kan en betydande minskning av volymen av DNA Extraction-lösning (t.ex. 200-100 il i steg 2,2) fortfarande tillåter genotypning, men det kan minska tillförlitligheten och resulterar i variation i PCR-resultat. Under sådana betingelser är det rekommenderat att minska volymen av den DNA-extrakt 4-2 ul, och öka volymen av H2O från 2 till 4 | j, l för att kompensera för volymförändringen under PCR-reaktioner (steg 2,5). För det andra, vid slutet av DNA-extraktion, kan lösningen användas för PCR omedelbart utan centrifugering i de flesta fall, även om svansen kommer att behålla sin övergripande struktur och kommer inte att helt nedbrutet. Är emellertid nödvändigt för att dissociera iskt DNA från vävnaden (steg 2.4) den beskrivna invertering av rören. Det är också viktigt att använda den övre, klart en del av lösningen, med undantag för det skräp på botten av röret, eftersom införandet av den senare kommer att leda till inconclusive PCR-resultat. Dessasteg kommer att vara effektiva med minimal tid och ansträngning. Lika goda resultat kan erhållas genom att aktivt vortexa förlagan (i stället för de inversioner) följt av centrifugering och användning av supernatanten. För det tredje, efter DNA-extraktion, DNA kan lagras för långsiktig (t.ex.> två veckor). Det rekommenderas att centrifugera om lösningen med en mikrocentrifug (t.ex. 3,000-13,000 g vid 4 ° C under 2 min), överför supernatanterna till nya rör, och lagra dem vid -80 ° C. När det lagrade extraktet skall användas för genotypning, centrifugera kort provet efter upptining, och använda supernatanten.

Neuronala kulturer

En annan kritisk egenskap hos våra protokoll är användningen av en glia matarskikt för att upprätta neuronala kulturer vid en låg plätering densitet. Vanligtvis i primära kulturer av däggdjurs hjärnneuroner cellerna pläteras med en relativt hög densitet, på belagda täckglas utan en Glial matarskikt (t.ex. 31-39). När plätering tätheten av nervceller reduceras med den här metoden, den initiala bristen på gliaceller plåt leder till dålig neuronal tillväxt och dendritiska förlängning (paneler B, C i siffror 8-10), som rapporterats tidigare 40-42, troligen på grund av dålig gliaceller tillväxt 43,44.

Framgångsrik, låg densitet neuronala kulturer kan genereras genom åtminstone tre huvudtyper av metoder. I ett tillvägagångssätt är Neurobasal medium användes som odlingsmedium. Detta gör det möjligt att odlings neuroner i frånvaro av en glial matarskikt, och kan användas för låg densitet neuronala kulturer 45,46. I en andra metod ("Banker-typ" och dess modifiering), gliaceller är samodlade med nervceller i samma bra men är fysiskt åtskilda från dem. I detta sammanhang gliaceller ge "trofiska stöd" till nervceller utan att kontakta dem direkt1,41,42,47-49. I det tredje tillvägagångssättet, är nervceller pläterade på en i förväg fastställd gliaceller feeder lager som stödjer neuronal tillväxt (t.ex. 50-53) (figurerna 8-10). Specifikt är mus hjärnans nervceller pläterade på en gliaceller feeder lager beredd från möss 8,34,54 eller råttor 41,55,56.

Vi föredrar den sista av de tre metoder för låg densitet kultur, eftersom Neuro Medium kan påverka neuronal överlevnad 57, kommer de astrocytiska gliaceller vara avgörande i regleringen neuronala funktioner 8,58, och den fysiska kontakten mellan nervceller och gliaceller kan vara viktigt. Förfarandena för odling av mus- och rått gliaceller liknar 59,60, men vi har ändrat dem något för att rymma för snabbare tillväxt in vitro av råtta vs mus gliaceller. Förfarandena för rått cellodling modifierades 61-63. Användningen av en glia matar layer för låg densitet neuronala kulturer gör det nödvändigt att utföra en snabb genotypning, för att matcha genotyp av matarskiktet till det av nervceller inom perioden mellan valparna "födelse och de neonatala dödsfall eller slutet av kulturfönster (1 -2 postnatala dagar).

Låg-densitet kultur på ett glialt matarskikt är också en viktig metod när man försöker att odlings neuroner av små kärnor i hjärnan (t ex, det norepinefrin-frisättande locus coeruleus, och dopamin-frigör substantia nigra). Dessa kärnor innehåller endast ett litet antal nervceller och oundvikligen skulle ge låg densitet kulturer 64-67.

Primära odlingar rutinmässigt framställts i vårt laboratorium från CA3-CA1-regionen av hippocampus, motorregionen av hjärnbarken och striatum hos möss. Samma förfaranden kan användas för framställning av neuronala kulturer som representerar andra delar av hjärnan, exempelvis hela hippocampus (inkluding gyrus dentatus) och det hela hjärnbarken. Rat neuroner från hjärnregioner såsom hippocampus och locus coeruleus odlas på liknande sätt, med användning av rått-gliaceller matarskikt. Dessa odlade nervceller används vanligen vid 1-4 veckor in vitro, med den exakta åldern av kulturen beroende på syftet med försöket. Det är att notera att vissa nervceller odlade på en gliaceller feeder lager kan överleva i mer än 10 veckor 34,68.

Ett potentiellt problem med låg densitet neuronala kulturer är att de neuronala egenskaper kan skilja sig från dem i hög densitet kulturer eller i neuroner in situ. Jämförelse av dessa system ger en intressant möjlighet att studera hur neuronal utveckling och mognad påverkas av flera faktorer, såsom den neuronala densitet, de lösliga faktorer som utsöndras från neuroner, neuron-till-neuron kontakt och gliaceller-neuronala interaktioner.

Sammanfattningsvis tattooing-baserade mus märkning är långvarig, är genotypning metoden snabb, och odlingsmetoden tillåter för plätering mus neuroner vid låg densitet. Protokollet som beskrivs här kan tillämpas i sin helhet till andra djurarter hyser andra genetiska mutationer. Dessutom kan enskilda stegen i protokollet kan användas för andra ändamål. Således protokollet kan användas i ett brett spektrum av applikationer baserade på praktiker behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS - tattooing
Machine Cleanser Animal Identification and Marking Systems, Inc. NMCR3 This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent Animal Identification and Marking Systems, Inc. NDAR4 This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment Animal Identification and Marking Systems, Inc. NBP01
Skin Prep Applicator Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSPA1 Q-tip.
Skin Prep solution Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSP01 This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format) EZ BioResearch LLC G2001-100
2X PCR Ready Mix II EZ BioResearch LLC G2001-100 A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial VWR BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade rpi A20090-500  We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA) Fisher BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl Dot Scientific Inc UG104-96RS  Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl Dot Scientific Inc UG2020-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl Dot Scientific Inc UG2812-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp EZ BioResearch LLC L1001 We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp EZ BioResearch LLC L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder GIBCO-Invitrogen 10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml  USA Scientific 1402-2900 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual  rpi 145660 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural USA Scientific 1605-0000 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO GIBCO-Invitrogen S33102
Tris base rpi T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100MG See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement GIBCO-Invitrogen 17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated BD falcon 353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml BD falcon 353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml BD falcon 353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml BD falcon 352095
Countess (cell number counter) chamber slides GIBCO-Invitrogen C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride) Sigma-Aldrich C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC) Sigma-Aldrich G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm Pyrex 3160-101
Distilled water GIBCO-Invitrogen 15230-147
DNase Type II Sigma-Aldrich D4527-200KU Stock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate GIBCO-Invitrogen 10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 569-0020
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO-Invitrogen 26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0 Carolina 633017
GlutaMAX-I GIBCO-Invitrogen 35050-061
Hanks' Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma-Aldrich H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent Sigma-Aldrich 258148-100 ML
Insulin Sigma-Aldrich I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka) Sigma-Aldrich 63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free BD Biosciences 356237 This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM) GIBCO-Invitrogen 51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml BD Biosciences 355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate BD falcon 353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate BD falcon 353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid GIBCO-Invitrogen 10888-022
Nitric Acid VWR bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21  prepared in the lab Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”  Fisher 13-678-6A Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”  Fisher 13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0% Sigma-Aldrich P9333-500G
Serological pipet, 2 ml BD falcon 357507
Serological pipet, 5 ml  BD falcon 357543
Serological pipet, 10 ml BD falcon 357551
Serological pipet, 25 ml BD falcon 357525
Serological pipet, 50 ml  BD falcon 357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis Sigma-Aldrich 480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich Sigma-Aldrich 431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC) Sigma-Aldrich S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm Corning 431219
Syringe, 3 ml BD falcon 309585
Transferrin, Holo, bovine plasma Calbiochem 616420
Trypan Blue stain, 0.4% GIBCO-Invitrogen T10282 This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI Sigma-Aldrich T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%  GIBCO-Invitrogen 25200-056
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2 Merck Millipore AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail Merck Millipore NE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMS Animal Identification and Marking Systems, Inc. NEO–9 This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GT BIO–RAD 170–4405 Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800 ProteinSimple FluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal Cycler BIO-RAD PTC-1148EDU Our PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac Basic BIO-RAD 164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, Countess GIBCO-Invitrogen C10310 This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2 NUAIRE NU-425-400 This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water Jacket NUAIRE NU-4850
Horizontal Clean Bench NUAIRE NU-201-330 This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed Shaker Labnet S2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifuge Fisher 46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793 (2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034 (2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245 (2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. , e626 (2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. , e3844 (2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87 (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895 (2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. , e2373 (2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. , e2389 (2011).
  36. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. , e3634 (2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. , e3965 (2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012 (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. , e3257 (2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. , e2111 (2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633 (2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M. Ch. 18. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).

Tags

Neurovetenskap AP2 genotypning gliaceller feeder lager mus svans neuronal kultur nukleinsyra-syraextraktion PCR tatuering Torsina
Snabb Genotypning av djur Följt av Etablera Primära kulturer av hjärnans nervceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., … More

Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter