Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Hayvanlar Rapid Genotipleme Beyin Nöronlar İlköğretim Kültürler kurulması izledi

Published: January 29, 2015 doi: 10.3791/51879
Automatic Translation
*1,2, *1, 3, 1
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Psychiatry, University of Iowa Carver College of Medicine, 3EZ BioResearch LLC
* These authors contributed equally

Summary

Biz etiketleme ve yenidoğan farelerin genotiplenmesi ve onlardan birincil nöronal kültürlerin üreten prosedürleri açıklar. genotyping, hızlı, verimli ve güvenilir, ve otomatik nükleik asit ekstraksiyon için izin verir. Bu neonatally öldürücü fareler ve genotipleme önce tamamlanmasını gerektirmektedir kültürleri için özellikle yararlıdır.

Abstract

Memeli nöronların yapısının ve fonksiyonunun yüksek çözünürlüklü analizi genellikle nöronlarının birincil kültürleri analizi ve ardından tek tek hayvanların genotipleme gerektirir. Genotyped için yenidoğan fareler, hızlı genotiplendirmesi etiketleme, ve bu farelerin beyin nöronları düşük yoğunluklu kültürleri kurulması: Biz prosedürlerin bir dizi tarif. Bireysel fareler yetişkinlikte süren uzun süreli kimlik sağlar dövme, tarafından etiketlenir. Açıklanan protokol tarafından Genotipleme hızlı ve verimli ve iyi güvenilirlik ile nükleik asitin otomatik çıkarılması için izin verir. Bu yenidoğan letalitesinin muzdarip farelerde, örneğin geleneksel genotiplemede için yeterli zaman mevcut değildir şartlar altında yararlıdır. Primer nöronal kültürlerin yüksek uzaysal çözünürlükte görüntüleme deneyleri sağlayan düşük yoğunlukta, oluşturulur. Bu kültür yöntemi öncesinde nöronal kaplama için glial besleyici katmanlar hazırlanmasını gerektirir. protocol hareket bozukluğu DYT1 distoni (AE-Torsina knock-in fareleri) bir fare modelinde bütünüyle uygulanır ve nöronal kültürler, bu farelerin hipokampus, serebral korteks ve striatum hazırlanır. Bu protokol, diğer türlere ait hayvanlar için, hem de diğer genetik mutasyonlar olan farelere de uygulanabilir. Ayrıca, protokol bireysel bileşenleri izole alt projeler için kullanılabilir. Böylece bu protokol nörobilim hem de biyolojik ve tıbbi bilimlerin diğer alanlarında değil, sadece geniş bir uygulama, sahip olacaktır.

Introduction

Genetik hastalıkların kemirgen modelleri, normal protein ve nükleik asit, aynı zamanda, bu kusurların patofizyolojik fizyolojik işlevleri açısından yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Örnekler önemli hücresel fonksiyonlara yer alan proteinleri eksikliği olan fareler, aynı zamanda, Alzheimer hastalığı gibi hastalıkların fare modelleri yer alır. Ancak, bazı genetik manipülasyonlar kısa bir süre yenidoğan öldürücülüğü veya doğumdan sonra birkaç gün yol açabilir. Bu gibi durumlarda, birincil hücre kültürleri, canlı hücrelerin ölümünden önce embriyonik veya neonatal yavrular elde edilebilir, çünkü önemli bir araç olup, bu in vitro en az birkaç hafta muhafaza edilebilir, ve bu süre içinde, erken nöronal gelişimi ile takip edilebilir , biyokimyasal, fonksiyonel ve morfolojik deneyler. Birincil kültürler için, bu düşük yoğunluklu nöronlar plaka için yararlı olabilir; Bu bireysel somata, dendrit, akson milleri ve sinir TERMI görselleştirmek mümkün kılaryüksek uzaysal çözünürlükte rken,. Bununla birlikte, düşük yoğunlukta nöron sağkalım ve farklılaşma, tipik olarak bir glial besleyici tabaka kaplama gerektirir, ko-kültür glia 1 şartlandırılmış fiziksel bunlarla temas üzerine ya da ortam içinde kültürlenen yokluğunda glial hücreler.

Glial besleyici katmanlar üzerinde düşük-yoğunluklu nöronal kültürlerin kurulması önceden hızlı ve güvenilir genotipleme bağlı olabilir - bir kaç gün aksine bir kaç saat içinde. Nöronal genotip daha önceden hazırlanmış bir glial besleyici tabakanın edilene uyumlu olması gerekir, hız özellikle önemlidir. Daha pratik bir örnek olarak, genotip arasında yavrular bir deney etkinliğini optimize etmek için, oluşturma kültürlerinde kullanmadan karar vermek için gerekli olabilir.

Burada önceki yayınlarda 2-6 hızlı, basitleştirilmiş ve güvenilir bir fare genotip için kullanılır olmuştur çalışma protokolü göstermektedir. Fare kuyrukları veBir ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılır. Bu protokol, doku nükleik asitlerin tek aşamalı ekstraksiyon ve ('durdurma çözeltisi'), bir nükleik asit saflaştırma adımı veya bir sonlandırma tamponu kullanılmasını gerektirmez. Bu genotipleme yönteminin güvenilirliği farkları örneklerin başlangıç ​​miktarı, hayvanların yaş ve PCR amplikonlarının uzunluğuna göre sokulduğunda bir dizi test sonuçlarını gösteren açıklanmaktadır. Bu kit otomatik çıkarma ve güvenilirlik avantajlar sunuyor.

Kapsamlı olma uğruna, genotip farelerin uzun vadeli belirlenmesi için dövme kullanımı da gösterilmiştir. Dövme (epidermisin altında) derinin dermiş için dövme mürekkep uygulanarak elde edilir 7. Bir prosedür dövmeler gibi kuyrukları ve ayak gibi vücudun diğer bölgelerine uygulanabilir olmasına rağmen, yeni doğan ya da 1 gün eski farelerin pençe yastıkları dövme için tarif edilir ve Anim içinHer yaştan als. Buna ek olarak, yöntemler, glial besleyici tabakalarının 2,8 farklı optimize hazırlanması göre, bir düşük yoğunlukta fare nöronlar kaplama ve kültür olması gerekmektedir.

(; P.Glu302del / p.Glu303del c.904_906delGAG / c.907_909delGAG) 9 gen TOR1A bir mutasyon nedeniyle otozomal dominant hareket bozukluğu - Biz miras nörolojik bozukluk DYT1 distoni bir genetik fare modeli kullanın. Protein açılımı, protein kompleksi demontaj, membran kaçakçılığı ve vezikül füzyon: kodlanan protein, Torsina, üyeleri genellikle, hastabakıcı gibi işlevleri yerine yardımcı (AAA +) proteinlerin ailesi, "çeşitli hücresel faaliyetler ile ilgili ATPazların" aittir 10-13. Mutasyon glutamik asit için bir kodonun bir çerçeve içi silme ile sonuçlanır, ve erken başlangıçlı genel izole distoni '14,15 ortaya konulmasına neden olur. Bununla birlikte, yolBu bozukluk sorumlu ophysiological mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır kalır. Bir knock-fare modelinde, mutant alel Tor1a AE olarak, burada bahsedilen Tor1a tm2Wtd vardır. Heterozigot AE-Torsina knock-farelerin DYT1 distoni ile canlı ve genetik taklit insan hastalar, oysa homozigot knock-fareler genetik kökenli 18 etkilenen doğum sonrası ölüm gecikme ile, doğumdan 16,17 sonra ölürler. homozigot knock-farelerin erken ölüm hayvanların genotipleme ve nöronal kültürlerin kurulması hem hızla tamamlanmasını gerektirmektedir. Genotipleme başka örnek olarak, Tfap2a (transkripsiyon faktörü, AP-2α, arttırıcı protein 2α bağlanma geçirmek için) kullanılır. Bu gen tarafından kodlanan bir protein, proliferasyon, diferansiyasyon, hayatta kalma ve apoptoz 19 gibi çok sayıda hücresel işlemleri düzenleyen önemlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Bu çalışmada yapılan tüm hayvan prosedürleri Iowa Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Paw Pedleri dövme yapılması kullanma Fareler 1. Uzun süreli Kimlik

  1. Deneyci bakan pençe ped (plantar yüzeyi) ile bir pençe hareketsiz. Başparmak ve işaret parmağı ile pençe tutun. Pençe sıkmamaya özen gösterin.
    NOT: Kararlı immobilizasyon dövme pigmenti pençe pad dermis içine yerleştirilir sağlamak için önemlidir, ve bu nedenle 7 kalıcıdır.
  2. Bir gazlı bez sünger veya bez üzerinde% 70 etanol ile pençe pedi çubukla.
  3. Bir pamuk uçlu aplikatör cilt yağı uygulayın ve nazikçe pençe ped birkaç kez yüzeyine karşı ucunu basın. Cilt yağ çok az miktarda kullanmak; mevcut olduğunda büyük miktarlarda, cilde ulaşmasını dövme pigmenti önleyecektir.
  4. Hemen önce dövme mürekkebi içine dövme iğneleri ipuçları Dipdövme için. Ağrı ve enfeksiyon olasılığını azaltmak için, ve aynı zamanda dövme verimliliğini artırmak için, temiz, aseptik ve keskin dövme iğne kullanın.
  5. Pençe ped yüzeyi cilt yağı ile kaplı iken, pençe pad merkezinde cilde karşı dikey ve hafifçe dövme iğne ipuçları basın ve mürekkep birden çok kez enjekte edilir. Elektrik dövme sistemi hakkında bilgi almak için Malzemeleri / Ekipman Tablo bakın.
  6. Yavaşça, bir gazlı bez sünger üzerinde% 70 etanol Sprey cilt yüzeyinde ekstra dövme pigmenti kaldırmak için pençe karşı basın ve dövme kalitesini kontrol edin. Pençe pad orta normal deri pigmentasyonu farklı bir karanlık, yuvarlak nokta olduğunu kontrol edin. Dövme koyu veya kolay görüntüleme için yeterince büyük değilse, önce dövme adımları tekrarlayın.

Fast PCR Genotipleme Kit kullanarak 2. Genotipleme Yenidoğan Fareler

  1. % 70 etanol ile bir fare kuyruk distal ucunu dezenfekte kuyruk 5 mm ya da daha az kesimipucu ve PCR için kullanılan tipte 8 boru şeridin bir tüpe aktarın. Örneklerin arasında çapraz bulaşmayı önlemek için her yavru için bir un-kullanılan jilet kullanın. Seçenek olarak ise, bir makas kullanımı, ancak bu durumda, dikkatli bir şekilde ve iyice% 70 etanol kullanılarak bıçaklar üzerinde kalan doku çıkarın. Kanama kontrol edin. Kanama oluşursa kanama durana kadar, bir gazlı bez sünger ile kuyruk kesme kısmına basınç uygulayın.
  2. Bir örnek ihtiva eden her bir PCR tüpü DNA ekstraksiyon çözeltisinden 200 ul ekle. Kit hakkında kompozisyonu ve bilgi Malzemeleri / Ekipman Tablo bakın.
  3. PCR termal döngü içine boru şeridi yerleştirin ve aşağıdaki programı kullanılarak DNA çıkarma işlemini başlatmak: 1 döngü, 55 ° C'de 10 dakika, 10 dakika boyunca 95 ° C 'de 1 döngü için, ve 4 ° C'de tutma.
    Not: Bu, daha sonra, PCR için kullanılan aynı PCR termal döngü cihazı olup.
  4. DNA ekstraksiyon işlemi tamamlandıktan sonra, termal döngü a gelen tüp şeridi çıkarınnd 5 kez ters çevirin.
  5. Bir un-kullanılan bir 8-tüp şerit tüp, ve ile karıştırmak için her numunenin Transfer çözüm (DNA özü) 4 ul: 2X PCR Hazır II 10 ul, ileri ve geri primerler karışık 2 ul (tavsiye edilen 0.5 uM, her numune için nükleazsız H 2 O dizileri için Malzemeleri / Ekipman Tabloya bakınız), ve 4 ul. Bir masa üstü santrifüj kullanılarak Spin kısaca (örneğin, 3 sn). Işlerken dışında her zaman buz üzerinde tüpler tutun.
  6. Termal bisiklet gerçekleştirin. Görmek Termal program Malzemeleri / Ekipman Tablosu.
  7. Çoğaltılan DNA ürünleri algılar. Doğrudan bir agaroz jel, bir kuyu içine PCR'dir (20 ul), toplam reaksiyon çözeltisinin yerleştirin. Ayrı bir kuyuya moleküler ağırlık belirteçleri yükleyin. Bir elektrik alanı uygulanır.
  8. Ultraviyole ışık altında floresan bantları görüntülerini elde edin.

Fare Beyin Neuron 3. İlköğretim KültürüGlial Besleyici Layer s

NOT: Beyin diseksiyon ve hücre ayrışma (3.1) için prosedürler izleyen tüm prosedürler için ortaktır. Fare glial kültürlerinden prosedürleri (3.2), sıçan glial kültürleri (3.3) ve fare nöronal kültürlerinde (3.4) daha sonra ayrı ayrı açıklanmaktadır.

  1. Beyin Diseksiyon ve Hücresel Dissocaiation
    1. Hızla beyin kaldırmak ve Hanks solüsyonu içine yerleştirmek, başı kesilerek bir fare veya sıçan yavrusuna Kurban (bileşim için tablo 1 e bakınız) +% 20 (buz üzerinde tutulur), bir 35 mm çanak fetal sığır serumu (FBS).
    2. İki hemisfer içine orta hat boyunca beyin kesin. Beynin her yarımkürede ilgi bölgeyi (örneğin, serebral korteks, striatum ve hipokampus) sökün. Yüzeyden meninksler ve büyük kan damarları çıkarın. Cerrahi bıçak kullanarak 4-10 ince dilimler halinde beyin bölgesini kesin.
    3. Zekâ, bir kez 15 ml'lik santrifüj tüp içinde beyin dilimleri durulayınh Hanks çözeltisi +% 20 FBS, Hanks ile sonra da 3 defa '(serumsuz örneğin) bir (4 ° C). , Durulama 5-10 ml solüsyon ekleyin, dilim tüpün dibinde yerleşmek beyin, üst çözüm aspirat, izin ve taze bir çözüm eklemek için. Çözüm aspire durulama işlemi bitirin.
    4. 3 ml'lik bir şırınga ve bir 0.2 um şırınga filtresi kullanılarak tripsin içeren sindirim çözeltisi (bileşim için tablo 1 e bakınız), 2 ml filtre ve beyin dilim içeren tüp içine doğrudan filtrat ekleyin. Trypsinization oda sıcaklığında 13 dakika devam edelim.
    5. En iyi şekilde aspire ve 7-10 mi Hanks çözeltisi +% 20 FBS (4 ° C) ilave etmek suretiyle tripsin solüsyonu nötralize.
    6. Hanks ile iki kez, beyin dilimleri yıkayın 'çözeltisi +% 20 FBS ve Hanks daha sonra üç kez' solüsyonu (yani serumsuz) (4 ° C). Solut aspire durulama işlemi bitirmekiyonu temsil etmektedir.
    7. 3 ml'lik bir şırınga ve bir 0.2 um şırınga filtresi kullanılarak ayrışma çözeltisi (bileşim için tablo 1 e bakınız), 2 ml filtre ve beyin kesitleri ile doğrudan boruya filtrat ekleyin.
    8. Mekanik görünür doku parçaları kaybolana kadar hafifçe, 10-20 kez öğütülerek hücreleri ayırmak. Bir pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipet kullanın ve triturasyonun sırasında kabarcıkları yapmaktan kaçınmak.
    9. Küçük parçalar yerleşmek için 3 dakika bekleyin.
    10. Çözeltisi çoğunluğu aktarın (~ 1.5 mi, altındaki bir bir solüsyon) kullanılarak, 3 mi Hanks solüsyonu +% 20 FBS çözeltisi (4 ° C) ihtiva eden bir 15 mL santrifüj tüpüne pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipeti. Altındaki herhangi bir tortu dahil tipik kültür bozulması ile sonuçlanır, çünkü tüm çözüm transferi yapmayın.
    11. 4 ° C'de ~ 185 g (~ 1100 rpm) 13 dakika santrifüj uygulayın.
    12. Yavaşça süpernatant aspire,eklemek 1 ml önceden ısıtılmış pelet orta (37 ° C) kaplama ve hafifçe pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipet kullanarak birkaç kez pipetleme bunu tekrar süspansiyon.
      NOT: Ortamı kaplama Üç farklı farklı kültür amaçlı kullanılır: fare nöronları orta-2 kaplama, fare glial hücreler orta-1 kaplama, ve sıçan nöronlar ve glial hücreler orta-3 kaplama (kompozisyonlar için Tablo 1'e bakınız) .
    13. Hemasitometre veya otomatik hücre sayıcı kullanılarak, hücre süspansiyonu 10 ul çıkarın% 0.4 tripan mavisi çözeltisi 10 ul ile karıştırarak, ve canlı hücrelerin yoğunluğunu ölçmek.
  2. Fare Glial Kültürleri
    1. Fare hücreleri sağlıklı kültürleri kurulmasına yardım etmek lamelleri yıkayın.
      1. Cam bir Petri kabı içinde% 70 nitrik asit içinde cam lamelleri (yuvarlak, 12 mm çapında) daldırın. Alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun ve bir yörünge çalkalayıcı O / N üzerine yerleştirin.
      2. Cam coversli durulayındamıtılmış su ile Petri kabındaki PS en az üç kez. Distile su onları bırakın. Bir yörünge çalkalayıcı O / N çanak yerleştirin.
      3. Biyolojik güvenlik kabininde bir Whatman 150 mm filtre kağıdı üzerinde lamelleri kurulayın.
      4. Lamelleri otoklavlayın.
      5. 24-çukurlu kültür kabına lamelleri yerleştirin.
    2. Adım 1 ve 2'ye göre etiket ve genotip doğan farenin.
    3. Adım 3.1 göre fare yavrular beyin hücreleri elde.
      Not: serebral kortekste fare glial besleyici tabakanın hazırlanması için tipiktir. Bununla birlikte, bu hipokampus ve striatum gibi diğer beyin bölgelerinde, farklı sayı ve farklı bölgelerden hücre verimi için hücre yoğunluğu, uygun ayarlamadan sonra çalışır.
    4. Önceden ısıtılmış son hücre süspansiyonu, orta 1: kaplama ~ 4 ml (~ 1 mi). Ön ısınma kültür ortamı için, kültür inkübatör çözümü (% 5 CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, yerleştirmeksıcaklık ve pH değerleri, stabilize olmasına izin verin.
    5. Pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak, bir kaplanmamış T25 kültür şişesine hücre süspansiyonu aktarın. Kültür inkübatör içine yerleştirilir.
    6. Nitro (DIV), 1 gün içinde iki defa kaplama ile T25 şişesi içinde kültürlenmiş hücrelerin durulama orta 1 (4 ° C). Geri kuvöz içine balon yerleştirin. Bir girdap hareket birkaç kez taze ortamın ~ 5 ml ekleyerek, tamamen Pasteur pipeti şişeye içinde orta aspire ve yavaşça şişeyi eğerek durulama yapınız.
    7. 6-9 DIV anda, (yani, bir trypsinization gün önce ve 3.2.8-3.2.13 adımda, lamelleri kaplama), (hücre dışı matriks proteinleri ile kaplama malzemesinin 100 ul yer hakkında yorumlar için Malzemeleri / Ekipman bkz: İçindekiler Kaplama bir kültür kabı içinde cam lameller üzerine bir malzeme) ve kültürü inkübatöründe kültür kaplarına yerleştirin.
    8. 7-10 DIV, at hücreleri 20-4 olduğunda0% konfluent (mekansal sürekli), onları trypsinize.
      1. Bir şişe içinde tüm solüsyonu aspirasyon ve ~ Hanks solüsyonu (4 ° C) 13 ml ilave etmek suretiyle, bir kez balon yıkayın, yumuşak bir dönme hareketi bir şişe içinde bir kaç kez tilt ve tamamen çözelti aspire.
      2. 4 mi tripsin-EDTA çözeltisi DNaz çözeltisi (nihai konsantrasyon, 750 birim / ml) 40 ul ekle 0.2 mikron bir şırınga filtreden geçirilmiştir çözeltisinin, ve şişe hücreler doğrudan filtrat ekleyin.
      3. Tripsinizasyon kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 13 dakika sürmesine izin verin.
      4. Şişeye 100% FBS (4 ° C) 2 ml ekleyerek tripsin solüsyonu nötralize.
      5. Hanks çözeltisi +% 20 FBS (4 ° C), santrifüj ~ 4 ml, bir 5- ila 10-mi bir pipet kullanarak 15 ml santrifüj tüpüne tripsinize hücreleri transfer ~ 185 g ve 13 dakika süre ile 4 ° C ve süpernatant aspire.
    9. Ön Warme 1 ml pelletinid kaplama orta-1.
    10. Aşama 3.1.13 göre hücre yoğunluğu ölçülür.
    11. Lamelleri ~ yeniden süspanse glial hücreler 50 ul kaplama cam lamelleri tamamen malzeme, ve plaka aspire.
      NOT: Bu hücreler glial besleyici tabaka kuracak.
    12. Inkübatör lamelleri kültür çanak yerleştirin.
    13. 20-60 dakika sonra, önceden ısıtılmış her kuyuya orta-1 kaplama 1 ml ekleyin ve inkübatör geri çanak yerleştirin. Not: kaplama ortam ilave edilirken, lamel ortamda yüzer olmayacak şekilde, (hayır kaplama hücreler vardır) lamel çevresini aşağı basın başka bir pipet kullanmak yararlı olacaktır.
    14. (Cam lamel üzerinde, yani,), glial besleyici tabakanın 1 DIV içinde 1 ml orta yerine önceden ısıtılmış kaplama orta 1, bir kuyu içinde çözelti her aspirasyon ve daha sonra taze aracı ile doldurarak.
    15. Glial besleyici tabakasının 2-3 DIV at zaman celher bir oyuğa, bundan dolayı DNA replikasyonu ve inhibe etmek için, Ls mitotik durdurucu (81,2 ve 204,8 uM nihai konsantrasyonlar, sırasıyla 5-floro-2'-deoksiüridin + üridin karışımı 10 ul) ekleyin,% 80-100 konfluent Glial hücre çoğalmasını bastırmak.
    16. Hücreler% 90-100 sıklıkta (glial besleyici tabaka nöronlar kaplama önce 1-2 saat) zaman 7-9 DIV de, kültür ortamı yerine önceden ısıtılmış kaplama, orta-2 (37 ° C).
      Not: Nöronlar adım 3.4 kullanarak, aynı gün kaplama olacaktır.
  3. Sıçan Glial Kültürleri
    1. Kaplama aynı kaplama malzemesi ile T25 kültür şişesi.
      NOT: Bu adımda 3.3.5 içinde yapışkan olmayan hücreler daha sonra çıkarılması için gereklidir.
      1. Şişeye kaplama malzemesinin 2.0 ml ilave edilir, ve kültürü inkübatöründe balon yerleştirin.
      2. 2-3 saat sonra, şişenin taban kurur, böylece, tam olarak kaplama malzemesini aspire.
    2. Hücreler elde edilirsıçan yavrularından, 3.1 adım göre yöntem.
      NOT: hipokampus CA3-CA1 bölgesi sıçan glial besleyici tabaka hazırlamak için kullanılır. Bununla birlikte, bu tür beyin bölgelerinden gibi diğer beyin bölgelerinde, farklı sayı ve farklı bölgelerden hücre verimi hücre yoğunluğunda farklılıklar için ayarlama yapıldıktan sonra çalışacaktır.
    3. Önceden ısıtılmış son hücre süspansiyonu, orta 3: kaplama ~ 4 ml (~ 1 mi).
    4. Pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak, kaplamalı T25 kültür balona hücre süspansiyonu aktarın. Kültürü inkübatöründe (% 5 CO2 -95% O 2, 37 ° C) tutulur.
    5. 2-3 DIV hücreler% 20-40 konfluent olduğunda, kapağı sıkıca kapama balonu çalkalamak, yapışkan olmayan ya da zayıf biçimde yapışmayan hücreler giderilmiş kuvvetli bir şekilde ~ 10 kat çözeltisi, aspirasyon ile kaplama 4-5 mi ekleme Orta-3 (4 ° C'de). Bir kez bu işlemi tekrarlayın. (Örn tüm şişe zemin üzerinde kültür hücreleri incelemek,tamamen kaldırılır) hücre vücudun dış kenar faz parlak görünen o ki için, yani nöronal (görünür olanlar onaylamak için faz-kontrast mikroskobu) kullanılarak. Bu hücreleri kaldırmak ve daha sonra inkübatör şişeyi geri dönmek için gerektiği kadar işlemi tekrarlayın.
      NOT: gücü ve bireysel deneyci arasında farklılık olabilir gerekli 'sallar' toplam sayısı. Önemli olan bir dizi sayıya sallar toplam sayısını tutmak, ancak nöron benzeri hücreler ortadan kalkar onaylamak değildir.
    6. 6-8 DIV hücreler% 90-100 sıklıkta olduğu, geçiş adımı 3.2.8 olduğu gibi bunları trypsinizing glial hücreler olduğunda.
    7. Santrifüj işleminden sonra, bir kaplanmamış T75 şişeye tripsinize hücreleri transferi, orta-3 (4 ° C), kaplama 10 mi ekleyin ve kültür onları orta-3 (4 ° C), kaplama, 1 ml pelletini inkübatör.
      NOT: Sıçan glial hücreler iki kez geçişli olacak; Buna fare glial hücreler arbirden çok pasajlar sonra sağlıksız hale çünkü e sadece bir kez pasajlanır. Sıçan, glial hücreler, herhangi bir kaplama malzemesi ile kaplanmıştır değildir T75 şişeleri içinde pasajlanmağa devam edilecektir. Kaplama sıçan glial hücreler çok hızlı büyür ve daha sonra nöronal kültür durumunu bozulacaktır birçok kirpikli hücreler (varsayılan ependimal hücreler), verim sağlar.
    8. Bir şişe içinde, glial kültür 17-19 DIV de (örneğin, 11 gün pasaj ve tripsinleme bir gün önce ve 3.3.9-3.3.14 adımlarla lamelleri üzerine kaplama sonrası), (yıkanmamış cam lameller üzerine kaplama malzemesinin 100 ul koyun yuvarlak, 12 mm çapında) bir kültür çanak ve kültür inkübatör kültür çanak yerleştirin.
      NOT: sıçan glial kültürler için, bir fark ile veya lamelleri yıkama olmadan kültür sonuçlarında fark edildi.
    9. Bir şişede glial kültür 18-20 DIV anda (yani, Pasajlanması sonra 12 gün), st göre, kültür hücreleri trypsinizing glial besleyici tabaka hazırlamakep 3.2.8.
    10. Santrifüj sırasında, cam lamelleri tamamen kaplama malzemesi aspire.
    11. Santrifüj işleminden sonra, adım 3.1.13 göre, orta-3 (4 ° C), kaplama, 1 ml pelet tekrar süspansiyon ve hücre yoğunluğunun ölçülmesi.
    12. 10 4 canlı hücre / ml glial yoğunluğunu ayarlayın ve kaplamalı cam lamelleri glial hücre süspansiyonu 100 ul plaka.
      NOT: Bu hücreler glial besleyici tabaka kuracak.
    13. 20-60 dakika süreyle kuvöz içine lamelleri ile kültür çanak yerleştirin.
    14. Her bir orta-3 (4 ° C) kaplama için 1 ml ilave edilir, ve inkübatör çanak yerleştirin.
    15. Lamel hücreleri% 40-80 konfluent olduğunda, glial besleyici tabaka 3-4 DIV, içinde önceden ısıtılmış bir büyüme ortamı, 1 ml ilave (sitosin β-D-arabinofuranosid içeren (bileşim için tablo 1 e bakınız) Araç, 4 uM nihai konsantrasyon), glial hücre çoğalmasını durdurmak için. Plaka nöronGlial besleyici tabakasının 7-9 DIV s at hücreleri adım 3.4 kullanarak,% 60-80 konfluent olduğunda.
  4. Fare nöronal kültürlerinde
    1. Adım 1 ve 2'ye göre etiket ve genotip doğan farenin.
    2. Adım 3.1 için fare yavrular kullanın.
    3. Canlı hücre süspansiyonu yoğunluğunu ayarlamak için ~ kullanılarak, 2.0 x 10 5 hücre / ml önceden ısıtılmış orta 2 fare, glial hücreler üzerinde kaplama ya da kullanımı için kaplama kaplama orta 3 sıçan glial hücreler üzerine kaplama için.
    4. Yavaşça her kültür ortamı hücre süspansiyonuna eklenmeden tarafından iyi glial besleyici tabaka, hücreler plaka. Not: eklenecek hücre süspansiyonu hacmi de bir kültürde hücrelerin hedef numarası ile belirlenecektir. Örneğin, plakasının hücre süspansiyonu 60 ul / kuyucuk 12,000 hücre elde etmek için.
    5. Nöronlar kaplama sonra hiçbir çözüm değişiklikler gerekli olduğunu unutmayın. Kültür boyunca, iç o nemlendirerek kuyulardan çözümün buharlaşmasını önlemek için dikkatli olunkültürü inkübatöründe f.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokolün uygulanmasında bir örnek olarak, temsili sonuçlar çeşitli deneysel koşullar altında dövme, güvenilir genotiplemede tarafından fareler etiketleme, ve glial besleyici katmanlar birincil nöronal kültürlerin kurulması için gösterilmiştir.

Dövme

Yenidoğan yavrular (Şekil 1 'Yenidoğan') bir dövme sistemi kullanılarak pençe yastıkları etiketli bulundu. etiketler 3 haftada açıkça görünür kalmıştır ('3 haftalık') ve yaş 32 hafta ('32 'haftalık bir eski). Bireysel fareler benzersiz Dört bacak (sayı 1-16) dövmeler bir kombinasyonu ile ve hayvan kafesine ya da daha karmaşık bir numaralama şemaları ile ilgili bilgileri ile tespit edilebilir (gösterilmemiştir).

Genotipleme

Genotiplemede biri temsili bir örneği (Şekil 2) gösterilmiştir. Yabani tip Tor1a geni (Tor1a (Tor1a + / AE) ve homozigot (Tor1a AE / AE) AE-Torsina knock-in fareler doğan yavrular kuyruk klipleri izole edilen genomik DNA'dan büyütülmüştür. Bu özel örnekte, Genotipleme, bir neomisin direnç kaseti 16,18 başarılı Cre rekombinasyon ve silme sonra mutant Tor1a allelindeki bir tek 34-baz-çifti loxP bölgesinin varlığına dayanır.

Genomik DNA, en az eller kez ekstre edildi, ve bir çok numuneler aynı anda işlenmiştir. ekstraksiyon hacimleri sabit tutuldu ve bu nedenle hacim hiçbir ayarlama test koşullarındaki değişikliklere uydurulmak için gerekliydi. Aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi genotipleme güvenilirlik, dört koşullar altında test edilmiştir.

İlk olarak, başlangıç ​​dokusu miktarı farklılıklarının etkileri (Şekil 3) incelenmiştir. Farklı uzunluklarda kuyrukları vardısütten yaşta heterozigot AE-Torsina knock-farelerin (Tor1a + / AE) (~ 3 hafta) hazırlanan. 2 ila 5 mm arasında kuyruk uzunluğu, tipik olarak genotipleme protokollerinde tavsiye edilen aralık, yüksek kalite aynı genotipleme sonuç verdi. iki bant vahşi tip ve mutasyona uğramış aleller (Tor1a + ve Tor1a AE, sırasıyla) karşılık gelmektedir.

İkinci olarak, hayvan yaşı değişkenlik etkileri (Şekil 4) incelendi. Tails yenidoğan, 3 haftalık elde edildi ve ~ 24 haftalık heterozigot AE-Torsina knock-farelerin (Tor1a + / AE). Doğumdan 16-18 gün sonra birkaç die çünkü homozigotlann kullanılmamıştır. iki vahşi tip için beklenen bantlar ve mutasyona uğramış Tor1a genler bağımsız hayvan yaşı (Şekil 4A) ve görünür. Bu sonucun, genel uygulanabilirliği vahşi t ikinci bir gen, Tfap2a 19 kullanılarak test edilmiştirype fareleri (Tfap2a + / +) (Şekil 4B).

Üçüncü olarak, PCR amplikonlarının uzunluğu farklılıkları etkileri (Şekil 5) test edilmiştir. Bu amaçla, farklı primer çiftleri büyütülmüş DNA'lar farklı baz çifti uzunlukta olan, öyle ki, belirli bir gen için sentezlenmiştir. Tfap2a geni sürekli olarak, farklı amplikon uzunlukları ile tespit edildi.

Dördüncü olarak, iki DNA ekstraksiyon yöntemleri (Şekil 6) göre gerçekleştirilmiştir. Bir yöntemde, PCR şerit tüpler ve PCR termal döngü cihazı (aşama 2'de tarif edilmiştir) kullanıldı. Bu, otomatik paralel çoklu tüp ekstraksiyon metodu (Şekil 6'da "Otomatik") 'dir. Birden çok boru şerit biçiminde eş zamanlı olarak ele alınabilir ve bir PCR makinesi, dört sıcaklık adım adım çalıştırmak için bir program ile kullanıldığı için, el ile, borular aktarmak ekstraksiyon sırasında sıcaklığının değiştirilmesi veya çok sayıda, kullanmaya gerek yokturekipman. Böylece birçok örnekleri işlemek kolaydır. Bu (Şekil 6 'Manuel') manuel, tek tüp çıkarma dayanan ikinci yöntem ile karşılaştırıldı. Bu DNA ekstraksiyon sırasında sıcaklığını kontrol etmek, bireysel PCR tüpleri ve ayrı olmayan PCR makineleri (ısı blokları ve su banyoları) kullanır. Bu durumda, birden fazla tek tüpler çoklu sıcaklık kontrol cihazları gerektiren, her basamaktan sonra yeni bir ısı derecesine taşınmıştır. Her iki durumda da, Tor1a geni yabani tipli, heterozigoz ve homozigoz AE-Torsina knock-in fareler (Şekil 6A) içinde analiz edildi ve Tfap2a geni yabani tip fareler (Şekil 6B) içinde analiz edildi. İki çıkarma protokolleri eşdeğer genotipleme sonuçlar vermiştir.

Özet olarak, Şekil 3-6 sunulan sonuçlar genotipleme yöntemi va rağmen, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde sağlam olduğunu göstermektedirdoku miktarı, hayvan yaşı, amplikon uzunluğu ve kullanılan ekstraksiyon protokolünde riations.

Nöronal kültürler

Fare glial besleyici tabaka üzerinde fare nöronları kültürleme için, prosedürlerin sırası: nöronal kültür → nöronal kültür için yenidoğan fareler → genotiplendirmesi dövme glial kültürü → (glial kültür → için dövme yenidoğan fareler → genotiplemesi). Sıçan glial besleyici tabaka üzerine kurulan kültürler için, parantez içinde prosedürleri atlanır.

Biz nöron hayatta kalma ve büyüme üzerindeki öncesi numaralı seribaşı glial besleyici tabakasının destekleyici etkisi incelenmiştir. Nöronlar hipokampüsün CA3-CA1 bölgesinde, serebral korteks, motor bölgesi, ve yeni doğan vahşi tip farelerin striatum elde edilmiştir. Bunlar uygun olarak, hipokampüsün CA3-CA1 bölgesinde elde edilen ve nöronal kaplama öncesinde ekilen sıçan glial besleyici tabaka üzerinde düşük yoğunlukta kaplandıŞekil 7 'de gösterilen şema (prosedürler basitleştirilmiş özet). Düşük yoğunluklu kültürleri, yüksek uzaysal çözünürlükte somata 4,6, sinir terminalleri 2,3,5,8 ve aksonal milleri 5 ayrı dendritlerin görüntüleme için uygun bulunmaktadır. hipokampal hücreleri (nöronlar ve glial hücreler içeren) ya da (Şekil 8A) veya önceden belirlenmiş bir glial besleyici tabaka (Şekil 8B, C) ​​olmadan, kaplanmış cam lameller üzerine kaplanmıştır ve faz-kontrast optikler ile gözlendi. Hemen hemen birleşik glial besleyici tabaka varlığında, nöronlar (her panelde, bir ok ucu bir temsilci nöron belirtir) göreceli olarak (in vitro gün DIV) (Şekil 8A), kaplama sonrası 3 ve 7 gün dağıtılmıştır. Onlar da bu tür nöronal somata açık farkla, genişletilmiş dendritler, kümelenmiş somata eksikliği ve birlikte nöritlere eksikliği olarak iyi bir sağlık belirtileri gösterdi (yüksek büyütmeli imagilavelerde es). 14 DIV anda, bu nöronlar uzun nevritler (dendritler ve aksonlar) ile karakterize yoğun bir ağ kurdu. Nöronlar Mitotik durdurucunun ARAÇ (aşama 3.3.15) içeren büyüme ortamı ilave edilerek kaplama önce glial proliferasyon inhibe dikkat etmek gerekir.

Bunun aksine, hipokampal nöronlar kaplama sırasında glial besleyici tabaka yokluğunda kültürlenmiş hipokampal nöronlarının büyümesi daha AraC yokluğunda zayıflatılmıştır. 3 DIV anda, (yeni kaplama hipokampal hücrelerde dahil) glial hücreler (Şekil 8B üst panelinde yıldız) bir birleşik levha oluşmuş değil. kültürler gibi altta yatan glial hücreler (yıldız işareti) olmadan geniş alanlarda yüksek çözünürlüklü görüntüleme çalışmaları için uygun değil birkaç işaretler, kümelenmiş somata varlığını ve bazı bölgelerde birlikte nöritlerin varlığını göstermiştir (veriler gösterilmemiştir). 7 DIV, glial hücreler konfluent levha (Şekil 8C orta panel) kurdu. Ancak buradaner, nöronları önceden belirlenmiş bir glial besleyici tabaka ile kaplandı zaman sayıca daha az idi. kalan nöronlar da uzun, ağ oluşturan neurites (ek) yoktu. glial hücreler, böylece faz-parlak görünen, besleyici tabaka kültüründe daha eğrilik ve kalınlığı daha heterojen idi. Nöronlara glial hücre proliferasyonunu bastırma etkilerini test etmek için, biz büyüme ortamı AraC içeren uygulanır. Ara C 3 veya 7 DIV ilave edildi ve hücreler, 14 DIV kadar kültürlendi ve bu gün (Şekil 8B ve C, alt paneller) ile gözlendiğinde, gliyal hücreler, lamel zemindeki. Ancak, nöronlar AraC 7 DIV uygulanmıştır özellikle, hala sayıca azdı. hayatta nöronlar sadece kısa süreçleri vardı ve yoğun bağlantılı değildi. Böylece, AraC'nin geç eklenmesi oluşturmak için bir üniforma glial tabaka izin ama nöronal canlılığı veya akson uzantısı teşvik etmedi; kontrolsüz glial büyüme yerinenöronlar üzerinde zararlı etkileri vardı.

Bu veriler, glial besleyici tabaka düşük yoğunlukta plakalanmaktadır nöronların hayatta kalması ve büyümesi için kritik olduğu ve glial tabaka nöronal kültür sırasında daha nöronal kaplama yerine anda mevcut olması gerektiğini gösterir. Benzer sonuçlar, serebral kortikal kültürleri (Şekil 9) ve striatal nöronlar (Şekil 10) kullanılarak elde edilmiştir.

Nöronal hayatta kalma ile ilgili nitel gözlem nicel analizi ile teyit edilmiştir. Spesifik olarak, 14 DIV yaşayabilen nöron sayısı kültürlerin faz-kontrast görüntüleri (Şekil 11) dayanmaktadır, sayılmıştır. numara glial besleyici bir tabaka kültüre nöronlar (yani., glial besleyici tabaka üzerine kaplama) için büyük oldu. sayı glial besleyici bir tabaka yokluğunda kültürlenmiş nöronların durumunda daha düşüktü. Hücreler en AraC ile tedavi edildikleri zaman sayısı daha da azaltılmışsonraki zaman. Bu farklar, istatistiksel olarak anlamlı idi ve üç beyin bölgelerinde elde edilen nöron kültürlerinde gözlenmiştir.

Hayatta kalan hücrelerin tip hipokampal kültürleri fare hipokampal besleyici tabaka kaplama farede 14 DIV tespit edilmiştir. Çift immünositokimya nöronal marker karşı mikrotübüle bağlı protein, 2 (MAP2) antikorlar kullanılarak gerçekleştirildi ve astrositik glial hücre işaretleyici, gliyal fibriler asidik protein (GFAP). Altta yatan glial besleyici tabakasındaki hücreler GFAP (iki temsilci görüntü alanları, Şekil 12A) için pozitif ise genişletilmiş süreçlerle hücreler, map2 için pozitif idi. İkinci antikorların farklı bir dizi (Şekil 12B) kullanıldığı zaman, aynı model elde edildi, bu boyama, birincil ve ikincil antikorlar, belirli bir kombinasyonunun bir artifakt olup.

Bunun tersine, aynı boyama perfo specializing zamanilave fare hücreleri (iki temsili görüntü alanları, Şekil 13A) yokluğunda sadece glial besleyici bir tabaka, örneğin, aşağıdakilerden oluşan kültürleri üzerinde rmed, hiçbir hücre MAP2'nin pozitifti. besleyici tabakasının hücreleri GFAP sürekli pozitif idi. Negatif kontrol için, her iki primer antikorlar immünositokimyasal prosedür (Şekil 13B) için ihmal edilmiştir. Hücreler, bu her ne kadar hiçbir boyama geçen ışık optik (diferansiyel-interferans-kontrast DIC) ve Hoechst boya ile nükleer boyama de görüldüğü gibi, bu örneklerde tespit edildi. Bu nedenle, MAP2 ve GFAP kanallarında spesifik olmayan boyama çok zayıftı.

Bu immünositokimyasal veriler de nicel olarak (Şekil 14) kullanılarak analiz edilmiştir. Her biri 8 bitlik bir görüntü olarak, yoğunluğu ölçülür ve bir hat boyunca grafiğe geçirilmiştir. Fare hücreleri (nöron içeren örnekler) (Nöron + glial besleyici bir tabaka kültüre ne zaman Kaplanmış araziler, MAP2 boyama ortayaGlia + gibi boyama sadece glial besleyici bir hücre kültürlerinde (Neuron olarak mevcut iken, birincil antikor (1 ° Ab) +) - glia + 1 ° Ab *). (- 1 ° antikor, glia + - Nöron) primer antikor içermeyen negatif kontrol olarak, boyama sadece glial besleyici bir hücre kültürlerinde ardı edilebilir miktarlarda olmuştur. GFAP boyama bağımsız fare hücreleri kaplandı olsun, gliyal besleyici tabaka içinde görülür olduğu (Nöron + glia + 1 ° antikor +) ya da (Nöron - glia + 1 ° Ab *). Yine, negatif kontrol olarak boyama (Nöron - glia + 1 ° antikor -) ihmal edilebilir. Bu sonuçlar, sıçan glial besleyici tabaka çoğunlukla astrositlerde oluştuğunu gösteriyor ve nöronlar mevcut olduğunu fare hücreleri eklendi sadece. Ayrıca, bu kültürlerde mevcut nöronlar fareden yalnızca çıktığına işaret etmektedir.

Online video Sonuçları Bölümü de bo glial besleyici bir tabaka üzerinde kaplama kültürlü nöronların DIC ve MAP2 görüntüleri gösteririnci yabani tip farelere CA3-CA1 hipokamp bölgesinin hazırlanabilir.

Hücre kültürü ayrıntılı kontrol için, her iki beyin diseksiyon ve hücre ayrıştırma aşamaları genel kalitesini değerlendirmek için ve önceden belirlenmiş bir yoğunlukta hücreler kaplama için canlı hücre yoğunluğunu ölçmek için tavsiye edilir. Tipik yoğunluk ölçümleri ile ilgili dört ayrı aşağıda listelenmiştir. Bu sayılar, kültür koşulları ve tepkime maddeleri bağlı olarak değişebilir, ancak, dikkat edin. Örneğin, aynı satıcıdan alınan serum hatta farklı sayıda sonuçlarını etkileyebilir. Bu nedenle, bu rakamlar genel bir göstergesidir yerine mutlak kılavuz göz önüne alınmalıdır.

Hücresel ayrışma (adım 3.1.13) için, bir yavru elde edilen canlı hücre yoğunluğu için tipik değerler şunlardır: ~ 2 x 10 5 hücre / ml (fare motor korteks ve fare CA3-CA1 hipokampus), ~ 5 x 10 5 hücre / ml (fare serebral korteks ve sıçan CA3-CA1 hipokampus), ve ~ 1 x 10 6 carşın / ml (sıçan striatum). Bütün bu durumlarda, canlı hücre fraksiyonları (toplam hücre sayısının edilene canlı hücre sayısına oranı olarak tanımlanmaktadır, canlılık),>% 90 idi. motor korteks gevşek hemen striatum 20 dorsal yattığı serebral korteksin bölge olarak tanımlanır. Hipokampal kültürler için, hipokampus CA3 ve CA1 bölgeleri doğru tercih edilir. Bütün hipokamp ek granül hücrelerin büyük sinir terminalleri oluşumuna yol açar ve sinaptik özellikleri 21 heterojenite getirmektedir dahil olan dentat girus içerir. striatal kültür kaudat-putamen ve globus pallidus içerir, ancak çekirdek accumbens dahil, ya da yakın yapılarda medial veya lateral septal çekirdekler değil.

Fare glial kültürü (aşama 3.2.11) için, kaplama yoğunluğu, yaklaşık 2 x yoğunluğunda her 12 mm yuvarlak lamel ~ 10000 glial hücreler kullanılarak ~ hücre süspansiyonu 50 ul bir10 5 hücre / ml olmuştur. Genellikle yüzer ölçülen yoğunluk sabit olduğu ve ayarlama gerektirmez. Farklı alanlarda yoğunluğu dönüştürmek için yararlı bilgiler lamel 1.20 cm'lik bir çapa ve 1.13 cm 2 lik bir alan olmasıdır. Böylece, ~ 10.000 hücre / lamel = ~ 8,800 hücre / bir lamel cm 2.

Sıçan glial kültürü (aşama 3.3.12) için, kaplama yoğunluğu ~ 1x10 4 hücre / ml bir yoğunlukta hücre süspansiyonu ~ 100 ul kullanılarak, her biri 12 mm yuvarlak lamel ~ 1000 glial hücreleri. Böylece, 1,000 hücre / lamel = ~ 900 hücre / bir lamel cm 2.

Düşük yoğunluklu fare nöronal kültür (aşama 3.4.4) için, kaplama yoğunluğu, 24 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu başına 2,000 ila 48,000 hücreleri arasında değişir. Sıçan glial hücreler üzerinde nöronları kaplama tipik değerler şunlardır: 10,000-24,000 hücre / kuyu serebral kortikal nöronlar için, 12,000-24,000 hücre / kuyu CA3-CA1 hipokampal nöronlar ve 2Iyi striatal nöronlar için 4,000-48,000 hücre /. Fare, glial hücreler üzerinde kaplama, numara, azalır, örneğin, 2,000 hücre / göz 'de CA3-CA1 hipokampal nöronlar. Bir yan not olarak, bir sıçan glial besleyici tabaka üzerinde fare CA3-CA1 hipokampal nöronlar kaplama için, kaplama yoğunluğu / kuyu 1,000-6,000 hücreleri. Bir lamel yoğunluğu iyi olarak yoğunluğu dönüştürme için yararlı bilgiler alt İç de çapı 1.56 cm'dir ve alanı 1.91 cm2 olmasıdır. Bu durumda, örneğin, 12,000 hücre / kuyu = 7,100 hücre / lamel = 6,300 hücre, bir lamel / cm2. Bu yoğunluklar, yüksek çözünürlüklü görüntüleme hücresel nispeten seyrek nöronlar kültürleme amacıyla seçilmiştir. Araştırmacılar en iyi şekilde deneysel amaçlarına uygun sayılarını seçmelisiniz.

Şekil 1,
Şekil farelerin 1. Dövmeli pençe yastıkları. Newborn fareler pençe yastıkları dövme ile etiketlendi. Onlar (3 haftalık) yaş 3 hafta, dövme (yenidoğan) hemen sonra fotoğraflandı ve yaş (32 haftalık) 32 haftalık bulundu. etiketler yetişkinlik boyunca kolayca görülebilir kalmıştır. Çıkan Farklı hayvanlardan alınmıştır. Aynı ölçekte gösterilmemiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2, yabani tip Genotipleme (Tor1a + / +), heterozigot (Tor1a + / AE) ve homozigot (Tor1a AE / AE) Tor1a gen allelleri yabani tip ve mutant analiz edildi knock-farelerin. AE-Torsina formlar, kullanılarak DNA doğan yavruların kuyrukları çıkarılan. Tail uçları uzunluğu yaklaşık 4 mm idi. DNA SYBR Güvenli DNA Jel Leke kullanılarak boyandı. Tor1a geni için primer ve termal döngü programı hakkında bilgi için Malzeme / Ekipman Tablo Bkz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Başlangıç ​​malzemesinin miktarı değişim bağlamında genomik DNA Şekil 3. Algılama., Farklı uzunluklardaki kuyruk uçları kullanılmıştır. Deney hayvanları 3 haftalık eski, heterozigot AE-Torsina knock-farelerin (Tor1a + / AE). Geçitler iki kez (soldan sağa), 2, 3, 4 ve 5 mm kuyruk uzunlukları temsil eder. kuyruk uçları farklı farelerden elde edilmiştir. En soldaki şeritte molekül ağırlıklı boyutu belirteçleri, DNA s uzunlukları temsil100 baz çifti Teps'in. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Hayvan yaş değişim bağlamında genomik DNA 4. Algılama Şekil. (A), Tor1a geni. (Soldan tekrarlardaki) ~ 24 haftalık 3 haftalık, yenidoğan ve (B): şerit şu aşamada heterozigot AE-Torsina knock-farelerin (Tor1a + / AE) elde edilen kuyruk ipuçları temsil eder. Tfap2a geni. (Soldan tekrarlardaki) ~ 24 haftalık doğan, 3 haftalık ve: şerit şu aşamada yabani tip (Tfap2a + / +) farelerden elde kuyruk ipuçları temsil eder. Her iki gen de kuyruk uzunluğu yaklaşık 4 mm çoğaltıldı. Beklenen PCR parçası 498 bp. PCR programı wa Tor1a geni için kullanılan aynı s. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
PCR amplikonunu uzunluğunda değişim bağlamında genomik DNA Şekil 5. tespiti. Tfap2a geni PCR amplikonu 498 bp uzunlukları (sol kulvar), 983 bp (orta şerit) ve 1990 bp (sağ kulvar) içinde analiz edildi çoğaltır. Gen 3 haftalık farelerin kuyruk ile amplifiye edildi. Jelin en soldaki ve sağdaki şerit Moleküler ağırlık belirteçleri boyutu, sırasıyla 100 ve 200 baz çifti adımlarla DNA uzunlukları temsil eder. Farklı amplikonlarının için primerler hakkında bilgi için Malzeme / Ekipman Tablo bakın. 879fig5highres.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil 6,
DNA ekstraksiyon yöntemi varyasyon kapsamında genomik DNA Şekil 6. Algılama. El Çıktıları, tek tüp çıkarma (Manuel) ve otomatik, paralel çoklu tüp çıkarma yöntemleri (Otomatik) karşılaştırılır. İkinci yöntem, bu rapor boyunca kullanılmıştır. Genler kuyrukları yenidoğan toplanan uzunluğu yaklaşık 4 mm çoğaltıldı. AE-Torsina arasında doğan yavrular (A) Tor1a gen knock-farelerin. Geçitler (manuel ve otomatik), vahşi tipli, heterozigoz (manuel ve otomatik) ve homozigot farelerde (manuel ve otomatik) (soldan sağa) elde DNA'lar temsil eder. 3 haftalık vahşi tip farelerden (B) Tfap2a geni. Beklenen PCR parçası 498 bp.jove.com/files/ftp_upload/51879/51879fig6highres.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil 7,
Glial hücreler, ilk olarak kültürde plâkalanmış sonra Şekil 7. Fare (A) ve farede (B), glial besleyici tabakalar fare nöronlar kaplama için prosedürlerin şematik basitleştirilmiş. Numaraları gün (in vitro gün) kümülatif gün bakınız matara. Onlar sadece kaba bir tahmin olarak hizmet vermektedir. Pratik ayrıntılar için, Prosedürleri bölümüne bakın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 8,
Şekil 8. Destekleyici etkisidüşük yoğunluklu kültür hipokampal nöronlarının büyümesi üzerindeki glial besleyici tabakanın. Nöronlar yenidoğan, vahşi tipli fare hipokampusunda CA3-CA1 bölgesinde elde edilmiştir. (A), fare hipokampal hücreleri, kaplanmış cam kapak slipleri üzerinde plakalanmıştır olan hipokampüsün CA3-CA1 bölgesinde elde edilen bir sıçan glial besleyici tabaka ile önceden tohumlanmış edilmiştir. Nöronlar sağlıklı bir şekilde eşit dağıtılmıştır. Kültürler, 3, 7 ve 14 DIV gözlenmiştir. (B, C) ​​fare hipokampal hücreleri, önceden belirlenmiş besleyici tabakası vardı kaplanmış cam kapak slipleri üzerinde plakalanmıştır. Kültürler 3 DIV (B üst panel) ve AraC tedavi olmadan 7 DIV (C orta panel) gözlenmiştir. Kültürlerin diğer setleri, hücreler 3 DIV (B alt panel) ve 7 DIV (C alt panel) de AraC ile tedavi edildi ve 14 DIV gözlendi. Tüm görüntüler olan nöronlar aynı gün ekildi aynı yavru, elde edilen kardeş kültürleri temsil eder. Ayrıntılar için metne bakınız. Her panel, bir exBir nöronun geniş bir beyaz ok ile gösterilen ve bir içerlek büyütülür. Nöronlar olan çevre faz-kontrast optik tarafından bakıldığında parlak görünen hücre ceset var, ve onlar da kalın süreçleri var. Yıldız glial hücreleri olmadan alanları gösterir. Kültürler (1x de, yani) bir ara lens olmadan 20X objektif lens (0.45 sayısal diyafram) ile faz-kontrast optikler kullanılarak ters bir mikroskop canlı görüntülenmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 9,
Düşük yoğunluklu kültür serebral kortik nöronlarının büyümesi üzerindeki glial besleyici tabakanın Şekil 9. Destek etkisi. Ama c motor bölgesinden elde edilen nöronlarla Şekil 8'de olduğu gibi, benzer sonuçlar eldeerebral korteksi yer alır. AC Şekil 8 olanlara karşılık etiketler koşullar altında. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 10,
Şekil 10. bir düşük yoğunluklu kültür striatal nöronların büyümesine glial besleyici tabakanın Destek etkisi. Şekil 8 ve 9'da olduğu gibi fakat striatumda elde edilen nöronlarla benzer sonuçlar. AC Şekil 8 olanlara karşılık etiketler koşullar altında. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 11. nöron yaşamı üzerinde glial besleyici tabakanın Destek etkisi. Kalan nöron sayısı faz-kontrast mikroskobu ile elde edilen görüntüleri kullanarak, Şekil 8'de gösterilen deneylerde sayılmıştır. 14 DIV için Görüntüler tekrar burada gösterilen, ancak ok uçları ile sayılan nöronların örneklere işaret ediyor. çubuk grafik (her kültür durumu için 7-24 alanları ortalama ± standart hata, n =) görüntü alanının (449,0 mm x 335,5 mm) başına nöron sayısı gösterilmektedir. '(-), AraC 3 DIV Glial besleyici tabakası' ve 'Glial besleyici tabaka (-), AraC 7 DIV üzerinde' 'Glial besleyici tabaka (+)' (dan * p <0.05, ** Yıldız istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar göstermektedir p <0.01, Student t-testi). çubuklar üzerinde sayısı, bir çok görüntü alanları da montajlanmasında ölçülen nöronal yoğunluğu göstermektedir. Görüntüler vardıBir 20X objektif lens kullanarak satın aldı. Satın alma önyargı önlemek için, tüm görüntüler bir lamel yukarıdan aşağıya, tam dikey şeridinde edinilen ve lamel yaklaşık merkezinden geçerek. Bireysel görüntüleri (üstte ve altta bir görüntü alanının 1/4 örneğin, 1/6) bazı örtüşme vardı. Iki yöntem analizi için kullanıldı. Birinde, nöronlar bireysel nöronların birden fazla sayılmamıştır sağlamak için görüntü ardışık olarak sayılmıştır. Elde edilen numaralar çubuk grafiği oluşturmak için kullanıldı. İkinci yöntemde, tek bir montaj bireysel görüntülerden oluşturuldu. Onlar Photoshop kullanarak el ile Microsoft Image Composite Editor kullanarak veya dikişli edildi. kurgular aynı nöronların birden sayıları hariç. Ortaya çıkan rakamlar barlar yukarıda listelenmiştir. Her iki yöntemde de, herhangi bir hücre içermeyen bir örtücü cam, çevresinde geniş alanlar hariç tutulmuştur. Onlar parlak göründü hücre gövdeleri olsaydı Hücreler nöronlar gibi sayıldıFaz-kontrast mikroskobu, yanı sıra genişletilmiş hücresel süreçlerle. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 12,
Nöronal kültürlerde hücre tiplerinin Şekil 12. imünosito kimyasal tespiti. Kültür durum Şekil 8A'da sol alt görüntüye karşılık gelir. Nöronlar, vahşi tipli fare hipokampusunda CA3-CA1 bölgesinde elde edilen ve vahşi tip sıçan hipokampusunun CA3-CA1 bölgesinden oluşturulmuş glial besleyici bir tabaka ile kaplanmıştır. kültürlü hücreler nöronal belirteç map2 için immünsitokimya ve astrositik glial hücre işaretleyici GFAP ile analiz edilmiştir. Diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi, 14-17 görüntülü alanların genel morfolojisi ortaya çıkarmak için kullanıldınöronlar gün sonra glial besleyici tabaka ile kaplandı. (A), üç renkli boyama, nükleer işaretleyici Hoechst 33342 boya ile karşıt dahildir. İki temsili görüntü alanları gösterilmiştir. (B) İki renkli boyama, farklı floroforlar ile konjuge sekonder antikor farklı kombinasyonları ile. CaCl2, 2 125 NaCI, 2 KCI, 2 MgCl2, 30 D-glükoz, 25 HEPES, pH 7.4: Bu deneylerde, kültürlenmiş hücreler, Tyrode çözeltisi (mM olarak ihtiva eden% 4 paraformaldehit ve% 4 sukroz ile sabitlendi 5 M NaOH ile ayarlanmıştır, ~ 4 ° C sıcaklıkta 30 dakika için ayarlama yapılmadan 310 mOsm). Tyrode çözeltisi ile yıkandıktan sonra, 10 dakika Tyrode çözeltisi içinde% 0.1 Triton X-100 ^ ile geçirgenleştirildi edildi. Yine Tyrode çözeltisi ile yıkanmış ve daha sonra oda sıcaklığında 60 dakika boyunca fosfat tamponlu tuz (PBS) (engelleme çözeltisi) içinde% 2 normal keçi serumu ile bloke edilmiştir. Bundan sonra, tavşan poli ile muamele edildiklonal bir anti-MAP2 antikoru (AB5622; çözümü engelleme 400x seyreltme) ve fare monoklonal anti-GFAP kokteyli (NE1015, 1,000x seyrelti) O / N (15-21 saat) 4 ° C'de ilave edildi. PBS ile yıkamayı takiben, hücreler (bloke çözeltisi içinde 500x seyreltme) Alexa Fluor 405 ile konjuge edilmiş keçi anti-tavşan ve anti-fare IgG antikoru, Alexa Fluor 488 (1,000x) ya da 60 için Alexa Fluor 568 boya (500x) ile inkübe edildi oda sıcaklığında Min. Bunlar, PBS ile yıkandı ve PBS içinde doğrudan gözlenmiştir. Bazı kültürlerde, yukarıdaki prosedürlere son yıkamadan sonra, hücreler, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde 0.5 ug / ml'de Hoechst 33342 ile muamele edildi ve gözlem önce PBS ile yıkanmıştır. Bu daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen rakam.

Şekil 13,
Şekil 13. Immunocytochemical glial besleyici tabaka kültürlerinde hücre tiplerinin tanımlanması. Şekil 12'de gösterildiği gibi, sıçan, glial besleyici tabakalarının kardeş kültürleri, ama fare nöronların kaplama olmaksızın. (A), Şekil 12A'da tarif edilen prosedürler kullanılarak imüno lekelenmesi. İki temsili görüntü alanları. Gösterildiği A'da tarif immünositokimyasal prosedürler kullanılarak, glial besleyici tabaka (B) Boyama, ancak primer antikorlar ile çıkarılmıştır. Şekil 12A ve 13A, B Tüm MAP2 görüntüleri aynı görüntüleme koşulları altında elde edilmiştir, ve yoğunluğu karşılaştırılmasına olanak aynı görüntü kontrastı gösterilmektedir. Aynı prosedürler Şekiller 12A ve 13A, B GFAP görüntüler için kullanılmıştır. Glial besleyici tabaka kültürü, Şekil 12'de kültürler aynı gün görüntülendi. Bu nedenle, glial besleyici tabakalar 13 aynı süre için in vitro kültüre edildi Rakamlar> g. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 14,
Immünositokimyasal boyama 14. Yoğunluğu Şekil. Çizgiler Şekil 12 ve 13'te gösterilen görüntülerde çizildi ve bu boyunca yoğunluğu çizildi. Insets Şekil 12A üst satırda görüntüleri gösterir. Üç koşulları: primer antikorlar (Nöron +, glia + 1 ° Ab +) ile bir sıçan besleyici tabakası ve boyama fare hücreleri (nöronlar içeren) 1) kaplama, 2) glial besleyici tabaka yalnızca (nöronal kaplama) ve primer antikorlar (Nöron - glia + 1 ° antikor +) ile boyama ve 3), glial besleme(-, + glia, 1 ° Ab - Nöron) er yalnızca (nöronal kaplama) ve boyama primer antikorlar olmadan katman. Fare hücreleri (koşullar 1 vs 2) kaplama, boyama ve glial (GFAP) kültürler (koşullar 1 vs 2) iki set mevcut idi sadece Nöronal boyama (MAP2) mevcuttu. immünositokimyasal boyama hem birincil antikor (1 şartlar vs 3) özgü idi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ÇÖZÜMLER
TAE tamponu (50x çözelti)
Tris baz, 486 gr
Buzlu asetik asit, 114.2 mi
0.5 M EDTA, pH 8.0, 200 mi
2 L toplam hacmi getirmek için damıtılmış su ekleyin
Bir kimyasal davlumbaz Makyaj.
Kullanımdan önce 50 kat seyreltilir.
Hanks 'çözüm
Hanks Dengeli Tuzları, kalsiyum klorür, magnezyum sülfat ve sodyum bikarbonat içermeyen (1 L)
NaHCO 3, 350 mg (nihai konsantrasyon 4.17 mM)
HEPES, 2.38 g (nihai konsantrasyon, 10 mm)
5 M NaOH ile pH 7.4'e ayarlayın.
(Ozmolarite herhangi bir ayarlama yapmadan ~ 290 mOsm eğilimi) sakaroz kullanılarak 310 mOsm ozmolariteyi ayarlayın.
1 L toplam hacmi getirmek için damıtılmış su ekleyin
(Beyin dokusu tripsin tedavisi için) Sindirim solüsyonu
NaCI, 800,6 mg (nihai konsantrasyon, 137 mM)
KCI, 37.3 ml (fnominal konsantrasyonu 5 mM)
Na 2 HPO 4 · (7H 2 O), 187.6 mg (nihai konsantrasyon, 7 mM)
HEPES, 595,8 mg (nihai konsantrasyon 25 mM)
Glikoz, 97.3 mg (nihai konsantrasyon, 5.4 mM)
5 M NaOH ile pH 7.2'ye ayarlayın.
Ozmolarite herhangi bir ayarlama yapmadan ~ 310 mOsm eğilimindedir.
100 ml toplam hacmi getirmek için damıtılmış su ilave edilir.
Sağ kullanmadan önce, tripsin, 20 mg DNase ve 20 ul (10 mg / ml nihai konsantrasyon), sindirim çözeltisi 2 ml (750 birim / ml nihai konsantrasyon) ilave edin.
(Beyin dokusu mekanik ayrışması için) ayrışma çözeltisi
Hanks 'çözüm
MgSO 4 · (7H 2 O), 295,1 mg (son konsantrasyon derecesindenüzerine, 11.97 mM)
Sukroz ile 310 mOsm ozmolarite ayarlayın.
Toplam hacim 100 ml olmuştur.
Sağ kullanmadan önce, DNase ayrılma çözeltisi 2 ml (750 birim / ml nihai konsantrasyon) 20 ul ekle.
(Fare glia hücreleri) orta 1 Kaplama
Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), 449,5 mi
MITO + Serum Extender, 0.5 ml
FBS, 50 mi
Toplam hacmi 500 ml'dir.
Aranın kaplanması-2 (fare nöronlar için)
Neurobasal-A 485 mi
B27, 10 mi
GlutaMAX-l, 5 mi (nihai konsantrasyon 2 mM)
Toplam hacmi 500 ml'dir.
Aranın kaplanması-3 (sıçan nöron ve glial hücreleri için)
(Fenol kırmızısı olmadan MEM) Minimum Esansiyel Ortam
Glukoz, 2,5 g (nihai konsantrasyon, 27.8 mM)
NaHCO 3, 100 mg (nihai konsantrasyon, 2.38 mM)
Transferin, 50 mg
FBS, 50 mi
GlutaMAX-l, 5 mi (nihai konsantrasyon 2 mM)
İnsülin, 12.5 mg
Toplam hacmi 500 ml'dir.
Büyüme ortamı (sıçan nöron ve glial hücreleri için)
(Fenol kırmızısı olmadan) MEM
Glukoz, 2,5 g (nihai konsantrasyon, 27.8 mM)
NaHCO 3, 100 mg (nihai konsantrasyon, 2.38 mM)
Transferin, 50 mg
FBS,25 mi
GlutaMAX-l, 1.25 mi (son konsantrasyon, 0.5 mM)
B27 veya NS21 {Chen, 2008 # 2399}, 10 mi
Sitozin β-D-arabinofuranosid (Ara C), 0.56 mg (nihai konsantrasyon, 4 uM)
Toplam hacmi 500 ml'dir.
Genel yorumlar
Bunlar kültürlenmiş glial hücreler ve nöronlar (referans 70, 71) üzerinde sitotoksik etkiler gösterebilir çünkü kültür ortamı antibiyotik içermez. Bu özellikle önemlidir kültürü ile ilgili çalışmaları prosedürleri, steril uymak için yapar.
Kimyasalların detaylı kaynaklarının Reaktifler Tablo bakınız.

Tablo 1. Çözüm

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada sunulan protokol kuyruk ipuçları fareler genotiplemeye, / etiket fareler tanımlamak için dövme prosedürlerini içerir ve düşük yoğunlukta kültür fare beyin nöronları için. 6-8 yavrular kullanıldığı deneylerde bir turunda, bu işlemler genellikle 6-7 saat toplam sırasıyla ~ 0.5 saat, ~ 4 saat ve ~ 2 saat, gerektirir. (Glial besleyici katmanlar önceden hazırlık hariç) tek bir çalışma günden kısa bir sürede - Bu nöronal kültürlerin kaplama için pups 'doğum sırasında gerekli tüm prosedürleri tamamlamak için bir tek deneyci için pratik yapar.

Dövme

Histoloji, hücre fonksiyonu ve hayvan davranışlarının analizi gibi hayvanların uzun süreli kimlik yetiştiriciliği ve bilimsel çalışmaların amaçları için gereklidir. Hızla yürütülen ve hayvanın yaşam 7,22-25 çok sürer, çünkü yeni doğan hayvanların dövme avantajlıdır. Tpençe yastıkları üzerinde attooing, süspansiyon, örneğin, test edilebilir davranışları koruyarak ya da 22,26 kavrama göre 23 kırpma ayak daha iyi olabilir bazı çalışmalar bu tür eksiklikler kaydetti değil rağmen (örneğin, 25). Ya da reddetme dövme sonra yavrular cannibalizing annelerin hiçbir örneği yoktu. Hayvanların uzun süreli kimlik diğer yöntemler için son değerlendirmeleri 7,23,24 bakın.

Genotipleme

Bizim protokolde bir kritik özelliği hızlı genotipleme yönteminin kullanılmasıdır. Benzer genotipleme yöntemleri önceki raporlarda (örneğin, 27,28) 'de tarif edilmiş olmasına rağmen, burada açıklanan sistem en az iki gelişmeler var. Birincisi, bu başlangıç ​​dokusu, hayvanların yaşına ve amplikon uzunluğu miktarı belli varyasyonları tolere edebilir. Bundan dolayı, başarılı genotipleme 1 gün kadar küçük ve 6 aylık olarak farelere, kullanılarak elde edilebilir ve kullanılarak gerçekleştirilebilirprimer çiftleri geniş yelpazesi. İkinci olarak, bu yöntem, DNA öz çıkarma aşaması için bir durdurma çözeltisi gerektirmez. Bu aşırı tüp işleme ve pipetlenmesini ortadan kaldırır ve bir PCR makinesi ile sürecin paralel çoklu tüp otomasyonu sağlar. örneklerin sayısı kadar ölçeklendirilebilir (örneğin, 96 numune) henüz kolay ve eş zamanlı olarak işlenir. Ayrıca numune tipi kuyruk klipleri sınırlı değildir; kullanılabilecek diğer örnek türleri kulak yumruklar, ayak kupürleri, tüm erken embriyo, plasenta ve dokuları 2-4,29,30 içerir. Farklı hayvan türleri de kullanılabilir. Böylece genotipleme prosedürleri güvenilir (düşük intra-tahlil varyans ile tekrarlanabilir) ve (koşular arasında ya da laboratuvarlar arasında inter-analiz varyans düşük) tekrarlanabilir, yüksek ölçeklenebilirlik avantajı var.

Bazı dikkatli sonuçlarının beklenen kalitesini elde etmek için gerekli olduğunu unutmayın. Birincisi, DNA ekstraksiyon sırasında, protokol büyük bir değişim sonuçlarını bozabilir.Örneğin, DNA ekstraksiyonu çözeltisi hacminde belirgin bir azalma (örneğin, aşama 2.2'de 200 100 ul ile ilgili), yine genotipleme sağlar, ancak güvenirliğini azaltabilir ve PCR sonuçları varyasyon neden olabilir. Bu koşullar altında, bu 4 2 ul DNA özü hacmini azaltmak ve PCR reaksiyonları (adım 2.5) sırasında hacim değişikliği telafi etmek için 2 ila 4 ul gelen H2O hacmini artırmak için tavsiye edilir. Kuyruk genel yapısını korur ve tamamen dekompoze olmaz, ancak ikinci DNA çekip çıkarma işleminin sonunda, çözelti hemen bir çok durumda, santrifüj olmadan PCR için kullanılabilir. Fakat tüplerin bu tarif edilen ters doku (adım 2.4), genomik DNA ayrıştırma amacıyla gereklidir. Anlaşılacağı gibi, ikinci dahil sonuçsuz PCR sonuçlara sebep olur, çünkü tüpün altındaki enkaz Üst, çözeltinin berrak parçası kullanılması da önemlidir. Bunlaradımlar az zaman ve çaba ile etkili olacaktır. Aynı şekilde iyi sonuçlar aktif (inversiyon yerine) örnek vorteks ile elde edilebilir santrifugasyonu ve kullanımı takip etmektedir. Üçüncü olarak, bir DNA ekstraksiyon işleminden sonra, DNA, uzun süreli (örneğin,> iki hafta) muhafaza edilebilir. Bu mikrosantrifüj (örneğin, 2 dakika süreyle 4 ° C'de 3,000-13,000 g) yeni tüplere süpernatantlar aktarabilir ve -80 ° C'de saklayın kullanılarak çözelti santrifüj önerilir. Saklı ekstre genotipleme için kullanılacak olduğunda, kısa bir süre için, çözüldükten sonra numune santrifüj ve süpernatant kullanın.

Nöronal kültürler

Protokolde bir diğer önemli özelliği, düşük plaka yoğunluğunda nöron hücreleri oluşturmak için bir glial besleyici tabaka kullanılmasıdır. Tipik haliyle, memeli beyin nöronlarının birincil kültürlerinde, hücreler, bir glia olmaksızın kaplanmış lamelleri, nispeten yüksek bir yoğunluk ile kaplanırl besleyici tabakası (örneğin, 31-39). Nöronların kaplama yoğunluğu, bu yöntem kullanılarak azaltıldığı zaman, daha önce rapor edildiği gibi 40-42, gliyal tabakanın ilk olmaması muhtemelen zayıf glial için, kötü nöronal büyüme ve dendritik uzantı (Şekil 8-10 levhalar, B, C) ​​yol açar Büyüme 43,44.

Başarılı, düşük yoğunluklu nöronal kültürler yöntemden en az üç ana türleri tarafından üretilebilir. Bir yaklaşımda, Neuro temelli vasat bir kültür ortamı olarak kullanılır. Bu glial besleyici bir tabaka yokluğunda kültür nöronları için mümkün kılar, ve düşük yoğunluklu nöronal kültürler 45,46 için kullanılabilir. Ikinci bir yöntem ('Banker tipi' ve modifikasyonu) ise, gliyal hücreler, aynı kuyu nöronların birlikte kültürlenir ama fiziksel olarak ayrılır. Bu bağlamda glial hücreler doğrudan temas etmeden nöronlara 'trofik destek' sağlamak1,41,42,47-49. Üçüncü bir yaklaşımda, nöronlar nöronal büyüme (örneğin, 50-53) (Şekil 8-10) destekleyen bir önceden belirlenmiş glial besleyici tabaka ile kaplanmıştır. Spesifik olarak, fare beyin nöronları fareler 8,34,54 veya sıçanlar 41,55,56 hazırlanabilir glial besleyici bir tabaka ile kaplanmıştır.

Biz Neurobasal Orta nöronal hayatta 57 etkileyebilir çünkü, astrositik glial hücreler nöronal fonksiyonlar 8,58 düzenlenmesinde esas olacak, düşük yoğunluklu kültürüne üç yaklaşımın son tercih, ve nöronlar ve glial hücreler arasındaki fiziksel temas olabilir Önemli. Fare ve sıçan glial hücrelerin kültürlenmesi için prosedürler 59,60 benzer, ama fare glial hücreler genel fare daha hızlı in vitro büyüme karşılamak için hafifçe olarak var. sıçan hücre kültürü için prosedürler 61-63 modifiye edildi. Bir glial besleyici laye kullanımıDüşük yoğunluklu nöronal kültürler için r, 1 (gerektiğinde, hızlı genotipleme yerine pups 'doğum ve yeni doğan ölümleri ya da kültür penceresinin sonunda arasındaki dönemde nöronların edilene besleyici tabakanın genotip eşleşmesi için kolaylaştırır -2 doğum sonrası gün).

Bir beyin (örn, norepinefrin-salan odağı coeruleus ve dopamin-salgılatıcı substantia nigra) küçük çekirdeklerin kültür nöronlar çalıştığında glial besleyici bir tabaka Düşük yoğunluklu kültürü de önemli bir yöntemdir. Bu çekirdekler nöron yalnızca az sayıda içeren ve kaçınılmaz olarak, düşük yoğunluklu kültürleri 64-67 verim olacaktır.

Birincil kültüründe, hipokampus, serebral korteks, motor bölgesi ve farelerin striatum CA3-CA1 bölgesinden laboratuvarımızda hazırlandı. Aynı prosedürler, örneğin bütün hipokamp (dahil için, diğer beyin bölgeleri temsil eden nöron hücreleri hazırlamak için kullanılabilirdentat girus) ve bütün serebral korteks uding. Hipokampus ve locus coeruleus gibi beyin bölgelerinde sıçan nöron sıçan glial besleyici tabaka ile, benzer bir şekilde kültürlenmiştir. Bu kültürlenmiş nöronlar genellikle deney amacına bağlı olarak kültür tam yaş, in vitro 1-4 hafta kullanılır. Bu glial besleyici bir tabaka üzerinde kültüre bazı nöronlar fazla 10 hafta 34,68 hayatta olabilir not olduğunu.

Düşük yoğunluklu nöronal kültürler potansiyel bir sorun, nöronal özellikleri, yüksek yoğunluklu kültürlerinde veya yerinde nöronlarda daha farklı olabilmesidir. Bu sistemlerin karşılaştırılması gibi nöronal yoğunluk, nöronlardan salgılanan çözünür faktörler, nöron-to-nöron teması, ve glial-nöronal etkileşimleri gibi birçok faktörün, nasıl etkilendiği nöronal gelişim ve olgunlaşma incelemek için ilginç bir fırsat sağlar.

Özet olarak, tattooing-tabanlı fare etiketleme uzun ömürlü, Genotipleme yöntemi hızlı ve kültür yöntemi, düşük yoğunlukta fare nöronları kaplama sağlar. Burada açıklanan protokol diğer genetik mutasyonlar barındıran diğer hayvan türlerinin kendi bütünlüğü içinde uygulanabilir. Ayrıca, protokol tek tek adımları, başka amaçlar için de kullanılabilir. Böylece protokol deneyci 'ihtiyaçlarına dayalı uygulamalar geniş bir yelpazede kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS - tattooing
Machine Cleanser Animal Identification and Marking Systems, Inc. NMCR3 This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent Animal Identification and Marking Systems, Inc. NDAR4 This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment Animal Identification and Marking Systems, Inc. NBP01
Skin Prep Applicator Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSPA1 Q-tip.
Skin Prep solution Animal Identification and Marking Systems, Inc. NSP01 This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format) EZ BioResearch LLC G2001-100
2X PCR Ready Mix II EZ BioResearch LLC G2001-100 A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B EZ BioResearch LLC G2001-100 Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial VWR BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade rpi A20090-500  We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA) Fisher BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl Dot Scientific Inc UG104-96RS  Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl Dot Scientific Inc UG2020-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl Dot Scientific Inc UG2812-RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp EZ BioResearch LLC L1001 We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp EZ BioResearch LLC L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder GIBCO-Invitrogen 10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml  USA Scientific 1402-2900 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual  rpi 145660 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural USA Scientific 1605-0000 Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO GIBCO-Invitrogen S33102
Tris base rpi T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503-100MG See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement GIBCO-Invitrogen 17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated BD falcon 353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml BD falcon 353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml BD falcon 353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml BD falcon 352095
Countess (cell number counter) chamber slides GIBCO-Invitrogen C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride) Sigma-Aldrich C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC) Sigma-Aldrich G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm Pyrex 3160-101
Distilled water GIBCO-Invitrogen 15230-147
DNase Type II Sigma-Aldrich D4527-200KU Stock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate GIBCO-Invitrogen 10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size Nalgene 569-0020
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO-Invitrogen 26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0 Carolina 633017
GlutaMAX-I GIBCO-Invitrogen 35050-061
Hanks' Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma-Aldrich H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent Sigma-Aldrich 258148-100 ML
Insulin Sigma-Aldrich I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka) Sigma-Aldrich 63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free BD Biosciences 356237 This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM) GIBCO-Invitrogen 51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml BD Biosciences 355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate BD falcon 353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate BD falcon 353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid GIBCO-Invitrogen 10888-022
Nitric Acid VWR bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21  prepared in the lab Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”  Fisher 13-678-6A Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”  Fisher 13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0% Sigma-Aldrich P9333-500G
Serological pipet, 2 ml BD falcon 357507
Serological pipet, 5 ml  BD falcon 357543
Serological pipet, 10 ml BD falcon 357551
Serological pipet, 25 ml BD falcon 357525
Serological pipet, 50 ml  BD falcon 357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5% Sigma-Aldrich S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis Sigma-Aldrich 480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich Sigma-Aldrich 431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC) Sigma-Aldrich S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm Corning 431219
Syringe, 3 ml BD falcon 309585
Transferrin, Holo, bovine plasma Calbiochem 616420
Trypan Blue stain, 0.4% GIBCO-Invitrogen T10282 This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI Sigma-Aldrich T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%  GIBCO-Invitrogen 25200-056
Uridine Sigma-Aldrich U3003-5G Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2 Merck Millipore AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail Merck Millipore NE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMS Animal Identification and Marking Systems, Inc. NEO–9 This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GT BIO–RAD 170–4405 Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800 ProteinSimple FluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal Cycler BIO-RAD PTC-1148EDU Our PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac Basic BIO-RAD 164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, Countess GIBCO-Invitrogen C10310 This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2 NUAIRE NU-425-400 This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water Jacket NUAIRE NU-4850
Horizontal Clean Bench NUAIRE NU-201-330 This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed Shaker Labnet S2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifuge Fisher 46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793 (2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034 (2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245 (2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. , e626 (2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. , e3844 (2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87 (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895 (2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. , e2373 (2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. , e2389 (2011).
  36. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. , e3634 (2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. , e3965 (2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012 (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. , e3257 (2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. , e2111 (2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633 (2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M. Ch. 18. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).

Tags

Nörobilim Sayı 95 AP2 Genotipleme glial besleyici tabaka fare kuyruğu nöronal kültür nükleik asit ekstraksiyon PCR dövme Torsina
Hayvanlar Rapid Genotipleme Beyin Nöronlar İlköğretim Kültürler kurulması izledi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., … More

Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons. J. Vis. Exp. (95), e51879, doi:10.3791/51879 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter