Summary
Wij rapporteren een inrichting en een nieuwe werkwijze om cellen en embryo bestuderen. Enkele cellen worden nauwkeurig gerangschikt in microcavity arrays. Hun 3D opsluiting is een stap in de richting 3D-omgevingen aangetroffen in fysiologische omstandigheden en maakt het organel oriëntatie. Door het regelen van celvorm, deze opstelling minimaliseert variatie gerapporteerd in standaardtesten.
Abstract
Biologische cellen worden gewoonlijk waargenomen op vlakke (2D) oppervlakken. Deze voorwaarde is niet fysiologische en fenotypes en vormen zijn zeer variabel. Screening op basis van cellen in dergelijke omgevingen hebben dus ernstige beperkingen: celorganellen tonen extreme fenotypes cel morfologie en grootte zijn heterogeen en / of specifieke celorganellen niet goed zichtbaar is. Bovendien, cellen in vivo in een 3D-omgeving; in deze situatie cellen vertonen verschillende fenotypen vooral door hun interactie met de omringende extracellulaire matrix van het weefsel. Om standaardiseren en genereren orde van enkele cellen in een fysiologisch relevante 3D omgeving voor cel-gebaseerde testen, beschrijven we hier de microfabricage en toepassingen van een inrichting voor in vitro 3D celkweek. Deze inrichting bestaat uit een 2D reeks microcavities (gewoonlijk 10 5 holten / cm 2), elk gevuld met losse cellen of embryo's. cel positie, vorm, polariteit en de interne organisatie van de cel worden dan genormaliseerd met een 3D-architectuur. We gebruikten replica molding patroon een reeks van microcaviteiten, 'eierdopjes', op een dunne polydimethylsiloxaan (PDMS) laag gehecht op een dekglaasje. Holtes waren bedekt met fibronectine hechting vergemakkelijken. Cellen werden ingebracht door centrifugeren. Vervullingspercentage werd geoptimaliseerd voor elk systeem waardoor tot 80%. Cellen en embryo levensvatbaarheid werd bevestigd. Wij pasten deze methode voor de visualisatie van cellulaire organellen zoals kern en Golgi apparaat en actieve processen, zoals de sluiting van de ring tijdens cytokinetic celmitose bestuderen. Dit apparaat kon de identificatie van nieuwe functies, zoals periodieke ophopingen en inhomogeniteiten van myosine en actine tijdens de cytokinetic ring sluiting en verdicht fenotypes voor Golgi en de kern uitlijning. Wij karakteriseerden de werkwijze voor zoogdiercellen, splijtgist, gist, C. elegans wide specifieke aanpassing in elk geval. Tenslotte, de kenmerken van dit apparaat worden bijzonder interessant voor screeningstesten voor geneesmiddelen en gepersonaliseerde geneeskunde.
Introduction
Huidige in vitro op cellen gebaseerde assays zijn tweedimensionale (2D). Deze configuratie is niet natuurlijk voor zoogdiercellen en dus niet fysiologisch relevant 1; cellen vertonen een diversiteit aan vormen, maten en heterogene fenotypes. Zij presenteren op ernstige beperkingen bij toepassing op screening toepassingen, zoals een wanordelijke verdeling binnen het vliegtuig en extreme fenotypes van cellulaire organellen (stress vezels, in het bijzonder). Dit is vooral belangrijk bij klinische proeven voor het testen van geneesmiddelen, waarbij hoge budgetten jaarlijks worden uitgegeven. De meeste van deze geneesmiddelen echter niet wanneer toegepast op diermodellen vanwege de kunstmatige 2D kweekomstandigheid in een vroege drug discovery. Bovendien gegevens geven specifieke celorganellen kan niet goed zichtbaar, zoals cytokinetic actomyosine ring tijdens celmitose en algemeen structuren die evolueren in het vlak loodrecht op het vlak van waarneming. sommigenieuwe 2D assays zijn om te overwinnen de bovengenoemde nadelen en belangrijke inzichten cytoskelet organisatie waargenomen 2,3 voorgesteld. Echter, deze testen nog onderhavige serieuze beperking: cellen vertonen een fenotype spreiding in tegenstelling tot wat wordt waargenomen in vivo, waarbij cellen vormen een 3D architectuur. Deze artefacten in verband met de kweekmethode kan niet-fysiologische functies te sturen, zoals verhoogde stress-vezels 1,4,5.
Driedimensionale celcultuur assays om talrijke voordelen ten opzichte van 2D omgevingen 6,7. Ze zijn fysiologisch relevanter en resultaten zijn daarom zinvol. Als voorbeeld, cellen ingebed in hydrogels tonen 3D-structuren maar hun morfologie verschillen van de ene cel naar de andere 8,9. Echter, hun morfologie verschillen van de ene cel naar de andere, waarbij het screenen bemoeilijkt. Een alternatieve strategie is om insluiten enkelcellen in microfabricated holten 10,11. Cell positie, vorm, polariteit en de interne organisatie cel kan vervolgens genormaliseerd worden. Naast het verstrekken van 3D-achtige architectuur aan cellen, microcaviteiten maakt het ook mogelijk voor high-gehalte screening studies 10,12-14; enkele cellen kunnen worden besteld in microarrays en cellulaire organellen en hun evoluties kunnen parallel worden waargenomen. Deze regelmaat biedt goede statistieken met een gering aantal cellen en betere temporele / ruimtelijke resoluties. Bruikbare verbindingen zijn gemakkelijker betrouwbaar te identificeren.
In deze studie tonen we de fabricage en toepassing van een nieuwe 3D-achtige enkele cellen kweeksysteem voor high-content-screening toepassingen 10,12,13. De inrichting bestaat uit een matrix van elastomeer microcavities (10 holten 5 / cm 2), bedacht 'eierdopjes (EC). Afmetingen en de totale omvang van de EC in dit werk zijn geoptimaliseerd om de typische volume van één NIH3T3 en HeLa-cellentijdens de celdeling. Morfologie van de holten - cilindrische - is geselecteerd goed oriënteren celvorm voor de visualisatie van actieve processen. Replica gieten wordt gebruikt voor het patroon van een array van de EG op een dunne polydimethylsiloxaan (PDMS) laag gehecht op een glazen dekglaasje 15,16. De cellen worden in de EG geïntroduceerd door centrifugeren. Wij rapporteren hier observatie en normalisatie van cellulaire organellen (actine stressvezels, Golgi-apparaat en nucleus) in 3D (EG) in vergelijking met dezelfde cellen 2D (vlakke) oppervlakken. Wij rapporteren ook de waarneming van actieve dynamische processen zoals de sluiting van de ring tijdens cytokinetic actomyosine celmitose 17. Tot slot laten we resultaten van deze methodologie op andere systemen met vaste wanden, zoals gist, splijtgist en C. elegans embryo's die de toepasbaarheid van onze methodologie bevestigt aan een breed scala van modelsystemen.
We naast een gedetailleerd en uitputtend pROTOCOL om te fabriceren en de 'eierdopjes "3D microfabricatie toepassing. Onze benadering is eenvoudig en vereist geen schone ruimte nodig. We verwachten dat deze nieuwe methode met name interessant voor drug screeningstesten en gepersonaliseerde geneeskunde zal zijn, ter vervanging van petrischaaltjes. Tenslotte zal ons apparaat bruikbaar voor het bestuderen van de verdelingen van cellen reacties op externe stimuli, bijvoorbeeld kanker 18 en fundamenteel onderzoek 19 zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Microfabricage van 'Eggcups'
- Fabricage van de Master: microcaviteiten Array
- Verhit een 3 '' silicium wafer tot 200 ° C om eventuele aanwezigheid van vocht verdampen.
- Spin-coat een dunne laag van SU-8. Stel het volume hars en spinsnelheid afhankelijk van de gewenste dikte en het type fotoresist. Deze dikte zal de diepte van de "eierdopjes (EG) bepalen. Voor een 30 micrometer dikke laag en SU-8 2025 spin-laag bij 2.800 toeren per minuut.
- Pre-bak de wafer bij 65 ° C gedurende 1 min (stap 1 van 2) om een 30 urn dikke SU-8 2025 laag. Pas de tijd afhankelijk van het fotoresist en de gewenste dikte. Controleer de fabrikant datasheet voor meer informatie.
- Pre-bak de wafer bij 95 ° C gedurende 3 minuten (stap 2 van 2) om een 30 urn dikke SU-8 2025 laag. Pas de tijd afhankelijk van het fotoresist en de gewenste dikte. Controleer de fabrikant datasheet voor meer informatie.
- Laad dewafer op het masker aligner UV blootstelling. Plaats het fotolithografisch masker op. Het masker toont een patroon van cirkelvormige elementen (schijven) van 20 pm in diameter. Zorgen voor een perfect contact met elkaar.
OPMERKING: Verschillende fabrikanten bieden fotolithografie maskers. De ruimtelijke resolutie zal de uiteindelijke kosten te bepalen. Acetaat maskers bieden aanvaardbare resolutie (≈10 pm) tegen lage kosten. Chromium maskers betere resolutie, maar zijn duurder. Pas de diameters van de schijven (van de fotolithografie masker) om het volume van cellen. Afmetingen van schijven op het masker zal de diameter van holten in het apparaat. Kleine diameters leidt tot een laag vulling; te grote diameter niet beperken de cellen. Voor HeLa en NIH3T3 cellen, zijn diameters van 20 urn tot 25 urn voorgesteld. - Controleer de kracht van de UV-lamp voorafgaande expositie en dus optimaliseren van de belichtingstijd. Bestralen (golflengte = 365 nm) gedurende 41,5 sec (of het optimale belichtingstijd) en250 mJ / cm2.
OPMERKING: SU-8 2025 is een negatieve fotoresist, waardoor belichte gebieden aan UV wordt uitgehard. In dit geval, de cirkelvormige kenmerken waren zwart en de rest transparant. Positieve fotolak werk in de tegenovergestelde manier: niet-belichte gebieden worden genezen. Selecteer de fotoresist derhalve afhankelijk van het ontwerp en het fotomasker.
OPMERKING: Bescherm de ogen tegen UV-licht met de juiste veiligheidsbril. - Verwijder voorzichtig het masker van de fotoresistlaag.
- Post-bak de wafer bij 65 ° C gedurende 1 min (stap 1 van 2) om een 30 urn dikke SU-8 2025 laag. Post-bak de wafer bij 95 ° C gedurende 3 minuten (stap 2 van 2) om een 30 urn dikke SU-8 2025 laag. Pas de tijd afhankelijk van het fotoresist en de gewenste dikte. Controleer de fabrikant datasheet voor meer informatie. Na post-bakken, koelen van de wafer op kamertemperatuur op de bank voor ongeveer 1 min.
- Plaats de wafer in de spin-coater en drop paar mm van de SU-8 developer te dekkende hele wafer gebied. Ontwikkelen gedurende 2 minuten en vervolgens spin-laag bij 1000 tpm gedurende 30 sec. Herhaal deze procedure drie maal.
- Spoelen met 2-propanol om de volledige verwijdering van onontwikkelde SU-8 waarborgen. Verschijning van de witte gebieden is een indicatie van onvolledige ontwikkeling. Als dat zo is, herhaalt u de ontwikkeling van een stap extra tijd.
- Hard-bak de wafer bij 200 ° C om robuustheid van de vervaardigde microstructuren waarborgen. Deze stap is optioneel.
- Bewaar de 3 '' wafer met microstructuren in een 94 mm x 15 mm polystyreen petrischaal.
NB: Er is geen noodzaak voor oppervlaktebehandeling, in het bijzonder silaneren, voor de volgende stappen.
- Fabricage van de Polydimethylsiloxane (PDMS) Replica: Pijlers Array
- Meng in een 01:10 verhouding (w / w) de verknoper en de prepolymeer voor een totaal van 30 g in een 50 ml buis.
LET OP: Het gebruik van een (v / v) 01:10 verhouding werkt ook. - Centrifugeer de buis bij 1800 xg gedurende 5 minVerwijder luchtbellen.
- Drop voorzichtig de PDMS op de top van de microstructuren.
NB: Als er luchtbellen verschijnen tijdens deze stap, ontgas het monster met behulp van een vacuümpomp voor 15-20 min. - Het monster wordt in een oven bij 65 ° C gedurende 4 uur.
OPMERKING: De uithardingstijd varieert tussen gebruikers en, samen met de vernetter: prepolymeer verhouding. Deze keer zal de stijfheid van het PDMS te dicteren. Het wordt aanbevolen om meer dan 2 uur harden en te houden aan een vaste uithardingstijd. - Gebruik een scalpel om voorzichtig te snijden het gebied van belang (stempel) van ongeveer 1 cm 2, die ongeveer 10 5 microcaviteiten of 'eierdopjes' omvat.
OPMERKING: Knip eerst het PDMS en dan, afschilferen voorzichtig. De kwaliteit van de replica PDMS met een optische microscoop.
- Meng in een 01:10 verhouding (w / w) de verknoper en de prepolymeer voor een totaal van 30 g in een 50 ml buis.
- Fabricage van 'eierdopjes' van replica gieten. Hierna worden twee alternatieve strategieën voor de vervaardiging van "eierdopjes 'beschreven. Beide protocollen SimiLAR en geven identieke resultaten:
- strategie 1
- Activeer de gefabriceerde PDMS stempel door zuurstof plasma behandeling voor 30 sec. Tijdelijk op te slaan de geactiveerde stempels in een gesloten petrischaaltje om afzetting van stof te voorkomen.
OPMERKING: Stel de expositie tijd als andere gassen voor het plasma worden gebruikt. - Plaats de geactiveerde PDMS stempel ondersteboven op (de zijde met de structuur) in een petrischaal naast een 15 ml tube cap. Vul de dop met 200 ul van trimethylchloorsilaan (TMCS). Sluit de petrischaal en laat de stempel silaniseren gedurende 7 min.
OPMERKING: Sommige tijdelijke vervorming op de postzegel en / of verandering in kleur (wit) kan worden waargenomen. Het stempel zal zijn oorspronkelijke vorm in korte tijd herstellen en de structuren zal niet worden aangetast.
LET OP: TMCS produceert acute inademing en dermale toxiciteit en is licht ontvlambaar (met ontsteking flashback kunnen zich voordoen over grote afstanden). Daarom moet deze worden gebruikt in een zuurkast verwijderd van brons van de ontsteking. - Plaats de PDMS stempel op de spin-coater met de structuren kop omhoog. Doe een druppeltje paar microliter (ongeveer 20 pl) van vloeibare PDMS (1:10 w / w verknopingsmiddel: prepolymeer) bovenop de structuren. Spin-laag bij 1500 rpm gedurende 30 seconden om een dunne laag van PDMS bovenop de structuren deponeren.
NB: Als de stempel past niet in de spin-coater boorkop plaats de stempel op de top van een petrischaal deksel met een klein gat in het midden. - Plaats de stempel in de oven bij 65 ° C gedurende 4 uur om de gedeponeerde roterend bedekken PDMS laag harden.
- Activeer de dunne PDMS laag door het plaatsen van de PDMS stempel ondersteboven op, samen met een glazen dekglaasje # 0 van 25 mm diameter, gebruik van zuurstof plasma reiniger voor 30 sec. Gaat snel naar de volgende stap.
OPMERKING: Coverslips met andere dikten, vormen en afmetingen kunnen eveneens worden gebruikt. Echter kunnen sommige cellulaire structuren moeilijk te visualiseren afhankelijk van de geselecteerde dekglaasje dikte en objectievevergroting en / of NA en / of werken op afstand. Controleer de objectieve data sheet. - In contact te brengen de stempel (de kant met de dunne-spin-bekledingslaag) met de glazen dekglaasje. Druk zachtjes rondom het oppervlak van de stempel met een pincet aan de 'bonding' maken. Tenslotte, houdt een constante druk op de top van de stempel ongeveer 10 sec.
- Na 30 min zachtjes 'schil' van de stempel van het dekglaasje om te 'bevrijden' 'eierdopjes' (zie figuur 1). Spoel grondig met ethanol en droog. Als PDMS 'eierdopjes' niet goed nageleefd op het glas dekglaasje (dwz ze los tijdens de 'unpeeling' stap), overweeg dan het aanpassen van de instellingen van de plasma schoner en start bij stap 1.3.1.5.
OPMERKING: Deze stap is delicaat. Let teneinde breuk van het dekglaasje en / of loslaten van de dunne laag PDMS voorkomen. - Lijm een klein stukje (handvat) van de uitgeharde PDMS van 1 mm x 1mm x 3 mm in volume aan de rand van het dekglaasje met een kleine druppel vloeistof PDMS en genezen van de PDMS als voorheen. Dit zal de manipulatie van het monster daarna vergemakkelijken (zie figuur 1). Deze stap is optioneel.
- Activeer de gefabriceerde PDMS stempel door zuurstof plasma behandeling voor 30 sec. Tijdelijk op te slaan de geactiveerde stempels in een gesloten petrischaaltje om afzetting van stof te voorkomen.
- strategie 2
- Hydrofiliseren de gefabriceerde PDMS stempels door zuurstof plasmabehandeling gedurende 30 sec. Tijdelijk op te slaan de geactiveerde stempels in een gesloten petrischaaltje tot afzetting van stof te voorkomen.
OPMERKING: Stel de expositie tijd als andere gassen voor het plasma worden gebruikt. - Hydrofiliseren de 25 mm diameter glazen dekglaasjes # 0 zuurstofplasma behandeling bij 15 W gedurende 30 seconden. Gaat snel naar de volgende stap.
OPMERKING: Coverslips met andere dikten, vormen en afmetingen kunnen eveneens worden gebruikt. Echter celstructuren moeilijk te visualiseren afhankelijk van de geselecteerde dekglaasje dikte en objectieve kenmerken (zie opmerking boven). - Spin-coat een druppeltje PDMS (1:10 w / w verknopingsmiddel: pre-polYmer) van de weinige microliter op het glas dekglaasjes. Spin-laag bij 1500 rpm gedurende 30 seconden voor een uiteindelijke dikte van ongeveer 50 urn.
- Lijm een klein stukje (greep) van uitgeharde PDMS van 1 mm x 1 mm x 3 mm in volume aan de rand van het dekglaasje met een kleine druppel vloeistof PDMS en genezen van de PDMS als voorheen. Dit zal de manipulatie van het monster daarna vergemakkelijken (zie figuur 1). Deze stap is optioneel.
- Bewaar tijdelijk de-PDMS gecoate dekglaasjes op een schoon te vegen in een petrischaal te beschermen tegen stof depositie.
- Een druppel silaneren reagens bovenop elkaar stempel en laten verdampen gedurende 1-2 min. Vervolgens drogen onder een stroom N2.
Opmerking: In deze stap kan een tijdelijke vervorming van de stempel tijdens verdamping worden waargenomen. Het stempel zal zijn oorspronkelijke vorm te herstellen na het drogen met N2 zonder blijvende vervorming van microstructuren. - Drop heel voorzichtig de gesilaniseerde stempel op de top van dePDMS-spin-beklede glazen dekglaasje opgeslagen in de petrischaal. Zorg ervoor dat beide partijen volledig parallel zijn tijdens het contact. Vermijd drukken of het verplaatsen van de stempel na het plaatsen van het op de PDMS-gecoate dekglaasje.
- Plaats de petrischaal met monsters in vacuüm gedurende 1-2 uur om luchtbellen te verwijderen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de monsters zijn volledig horizontaal stempel verplaatsing te voorkomen. Vermijd ook trillingen mogelijk veroorzaakt door de vacuümpomp. - Plaats de monsters in een oven van 65 ° C gedurende 4 uur.
- Voorzichtig, haal het stempel 'eierdopjes' te onthullen. Spoel grondig met ethanol en droog.
OPMERKING: praktijk op dit moment nodig is. Besteed aandacht in het vermijden van breuk van de dekglaasje en / of loslaten van de dunne PDMS laag.
- Hydrofiliseren de gefabriceerde PDMS stempels door zuurstof plasmabehandeling gedurende 30 sec. Tijdelijk op te slaan de geactiveerde stempels in een gesloten petrischaaltje tot afzetting van stof te voorkomen.
- strategie 1
2. De invoering van cellen in de 'Eggcups'
Om zoogdiercellen binnen 'eggcups', PDMS oppervlak ne introducereneds worden gefunctionaliseerd met adhesie-eiwitten van de extracellulaire matrix. In dit voorbeeld wordt fibronectine maar andere eiwitten van belang, zoals collageen, kunnen worden gebruikt.
- Hydrofiliseren de 'eierdopjes in het zuurstofplasma reiniger voor 30 sec.
OPMERKING: Optimaliseer de parameters indien nodig. - Bereid een oplossing in PBS 1x van 20 ug ml -1 fibronectine van Bovine bronnen.
- Steriliseer de 'eierdopjes' met UV gedurende 5 minuten. Stort een kleine druppel (ongeveer 20-50 ui) van fibronectine oplossing voor de gehele 'eierdopjes' bedekken en incubeer gedurende 1 uur bij KT. Bescherm het monster uit te drogen.
- Spoel voorzichtig de 'eierdopjes' met PBS 1x. Herhaal dit 3 keer.
Opmerking: Het monster direct klaar voor gebruik of opgeslagen bij 4 ° C in het donker gedurende meerdere weken. - Introduceer een cilindrische custom-made plastic stuk van 63 mm in de hoogte, 26 mm van de externe radius en 7 mm van de inwendige afmetingen straal in een 50 ml buis (zieFiguur 2) 20
LET OP: Gebruik UV-gesteriliseerde items of steriliseren ze eerder gebruik.
NB: Dit stuk kan gemakkelijk worden vervaardigd in het lab. of met alle beschikbare machine winkel. - Doe 13 ml van celkweek medium binnen de buis (zie tabel 1). De drager dient minimaal 2 cm boven het cilindrische stuk vullen volledige onderdompeling van het monster te verzekeren.
LET OP: Voor meer informatie over specifieke celtypen, en andere model systemen zoals gist of C. elegans embryo's, en de bijbehorende gebruikte medium, te vinden in hoofdstuk 5 en tabel 1. De beschreven protocol werd geoptimaliseerd voor HeLa, NIH3T3-cellen, en andere cellijnen (zie tabel 1). - Introduceren zachtjes het "eierdopjes 'in de buis en evenwijdig aan de bovenzijde van het kunststof stuk. Gebruik scherpe pincet om het monster met behulp van de PDMS handvat vast te houden. Druk voorzichtig de dekglaasje totdat het ligt op de top van de bovenkant van het plastic onderdeel, until volledig wordt ondergedompeld (zie figuur 2).
LET OP: Het is aanbevolen om scherpe en rechte pincet gebruiken. Met gebogen pincet, de manipulatie van het monster is moeilijk deze kan breken. - Kweekcellen tot 80-100% samenvloeiing in een P60 petrischaal en verzamel ze door behandeling met trypsine.
OPMERKING: Cellen kunnen wild-type, getransfecteerd of behandeld met een geneesmiddel van belang zijn.
OPMERKING: Vermijd de vorming van cel aggregaten die enkele cellen zullen voorkomen dat de 'eierdopjes' te openen. Om deze stap, pipet op en neer grondig na behandeling met trypsine te optimaliseren. - Resuspendeer cellen in 5 ml kweekmedium. Pipetteer 200 ul van cellen bovenop de 'eierdopjes.
OPMERKING: Drop cellen zoveel mogelijk gecentreerd boven de 'eierdopjes' maar vermijden fysiek contact. Dit breuk en / of beschadiging van het monster te voorkomen. - Centrifugeer bij 1800 xg gedurende 2 minuten.
NB: Na de eerste centrifugeren, check-in een microfoonroscope het vullen percentage van de "eierdopjes. - Pipetteer weer 200 ul van cellen bovenop de 'eierdopjes en centrifugeer bij 1800 xg gedurende 2 minuten. Herhalen voor een totaal van drie keer teneinde de vervullingspercentage optimaliseren.
LET OP: Na de laatste centrifugeren, controleren met een microscoop het vullen percentage 'eierdopjes'. Indien nodig, herhaal de vulling + centrifugeren stappen tot het bereiken van de gewenste vulling percentage. - Verwijder het monster uit de buis met behulp van de scherpe pincet die de PDMS handvat. Zorg ervoor dat voorzichtig in geen 'storende' cellen die worden gehouden in de 'eierdopjes' te zijn (zie figuur 2).
- Plaats het monster in een petrischaal met medium. Spoel de overmaat cellen die niet in de 'eierdopjes' voorzichtig naast elke zijde (totaal 4 zijden) van de microstructuur matrix verwijderen en neer te pipetteren driemaal.
OPMERKING: Pipetting misschien te sterk vrijgevensommige cellen uit de 'eierdopjes'. - Vervang het medium met vers medium om nonattached cellen te verwijderen.
Opmerking: In deze stap een geneesmiddel plaats kunnen worden toegevoegd. - Fix cellen of hen voor te bereiden time-lapse imaging.See stap 4.1.
3. Observatie van Active Cellular Dynamics in 'Eggcups': Cytokinetic Ring Sluiting
LET OP: Dit voorbeeld gebruikt HeLa-cellen die zijn getransfecteerd met MYH10-GFP en Lifeact-mCherry voor myosine en actine, respectievelijk, de belangrijkste actieve moleculen die betrokken zijn bij de cytokinetic ring sluiting tijdens de cel mitose. Het apparaat wordt bereid met microcavities van 25 urn in diameter. Voor hun waarneming werd een epifluorescentie omgekeerde microscoop gebruikt, uitgerust met een 60X objectief olie (1,40 NA, DIC, Plan Apo) en GFP (myosine) en TxRed (actine) filters. Als alternatief kan een rechtopstaande confocale microscoop werd gebruikt, uitgerust met een 25x of 63x HCX IR APO objectief L water (0,95 NA). Hiervoor EXAmple, is het sterk aanbevolen om cellen te synchroniseren met behulp van de dubbele thymidine blok, mitotische blok of mitotische shake-off methode 21-24.
OPMERKING: De dikte van de PDMS gebruikt wordt voor het eierdopjes 'staat het gebruik van een verscheidenheid aan doelstellingen zowel gemarkeerd en opengevouwd microscopen.
- Place 'eierdopjes' in een microscoop houder en vul deze met 1 ml 10% FCS L-15 observatie medium. Om verdamping te voorkomen, plaatst u een glazen deksel op de top van de houder of breng een dun laagje van minerale olie op de top van de medium.Select de olie doelstelling 60X.
OPMERKING: L-15 medium is geschikt voor niet-CO 2 atmosferen. Merk ook op dat sommige verbindingen met DMEM zijn auto-fluorescentie. Bij gebruik van dit medium, is het raadzaam om de fluorescerende verbindingen photobleach door belichten met een lamp met hoge intensiteit gedurende 1-2 uur.
LET OP: Vermijd het gebruik van plastic deksels bij het werken met DIC imaging. - Plaats de houder met 'eierdopjes en goeder trouwvatie medium in de microscoop. Focus voorzichtig met helderveld licht tot het 'eierdopjes' en cellen in hetzelfde gebied van waarneming.
- Open de software en de parameters aan te passen. Selecteer de filters TxRed en GFP voor actine en myosine; Stel de belichtingstijd voor elk kanaal. Een typische overname bedraagt 5 sec voor beide kanalen.
NB: De expositie tijd mogelijk moeten worden aangepast, afhankelijk van de instelling gebruikte kleurstof of andere cellulaire organellen van belang. - Selecteer de regio van belang en zoeken naar een cytokinetic ring met behulp van de GFP of TxRed kanaal. Focus nauwkeurig.
NB: De ring is scherper in myosine en gemakkelijker te herkennen. - Voer de automatische acquisitie in beide kanalen, totdat de ring volledig gesloten is.
OPMERKING: Sommige fotobleken kan worden waargenomen. Pas de microscoop parameters om reduceren.
4. Observatie van Vaste celorganellen in de 'Eggcups'
Deze stap kan worden uitgevoerd voor of na stap 3. Cellen kunnen direct worden vastgesteld nadat het centrifugeren stap en gekleurd voor de organel van de rente of na de constatering in de microscoop. Dit voorbeeld toont de kleuring van het Golgi-apparaat, kern en actine vezels op NIH3T3 fibroblasten in 'eierdopjes.
- Fixatie van cellen in de 'Eggcups'
- Bereid 3% paraformaldehyde (PFA) en verwarm bij 37 ° C. Verwijder het monster 'eierdopjes' uit de 50 ml buis (of de microscoop houder) en plaats deze in een P35 petrischaal. Spoel eenmaal met PBS 1x.
OPMERKING: Protocollen voor de bereiding van 3% paraformaldehyde elders schaal beschikbaar.
LET OP: Gebruik van nitril en oogbescherming tijdens de voorbereiding van de PFA. - Volledig te verwijderen van de PBS en drop 1 ml van 3% PFA en incubeer gedurende 17 min. Verwijder de PFA en tweemaal spoelen met 1 ml PBS 1X. Doorlaatbaar cellen met behulp van 1 ml 0,5% Tritgedurende 3 min en was tweemaal met PBS 1 x gedurende 5 min.
- Bereid 3% paraformaldehyde (PFA) en verwarm bij 37 ° C. Verwijder het monster 'eierdopjes' uit de 50 ml buis (of de microscoop houder) en plaats deze in een P35 petrischaal. Spoel eenmaal met PBS 1x.
- Kleuring van cellen in 'Eggcups'
- Incubeer cellen voor Golgi kleuring met het primaire antilichaam polyklonaal konijn anti-Giantin in een 1: 500 verdunning in PBS. Plaats een 100 ul druppel antilichaamoplossing op een kunststoffolie plaat en incubeer de cellen in de "eierdopjes" ondersteboven 45 min.
OPMERKING: Bescherm het monster met een deksel om uitdroging te voorkomen. - Laat voorzichtig de 'Eggcups' en leg ze in een P35 petrischaal. Spoel 3 keer, 5 minuten elk met PBS 1x.
- Bereid een cocktail in PBS met het secundaire antilichaam Cy3 geit anti-konijn (1: 1000) en met Phalloidin Alexa Fluor 488 (1: 200) voor het kleuren actine stressvezels.
- Incubeer de cellen met 100 ul druppel antilichaamoplossing op een kunststoffolie plaat en incubeer cellen in het "eierdopjes" ondersteboven 45 min.
- Vrijgeven zorgvuldig de 'eggcups 'en plaats ze in een P35 petrischaal. Spoel 3 keer, 5 minuten elk met PBS 1x.
- Incubeer cellen gedurende kern kleuring plaatsen van een 100 ul druppel van 1 ug ml -1 DAPI in PBS op een kunststoffolie plaat en incubeer cellen in het "eierdopjes" ondersteboven 45 min. Deze stap kan worden uitgevoerd met stap 4.2.3.
- Laat voorzichtig de 'eierdopjes en plaats ze in een P35 petrischaal. Spoel 3 keer, 5 minuten elk met PBS 1x.
- Mount cellen met behulp van een 15 ul glycerol: PBS (1: / v 1 v) op een standaard microscoop glasplaatje en verzegelen van het monster met nagellak om uitdroging te voorkomen.
OPMERKING: Afhankelijk van de dikte 'eierdopjes', montage kan moeilijk zijn. Aanbevolen wordt opgeslagen dat het monster in een petrischaal P35 in PBS, beschermd tegen uitdrogen.
- Incubeer cellen voor Golgi kleuring met het primaire antilichaam polyklonaal konijn anti-Giantin in een 1: 500 verdunning in PBS. Plaats een 100 ul druppel antilichaamoplossing op een kunststoffolie plaat en incubeer de cellen in de "eierdopjes" ondersteboven 45 min.
- microscoop Observation
LET OP: Voor dit voorbeeld een rechtopstaande confocale microscoop wordt gebruikt, uitgerust met PMT en Hybrid detectoren. Een 25X of 63 X HCX IR APO objectief L water (0,95 NA) werd geselecteerd om een breed gebied van het monster en tonen de toepasbaarheid van de inrichting voor high content screening toepassingen.- Selecteer het doel 25X of 63x water.
LET OP: Verschillende doelen kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de toepassing en het signaal. Maar het gebruik van een hoge opening doelstellingen numerieke wordt aanbevolen. - Plaats het vaste monster met de 'eierdopjes en concentreren voorzichtig met helderveld licht (fasecontrast of DIC) tot het' eierdopjes en cellen in het vlak van de waarneming.
- Open de software en de parameters aan te passen. Selecteer de filters GFP, Cy3 en DAPI voor actine, Golgi en de kern observatie, respectievelijk; pas de expositie tijd voor alle kanalen.
NB: De expositie tijd mogelijk moeten worden aangepast, afhankelijk van de configuratie. - Selecteer en de focus van de regio van belang; start het vastleggen van beelden (zie figuur 3).
- Selecteer het doel 25X of 63x water.
- Kernsplijting en Budding gistcellen
LET OP: Dit voorbeeld gebruikt splijtingsproducten gistcellen die zijn gelabeld met RLC1-mCherry en CHD-GFP voor myosine en actine, respectievelijk. De ontluikende gistcellen worden niet fluorescent hier geëtiketteerd. Voor kernsplijting gist waarneming werd een omgekeerde draaiende schijf confocale microscoop gebruikt. Een 100X HCX PL APO CS olie doelstelling (1.4 NA) werd gebruikt voor alle overnames. Alternatief cellen werden ook waargenomen met behulp van een omgekeerde fase contrast microscoop uitgerust met een 20X objectief fasecontrast lucht LCPlanFl (0,4 NA). In dit voorbeeld is het protocol voor beide celtypen.- Bereid het oppervlak "eierdopjes zoals hierboven is aangegeven. Voor splijting en gist cellen, bereid holten van 5 urn in diameter (zie tabel 1). In dit geval is het oppervlak niet te worden gefunctionaliseerd met adhesie-eiwitten.
LET OP: De vulling can geoptimaliseerd worden door gebruik conische 'eierdopjes. Deze vorm vangt en houdt de cellen los te vermijden tijdens de spoelstap na centrifugeren. Vervullingspercentage optimaal ongeveer 80%. Deze conische 'eggcups' kan worden vervaardigd door middel van Deep Reactive Ion Etching 13. - Cultuur gistcellen in het juiste kweekmedium (zie tabel 1) tot aan een optische dichtheid (OD) in het bereik van 0,2 en 0,8. Ultrasone trillingen van de cultuur van gistcellen om aggregaten te verwijderen.
- Invoegen gistcellen in 'eggcups' door centrifugeren. Voor centrifugeren wordt 4 ml gekweekte cellen in de geschikte OD toegevoegd aan de buis met 'eierdopjes. Na de eerste centrifugatie, schud de buis resuspendeer cellen die niet in de 'eierdopjes', terwijl cellen in de "eierdopjes 'niet gestoord. Zonder het openen van de buis, centrifuge opnieuw en twee keer herhaalt u deze stap. Dit garandeert de afzettingcellen uit de kweek in het lege microcavities en de vervullingspercentage verhogen.
LET OP: Bij het werken met gist, is het raadzaam om voor te verwarmen de centrifuge aan de werkende temperatuur tijdens experimenten
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken en later voortgezet tot 12 uur. In dit geval, slaat het monster bij de werktemperatuur bedekken om verdamping te voorkomen. - Plaats 'eierdopjes' in een microscoop houder en vul de houder met filter gesteriliseerd medium voor beeldvorming. Nu Spoel de cellen met hetzelfde medium tot de drijvende gistcellen doeltreffende wijze opgeheven. Zorg ervoor dat u de cellen in 'eierdopjes' verstoren tijdens het spoelen proces.
- Selecteer de 100X olie objectief en nauwkeurig scherp te stellen. Open de software en de parameters aan te passen. Voor kernsplijting gist, selecteert u de filters GFP en TxRed voor actine en myosine en stel de expositie tijd voor beide kanalen. Een typische overname bedraagt 3 sec.
OPMERKING: Afhankelijk vande fluorofoor, type tagging en de set-up, belichtingstijd varieert voor andere systemen.
- Bereid het oppervlak "eierdopjes zoals hierboven is aangegeven. Voor splijting en gist cellen, bereid holten van 5 urn in diameter (zie tabel 1). In dit geval is het oppervlak niet te worden gefunctionaliseerd met adhesie-eiwitten.
- C. elegans Embryo
OPMERKING: Dit voorbeeld gebruikt C. elegans embryo 25-30 micrometer breed en 50-55 micrometer lang. Embryo's werden gekweekt zoals aangegeven in 25. Een eenvoudige visuele protocol over hoe om C. te manipuleren elegans is te vinden in 26. De observatie werd uitgevoerd met een omgekeerde fase contrast microscoop uitgerust met een 40X objectief air 0,55 NA.- Bereid het oppervlak "eierdopjes 'zoals hierboven beschreven en 25 micrometer in diameter (zie tabel 1). In dit geval is het oppervlak niet te worden gefunctionaliseerd met adhesie-eiwitten.
- Cultuur van de C. elegans embryo in de juiste kweekmedium (zie tabel 1).
- Plaats embryo's in 'eierdopjes' door centrifugeren, zoals hierboven beschreven (zie paragraaf 2,6-2,12) met behulp van ultrapuur water als kweekmedium.
OPMERKING: Embryo's werden 'gedraagt' normaliter ultrazuiver water voor de duur van het experiment. U kunt ook gebruik maken van een fysiologische M9 buffer voor de lange termijn experimenten. - Spoel het monster zoals hierboven beschreven (zie paragraaf 2.14). Plaats de 'eierdopjes' in een microscoop houder. Selecteer het doel 40X lucht en zorgvuldig richten. Open de software en de parameters aan te passen. Selecteer een overname van 3 sec.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De 'eierdopjes' (EC) zijn een nieuwe high content-screening methodiek die de visualisatie van georiënteerde cellen en embryo's mogelijk maakt in een 3D omgeving. Daarnaast is een aantal cellulaire processen, die moeilijk te observeren standaard 2D (plat) culturen waar te nemen van deze nieuwe werkwijze. Figuur 1a toont een samenvatting van de procedure voor de EC microfabricatie (zie paragraaf 1 in het hierboven beschreven protocol ). De methode is eenvoudig, snel, efficiënt en zonder vereiste van speciale apparatuur. Figuur 1b en 1c toont een vergroot scanning elektronenmicroscoop beeld van 'eierdopjes', respectievelijk grootschalige beeld en. Als het kan worden waargenomen, hun vorm en grootte zijn zeer regelmatig. Deze methode is zeer flexibel; verschillende vormen en afmetingen kunnen gemakkelijk worden vervaardigd en aangepast voor verschillende modelsystemen. De afmetingen van'eggcups' werden geselecteerd op de volgende wijze: Afmetingencellen dat deling ondergaat gemeten 2D vlakken: ze hebben een sferische vorm en de diameter werd als een goede indicatie voor de EC diameter. Cellen in'eggcups' langwerpige en oriënteren langs hun lange as tijdens de celdeling bijvoorbeeld. Deze maat is afhankelijk van het systeem - cellen en embryo - dus deze dimensie worden geëvalueerd deelneemt.
Figuur 2 toont het materiaal dat nodig is (figuur 2a) en een stap-voor-stap protocol (figuur 2b) over de "eierdopjes '(zie ook paragraaf 2 in het hierboven beschreven protocol). Het vullen van de EC met cellen van belang (of andere modelsystemen) is zeer eenvoudig en snel. Doorgaans duurt minder dan 20-30 min, die ook de tijd voor behandeling met trypsine cel. Na het vullen kunnen monsters worden gebruikt om actieve processen te bestuderen (live imaging) en eveneens gefixeerd en gekleurd voor het visualiseren van organellen van interest (zie ook paragraaf 3 en 4 op de bovenbeschreven protocol).
Op een vlakke ondergrond, cellen vertonen heterogene reacties en extreme fenotypes van cellulaire organellen. In feite is gesuggereerd dat actine stressvezels (en andere cellulaire organellen) zijn artefacten van de kweekomstandigheden 1. Om deze hypothese te bewijzen, we gekweekte NIH3T3 cellen zowel 3D 'eierdopjes en op een vlakke ondergrond en vergeleken de fenotypen van verschillende cellulaire organellen, namelijk actine stressvezels, Golgi apparaat en kernen. Figuur 3 toont een voorbeeld van hoe cellen zijn georganiseerd beide configuraties. In EG worden cellen verdeeld in een geordende matrix die een homogene bolvormige fenotype (Figuur 3a). Op een vlakke ondergrond, cellen vertonen de typische wanordelijke, spreiding en heterogene morfologie (figuur 3b). Ook zijn er grote verschillen in cytoskelet structuren. Vooral cellen op R16; eierdopjes 'vertonen een vermindering van het aantal stressvezels vergelijking met vlakke oppervlakken. Dit wordt verder bevestigd in de 3D gereconstrueerde beelden, waar geen duidelijke spanning vezels zijn zichtbaar (zie figuur 3c - d). Dit bevestigt dat sommige cellulaire structuren worden uitvergroot in 2D culturen. Dit is ook in overeenstemming met de waarnemingen uitgevoerd in vivo waar stress vezels niet kunnen worden geïdentificeerd.
Het Golgi-apparaat toont ook significante verschillen in fenotype afhankelijk van de kweekomstandigheid (zie figuur 4). Het Golgi-apparaat op 2D culturen toont typisch een uitgebreide fenotype 'omarmen' de kern periferie, terwijl in 'eierdopjes' toont een verdichte fenotype (zie figuur 4a - b). Om drugonderzoek manipulatie simuleren evalueerden we ook het effect van geneesmiddelen op cellen gekweekt op beide omgevingen. Wij selecteerden Blebbistatin mainly want het verstoort de actine stress-vezels en kan een effect hebben op Golgi morfologie (zie figuur 3c - d) te hebben. Aangezien de Golgi is naast de celkern, kan dit geneesmiddel ook een effect hebben op de architectuur. We eerst waargenomen dat cellen behandeld met dit geneesmiddel laat een minder regelmatige en uniforme morfologie in vergelijking met wildtype (WT) cellen (zie Figuur 3c - d). We vervolgens vergeleken en gekwantificeerd de Golgi fenotype waargenomen op 'eierdopjes en op een vlakke ondergrond (zie figuur 4c). We zagen dat op 2D oppervlakken cellen vertoonden meestal een uitgebreide fenotype, terwijl op cellen 'eierdopjes' toonde een meer verdicht fenotype. We hebben niet in acht hoewel een opvallend verschil tussen de WT en Blebbistatin-behandelde cellen.
Tenslotte 2D oppervlakken de celkern wordt willekeurig georiënteerde terwijl bij cellen EC is orthogonaal georiënteerd ten opzichte van het XY-vlak in beideWT en Blebbistatin behandelde cellen (zie figuur 5a - c). Hieruit blijkt de sterkte van de inrichting te oriënteren celorganellen, vergelijkbaar met een vroegere toepassing van de werkwijze voor het oriënteren van het vlak van de waarneming van de cytokinetic ring in gist en zoogdiercellen 10,12,13. We eindelijk onderzocht hoe de kern bolvormigheid (gedefinieerd als ψ = [π 1/3 6V n 2/3] / A n, waarbij Vn = het volume van de kern en An de oppervlakte) werd beïnvloed afhankelijk van het kweken voorwaarde en bij de behandeling van cellen met Blebbistatin. Figuur 5d toont de overeenkomende verdelingen van ψ. We hebben niet een verschil maken voor WT flat vs WT EG, waaruit blijkt dat de EC niet van invloed zijn op de normale bolvorm van de cellen te observeren. Echter, we zagen eenverschil bij het vergelijken van WT EG tot Blebb EG erop wijst dat de EC een werkelijke effect van het geneesmiddel dat wordt gemaskeerd in 2D zijn onthullend.
Levende cel studies met 'eggcups' stelt identificatie van nieuwe actieve processen die niet zichtbaar zijn in standaard culturen. We geplateerde cellen in EC en gevisualiseerd celdeling. Figuur 6 toont een reeks beelden van de cytokinetic ringsluiting tijdens celmitose. De 'eierdopjes' apparaat kan een volledige visualisatie van de ring, terwijl standaard 2D culturen toont slechts twee gebieden die correspondeert met één enkel vlak 10. Reconstructie van de ring van een sequentie van z-stack beelden met behulp 2D kweken kan 27, maar belangrijke informatie verloren. De kwaliteit is verminderd als gevolg van lage z-resolutie en dynamische processen niet kunnen worden opgelost. Actine en myosine zijn de belangrijkste eiwitten in de troepenmacht van de celdeling. Hun dynamiek kan niet be afgebeeld en studeerde in 2D cultuur (Figuur 6a), terwijl bij 'eierdopjes' wordt meteen onthuld. In HeLa-cellen zien we periodieke ophopingen van myosine 17: We hebben nieuwe structuren en processen geïdentificeerd. Deze opeenhopingen radiaal bewegen de ring sluiten (figuur 6b). In kernsplijting gist inhomogeniteiten in myosine en actine vinden we ook (figuur 6c, rechts) 17. In tegenstelling tot wat we zien in HeLa-cellen, draaien ze op de ring tijdens het sluiten. De snelheid in het bereik van min -1 urn en niet oplosbaar bij z reconstructie met standaard microscopen zijn. Tenslotte de cytokinetic ring kan verder bestudeerd worden door kleuring van de componenten. We zien dat er een accumulatie van fosfotyrosine in de nabijheid van de ring (figuur 6d). We kunnen ook zien dat anillin wordt colocalizing in de ring (Figuur 6e). Door kleuring van de cellen in deze oriëntatie, we blijkt dat anillin toont ook een niet-homogene verdeling.
De 'eierdopjes' werden ook toegepast op verschillende modelsystemen: we gemeld zoogdiercellen, kernsplijting gist, maar we ook getest gist en C. elegans (zie figuur 7a - e). In dit geval werd het protocol aangepast voor elk specifiek systeem in termen van de cultuur media, holtes grootte en morfologie (zie tabel 1). Als voorbeeld, kegelvormige V -vormige 'eierdopjes' waren de optimale morfologie voor het immobiliseren splijtgist doelmatig 12, in plaats van volledig cilindrische (of U-vormig) vorm voor zoogdiercellen 13. Dit maakte het testen van het effect van verschillende geneesmiddelen met cytoskelet mogelijke toepassingen bij Life Science onderzoek. Dit demonstreert de flexibiliteit en betrouwbaarheid van de ontwikkelde methodologie.
Bovendien de zeer geordende cellen kan eeneenvoudige, geautomatiseerde uitlezing van de fluorescentie van afzonderlijke cellen. We illustreren dit door het invoegen NIH3T3 cellen die GFP in 'eggcups' (figuur 8a). De cel positie kan gemakkelijk worden herkend en de bijbehorende expressie gemeten. Figuur 8b toont de verdeling van fluorescentie signalen. Dit kan worden toegepast op elke uitlezing (immunofluorescentie, fluorescerende reporters in cellen bijvoorbeeld).
Figuur 1: Fabricage van 'eierdopjes' (a) Schematische beschrijving van de fabricage procedure van 'eierdopjes' van replica gieten. (I) Giet vloeistof PDMS op de SU-8 schimmel en genezen. (Ii) Knip de stempel en verwijder deze voorzichtig van het oppervlak, dan plasmapuls activeren om het te silaniseren. (Iii) Giet vloeistof PDMS op de gesilaniseerd stempel eend Het centrifugeren tot een dunne PDMS laag te verkrijgen. (Iv) Na het uitharden van de PDMS laag, plasma activeert zowel de PDMS bedekte stempel en een glas dekglaasje. (V) Plasma te binden door het aanbrengen van een zachte, homogene druk beide. (Vi) Na het plasma binden, verwijder voorzichtig de stempel naar de oppervlakte 'eierdopjes' bloot te leggen. (Vii) Om de behandeling in de volgende stappen te vereenvoudigen, voeg een kleine PDMS handvat stuk. Binden PDMS stuk naar het dekglaasje door verlijming met vloeibare PDMS en (viii) het genezen dan in de oven. (B) Het beeld van een 25 mm dekglaasje met PDMS 'eierdopjes en een handvat. (C) Scanning elektronenmicroscoop beelden van PDMS 'eierdopjes'. De afstand tussen de centra van 'eierdopjes' is 30 pm, en hun diameter van ongeveer 25 pm. (Links) Bovenaanzicht. (Rechts) 'Eggcups' zijn om het beeld te snijden het binnenste gedeelte. Klik hier om vie wa grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: (a) de elementen die nodig zijn voor het EG-vulling. (1) 50 ml buis; (2) cilindervormig stuk (boven- en zijaanzicht); (3) celkweekmedium; (4) "eggcups; (5) scherpe pincet. (B) Schematische voorstelling van het vullen EC. (I) een cilindervormig stuk wordt eerst ingebracht in een 50 ml buis gevuld met 13 ml celkweekmedium. Next, (ii) de 'eierdopjes' worden voorzichtig afgezet op de top van de cilindrische stuk met behulp van scherpe pincet om de EC te manipuleren met behulp van de kleine PDMS stuk. (Iii) cellen bij de juiste dichtheid gepipetteerd bovenop de EC. (Iv) De cellen worden in het 'eierdopjes "door centrifugeren. (V) Tenslotte wordt het monster voorzichtig vrijgegeven uit de buis en is klaar voor gebruik. m / files / ftp_upload / 51880 / 51880fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van de cel fenotypes op 3D 'eierdopjes en 2D vlakke oppervlakken. Confocale microscopie (25X water doelstelling, 0,95 NA, Leica) beeld van NIH3T3 cellen op (a) EG vormen van een geordende array, en het tonen van een homogene sferische fenotype, en (b) standaard 2D platte cultuur, willekeurig verdeeld met heterogene fenotypes. De cellen werden gekleurd voor actine (in het groen), Golgi (oranje) en de kern (in het blauw). Schaal bar = 100 urn. (C) 3D-reconstructie van cellen op EC en (d) op een vlakke ondergrond voor WT en Blebbistatin-behandelde cellen. Schaalbalken = 20 urn.880 / 51880fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Studie van NIH3T3 Golgi apparaat fenotype Schematische en monster beeld van Golgi fenotype classificatie van cellen op (a) plat en (b) EG.. Cellen werden geclassificeerd als verdicht, uitgebreid of gefragmenteerd afhankelijk van de α-waarde. (C) Kwantificering van Golgi fenotypes. Schaal bars = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:
Figuur 6: Gedetailleerde studie van de cytokinetic ring in levende en gefixeerde monsters en in twee systemen met behulp van 'eierdopjes' (a) Tijd sequentie van de cytokinetic ring met behulp van standaard 2D in vitro cultuur.. Slechts twee blaren in actine (Lifeact-mCherry, rood) en myosine (GFP hebben, groen) zichtbaar in de groef splitsing van de HeLa cellen (Schaal bar = 10 pm). (B) Tijd volgorde van de sluiting voor de cytokinetic ring in HeLa-cellen tijdens mitose met behulp van 'eierdopjes'. De beelden tonen actine (in het rood) en myosine (groen). 'Eggcups' toestaan dat de identificatie van de nog steeds myosine ophopingen. Een voorbeeld is aangegeven met een pijl. (Schaal bar = 5 micrometer). (C) De cytokinetic ring kan worden gevisualiseerd in splijtgist. (Links) Cellen liggen op een vlak oppervlak, het cyto kinetische ring is alleen zichtbaar als twee puntjes (rechts) cellen in 'eierdopjes':. de volledige sluiting kan worden vastgelegd. Actine is gemerkt met CHD-GFP (Schaalbalken = 2 pm). In min: sec. (D - e) Voorbeelden van gebrandschilderd cytokinetic ringen. (D) Actin GFP tot expressie brengende HeLa cellen gekleurd voor fosfotyrosine (PY) waarin ook signaal in de ring (Schaal bar = 5 pm). (E) HeLa-cellen die GFP-tag myosine en Lifeact-mCherry (actine) worden gekleurd voor anillin. Anillin geopenbaard te lokaliseren in de cytokinetic ring en minder geconcentreerd in de cortex. Het toont co-localisatie met actine en myosine (Schaal bar = 5 pm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
80 / 51880fig7.jpg "/>
Figuur 7:. Toepassing van de 'eierdopjes om andere celtypen en modelsystemen (a) U2OS (humaan osteosarcoom). De inzet toont een delende cel. (Schaal bar = 20 pm). (B) NIH3T3 cellen die GFP. Verschil in expressie niveaus kan eenvoudig worden uitgelezen (Schaal bar = 20 pm). (C) SW480 cellen (Schaal bar = 20 pm). (D) Ontluikende gist; de cyclustijd ongewijzigd. (Schaal bar = 10 pm). (E) C. elegans wormen,. (links) op een vlak oppervlak (rechts) 'eggcups' wordt embryo vanuit een anders verborgen perspectief. (Schaalbalken = 10 urn). Tijd in min. Sec Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: De organisatie in een array van 'eggcups' kan een geautomatiseerde analyse van de celpopulatie (a) NIH3T3 cellen in EG (Schaal bar = 20 pm).. Ze hebben verschillende expressieniveaus van GFP. (B) automatische herkenning van de mobiele stand kan een individuele analyse van de expressie niveau. Het wordt samengevat in het histogram van het GFP-expressie van de cel bevolking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| model System | Type | Culture Medium | Observation Medium | 'eierdopjes' diameter (μ; M) | Opmerkingen / Omschrijving |
| zoogdiercellen | NIH3T3 | 10% BCS high-glucose DMEM | 10% BCS L-15 | 20 | Andere stabiele cellijnen, zoals REF52 of MDCK, alsmede primaire cellijnen, kankercellen en / of stamcellen kan ook de "eierdopjes" ingevoegd. |
| HeLa | 10% FCS hoog-glucose DMEM | 10% FCS L-15 | 25 | Verkrijgbaar bij vele verschillende bronnen. | |
| U2OS | 10% FCS hoog-glucose DMEM | 10% FCS L-15 | 20-25 | Verkrijgbaar bij vele verschillende bronnen. | |
| SW480 | 10% FCS hoog-glucose DMEM | 10% FCS L-15 | 17-20 | Verkrijgbaar bij vele verschillende bronnen. | |
| Gist | Fission Yeast | agar-agarplaat (YE5S) en vloeibare media (YE5S en EMM5S) | Filter gesteriliseerd EMM media (zie de lijst van materialen) | 5 | Het oppervlak hoeft niet te worden gefunctionaliseerd met hechtende proteïnen. |
| gist | Agar plaat (YPD) en vloeibare media (YEPD en SD) | SD-media | 5 | Het oppervlak hoeft niet te worden gefunctionaliseerd met hechtende proteïnen. | |
| Embryo | C. elegans | NGM plaat | ultrapuur water | 25 | Alternatief M9 medium kan worden gebruikt voor lange-termijn experimenten. Het recept van deze gezouten oplossing kan hier worden gevonden: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2009/5/pdb.rec11798.full?text_only=true |
Tabel 1: Culture omstandigheden in 'eierdopjes' voor verschillende modelsystemen. Bovenstaande gerelateerde protocol kan gemakkelijk worden aangepastdoor gewoon het vervangen van de beschreven kweekomstandigheden en omvangrijkere eierdopjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Replica vormstuk werd gebruikt om de 'eierdopjes' fabriceren. Het fabricageproces niet een schone kamer nodig; het is eenvoudig, hoewel enige oefening vereist zijn. Vooral vrijgeven van de PDMS stempel is de meest kritische stap om een groot gebied van hoge kwaliteit "eggcups 'produceren. Daarom speciale zorg moet worden genomen in deze stap. Als deze stap herhaaldelijk faalt, overweeg dan om het plasma schoner parameters voorafgaand aan de silanisatie en plasma binding te optimaliseren. Onvoldoende silaneren zal leiden tot een sterke kleven van de stempel op de PDMS film. Indien dit zich voordoet, kan de incubatietijd met silaneren reagens worden verhoogd. Merk op dat andere technieken en materialen kunnen worden toegepast op het "eierdopjes ', dat kan worden gefunctionaliseerd met een groot aantal liganden (fibronectine, gelatine, collageen, enz.) Te fabriceren. In het bijzonder kan microcavities in polystyreen gemakkelijk worden vervaardigd door custom-made hot-embossing techniek. Hierdoor biocompatibiliteit en directe vergelijking met de resultaten verkregen in standaard kweekplaten. Ook speciale zorg en werkwijze vereist om de vervullingspercentage optimaliseren. Met name de spoelstap is essentieel om een geschikte vulling zonder overmaat cellen te waarborgen, bijdraagt aan ruis en achtergrond in het signaal. Als cellen gemakkelijk uit holten, overwegen de grootte of diepte holten veranderen.
'Eggcups' bieden 3D-achtige architectuur aan cellen en high-gehalte screeningstesten met behulp van een eenvoudig protocol. Celorganellen en actieve processen onbekende behulp standaardkweek assays gemakkelijk worden gevisualiseerd door middel van het inbrengen van afzonderlijke cellen de individuele microcavities (eggcups). Afhankelijk van het modelsysteem, kan de grootte, vorm en de afmetingen eenvoudig worden aangepast. Op deze manier zoogdiercellen, kernsplijting gist, gist en C. elegans ceen te bestuderen en manipuleren, alsmede embryo zoals Drosophila, muizen of menselijke embryo's voor in vitro fertilisatie, of stamcellen bijvoorbeeld.
In deze opstelling enkele cellen worden vastgelegd. Dit in tegenstelling tot epitheliale weefsels aangetroffen in vivo. Echter, kan deze omgeving worden gereproduceerd in onze 'eierdopjes' door het bekleden van de zijwanden met cadherins tot cel-cel contacten met behulp van flexibelere elastomeren na te bootsen. Focale contacten worden bevorderd door de afzetting van fibronectine onderaan putjes. Deze respectieve verdelingen van adhesiemoleculen in staat moeten stellen het reproduceren van de cellulaire omgevingen aangetroffen in vivo. Door deze methode zou men de fysiologische omstandigheden te benaderen.
Medium-uitwisseling in onze test is gewaarborgd. Cellen in EG geen degradatie bij het uitvoeren van zowel de korte als de lange termijn experimenten te wijten aan een gebrek aan medium valutamarkten. Merk ook op dat de cellen in de EG-can worden gekweekt tot samenvloeiing hoewel de belangrijkste rente is wanneer individuele cellen of embryo's worden geïsoleerd binnen de holtes.
Oriëntatie van organellen of hele organismen is onthullend nieuwe informatie. We tonen verschillende dynamiek van actine en myosine in de cytokinetic ring. Hoewel de cytokinetic ring in kernsplijting gist en zoogdiercellen is samengesteld uit soortgelijke belangrijke onderdelen, laten we zien met deze opstelling, dat hun specifieke dynamiek is anders 17. Dit ondersteunt het resultaat, dat het sluitmechanisme in de twee systemen is ook anders. Het ontwikkelen en bestuderen die een hypothese, de oriëntatie van de cel onontbeerlijk. In toekomstige studies, kan deze inrichting ook worden gebruikt om andere gebeurtenissen met betrekking tot organisatie organel in cellen te onderzoeken.
Buiten dat, kan deze techniek van groot nut in ontwikkelingsbiologie zijn. Langwerpige embryo's kunnen gemakkelijk worden georiënteerd, waargenomen of verder behandeld in een gedefinieerde oriëntatie.Waarschijnlijk onze assay zou opleggen polariteit van embryo's, maar de hoge vervullingspercentage zou toelaten de gewenste uitlezing extract op betrouwbare wijze. Al met al 'eierdopjes' zou een goed apparaat voor high-inhoud screenings zijn.
Andere cultuur assays zijn voorgesteld. Deze methoden variëren van meerdere cellen in 2D afmetingen in multiwell platen, om enkele cellen gedeponeerd in micropatterned zelfklevende motieven met identieke vorm. Echter, geen van hen is aangepast aan de beperkingen hierboven beschreven op de waarneming van cellulaire organellen en dynamische processen 1 te overwinnen.
Toekomstige verbeteringen aan ons systeem zal de toepasbaarheid van 'eierdopjes' to-industrie georiënteerde doeleinden mogelijk te maken. Als voorbeeld, het screenen van geneesmiddelen toepassingen in de farmaceutische bedrijven vereisen het gebruik van platen met meerdere putjes 14,28; implementeren 'eierdopjes' in een dergelijke platforms zal mogelijk het verbeteren van de betrouwbaarheid van deproeven en resultaten. Als zodanig high content screening assays worden uitgevoerd met de gebruikelijke geautomatiseerde processen van farmaceutische bedrijven (en onderzoekslaboratoria wetenschappelijke) gebruik van robots. Dit zal zorgen voor herhaalbaarheid en betrouwbaarheid met lage variabiliteit. Sommige commerciële producten op basis van 3D-celcultuur assays zijn al verschenen in de markt waarin het belang van dit soort testen. Tenslotte, deze apparaten opent nieuwe perspectieven voor gepersonaliseerde geneeskunde: cellen van patiënt kon 'eggcups worden geplaatst en behandeling cocktails kunnen worden getest in een fysiologisch milieu; biomarker uitlezing zal een optimale behandeling te geven aan de patiënt 29 voorzien. Al met al de fysieke vorm van de cellen en embryo's worden het begeleiden van de architectuur van de holten, en we hopen dat het apparaat en deze methode op grote schaal zal worden verspreid in de toekomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij erkennen L. Brino (IGBMC High Content Screening faciliteit, Illkirch, Frankrijk) voor het verstrekken van ons met de anti-Giantin antilichaam, M. Labouesse Lab. voor C. elegans (IGBMC) en B. Séraphin Lab. voor gist (IGBMC), E. Paluch en A. Hyman voor TL HeLa-cellen (MPI-CBG, Dresden), J. Moseley (Dartmouth Medical School) en JQ Wu (Ohio State University) voor kernsplijting gistcellen; A. Hoël en F. EVENOU voor experimentele hulp, C. Rick (IBMC, Straatsburg, Frankrijk) voor technische hulp, en JC Jeannot (Femto-st, Frankrijk) voor hulp bij het microfabrication. Dit werk werd ondersteund door fondsen van het CNRS, de Universiteit van Straatsburg, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale en de ci-FRC van Straatsburg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ddH20 (ultrapure) | Millipore | - | Use always fresh water. |
| Parafilm (plastic film) | Bemis | PM-999 | Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness. |
| Photo-mask | Selba | - | http://www.selba.ch |
| Silicon wafer | Siltronix | - | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 photoresist | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| SU-8 developer | MicroChem | - | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA |
| Available from multiple companies. | |||
| Sigmacote (siliconizing reagent ) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR |
| harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Chlorotrimethylsilane (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition | |||
| Nitrile gloves | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Available from multiple companies. | |||
| Glass coverslips #0 | Knittel glass | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Very fragile. Manipulate gently. | |||
| Sharp straight tweezers | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Available from multiple companies. | |||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN |
| The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies. | |||
| Microscope glass slides | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Available from multiple companies. | |||
| DMEM high-glucose medium | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Bovine calf serum | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS 1x | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O | |||
| L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Medium for atmospheres without CO2 control | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Penicillin & Streptomycin | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM |
| Petri dish P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
| Petri dish P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Petri dish P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldehyde 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr®ion=FR |
| Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 |
| dissolve powder in 1.5 ml methanol | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 dilution in PBS 1x |
| rabbit polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 dilution in PBS 1x |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
| rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). | 1:500 dilution in PBS 1x | |
| Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 goat anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1,000 dilution in PBS 1x | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr®ion=FR |
| 1 mg/ml for 1 min | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| HeLa cells | - | - | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| NIH3T3 cells | ATCC | - | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| Fission yeast | - | - | For details on strains, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| C. elegans worms | - | - | For details, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| YES (Agar) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| YES (Media) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search |
| For preparation: follow the instructions as given on the box | |||
| EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence. |
| Supplements (for EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search |
| (Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering) | |||
| Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters | Millipore | - | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
References
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies. PLoS ONE. 7, e37548 (2012).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. , (2012).
- Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments. Lab Chip. 11, 805-812 (2010).
- Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies. Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).
- Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 12, 458-465 (2013).
- Legant, W. R., et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat Meth. 7, 969-971 (2010).
- Devices and methods for observing the cell division. Riveline, D., Buguin, A. , WO/2010/092116 (2010).
- Ochsner, M., et al. Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells. Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).
- Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . Riveline, D. , WO2013144302 (2012).
- Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. Riveline, D., Wollrab, V. , WO2013135809 (2012).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).
- Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. Methods in Molecular Biology. Hughes, M. P., Hoettges, K. F. 583, Humana Press. 81-107 (2010).
- Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).
- Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction. Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).
- Yao, X., et al. Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits. Integr Biol. 6, 388-398 (2014).
- Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. The promise of single-cell sequencing. Nat Meth. 11, 25-27 (2014).
- Allen, T. D., et al. Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM). Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).
- Robbins, E., Marcus, P. I. Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations. Science. 144, (1964).
- Whitfield, M. L., et al. Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3" end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).
- Straight, A. F., et al. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science. 299, 1743-1747 (2003).
- Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1). Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).
- Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development. Curr Biol. 20, 322-327 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. JoVE. , e4019 (2012).
- Saha, S., Pollard, T. D. Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast. Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).
- Prestwich, G. D. Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery. Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).
- Futamura, Y., et al. Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification. Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).
