Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

طلب خلايا واحدة والأجنة واحدة في 3D الحبس: جهاز جديد لفحص المحتوى العالي

Published: September 18, 2016 doi: 10.3791/51880
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Laboratory of Cell Physics, Institut de Science et d'Ingénierie Supramoléculaires (ISIS), CNRS and Université de Strasbourg, 2Development and Stem Cells Program, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC), CNRS and Université de Strasbourg

Summary

نحن الإبلاغ عن الجهاز وطريقة جديدة لدراسة الخلايا والأجنة. الخلايا وحيدة هي أمر بالضبط في صفائف microcavity. من الحبس 3D هو خطوة نحو بيئات 3D التي واجهتها في الظروف الفسيولوجية ويسمح التوجه عضية. من خلال التحكم في شكل الخلية، وهذا الإعداد يقلل من التغيرات المبلغ عنها في فحوصات القياسية.

Abstract

وعادة ما تكون لوحظ الخلايا البيولوجية في (2D) الأسطح المسطحة. هذا الشرط غير الفسيولوجية، والظواهر والأشكال تختلف اختلافا كبيرا. الفرز على أساس الخلايا في مثل هذه البيئات لديها قصور بالتالي خطيرة: عضيات الخلية تظهر الظواهر المتطرفة، الأشكال التضاريسية خلية والأحجام هي عضيات الخلية غير متجانسة و / أو محددة لا يمكن تصور بشكل صحيح. وبالإضافة إلى ذلك، توجد خلايا في الجسم الحي في بيئة 3D. في هذه الحالة، خلايا تظهر الظواهر المختلفة وذلك أساسا بسبب تفاعلها مع المحيط المصفوفة خارج الخلية من الأنسجة. من أجل توحيد وتوليد ترتيب الخلايا وحيدة في بيئة 3D من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة لفحوصات خلية القاعدة، ونحن التقرير هنا التصنيع الدقيق وتطبيقات جهاز لفي المختبر زراعة الخلايا 3D. ويتكون هذا الجهاز من مجموعة 2D من microcavities (عادة 10 5 تجاويف / سم 2)، مليئة الخلايا واحد أو الأجنة لكل منهما. POSI خليةنشوئها، والشكل، والاستقطاب وتنظيم الخلايا الداخلية أصبحت ثم تطبيع تظهر بنية 3D. كنا صب متماثلة إلى نمط مجموعة من microcavities، (PDMS) طبقة "eggcups"، على لثنائي ميثيل بولي سيلوكسان رقيقة الالتزام على ساترة. كانت مغطاة تجاويف مع فبرونيكتين لتسهيل التصاق. تم إدراج الخلايا بواسطة الطرد المركزي. تم تحسين نسبة الملء لكل نظام والسماح لتصل إلى 80٪. وأكد الخلايا والأجنة جدوى. طبقنا هذه المنهجية لتصور من العضيات الخلوية، مثل جهاز نواة وجولجي، ودراسة العمليات النشطة، مثل إغلاق حلقة cytokinetic خلال الانقسام الخلوي. يسمح هذا الجهاز تحديد من الميزات الجديدة، مثل التراكمات الدورية وعدم تجانس من الميوسين والأكتين خلال إغلاق حلقة cytokinetic والظواهر المتراصة لجولجي والمواءمة النواة. نحن ميزت طريقة لخلايا الثدييات، الانشطار الخميرة، في مهدها الخميرة، C. ايليجانس ثإيث التكيف المحددة في كل حالة. وأخيرا، وخصائص هذا الجهاز تجعل من اهتمام بوجه خاص لفحوصات فحص المخدرات والطب الشخصي.

Introduction

الحالي في المقايسات خلية مقرها المختبر هما ثنائي الأبعاد (2D). هذا التكوين غير الطبيعي لخلايا الثدييات، وبالتالي ليست ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية 1؛ تظهر خلايا مجموعة متنوعة من الأشكال والأحجام والظواهر غير المتجانسة. ما يقدمونه قيود خطيرة إضافية عند تطبيقها على الطلبات الفرز، مثل توزيع المختلين داخل الطائرة والظواهر المتطرفة من العضيات الخلوية (ألياف الإجهاد، وعلى وجه الخصوص). هذا مهم بشكل خاص في التجارب السريرية لاختبار المخدرات، حيث يتم إنفاق الميزانيات الكبيرة كل عام. معظم هذه الأدوية تفشل على الرغم من عند تطبيقها على النماذج الحيوانية بسبب حالة الثقافة 2D الاصطناعية في المراحل المبكرة من فحص المخدرات. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام هذا النهج، عضيات الخلية المحددة لا يمكن تصور صحيح، مثل حلقة أكتوميوزين cytokinetic خلال الانقسام الخلوي، وعموما الهياكل التي تتطور في الطائرة عموديا على مستوى المراقبة. بعضوقد اقترحت المقايسات 2D جديدة من أجل التغلب وقد لوحظ السلبيات المذكورة أعلاه ومعلومات هامة لتنظيم الهيكل الخلوي 2،3. ومع ذلك، هذه المقايسات لا تزال موجودة واحد قيدا خطيرا: تظهر خلايا النمط الظاهري انتشارها جدا على عكس ما لوحظ في الجسم الحي، حيث تظهر خلايا بنية 3D. هذه القطع الأثرية المرتبطة مع أسلوب الثقافة قد يؤدي الميزات غير الفسيولوجية مثل ألياف الإجهاد تعزيز 1،4،5.

توفر ثلاثي الأبعاد تجارب زراعة الخلية مزايا متعددة بالمقارنة مع 2D بيئات 6،7. فهي من الناحية الفسيولوجية أكثر أهمية، والنتائج هي بالتالي ذات مغزى. وكمثال على ذلك، فإن الخلايا جزءا لا يتجزأ من الهلاميات المائية تظهر هياكل تشبه 3D ولكن الأشكال التضاريسية التي تختلف من خلية واحدة إلى 8،9 آخر. ومع ذلك، الأشكال التضاريسية التي تختلف من خلية واحدة إلى أخرى، مما يعقد التطبيقات الفرز. استراتيجية بديلة هو تضمين واحدالخلايا في تجاويف microfabricated 10،11. موقف الخلية، والشكل، والاستقطاب وتنظيم الخلايا الداخلية يمكن أن تصبح ثم تطبيع. وإلى جانب توفير بنية تشبه 3D إلى الخلايا، microcavities كما يسمح للدراسات فحص عالية المحتوى 10،12-14. الخلايا وحيدة يمكن أن يؤمر في المجهرية والعضيات الخلوية والتطورات التي يمكن ملاحظتها بشكل متواز. يوفر هذا الانتظام إحصاءات جيدة مع انخفاض عدد الخلايا وقرارات الزمنية / المكانية أفضل. مركبات مفيدة هي أسهل لتحديد موثوق.

في هذه الدراسة، نقدم لك مجموعة من تلفيق وتطبيق نظام جديد ثقافة الخلايا وحيدة مثل 3D للتطبيقات عالية المحتوى الفرز 10،12،13. يتكون الجهاز من مجموعة من microcavities من اللدائن المرنة (10 5 تجاويف / سم 2)، صاغ "eggcups" (EC). هي الأمثل الأبعاد والحجم الكلي للالمفوضية الأوروبية في هذا العمل إلى حجم نموذجي للخلايا NIH3T3 وهيلا الفرديةأثناء انقسام الخلية. يتم تحديد لتوجيه صحيح شكل خلية لتصور من العمليات النشطة - التشكل من تسوس الأسنان - أسطواني. يستخدم صب متماثلة إلى نمط مجموعة من المفوضية الأوروبية في الصعود إلى ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان رقيقة (PDMS) طبقة الالتزام على الزجاج ساترة 15،16. يتم إدخال الخلايا في المفوضية الأوروبية عن طريق الطرد المركزي. نحن هنا التقرير المراقبة وتطبيع العضيات الخلوية (ألياف الأكتين الإجهاد، جهاز جولجي والنواة) في 3D (EC) مقارنة مع نفس الخلايا على 2D (شقة) السطوح. نحن أيضا الإبلاغ عن مراقبة العمليات الديناميكية النشطة مثل إغلاق حلقة أكتوميوزين cytokinetic خلال خلية الانقسام 17. وأخيرا، وتبين لنا نتائج هذه المنهجية على أنظمة أخرى مع الجدران الصلبة، مثل مهدها الخميرة، الخميرة الانشطار وC. الأجنة ايليجانس التي تؤكد انطباق منهجية لدينا مجموعة واسعة من أنظمة نموذجية.

نقدم المقبل لص مفصل وشاملrotocol من أجل افتعال وتطبيق "eggcups" لالتصنيع الدقيق 3D. نهجنا هو بسيط ولا يحتاج إلى غرفة نظيفة. ونحن نتوقع أن هذه المنهجية الجديدة ستكون مثيرة للاهتمام بشكل خاص لفحوصات فحص المخدرات والطب الشخصي، في استبدال أطباق بتري. وأخيرا، سوف يكون لدينا جهاز مفيد لدراسة توزيع استجابات الخلايا للمؤثرات الخارجية، على سبيل المثال في سرطان 18 أو في البحوث الأساسية 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التصنيع الدقيق من "Eggcups"

  1. تلفيق للماجستير: Microcavities صفيف
    1. حرارة رقاقة 3 '' السيليكون تصل إلى 200 درجة مئوية لتتبخر أي وجود الرطوبة.
    2. تدور معطف طبقة رقيقة من SU-8 مقاومة للضوء. ضبط مستوى الصوت من الراتنج والغزل السرعة حسب المطلوب سمك ومقاومة للضوء نوع. وهذا سمك تملي عمق "eggcups" (EC). لطبقة سميكة 30 ميكرون وSU-8 2025، تدور معطف في 2800 دورة في الدقيقة.
    3. قبل خبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (الخطوة 1 من 2) لسميكة SU-8 2025 طبقة 30 ميكرون. التكيف مع الوقت اعتمادا على نوع مقاوم الضوء وسمك المطلوب. تحقق ورقة البيانات المصنعة للحصول على مزيد من التفاصيل.
    4. قبل خبز الرقاقة عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (الخطوة 2 من 2) لسميكة SU-8 2025 طبقة 30 ميكرون. التكيف مع الوقت اعتمادا على نوع مقاوم الضوء وسمك المطلوب. تحقق ورقة البيانات المصنعة للحصول على مزيد من التفاصيل.
    5. تحميلرقاقة على اليجنر قناع للتعرض للأشعة فوق البنفسجية. وضع قناع ضوئيه على ذلك. يظهر قناع نمط من الميزات دائرية (أقراص) من 20 ميكرون في القطر. ضمان اتصال تام بين بعضها البعض.
      ملاحظة: مصنعي مختلفة توفر أقنعة ضوئيه. فإن القرار المكانية تحديد التكلفة النهائية. توفر أقنعة خلات حل مقبول (≈10 ميكرون) بتكلفة منخفضة. توفر أقنعة الكروم قرار أفضل ولكن هي أكثر تكلفة. تكييف بأقطار من الأقراص (من قناع ضوئيه) إلى حجم الخلايا. سوف أبعاد الأقراص على قناع تحديد قطرها من تجاويف في الجهاز. بأقطار صغيرة من شأنها أن تؤدي إلى تعبئة منخفضة؛ أيضا سوف كبيرة قطرها لا حصر الخلايا. لخلايا هيلا وNIH3T3، واقترح بأقطار من 20 ميكرون إلى 25 ميكرون.
    6. تحقق قوة المعرض السابق مصباح الأشعة فوق البنفسجية وتحسين زمن التعرض وفقا لذلك. أشرق (الطول الموجي = 365 نانومتر) 41.5 ثانية (أو الأمثل وقت التعرض) في250 ميغا جول / سم 2.
      ملاحظة: SU-8 2025 هو مقاومة للضوء سلبي، وهو ما يعني أن المناطق التي تعرضت للأشعة فوق البنفسجية ويمكن الشفاء منه. في هذه الحالة، كانت ملامح دائرية سوداء وبقية شفافة. عمل مقاوم الضوء الإيجابي في الطريق المعاكس: ويشفى مناطق غير مكشوفة. حدد مقاومة للضوء وفقا لذلك، اعتمادا على التصميم والصور وقناع.
      ملاحظة: حماية العينين من الأشعة فوق البنفسجية مع نظارات السلامة المناسبة.
    7. إزالة بلطف قناع من طبقة مقاومة للضوء.
    8. بعد خبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (الخطوة 1 من 2) لسميكة SU-8 2025 طبقة 30 ميكرون. بعد خبز الرقاقة عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (الخطوة 2 من 2) لسميكة SU-8 2025 طبقة 30 ميكرون. التكيف مع الوقت اعتمادا على نوع مقاوم الضوء وسمك المطلوب. تحقق ورقة البيانات المصنعة للحصول على مزيد من التفاصيل. بعد ما بعد الخبز، تبريد ويفر إلى درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء لحوالي 1 دقيقة.
    9. وضع رقاقة في زيادة ونقصان المغطي وإسقاط ملم قليلة من SU-8 المطور لتغطيةمنطقة رقاقة بأكملها. تطوير لمدة 2 دقيقة ثم تدور معطف في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. كرر الإجراء ثلاث مرات.
    10. شطف مع 2-بروبانول لضمان إزالة كاملة من غير المطورة SU-8. ظهور مناطق بيضاء هو مؤشر التنمية غير مكتملة. إذا كان الأمر كذلك، كرر الخطوة تطوير وقتا إضافيا.
    11. من الصعب خبز الرقاقة عند 200 درجة مئوية لضمان متانة المجهرية ملفقة. هذه الخطوة اختيارية.
    12. تخزين "رقاقة 3" مع المجهرية داخل 94 مم × 15 مم البوليسترين طبق بيتري.
      ملاحظة: ليست هناك حاجة لمعالجة السطوح، في silanization وجه الخصوص، للخطوات المقبلة.
  2. تلفيق من ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) طبق الاصل: أركان صفيف
    1. تخلط جيدا في نسبة 01:10 (ث / ث) وعبر رابط وقبل البوليمر ليصبح المجموع 30 غرام داخل أنبوب 50 مل.
      ملاحظة: استخدام نسبة 01:10 (ت / ت) ويعمل أيضا.
    2. أنبوب الطرد المركزي في 1800 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة فقاعات الهواء.
    3. إسقاط برفق PDMS على رأس المجهرية.
      ملاحظة: في حالة ظهور فقاعات الهواء خلال هذه الخطوة، ديغا العينة باستخدام مضخة فراغ لمدة 15-20 دقيقة.
    4. وضع العينة في الفرن على 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
      ملاحظة: وقت المعالجة يختلف بين المستخدمين، وجنبا إلى جنب مع عبر رابط: قبل البوليمر نسبة. هذه المرة سوف تملي جمود PDMS. ومن الموصى به لعلاج أكثر من 2 ساعة والتمسك فترة علاج الثابتة.
    5. استخدام مشرط لقطع بلطف مجال الاهتمام (ختم) من حوالي 1 سم 2 الذي يضم حوالي 10 5 microcavities أو "eggcups".
      ملاحظة: أول خطوة من نوعها في PDMS ثم قشر تشغيله بلطف. التحقق من جودة النسخة المتماثلة PDMS مع المجهر الضوئي.
  3. تلفيق "eggcups" صب متماثلة. في ما يلي، موصوفة اثنين من استراتيجيات بديلة لتصنيع "eggcups". كل من البروتوكولات هي سيميلار وتقديم نتائج متطابقة:
    1. استراتيجية 1
      1. تفعيل الطابع PDMS ملفقة من قبل الأكسجين العلاج البلازما لمدة 30 ثانية. تخزين مؤقت الطوابع تفعيلها في طبق بيتري مغلق لمنع تراكم الغبار.
        ملاحظة: ضبط الوقت المعرض في حالة استخدام الغازات الأخرى للبلازما.
      2. ضع PDMS تنشيط ختم رأسا على عقب حتى (الجانب مع الهياكل) في طبق بيتري بجانب غطاء أنبوب 15 مل. ملء الغطاء مع 200 ميكرولتر من Trimethylchlorosilane (TMCS). إغلاق طبق بتري والسماح للsilanize ختم لمدة 7 دقائق.
        ملاحظة: بعض التشوه مؤقت على الطابع و / أو تغيير في اللون (أبيض) يمكن ملاحظة. وختم استعادة شكلها الأصلي في وقت قصير، وسوف لن تتأثر الهياكل.
        ملاحظة: TMCS تنتج الحادة الاستنشاق والجلد سمية، وغير قابلة للاشتعال للغاية (مع فلاش باك اشتعال قادرا على تحدث عبر مسافات طويلة). ونتيجة لذلك، فإنه ينبغي أن تستخدم في خزانة الدخان بعيدا عن مصدرالصورة الاشتعال.
      3. وضع ختم PDMS على زيادة ونقصان المغطي مع الهياكل رأسا على عقب فوق. وضع قطرة صغيرة من بضعة ميكرولتر (حوالي 20 ميكرولتر) من PDMS السائل (01:10 ث / ث عبر رابط: قبل البوليمر) على رأس الهياكل. تدور معطف في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية لإيداع طبقة رقيقة من PDMS على أعلى من الهياكل.
        ملاحظة: في حالة عدم ختم تناسب تدور المغطي ظرف مكان الطابع على رأس طبق غطاء بيتري مع وجود ثقب صغير في وسطها.
      4. وضع ختم في الفرن عند 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات لعلاج طبقة PDMS المغلفة تدور المودعة.
      5. تفعيل طبقة PDMS رقيقة عن طريق وضع ختم PDMS رأسا على عقب فوق، جنبا إلى جنب مع كوب ساترة # 0 25 مم في القطر، وذلك باستخدام الأكسجين نظافة البلازما لمدة 30 ثانية. المضي قدما بسرعة إلى الخطوة التالية.
        ملاحظة: Coverslips مع سمك أخرى والأشكال والأبعاد يمكن استخدامها أيضا. ومع ذلك، يمكن لبعض الهياكل الخلوية يكون من الصعب تصور حسب سمك ساترة المختارة والهدفالتكبير و / أو NA و / أو العمل عن بعد. التحقق من ورقة بيانات موضوعية.
      6. ضع في اتصال الطابع (الجانب مع الطبقة المغلفة تدور رقيقة) مع ساترة الزجاج. اضغط بلطف في جميع أنحاء سطح الطابع مع ملاقط لجعل "الترابط". وأخيرا، والحفاظ على الضغط المستمر على رأس ختم لحوالي 10 ثانية.
      7. بعد 30 دقيقة بلطف "قشر" الطابع من ساترة من أجل "تحرير" "eggcups" (انظر الشكل 1). شطف جيدا مع الإيثانول والجافة. إذا لم يتم الالتزام PDMS "eggcups 'حسنا على ساترة الزجاج (أي أنها فصل خلال' 'unpeeling خطوة)، والنظر في تعديل إعدادات نظافة البلازما وإعادة تشغيل في خطوة 1.3.1.5.
        ملاحظة: هذه الخطوة حساسة. إيلاء الاهتمام لتفادي الكسر ساترة و / أو انفصال طبقة PDMS رقيقة.
      8. الغراء قطعة صغيرة (مقبض) من PDMS شفي من 1 مم × 1مم × 3 مم في حجم عند حافة ساترة مع قطرة صغيرة من PDMS السائلة وعلاج PDMS كما كان من قبل. وهذا سوف يسهل التلاعب العينة بعد ذلك (انظر الشكل 1). هذه الخطوة اختيارية.
    2. استراتيجية 2
      1. Hydrophilize في PDMS الطوابع ملفقة من قبل الأكسجين العلاج البلازما لمدة 30 ثانية. تخزين مؤقت الطوابع تفعيلها في طبق بيتري مغلق لمنع تراكم الغبار.
        ملاحظة: ضبط الوقت المعرض في حالة استخدام الغازات الأخرى للبلازما.
      2. Hydrophilize 25 ملم coverslips قطر زجاج # 0 الأكسجين العلاج البلازما في 15 واط لمدة 30 ثانية. المضي قدما بسرعة إلى الخطوة التالية.
        ملاحظة: Coverslips مع سمك أخرى والأشكال والأبعاد يمكن استخدامها أيضا. ومع ذلك، فإن الهياكل الخلوية يكون من الصعب تصور حسب سمك ساترة المختارة والخصائص الموضوعية (انظر الملاحظة أعلاه).
      3. تدور معطف قطرة صغيرة من PDMS (01:10 ث / ث عبر رابط: قبل بولymer) من عدد قليل ميكرولتر على coverslips الزجاج. تدور معطف في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية لسمك النهائي من حوالي 50 ميكرون.
      4. الغراء قطعة صغيرة (مقبض) من PDMS شفي من 1 مم × 1 مم × 3 مم في حجم عند حافة ساترة مع قطرة صغيرة من PDMS السائلة وعلاج PDMS كما كان من قبل. وهذا سوف يسهل التلاعب العينة بعد ذلك (انظر الشكل 1). هذه الخطوة اختيارية.
      5. تخزين مؤقت لل coverslips المغلفة PDMS-على مسح نظيفة داخل طبق بيتري للحماية من ترسب الغبار.
      6. وضعت قطرة من كاشف silanizing على رأس كل طابع والسماح لها تتبخر لمدة 1-2 دقيقة. ثم، وتجفيفها تحت تيار من N 2.
        ملاحظة: في هذه الخطوة، تشويه مؤقت من الطابع ويمكن ملاحظة خلال التبخر. وختم استعادة شكلها الأصلي بعد التجفيف مع N 2 دون أي تشوه دائم من المجهرية.
      7. إسقاط بلطف شديد الطابع silanized على رأسPDMS تدور المغلفة ساترة الزجاج المخزنة في طبق بيتري. تأكد من أن كلا الجانبين موازية تماما أثناء الاتصال. تجنب الضغط أو تحريك ختم بعد وضعها على ساترة PDMS المغلفة.
      8. وضع طبق بتري مع العينات في فراغ لمدة 1-2 ساعة لإزالة فقاعات الهواء.
        ملاحظة: تأكد من أن عينات أفقية تماما لتجنب النزوح الطوابع. تجنب أيضا الاهتزاز المحتمل الناجم عن مضخة فراغ.
      9. وضع العينات في الفرن عند 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
      10. بلطف، تقشر طابع للكشف عن "eggcups". شطف جيدا مع الإيثانول والجافة.
        وهناك حاجة الممارسة في هذه المرحلة: ملاحظة. إيلاء الاهتمام لتفادي الكسر ساترة و / أو انفصال طبقة PDMS رقيقة.

2. تقديم خلايا في "Eggcups"

من أجل إدخال خلايا الثدييات داخل "eggcups، PDMS شمال شرق السطحمحرران أن functionalized مع بروتينات التصاق المصفوفة خارج الخلية. يستخدم هذا المثال فبرونيكتين ولكن غيرها من البروتينات المثيرة للاهتمام، مثل الكولاجين، ويمكن استخدامها.

  1. Hydrophilize و"eggcups" في نظافة البلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية.
    ملاحظة: تحسين المعلمات إذا لزم الأمر.
  2. يعد حل في برنامج تلفزيوني 1X من 20 ميكروغرام مل -1 الفيبرونكتين من مصادر الأبقار.
  3. تعقيم "eggcups" مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 5 دقائق. إيداع قطرة صغيرة (حوالي 20-50 ميكرولتر) من محلول فبرونيكتين لتغطية كامل منطقة 'eggcups "واحتضان لمدة 1 ساعة على RT. حماية عينة من الجفاف.
  4. شطف بلطف "eggcups" مع برنامج تلفزيوني 1X. كرر 3 مرات.
    ملاحظة: عينة جاهزة للاستخدام فورا أو تخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام لعدة أسابيع.
  5. إدخال حسب الطلب قطعة من البلاستيك اسطوانية من 63 ملم في الطول، 26 مم نصف قطرها الخارجي و 7 ملم من أبعاد دائرة نصف قطرها الداخلية في أنبوب 50 مل (انظرالشكل 2) 20
    تنبيه: استخدام المواد الأشعة فوق البنفسجية تعقيم أو تعقيم لهم استخدام مسبق.
    ملاحظة: هذه القطعة يمكن أن تكون ملفقة بسهولة في المختبر. أو أي آلة متجر المتاحة.
  6. وضع 13 مل من مستنبت خلوي من داخل أنبوب (انظر الجدول 1). المتوسط ​​يجب ملء لا يقل عن 2 سم فوق قطعة اسطوانية لضمان الغمر الكامل للعينة.
    ملاحظة: للحصول على تفاصيل من أنواع معينة من الخلايا، ونظم نموذج أخرى مثل الخميرة أو C. ايليجانس الأجنة، والمتوسطة المقابلة المستخدمة، تشير إلى الباب 5 الجدول 1. تم تحسين البروتوكول وصفها لهيلا، وخلايا NIH3T3، وخطوط الخلايا الأخرى (انظر الجدول 1).
  7. إدخال بلطف جدا "eggcups 'داخل الأنبوب وبالتوازي مع الجانب العلوي من قطعة من البلاستيك. استخدام ملاقط حادة لعقد العينة باستخدام مقبض PDMS. اضغط بلطف ساترة حتى تقع على رأس الجانب العلوي من قطعة من البلاستيك، الامم المتحدةسمسم مغمورة بالكامل (انظر الشكل 2).
    ملاحظة: من المستحسن استخدام الملقط حادة ومستقيمة. مع ملاقط منحنية، والتلاعب في عينة من الصعب وربما تسبب الكسر.
  8. خلايا ثقافة حتى 80-100٪ التقاء في P60 طبق بتري وجمع لهم من قبل trypsinization.
    ملاحظة: خلايا يمكن أن يكون من النوع البري، transfected أو تعامل مع أي دواء من الفائدة.
    ملاحظة: تجنب تشكيل المجاميع الخلية التي ستساعد على تجنب الخلايا وحيدة لدخول "eggcups". لتحسين هذه الخطوة، ماصة صعودا وهبوطا جيدا بعد trypsinization.
  9. إعادة تعليق الخلايا في مستنبت 5 مل. ماصة 200 ميكرولتر من الخلايا على رأس 'eggcups ".
    ملاحظة: إسقاط الخلايا كما تركزت ممكن على رأس 'eggcups' ولكن تجنب الاتصال الجسدي. هذا سوف يمنع الكسر و / أو ضرر من العينة.
  10. أجهزة الطرد المركزي في 1800 x ج لمدة 2 دقيقة.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي الأول، وتحقق في هيئة التصنيع العسكريroscope نسبة ملء "eggcups".
  11. ماصة مرة أخرى 200 ميكرولتر من الخلايا على رأس 'eggcups "وأجهزة الطرد المركزي في 1800 x ج لمدة 2 دقيقة. تكرار لما مجموعه ثلاث مرات من أجل تحسين نسبة الملء.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي الماضي، تحقق مع المجهر نسبة ملء "eggcups". إذا لزم الأمر، كرر ملء + الطرد المركزي خطوات حتى وصلت نسبة ملء المرجوة.
  12. إزالة عينة من الأنبوب باستخدام الملقط حادة عقد مقبض PDMS. تأكد من أن نكون حذرين في عدم الخلايا المثيرة للقلق "التي تقام في 'eggcups" (انظر الشكل 2).
  13. وضع العينة في طبق بيتري مع متوسطة. شطف لإزالة الفائض من الخلايا التي ليست في 'eggcups من قبل pipetting صعودا وهبوطا ثلاث مرات بلطف بجانب كل جانب (مجموع 4 الجانبين) من مجموعة المجهرية.
    ملاحظة: pipetting لبشدة أيضا قد تفرجبعض الخلايا خارج من 'eggcups ".
  14. استبدال المتوسطة مع المتوسطة الطازجة لإزالة الخلايا nonattached.
    ملاحظة: في هذه الخطوة يمكن إضافة المخدرات من اهتمام.
  15. إصلاح الخلايا أو إعدادهم للوقت الفاصل بين imaging.See خطوة 4.1.

3. مراقبة من ديناميات الخلوية النشطة في "Eggcups ': Cytokinetic حلقة إغلاق

ملاحظة: يستخدم هذا المثال خلايا هيلا التي و transfected مع MYH10-GFP وLifeact-mcherry للميوسين والأكتين، على التوالي، والجزيئات النشطة الرئيسية المشاركة في إغلاق حلقة cytokinetic خلال الانقسام الخلوي. يتم إعداد الجهاز مع microcavities من 25 ميكرون في القطر. للمراقبة، وكان يستخدم مجهر مقلوب epifluorescence، مجهزة الهدف النفط 60X (1.40 NA، مدينة دبي للإنترنت، خطة آبو) وGFP (الميوسين) وTxRed (الأكتين) مرشحات. بدلا من ذلك تم استخدام المجهر مبائر تستقيم، مجهزة 25X أو 63X HCX الأشعة تحت الحمراء APO الهدف لتر ماء (0.95 NA). لهذا إكساءmple، فإنه ينصح بشدة لمزامنة الخلايا باستخدام كتلة الثيميدين مزدوج، كتلة الإنقسامية أو الإنقسامية للاهتزاز من طريقة 21-24.
ملاحظة: سمك PDMS تستخدم ل 'eggcups "تتيح استخدام مجموعة متنوعة من الأهداف في كل من المجاهر المقلوب وضعه في وضع مستقيم.

  1. المكان "eggcups" إلى حامل المجهر وملء مع 1 مل من 10٪ FCS L-15 متوسطة المراقبة. لتجنب التبخر، ووضع غطاء زجاجي على أعلى من حامل أو تطبيق طبقة رقيقة من الزيت المعدني على الجزء العلوي من medium.Select الهدف النفط 60X.
    ملاحظة: L-15 متوسطة كافية لعدم CO-2 الاجواء. لاحظ أيضا أن بعض المركبات من DMEM هي السيارات الفلورسنت. عند استخدام هذه الوسيلة، فمن المستحسن أن photobleach المركبات الفلورية التي كتبها إلقاء الضوء عليه مع مصباح كثافة عالية لمدة 1-2 ساعة.
    ملاحظة: تجنب استخدام الأغطية البلاستيكية عند العمل مع التصوير مدينة دبي للإنترنت.
  2. وضع حامل مع "eggcups" وobserمتوسطة vation في المجهر. التركيز بعناية باستخدام ضوء brightfield حتى "eggcups"، والخلايا في نفس الطائرة من المراقبة.
  3. فتح البرنامج وضبط المعلمات. اختيار المرشحات TxRed وGFP لالأكتين والميوسين. ضبط الوقت المعرض لكل قناة. معدل الاستحواذ النموذجي هو 5 ثانية لكل القنوات.
    ملاحظة: قد يكون الوقت المعرض إلى تعديل اعتمادا على الإعداد المستخدم، صبغ أو غيرها من العضيات الخلوية في المصالح.
  4. تحديد المنطقة ذات الاهتمام والسعي لخاتم cytokinetic باستخدام إما GFP أو قناة TxRed. التركيز بدقة.
    ملاحظة: الحلبة هي أكثر وضوحا في الميوسين وأسهل للاعتراف.
  5. تشغيل الاستحواذ التلقائي في كل القنوات حتى يتم إغلاق عصابة تماما.
    ملاحظة: يمكن ملاحظة بعض photobleaching من. ضبط المعلمات المجهر من أجل الحد من ذلك.

4. مراقبة من العضيات الخلوية الثابتة في "Eggcups"

هذه الخطوة لا يمكن أن يؤديها قبل أو بعد الخطوة رقم 3. الخلايا يمكن أن تكون ثابتة مباشرة بعد الخطوة الطرد المركزي وملطخة للعضية من الفائدة أو بعد المراقبة في المجهر. يوضح هذا المثال تلطيخ من جهاز جولجي، نواة والأكتين الألياف على الخلايا الليفية NIH3T3 في "eggcups".

  1. تثبيت خلايا في 'Eggcups "
    1. إعداد 3٪ امتصاص العرق (PFA) ودافئة عند 37 درجة مئوية. إزالة عينة "eggcups 'من أنبوب 50 مل (أو حامل المجهر) ووضعه داخل P35 طبق بيتري. شطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X.
      هي بروتوكولات لإعداد 3٪ امتصاص العرق المتاحة على نطاق واسع في مكان آخر: ملاحظة.
      تنبيه: استخدام قفازات النتريل وحماية العين أثناء إعداد منهاج العمل.
    2. إزالة برنامج تلفزيوني وإسقاط 1 مل من 3٪ PFA واحتضان لمدة 17 دقيقة. إزالة PFA وشطف مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X. خلايا Permeabilize باستخدام 1 مل من 0.5٪ يسحقلمدة 3 دقائق ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق.
  2. تلطيخ الخلايا في 'Eggcups "
    1. احتضان خلايا لجولجي جهاز تلطيخ مع الأجسام المضادة الأولية الأرنب بولكلونل مكافحة Giantin في التخفيف 1: 500 في برنامج تلفزيوني. وضع قطرة 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة على ورقة فيلم من البلاستيك واحتضان الخلايا داخل "eggcups" رأسا على عقب لمدة 45 دقيقة.
      ملاحظة: حماية عينة مع غطاء لمنع جفاف.
    2. الافراج بعناية "Eggcups" ووضعها في طبق بتري P35. شطف 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما، مع برنامج تلفزيوني 1X.
    3. إعداد الكوكتيل في برنامج تلفزيوني مع الثانوي الأجسام المضادة و Cy3 الماعز المضادة للأرنب (1: 1000) ومع Phalloidin اليكسا فلور 488 (1: 200) لتلطيخ ألياف الأكتين الإجهاد.
    4. احتضان الخلايا مع انخفاض 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة على ورقة فيلم من البلاستيك واحتضان خلايا داخل "eggcups" رأسا على عقب لمدة 45 دقيقة.
    5. الافراج بعناية "eggcشكا "ووضعها في طبق بتري P35. شطف 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما، مع برنامج تلفزيوني 1X.
    6. احتضان خلايا لتلطيخ نواة وضع قطرة 100 ميكرولتر من 1 ميكروغرام مل -1 دابي في برنامج تلفزيوني على ورقة فيلم من البلاستيك واحتضان خلايا داخل "eggcups" رأسا على عقب لمدة 45 دقيقة. هذه الخطوة لا يمكن أن يؤديها مع خطوة 4.2.3.
    7. الافراج بعناية "eggcups" ووضعها في طبق بتري P35. شطف 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما، مع برنامج تلفزيوني 1X.
    8. جبل الخلايا باستخدام الجلسرين 15 ميكرولتر: برنامج تلفزيوني (1: 1 ت / ت) على شريحة ميكروسكوب القياسية وختم عينة مع طلاء الأظافر لتجنب الجفاف.
      ملاحظة: اعتمادا على سمك "eggcups، قد يكون من الصعب في تصاعد مستمر. فمن المستحسن لتخزين ثم العينة في طبق بيتري P35 في برنامج تلفزيوني، وحمايتها من الجفاف.
  3. مراقبة المجهر
    ملاحظة: للحصول على هذا المثال تم استخدام المجهر مبائر تستقيم، ومجهزة PMT والهجين كاشفات. و25X أو 63 وقد تم اختيار X HCX الأشعة تحت الحمراء APO الهدف لتر ماء (0.95 NA) لتوفير مجال واسع من العينة وتبين انطباق الجهاز لتطبيقات فحص عالية المحتوى.
    1. حدد الهدف 25X أو 63X المياه.
      ملاحظة: أهداف مختلفة يمكن استخدامها تبعا للتطبيق وإشارة. ولكن من المستحسن استخدام أهداف الفتحة العددية العالية.
    2. ضع عينة ثابتة مع 'eggcups "والتركيز بعناية باستخدام ضوء brightfield (المرحلة التباين أو DIC) حتى" eggcups "والخلايا هي في الطائرة من المراقبة.
    3. فتح البرنامج وضبط المعلمات. اختيار المرشحات GFP، و Cy3 دابي لالأكتين، جولجي والمراقبة النواة، على التوالي؛ ضبط الوقت معرض لجميع القنوات.
      ملاحظة: قد يكون الوقت المعرض إلى تعديل اعتمادا على الإعداد.
    4. تحديد وتركيز المنطقة من اهتمام. بدء التقاط الصور (انظر الشكل 3).
TLE "> 5. التكيف للمراقبة من خلايا الخميرة وجيم ايليجانس الأجنة

  1. الانشطار والناشيء خلايا الخميرة
    ملاحظة: يستخدم هذا المثال خلايا الخميرة الانشطار التي يتم تمييزها مع RLC1-mcherry وأمراض الشرايين التاجية-GFP للميوسين والأكتين، على التوالي. خلايا الخميرة في مهدها لا وصفت هنا fluorescently. للمراقبة الانشطار الخميرة تم استخدام مقلوب الغزل القرص مبائر المجهر. واستخدمت هدف النفط 100X HCX PL APO CS (1.4 NA) لجميع عمليات الاستحواذ. بدلا من ذلك، لوحظت خلايا أيضا باستخدام المجهر المرحلة على النقيض من المقلوب مجهزة 20X المرحلة الهدف الهواء المقابل LCPlanFl (0.4 NA). في هذا المثال، بروتوكول مطابق لكل أنواع الخلايا.
    1. تحضير السطح "eggcups" كما هو موضح أعلاه. للانشطار والناشئين خلايا الخميرة، وإعداد تجاويف من 5 ميكرون في القطر (انظر الجدول 1). في هذه الحالة، لا يحتاج إلى أن functionalized مع بروتينات التصاق السطح.
      ملاحظة: ملء كاليفورنيان يكون الأمثل باستخدام "eggcups" المخروطية. هذا الشكل يلتقط ويحتفظ خلايا تجنب الإفراج خلال الخطوة الشطف بعد الطرد المركزي. ملء مئوية هو الأمثل في حوالي 80٪. يمكن أن تكون ملفقة هذه 'eggcups "المخروطية عن طريق ديب رد الفعل ايون النقش 13.
    2. خلايا الخميرة في وسائل الإعلام ثقافة الصحيح (انظر الجدول 1) حتى الوصول إلى الكثافة الضوئية (OD) في حدود 0.2 و 0.8. يصوتن ثقافة خلايا الخميرة لإزالة الركام.
    3. إدراج خلايا الخميرة في "eggcups عن طريق الطرد المركزي. الطرد المركزي، يتم إضافة 4 مل من الخلايا المستزرعة في التطوير التنظيمي المناسب على الأنبوب مع "eggcups". بعد الطرد المركزي الأول، يهز بلطف أنبوب لاعادة تعليق الخلايا التي ليست في 'eggcups "، في حين لا نشعر بالانزعاج خلايا في' eggcups". دون فتح الأنبوب، الطرد المركزي مرة أخرى وكرر هذه الخطوة مرتين. وهذا يضمن ترسبمن الخلايا من ثقافة إلى microcavities فارغة وسوف تزيد من نسبة الملء.
      ملاحظة: عند العمل مع الخميرة، فمن المستحسن قبل تسخين الطرد المركزي إلى درجة حرارة خلال التجارب
      ملاحظة: بروتوكول يمكن أن يكون مؤقتا هنا واستمر حتى 12 ساعة في وقت لاحق. في هذه الحالة، وتخزين العينة في درجة حرارة وتغطية ذلك لمنع التبخر.
    4. وضع "eggcups" في حامل المجهر وملء حامل مع فلتر تعقيم المتوسطة للتصوير. الآن شطف الخلايا مع وسائل الإعلام نفسها حتى تتم إزالة خلايا الخميرة العائمة بكفاءة. الحرص على عدم إزعاج الخلايا في 'eggcups "أثناء عملية الشطف.
    5. حدد هدف النفط 100X والتركيز بعناية. فتح البرنامج وضبط المعلمات. لالخميرة الانشطار، حدد GFP الفلاتر وTxRed لالأكتين والميوسين وضبط الوقت المعرض لكل من القنوات. معدل الاستحواذ النموذجي هو 3 ثانية.
      ملاحظة: اعتمادا علىوfluorophore، نوع من العلامات وانشاء، وقت التعرض يختلف عن الأنظمة الأخرى.
  2. C. ايليجانس الأجنة
    ملاحظة: يستخدم هذا المثال C. ايليجانس الأجنة 25-30 ميكرومتر واسعة و50-55 ميكرومتر طويلة. كانت أجنة مثقف كما هو مبين في 25. بروتوكول البصرية بسيط لكيفية التعامل مع جيم ايليجانس يمكن العثور عليها في 26. تم إجراء المراقبة باستخدام المجهر المرحلة على النقيض من المقلوب مجهزة الهدف الهواء 40X 0.55 NA.
    1. تحضير السطح "eggcups" كما هو موضح أعلاه و25 ميكرون في القطر (انظر الجدول 1). في هذه الحالة، لا يحتاج إلى أن functionalized مع بروتينات التصاق السطح.
    2. ثقافة C. الأجنة ايليجانس في وسائل الإعلام ثقافة الصحيح (انظر الجدول 1).
    3. إدراج الأجنة في "eggcups عن طريق الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه (انظر القسم 2،6 حتي 2،12) باستخدام الماء عالى النقاء كما مستنبت.
      ملاحظة: تم الأجنة "يتصرف" بشكل طبيعي في الماء عالى النقاء لمدة التجربة. وبدلا من استخدام منطقة عازلة M9 الفسيولوجية للتجارب طويلة الأمد.
    4. شطف العينة كما هو موضح أعلاه (انظر القسم 2.14). وضع "eggcups" إلى حامل المجهر. حدد هدف الهواء 40X والتركيز بعناية. فتح البرنامج وضبط المعلمات. تحديد سعر شراء 3 ثانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

و"eggcups" (EC) هي منهجية عالية المحتوى الفرز الجديدة التي تسمح التصور من الخلايا المنحى والأجنة في بيئة 3D. بالإضافة إلى ذلك، بعض العمليات الخلوية، التي يصعب مراقبة في 2D الثقافات القياسية (شقة)، ويمكن ملاحظة هذا الأسلوب الجديد. ويوضح الشكل 1A ملخص للإجراءات التصنيع الدقيق EC (انظر أيضا القسم 1 في بروتوكول المبين أعلاه ). طريقة بسيطة وسريعة وفعالة ودون أي شرط من المعدات الخاصة. 1B الشكل ويظهر 1C صورة على نطاق واسع وتضخيم مسح الإلكترون صورة مجهر "eggcups"، على التوالي. كما يمكن ملاحظتها، والشكل والحجم والعادية جدا. هذا الأسلوب هو مرن جدا. يمكن بسهولة مختلف الأشكال والأحجام تكون ملفقة وتكييفها لأنظمة نموذجا مختلفا. وقد تم اختيار أبعاد'eggcups' على النحو التالي: أبعادالخلايا التي تخضع لتقسيم قيست على الأسطح 2D: لديهم شكل كروي، واقتيد قطرها باعتباره مؤشرا جيدا لقطر EC. الخلايا في استطال'eggcups' وتوجيه على طول محور الطويل أثناء انقسام الخلية على سبيل المثال. هذا البعد يعتمد على نظام - الخلايا والأجنة - لذلك يجب أن يتم تقييم هذا البعد في كل حالة.

ويبين الشكل 2 المواد اللازمة (الشكل 2A) وبروتوكول خطوة بخطوة (الشكل 2B) حول كيفية استخدام "eggcups" (انظر أيضا القسم 2 في البروتوكول المبين أعلاه). ملء المفوضية الأوروبية مع خلايا الفائدة (أو الأنظمة النموذجية الأخرى) هو بسيط جدا وسريع. عادة، فإنه يأخذ أقل من 20-30 دقيقة، والذي يتضمن أيضا الوقت لtrypsinization الخلية. بعد التعبئة، عينات يمكن استخدامها لدراسة العمليات النشطة (التصوير الحي) أو يمكن أن تكون ثابتة وملطخة التصور من العضيات من intereشارع (انظر أيضا القسمين 3 و 4 في البروتوكول المذكورة أعلاه).

على الأسطح المستوية، والخلايا تظهر استجابات متباينة والظواهر المتطرفة من العضيات الخلوية. في الواقع، فقد قيل أن ألياف الأكتين الإجهاد (وغيرها من العضيات الخلوية) هي القطع الأثرية من الظروف والثقافة 1. من أجل إثبات هذه الفرضية، ونحن مثقف خلايا NIH3T3 على حد سواء "eggcups" 3D وعلى الأسطح المستوية ومقارنة الظواهر العضيات المختلفة الخلوية، وهي ألياف الأكتين الإجهاد، جهاز جولجي ونوى. ويبين الشكل 3 مثال على كيفية تنظيم الخلايا على كل التشكيلات. في المفوضية الأوروبية، وتوزع الخلايا في صف أمر يظهر متجانسة كروية تشبه النمط الظاهري (الشكل 3A). على الأسطح المستوية، تظهر خلايا نموذجي ملخبط، وانتشار والتشكل غير متجانسة (الشكل 3B). هناك أيضا اختلافات كبيرة في الهياكل الهيكل الخلوي. ولا سيما الخلايا على Rتظهر eggcups 'انخفاضا في عدد من الألياف الإجهاد مقارنة مع الأسطح المسطحة و 16. وما يؤكد هذا أيضا في 3D بناء صور حيث لا ألياف الإجهاد واضحة مرئية (انظر الشكل 3C - د). وهذا يؤكد أن بعض الهياكل الخلوية التي تفاقمت في الثقافات 2D. وهذا هو أيضا في اتفاق مع الملاحظات التي أجريت في الجسم الحي حيث لا يمكن التعرف على ألياف الإجهاد.

يظهر جهاز جولجي أيضا تفاوت كبير في النمط الظاهري تبعا لحالة الثقافة (انظر الشكل 4). جهاز جولجي على الثقافات 2D يظهر عادة النمط الظاهري الممتد "احتضان" محيط النواة بينما في "eggcups" هذا يظهر النمط الظاهري أكثر المضغوط (انظر الشكل 4A - ب). من أجل محاكاة التلاعب فحص المخدرات، كما نقوم بتقييم تأثير الأدوية على الخلايا مثقف على كل البيئات. اخترنا Blebbistatin mainlذ لأنه يعطل ألياف الأكتين الإجهاد ويمكن أن يكون لها تأثير على جولجي التشكل (انظر الشكل 3C - د). منذ يقع جولجي بجانب نواة الخلية، يمكن لهذا الدواء أن يكون لها أيضا تأثير على هندسته المعمارية. لاحظنا أولا أن الخلايا تعامل مع هذا الدواء أظهرت التشكل منتظم وموحد أقل بالمقارنة مع نوع البرية (WT) خلايا (انظر الشكل 3C - د). ثم قارنا وكميا النمط الظاهري جولجي لوحظ على "eggcups" وعلى الأسطح المسطحة (انظر الشكل 4C). لاحظنا أن على السطوح 2D خلايا أظهرت معظمهم من النمط الظاهري الممتد في حين أظهرت على الخلايا eggcups "النمط الظاهري أكثر المضغوط. نحن لم نلاحظ على الرغم من الاختلاف الكبير بين WT والخلايا المعالجة Blebbistatin.

وأخيرا، في 2D السطوح نواة الخلية موجه بشكل عشوائي بينما للخلايا في المفوضية الأوروبية أنها متعامد المنحى فيما يتعلق طائرة XY في كل منWT وBlebbistatin الخلايا المعالجة (انظر الشكل 5A - ج). هذا يسلط الضوء على قوة الجهاز لالعضيات الخلوية المشرق، على غرار تطبيق السابق من طريقة لتوجيه الطائرة للمراقبة من الحلبة cytokinetic في الخميرة وخلايا الثدييات 10،12،13. درسنا أخيرا كيف كروية النواة (كما هو موضح ψ = [π 1/3 6V ن 2/3] / وn، حيث V n هو حجم النواة و A ن مساحة سطحه) تأثرت تبعا لحالة زراعة وبناء على علاج الخلايا مع Blebbistatin الشكل يظهر 5D التوزيعات المقابلة من ψ. نحن لم نلاحظ فرقا لWT شقة مقابل WT EC، الذي يكشف عن أن المفوضية الأوروبية لا تؤثر على كروية الطبيعية للخلايا. ومع ذلك، لاحظناالفرق عند مقارنة WT EC لBlebb EC مما يدل على أن المجموعة الأوروبية وكشف عن الأثر الحقيقي للعقار الذي ملثمين في 2D.

دراسات الخلايا الحية باستخدام "eggcups" تسمح أيضا تحديد العمليات النشطة الجديدة التي تكون غير مرئية في الثقافات القياسية. نحن مطلي الخلايا في المفوضية الأوروبية وتصور الخلية الانقسام. ويبين الشكل 6 سلسلة من الصور للإغلاق حلقة cytokinetic خلال الانقسام الخلوي. يسمح للجهاز eggcups "التصور الكامل للحلقة، في حين أن الثقافات 2D القياسية يظهر سوى اثنين من المناطق التي تتطابق مع طائرة واحدة (10). إعادة بناء حلقة من سلسلة من الصور ض المكدس باستخدام الثقافات 2D يمكن القيام به 27، ولكن يتم فقدان المعلومات الهامة. تتقلص نوعية بسبب قرار ض منخفض والعمليات الحيوية لا يمكن حلها. الأكتين والميوسين هي البروتينات الأساسية في توليد القوة من انقسام الخلايا. ديناميتها لا يمكن به تصوير ودرس في ثقافة 2D (الشكل 6A)، في حين مع "eggcups" تبين على الفور. لقد حددنا الهياكل رواية والعمليات: في خلايا هيلا نجد تراكمات الدورية للميوسين 17. هذه التراكمات تتحرك شعاعيا كما الحلبة هو إغلاق (الشكل 6B). في الخميرة الانشطار نجد أيضا عدم تجانس في الميوسين والأكتين (الشكل 6C، أليس كذلك) 17. على عكس ما نراه في خلايا هيلا، وتناوب على عصابة أثناء الإغلاق. السرعة هي في حدود ميكرون دقيقة -1 ولن يكون للحل من قبل ض إعادة الإعمار مع المجاهر القياسية. أخيرا حلقة cytokinetic يمكن مواصلة دراستها من قبل تلطيخ لمكوناته. نجد أن هناك تراكم phosphotyrosine في المنطقة المجاورة للحلقة (الشكل 6D). نحن يمكن أن تظهر أيضا أن anillin وcolocalizing في حلقة (الشكل 6E). من خلال تلطيخ الخلايا في هذا التوجه، ثالبريد تكشف عن أن anillin يظهر أيضا توزيع غير متجانس.

طبقت "eggcups" أيضا على أنظمة نموذجا مختلفا: أبلغنا خلايا الثدييات، الخميرة الانشطار، ولكن نحن أيضا اختبار في مهدها الخميرة و C. ايليجانس (انظر الشكل 7A - ه). في هذه الحالة، وقد تم تكييف البروتوكول لكل نظام محدد من حيث وسائل الإعلام والثقافة، وتجاويف حجم والتشكل (انظر الجدول 1). على سبيل المثال، على شكل V مخروطي كانت "eggcups" مورفولوجيا الأمثل لشل حركة الانشطار الخميرة بكفاءة 12، بدلا من أسطواني تماما (أو على شكل حرف U) الشكل تستخدم لخلايا الثدييات 13. يسمح هذا اختبار تأثير الأدوية الهيكل الخلوي مختلفة مع إمكانية تطبيقها في بحوث علوم الحياة. وهذا يدل على المرونة والاعتمادية المنهجية المتقدمة.

وعلاوة على ذلك، فإن الترتيب أمر غاية من خلايا يسمح للمن السهل، مؤتمتة للقراءة من مضان من الخلايا وحيدة. نحن لتوضيح هذا عن طريق إدخال الخلايا NIH3T3 معربا عن GFP في "eggcups" (الشكل 8A). موقف الخلية يمكن التعرف عليه بسهولة ومستوى التعبير المقابل قياسه. ويبين الشكل 8B توزيع الإشارات مضان. ويمكن تطبيق هذا على أي التدريجي قراءة (المناعي للصحفيين الفلورسنت في الخلايا على سبيل المثال).

شكل 1
الشكل 1: تصنيع "eggcups" (أ) وصف تخطيطي لإجراء تلفيق "eggcups" صب متماثلة: (ط) صب PDMS السائل على العفن SU-8 وعلاجه. (ب) للتخلص من الطوابع وإزالته بعناية من على سطح الأرض، ثم البلازما تفعيلها للتمكن من silanize ذلك. (ج) صب PDMS السائل على طابع silanizedد الطرد المركزي من الحصول على طبقة PDMS رقيقة. (د) وبعد المعالجة طبقة PDMS، البلازما تفعيل الطابع على حد سواء، وPDMS غطت وساترة الزجاج. (ت) البلازما ربط كل من تطبيق لطيف، والضغط متجانسة. (السادس) بعد الترابط البلازما، وإزالة بعناية الطوابع للكشف عن سطح "eggcups". (السابع) لتبسيط التعامل في الخطوات المقبلة، إضافة مقبض PDMS قطعة صغيرة. ربط قطعة PDMS إلى ساترة من قبل الإلتصاق مع PDMS السائل و (الثامن) علاجه ثم في الفرن. (ب) صورة من ساترة 25 ملم مع "eggcups" PDMS والتعامل معها. (ج) المسح الإلكترون الصور مجهر "eggcups" PDMS. المسافة بين مراكز "eggcups 'هو 30 ميكرون، وقطرها حوالي 25 ميكرون. (يسار) أعلى عرض. (يمين) يتم قطع" Eggcups "لصورة الجزء الداخلي. يرجى النقر هنا للتنافس وا نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: (أ) عناصر اللازمة لملء EC. (1) أنبوب 50 مل. (2) قطعة اسطوانية (أعلى وعرض الجانب)؛ (3) مستنبت الخلية؛ (4) "eggcups '؛ (5) ملاقط حادة. (ب) تخطيطي لإجراء ملء EC. هو عرض (ط) قطعة اسطوانية الشكل لأول مرة في أنبوب 50 مل ومليئة 13 مل من مستنبت الخلية. بعد ذلك، (ب) تودع فيه "eggcups" بلطف على أعلى من قطعة اسطوانية باستخدام الملقط حادة للتلاعب المفوضية الأوروبية باستخدام PDMS قطعة صغيرة. (ج) و pipetted خلايا في الكثافة المناسبة على رأس المفوضية الأوروبية. (د) يتم إدخال خلايا في 'eggcups عن طريق الطرد المركزي. (ت) وأخيرا، يتم تحرير عينة برفق من الأنبوب وانها مستعدة لاستخدام. م / الملفات / ftp_upload / 51880 / 51880fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): مقارنة بين الظواهر خلية في 3D "eggcups" والأسطح المسطحة 2D. المجهر متحد البؤر (الهدف المياه 25X، 0.95 NA، لايكا) الصورة من خلايا NIH3T3 على (أ) EC تشكيل مجموعة أمرت، ويظهر النمط الظاهري كروية متجانسة، وعلى (ب) معيار ثقافة مسطحة 2D، وزعت عشوائيا مع الظواهر غير المتجانسة. تم صبغ الخلايا لالأكتين (باللون الأخضر)، جولجي (باللون البرتقالي) والنواة (باللون الأزرق). الحانات النطاق = 100 ميكرون. (ج) 3D إعادة بناء الخلايا على EC و (د) على الأسطح المستوية للوزن والخلايا المعالجة Blebbistatin. الحانات النطاق = 20 ميكرون.880 / 51880fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: دراسة NIH3T3 جولجي جهاز النمط الظاهري صورة تخطيطية وعينة من جولجي تصنيف النمط الظاهري للخلايا على (أ) شقة و (ب) EC. صنفت الخلايا كما ضغط، تمديد أو مجزأة حسب القيمة α. (ج) الكمي من الظواهر جولجي. الحانات النطاق = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل (5): ترونج> دراسة NIH3T3 نواة النمط الظاهري (أ) (يسار) صورة مجهرية متحد البؤر خلية NIH3T3 داخل المفوضية الأوروبية والملون لالأكتين (باللون الأخضر)، جولجي (باللون البرتقالي) والنواة (باللون الأزرق). (يمين) مخطط التوجه أنويتها داخل المفوضية الأوروبية. (ب) التوزيع الزاوي من نوى داخل المفوضية الأوروبية لWT و (ج) خلايا Blebbistatin المعاملة. (د) القيم كروية نواة لخلايا WT وتعامل Blebbistatin على حد سواء لEC والأسطح المسطحة (P [WT EC -Blebb EC] <0.001، P [Blebb مسطحة -Blebb EC] <000.1، ن WT شقة = 47، ن WT EC = 94، ن Blebb شقة = 59، ن Blebb EC = 141 الخلايا). شريط النطاق = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

= "دائما"> الشكل (6)
الشكل 6: دراسة تفصيلية للحلقة cytokinetic في عينات الحية والثابتة وفي النظامين باستخدام 'eggcups "(أ) تسلسل زمني لحلقة cytokinetic باستخدام معيار 2D ثقافة في المختبر. اثنين فقط من النقاط المضيئة في الأكتين (Lifeact-mcherry والأحمر) والميوسين (GFP الموسومة والأخضر) واضحة في ثلم الانقسام للخلايا هيلا (شريط مقياس = 10 ميكرومتر). (ب) تسلسل زمني لإغلاق لعصابة cytokinetic في خلايا هيلا خلال الانقسام باستخدام 'eggcups ". وتظهر الصور الأكتين (باللون الأحمر) والميوسين (الخضراء). "Eggcups" تسمح بتحديد تراكمات لا يزال الميوسين. وأبرز مثال واحد مع رأس السهم. (مقياس بار = 5 ميكرون). (ج) يمكن أيضا تصور الحلقة cytokinetic في الخميرة الانشطار. (يسار) خلايا تقع على سطح مستو، وخلوي حلقة الحركية مرئيا فقط عن اثنين من النقاط (يمين) خلايا في "eggcups": إغلاق كامل يمكن التقاط. يسمى الأكتين مع أمراض الشرايين التاجية-GFP (الحانات مقياس = 2 ميكرون). الوقت في دقيقة: ثانية. (د - ه) أمثلة من حلقات cytokinetic الملون. هي ملطخة (د) أكتين-GFP معربا عن الخلايا هيلا لphosphotyrosine (السنة التحضيرية) مما يدل أيضا إشارة في حلقة (مقياس بار = 5 ميكرون). الخلايا (ه) هيلا معربا عن GFP الموسومة هي ملطخة الميوسين وLifeact-mcherry (الأكتين) لanillin. وكشف Anillin في توطين في حلقة cytokinetic وأقل تركيزا في القشرة. فإنه يدل شارك في التعريب مع الأكتين والميوسين (مقياس بار = 5 ميكرون). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

80 / 51880fig7.jpg "/>
الرقم 7: تطبيق "eggcups" إلى أنواع الخلايا الأخرى، ونظم نموذج (أ) U2OS (عظمية البشري). يظهر أقحم خلية الفاصل. (مقياس بار = 20 ميكرون). (ب) خلايا NIH3T3 معربا عن GFP. الفرق في مستويات التعبير يمكن قراءتها بسهولة (شريط مقياس = 20 ميكرومتر). (ج) خلايا SW480 (مقياس بار = 20 ميكرون). (د) في مهدها الخميرة. وقت الدورة الشهرية هو دون تغيير. (مقياس بار = 10 ميكرون). (ه) C. ايليجانس الديدان؛ (اليسار) على سطح مستو (يمين) في "eggcups"، ويعتبر الجنين من منظور خفية على خلاف ذلك. (الحانات مقياس = 10 ميكرومتر). الوقت في دقيقة: ثانية الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

شكل 8 الرقم 8: المنظمة في مجموعة من "eggcups" يسمح للتحليل الآلي للسكان الخلية (أ) خلايا NIH3T3 في المفوضية الأوروبية (مقياس بار = 20 ميكرون). لديهم مستويات التعبير مختلفة من GFP. (ب) الاعتراف الآلي للموقف الخلية يسمح تحليل فردي من مستوى التعبير. تتلخص في الرسم البياني للتعبير GFP من السكان الخلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

نظام نموذج اكتب الثقافة المتوسطة الملاحظة المتوسطة "eggcups" قطر (μ؛ م) تعليقات / الوصف
خلايا الثدييات NIH3T3 10٪ BCS ارتفاع الجلوكوز DMEM 10٪ BCS L-15 20 ويمكن أيضا خطوط أخرى مستقرة الخلية، مثل REF52 أو MDCK، فضلا عن خطوط الخلايا الأولية، والخلايا السرطانية و / أو الخلايا الجذعية يمكن إدراج في 'eggcups ".
هيلا 10٪ FCS ارتفاع الجلوكوز DMEM 10٪ FCS L-15 25 المتاحة من مصادر مختلفة عديدة.
U2OS 10٪ FCS ارتفاع الجلوكوز DMEM 10٪ FCS L-15 20-25 المتاحة من مصادر مختلفة عديدة.
SW480 10٪ FCS ارتفاع الجلوكوز DMEM 10٪ FCS L-15 17-20 المتاحة من مصادر مختلفة عديدة.
خميرة الانشطار الخميرة أجارلوحة (YE5S) والسائلة وسائل الإعلام (YE5S وEMM5S) فلتر تعقيم EMM وسائل الإعلام (انظر قائمة المواد) 5 لا بد من functionalized مع البروتينات لاصقة السطح.
في مهدها الخميرة أجار لوحة (YPD) والسائلة وسائل الإعلام (YEPD وSD) SD وسائل الإعلام 5 لا بد من functionalized مع البروتينات لاصقة السطح.
جنين C. ايليجانس لوحة NGM الماء عالى النقاء 25 بدلا من ذلك M9 المتوسطة يمكن أن تستخدم في تجارب طويلة الأمد. وصفة هذا الحل المملحة يمكن العثور عليها هنا: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2009/5/pdb.rec11798.full؟text_only=true

الجدول 1: أوضاع الثقافة في "eggcups" لأنظمة نموذجا مختلفا. يمكن بسهولة أن تتكيف بروتوكول ذات الصلة أعلاهفقط عن طريق استبدال الظروف والثقافة وصفها وحجم "eggcups".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد استخدم صب متماثلة من أجل افتعال "eggcups". عملية التصنيع لا يحتاج إلى غرفة نظيفة. فمن السهل والبسيط، على الرغم من بعض الممارسات قد تكون مطلوبة. على وجه الخصوص، والإفراج عن طابع PDMS هي الخطوة الأكثر أهمية من أجل إنتاج مساحة واسعة من جودة عالية "eggcups". لهذا السبب، والرعاية الخاصة التي يجب اتخاذها في هذه الخطوة. إذا كانت هذه الخطوة هو الفشل مرارا وتكرارا، والنظر إلى تحسين معايير نظافة البلازما السابقة إلى silanization وملزمة البلازما. سوف silanization كافية يؤدي إلى التصاق قوي من الطوابع للفيلم PDMS. إذا لوحظ هذا، وفترة حضانة مع كاشف silanizing يمكن زيادة. لاحظ أن تقنيات ومواد أخرى يمكن تطبيقها على افتعال "eggcups"، والتي يمكن functionalized مع طائفة واسعة من بروابط (فبرونيكتين، والجيلاتين، والكولاجين، وما إلى ذلك). على وجه الخصوص، microcavities في البوليسترين يمكن أن تكون ملفقة بسهولة بواسطة سلطات الجماركتوم جعل تقنية الساخنة النقش. وهذا يضمن توافق مع الحياة والمقارنة المباشرة مع النتائج التي تم الحصول عليها في أطباق ثقافة القياسية. وبالمثل، هناك حاجة للرعاية والممارسة خاصة من أجل تحسين نسبة الملء. على وجه الخصوص، فإن الخطوة الشطف أمر بالغ الأهمية من أجل ضمان ملء المناسب مع عدم وجود فائض من الخلايا، والمساهمة في ضجيج والخلفية في الإشارة. إذا تم إزالة الخلايا بسهولة من تسوس الأسنان، والنظر في تغيير حجم أو عمق تجاويف.

"Eggcups" توفر بنية تشبه 3D إلى الخلايا والمقايسات فحص عالية المحتوى باستخدام بروتوكول بسيط. العضيات الخلوية والعمليات النشطة مجهولة باستخدام فحوصات ثقافة القياسية يمكن تصور بسهولة عن طريق إدخال الخلايا وحيدة على microcavities الفردية ( 'eggcups'). اعتمادا على نظام نموذجي، وحجم وشكل وأبعادها يمكن أن تتكيف بسهولة. وبهذه الطريقة خلايا الثدييات، الانشطار الخميرة، في مهدها الخميرة و C. ايليجانس جويمكن التلاعب بها ودراستها، وكذلك أي الأجنة مثل ذبابة الفاكهة والفئران أو الأجنة البشرية للإخصاب في المختبر، أو الخلايا الجذعية على سبيل المثال.

في هذا الإعداد يتم التقاط الخلايا وحيدة. هذا هو على النقيض من الأنسجة الظهارية التي واجهتها في الجسم الحي. ومع ذلك، يمكن أن تتكرر هذه البيئة في "eggcups" لدينا عن طريق طلاء الجدران الجانبية مع cadherins لتقليد الاتصالات خلية خلية باستخدام اللدائن أكثر مرونة. وسيتم تعزيز الاتصالات المحورية التي ترسب فبرونيكتين في الجزء السفلي من الآبار. وينبغي لهذه التوزيعات كل من جزيئات الالتصاق يسمح في استنساخ البيئات الخلوية التي واجهتها في الجسم الحي. بهذه الطريقة يمكن لأحد أن الاقتراب من الظروف الفسيولوجية.

وتكفل الصرف المتوسط ​​في فحص لدينا. الخلايا في المفوضية الأوروبية لا تظهر أي تدهور عند إجراء التجارب على حد سواء قصيرة الأجل وطويلة الأجل بسبب عدم وجود صرف المتوسط. لاحظ أيضا أن الخلايا في كاليفورنيا ECن يكون مثقف حتى التقاء على الرغم من أن الاهتمام الرئيسي هو عندما يتم عزل الخلايا الفردية أو الأجنة داخل تجاويف.

توجه العضيات أو الكائنات الحية كلها تكشف معلومات جديدة. وتبين لنا ديناميات مختلفة من الأكتين والميوسين في حلقة cytokinetic. على الرغم من أن تتكون حلقة cytokinetic في الخميرة الانشطار وخلايا الثدييات من المكونات الرئيسية مماثلة، وتبين لنا مع هذا الإعداد، أن ديناميتها محددة مختلفة 17. هذا وتدعم النتيجة، أن آلية الإغلاق في النظامين مختلفة كذلك. لتطوير والتحقيق في هذه الفرضية، وتوجه الخلية لا غنى عنه. في الدراسات المستقبلية، وهذا الجهاز يمكن أن تستخدم أيضا للتحقيق في أحداث أخرى ذات صلة العضيم منظمة في الخلايا.

أبعد من ذلك، يمكن لهذا الأسلوب أن تكون ذات فائدة كبيرة في البيولوجيا التطورية. الأجنة ممدود يمكن الموجهة بسهولة، لاحظت أو مواصلة العلاج في اتجاه محدد.ربما لدينا فحص لا تفرض قطبية الأجنة، إلا أن نسبة ملء عالية تسمح لاستخراج المطلوب للقراءة بطريقة موثوقة. تماما 'eggcups "يمكن أن يكون وسيلة جيدة للعروض عالية المحتوى.

وقد اقترحت المقايسات ثقافة أخرى. وتتراوح هذه الأساليب من خلايا متعددة في الأبعاد 2D في لوحات multiwell، إلى الخلايا وحيدة تودع في زخارف لاصقة micropatterned مع شكل مطابق. ومع ذلك، فإن أيا منها هو المناسب للتغلب على القيود المفصلة أعلاه على مراقبة العضيات الخلوية والعمليات الديناميكية 1.

وتحسينات في المستقبل لنظامنا يسمح للتطبيق "eggcups" لأغراض صناعة المنحى. وكمثال على ذلك، والتطبيقات فحص المخدرات في شركات الأدوية تتطلب استخدام لوحات multiwell 14،28. سوف المنفذة eggcups "في مثل هذه المنابر يحتمل تحسين موثوقيةالاختبارات والنتائج. كما سيتم تنفيذ مثل هذه، وارتفاع المقايسات فحص المحتوى باستخدام العمليات المؤتمتة التي تستخدم عادة من شركات الأدوية (ومختبرات الأبحاث الأكاديمية) باستخدام الروبوتات. وسيضمن هذا التكرار والموثوقية مع تقلب منخفض. وقد ظهرت بعض المنتجات التجارية على أساس 3D خلية فحوصات مثقف بالفعل في السوق تسليط الضوء على أهمية هذا النوع من المقايسات. وأخيرا، وهذه الأجهزة تفتح آفاقا جديدة للطب شخصية: يمكن وضع الخلايا من المريض في 'eggcups، ويمكن اختبارها الكوكتيلات العلاج في بيئة الفسيولوجية. فإن العلامات البيولوجية للقراءة من السماح لاستباق العلاج الأمثل أن تعطى للمريض 29. تماما الشكل المادي من الخلايا والأجنة وتوجيه الهندسة المعمارية للتسوس الأسنان، ونأمل أن الجهاز وهذه الطريقة سوف تنتشر على نطاق واسع في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

ونحن نعترف L. Brino (IGBMC العليا منشأة فحص المحتوى، إلكيرش، فرنسا) لتزويدنا الأجسام المضادة لمكافحة Giantin، M. Labouesse مختبر. لC. ايليجانس (IGBMC) وباء. Séraphin مختبر. لفي مهدها الخميرة (IGBMC)، E. Paluch وA. هيمان لالفلورسنت خلايا هيلا (MPI-CBG، درسدن)، J. موسلي (كلية الطب في دارتموث) وJQ وو (جامعة ولاية أوهايو) للخلايا الخميرة الانشطار. A. هويل وواو Evenou لمساعدة التجريبية، C. ريك (IBMC، ستراسبورغ، فرنسا) للحصول على المساعدة التقنية، وJC جينوت (فيمتو-الحادي وفرنسا) للمساعدة في التصنيع الدقيق. وأيد هذا العمل من جانب صناديق من CNRS، جامعة ستراسبورغ، Conectus، لا مؤسسة صب لا بحوث ميديكال وCI-الثورى لفتح ستراسبورغ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ddH20 (ultrapure) Millipore - Use always fresh water.
Parafilm (plastic film) Bemis PM-999 Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness.
Photo-mask Selba - http://www.selba.ch
Silicon wafer Siltronix - http://www.siltronix.com/
SU-8 photoresist MicroChem 2000 series http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm 
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
SU-8 developer MicroChem - http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm 
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information
2-propanol Sigma-Aldrich 19030 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&region=CA
Available from multiple companies.
Sigmacote (siliconizing reagent ) Sigma-Aldrich SL2-25ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&region=FR 
harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. 
Chlorotrimethylsilane (TMCS) Sigma-Aldrich 386529-100ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR  
TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition
Nitrile gloves Kleenguard 57372 http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Available from multiple companies.
Glass coverslips #0 Knittel glass KN00010022593 http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Very fragile. Manipulate gently.
Sharp straight tweezers SPI 0WSSS-XD http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
50 ml tube BD Falcon 352070 http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Available from multiple companies.
PDMS Dow Corning Sylgard 184 kit http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN 
The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies.
Microscope glass slides Dutscher 100001 http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Available from multiple companies.
DMEM high-glucose medium Fisher Scientific 41965-039 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Bovine calf serum Sigma-Aldrich C8056-500ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&region=CA
0.25% Trypsin-EDTA Fisher Scientific 25200-072 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS 1x Fisher Scientific 14200-067 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O
L-15 medium Fisher Scientific 21083-027 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Medium for atmospheres without CO2 control
Fibronectin  Sigma-Aldrich F1141-5MG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Penicillin & Streptomycin Fisher Scientific 15140-122 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM
Petri dish P35 Greiner 627102 http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Petri dish P60 Greiner 628163 http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
Petri dish P94 Greiner 633179 http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldehyde 3 % Sigma-Aldrich P6148-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&region=FR 
Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Triton 0.5 % Sigma-Aldrich 93443-100ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 InVitrogen A12379 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 
dissolve powder in 1.5 ml methanol
Alexa Fluor 647 InVitrogen A21245 1:200 dilution in PBS 1x
rabbit polyclonal anti-Giantin Abcam ab24586 1:500 dilution in PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html 
rabbit anti-anillin Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). 1:500 dilution in PBS 1x
Anti-phosphotyrosine Transduction Lab 610000 http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 goat anti-rabbit  Jackson Immunoresearch 111-166-047 http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp 
1:1,000 dilution in PBS 1x
DAPI Sigma-Aldrich D8417  http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&region=FR 
1 mg/ml for 1 min
Glycerol Sigma-Aldrich G2025 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410-500ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
HeLa cells - - Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
NIH3T3 cells ATCC - Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
Fission yeast  - - For details on strains, contact the corresponding author.  See also Table 1
C. elegans worms - - For details, contact the corresponding author.  See also Table 1
YES (Agar) + 5 Supplements included MP Biomedicals 4101-732 http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search 
For preparation: follow  instructions as given on the box
YES (Media) + 5 Supplements included MP Biomedicals 4101-522 http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search 
For preparation: follow the instructions as given on the box
EMM (Media) MP Biomedicals 4110-012 http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search 
For preparation: follow  instructions as given on the box
Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging MP Biomedicals 4110-012 For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence.
Supplements (for EMM) MP Biomedicals 4104-012 http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search
 (Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering)
Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters Millipore - http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  2. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).
  3. Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies. PLoS ONE. 7, e37548 (2012).
  4. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  5. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. , (2012).
  6. Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments. Lab Chip. 11, 805-812 (2010).
  7. Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies. Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).
  8. Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 12, 458-465 (2013).
  9. Legant, W. R., et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat Meth. 7, 969-971 (2010).
  10. Devices and methods for observing the cell division. Riveline, D., Buguin, A. , WO/2010/092116 (2010).
  11. Ochsner, M., et al. Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells. Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).
  12. Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . Riveline, D. , WO2013144302 (2012).
  13. Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. Riveline, D., Wollrab, V. , WO2013135809 (2012).
  14. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).
  15. Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. Methods in Molecular Biology. Hughes, M. P., Hoettges, K. F. 583, Humana Press. 81-107 (2010).
  16. Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).
  17. Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction. Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).
  18. Yao, X., et al. Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits. Integr Biol. 6, 388-398 (2014).
  19. Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. The promise of single-cell sequencing. Nat Meth. 11, 25-27 (2014).
  20. Allen, T. D., et al. Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM). Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).
  21. Robbins, E., Marcus, P. I. Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations. Science. 144, (1964).
  22. Whitfield, M. L., et al. Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3" end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).
  23. Straight, A. F., et al. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science. 299, 1743-1747 (2003).
  24. Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1). Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).
  25. Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development. Curr Biol. 20, 322-327 (2010).
  26. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. JoVE. , e4019 (2012).
  27. Saha, S., Pollard, T. D. Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast. Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).
  28. Prestwich, G. D. Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery. Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).
  29. Futamura, Y., et al. Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification. Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 115، Microcavities، طبق الاصل صب، التصنيع الدقيق، وارتفاع محتوى الفرز، 3-الأبعاد، خلايا واحدة، نواة، جولجي، Cytokinetic الدائري.
طلب خلايا واحدة والأجنة واحدة في 3D الحبس: جهاز جديد لفحص المحتوى العالي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wollrab, V., Caballero, D.,… More

Wollrab, V., Caballero, D., Thiagarajan, R., Riveline, D. Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening. J. Vis. Exp. (115), e51880, doi:10.3791/51880 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter