Summary
我们报告的设备和新的方法来研究细胞和胚胎。单细胞精确下令微阵列。他们的3D坐月子是朝着在生理条件下遇到的3D环境的一个步骤，并允许细胞器的方向。通过控制细胞的形状，此设置最大限度地减少可变性中的标准试验的报道。
Abstract
生物细胞通常在平面（2D）表面观察。这种条件是不生理和表型和形状是高度可变的。根据在这种环境中的细胞筛选具有因而严重的局限性：细胞器显示极端的表型，细胞形态和尺寸是异质和/或特定的细胞器无法正确显示。此外， 在体内细胞位于3D环境;在这种情况下，细胞表现出不同的表型的，主要是因为它们与组织的周围的细胞外基质相互作用的。为了标准化和产生单个细胞中对基于细胞的测定生理相关的3D环境的次序，我们在这里报告的装置的用于体外三维细胞培养物的微加工和应用。此装置由微腔的2D阵列（通常是10 5的空腔/厘米2）中 ，填充有单细胞或胚胎。细胞POSI化，形状，极性和内部细胞组织变得那么标准化呈现出3D架构。我们使用复制品成型图案的微腔的阵列，'eggcups'，到薄聚二甲基硅氧烷（PDMS）粘附在盖玻片层。腔体上布满了纤维连接蛋白更容易粘附。细胞通过离心插入。填充百分比为每个系统允许高达80％的最优化。细胞和胚胎存活率证实。我们应用此方法对细胞器，如细胞核和高尔基体的可视化，并研究活动进程，如cytokinetic环的细胞有丝分裂期间的关闭。该器件允许cytokinetic闭环和压实表型的高尔基体细胞核对准期间的新功能，如周期性积累和肌球蛋白和肌动蛋白的不均匀性的鉴定。我们的特点的方法哺乳动物细胞，裂殖酵母，芽殖酵母，C.线虫 W¯¯在每种情况下i个具体的适应。最后，该装置的特性使得它特别有趣的药物筛选测定法和个性化的药物。
Introduction
当前在体外基于细胞的测定是二维（2D）。这种构造是不自然的哺乳动物细胞，因此不是生理有关1;细胞显示的形状，大小和异构表型的多样性。当应用于筛选应用，如平面和细胞器的极端的表型（应力纤维，特别是）内的无序分布它们呈现额外严重的局限性。这是在药物测试，在高预算每年花在临床试验尤为重要。当因为在药物筛选的初期阶段人工2D培养条件适用于动物模型大多数这些药物虽然失败。另外，通过使用这种方法，具体细胞器无法正常显现，如细胞有丝分裂期间cytokinetic肌动球蛋白环，一般认为是在平面垂直演进到观察平面结构。一些新的二维测定人为了克服上述缺点和重要的见解上细胞骨架组织已经观察到2,3被提出。但是，这些检测仍然存在一个严重的局限性：细胞表现出非常价差表型相反的是， 在体内 ，其中细胞呈现出3D架构观察。与培养法相关的这些文物可能引发非生理功能，如增强的应力纤维1,4,5。
时相比2D环境6,7-三维细胞培养测定提供多个优点。它们是生理上更相关的，并且结果是因此有意义。作为一个例子，嵌在水凝胶细胞显示3D状结构，但它们的形态从一个小区的不同而不同8,9。然而，它们的形态从一个小区到另一个，其中筛选应用复杂不同。另一种策略是嵌入单细胞微制造的腔10,11。然后细胞位置，形状，极性和内部细胞组织可以成为标准化。除了 提供类似3D的架构，细胞，微腔还允许高内涵筛选研究10,12-14;单电池可以订购成微阵列和细胞器和它们的演进可以并行进行观察。这个规律提供了较低的细胞数量和更好的时间/空间分辨率良好的统计数据。有用的化合物是更容易识别可靠。
在这项研究中，我们显示了高内涵筛选应用10,12,13制作和全新的3D般的单细胞培养系统中的应用。该装置由弹性微腔（10 5腔/厘米2），创造'eggcups“（EC）的阵列。在这项工作中的尺寸和EC的总体积进行优化，个人NIH3T3细胞和HeLa细胞的典型体积在细胞分裂过程。圆柱形 - - 腔形态被选择为活动进程的可视化的正确东方细胞形状。复制品成型用于图案EC的阵列上附着在玻璃的薄聚二甲基硅氧烷（PDMS）层盖玻片15,16。细胞通过离心在欧盟出台。我们在2D使用相同的细胞相比在这里报告的观察和三维（EC）细胞器（应力纤维，高尔基体和胞核）正常化（平）表面。我们还报告，积极动力过程的观察，如cytokinetic肌动球蛋白环的细胞有丝分裂过程中17封。最后，我们表明与刚性壁，如出芽酵母，裂殖酵母和C的其它系统这种方法的结果线虫胚胎这证实了我们的方法是否适用于广泛的模型系统。
接下来我们提出一个详细而详尽的protocol为了制造和应用三维微细加工的“eggcups”。我们的方法是简单，并不需要一个干净的房间。我们预计，这一新方法将成为药物筛选试验和个性化的医学特别有意思，在更换培养皿。最后，我们的设备将用于癌症18或在基础研究19研究的细胞响应的分布对外部刺激，例如有用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.“Eggcups”的微细
- 法师的制作：微腔阵列
- 热3''的硅晶片到200℃以蒸发湿度的任何存在。
- 旋涂层的SU-8光致抗蚀剂的薄层。调整树脂及纺丝速度取决于所需的厚度和光致抗蚀剂类型的体积。该厚度将决定'eggcups'（EC）的深度。对于2,800转30微米厚的层和SU-8 2025年，旋涂。
- 预烘烤在65℃下1分钟（第2步骤1）的晶片为一30μm厚的SU-8 2025层。取决于所需的光致抗蚀剂的类型和厚度适应的时间。详情请查阅制造商数据。
- 预烘烤在95℃下进行3分钟（第2步骤2）的晶片为一30μm厚的SU-8 2025层。取决于所需的光致抗蚀剂的类型和厚度适应的时间。详情请查阅制造商数据。
- 加载晶片上的掩模对准器为UV曝光。放置光刻掩模就可以了。掩模示出20微米直径的圆形特征（磁盘）的图案。确保相互之间的完美接触。
注：不同制造商提供的光刻面具。的空间分辨率将确定的最终成本。醋酸口罩低成本提供可接受的分辨率（≈10微米）。铬面罩提供更好的分辨率，但更昂贵。适应磁盘的直径（从光刻掩模），以细胞的体积。在掩模磁盘尺寸将确定在设备的空腔的直径。小直径会导致较低的填充;过大直径将不限制细胞。用于HeLa和NIH3T3细胞，直径为20微米至25微米的建议。 - 检查紫外灯之前博览会的力量，相应地优化曝光时间。照射（波长= 365纳米），用于在41.5秒（或优化曝光时间）250毫焦/厘米2。
注意：SU-8 2025的负光致抗蚀剂，这意味着暴露区域到紫外线将被固化。在这种情况下，圆形特征是黑，其余的是透明的。以相反的方式正性光刻胶工作：未曝光区域固化。选择相应的光致抗蚀剂，这取决于设计和光掩模。
注：用适当的防护眼镜从紫外线保护眼睛。 - 除去轻轻地从光致抗蚀剂层的掩膜。
- 后烘烤在65℃下1分钟（第2步骤1）的晶片为一30μm厚的SU-8 2025层。后烘烤在95℃下进行3分钟（第2步骤2）的晶片为一30μm厚的SU-8 2025层。取决于所需的光致抗蚀剂的类型和厚度适应的时间。详情请查阅制造商数据。后烘烤后，冷却所述晶片至室温长凳上为约1分钟。
- 放置晶片在旋转涂布机和落的SU-8显影剂几毫米以覆盖晶片的整个区域。制定2分钟，然后旋涂以1000rpm进行30秒。重复该过程三次。
- 用2-丙醇冲洗，以确保完全除去未显影SU-8的。白色区域的外观是不完全发展的指示。如果是这样，则重复显影步骤的额外时间。
- 硬烘烤在200℃的晶片，以确保所制造的微结构的稳健性。这个步骤是可选的。
- 存储与94毫米×15毫米的聚苯乙烯培养皿内的微观结构的3''晶片。
注意：没有必要进行表面处理，特别是硅烷化，为下一个步骤。
- 聚二甲基硅氧烷（PDMS）副本的制作：支柱阵列
- 在1:10的比例调匀（重量/重量）交联剂和预聚物为50ml管内共为30g。
注意：使用1:10（体积/体积）比率也工作。 - 离心管中，在1800 XG 5分钟去除气泡。
- 轻轻地砸在微观结构顶部的PDMS。
注：如果在该步骤中出现气泡，脱气使用真空泵15-20分钟的样品。 - 将样品在烘箱中在65℃下4小时。
注：固化时间用户之间和不同而不同，与交联剂一起：预聚物的比例。此时将决定的PDMS的刚性。它建议以固化超过2小时，粘到一个固定的固化时间。 - 使用手术刀轻轻切利息（印记）的面积的约1cm 2，它包括约10 5的微腔或'eggcups'。
注：先切PDMS，然后轻轻地把它剥开。检查PDMS复制品的质量用光学显微镜。
- 在1:10的比例调匀（重量/重量）交联剂和预聚物为50ml管内共为30g。
- 通过复制成型“eggcups”的制作。在下文中，关于'eggcups'的制造两种替代策略进行说明。这两个协议都西米LAR并提供相同的结果：
- 策略1
- 激活通过氧等离子处理所制造的PDMS压模30秒。临时存储活化邮票成封闭的培养皿，以防止灰尘沉积。
注：调整曝光时间，如果被用于等离子体等气体。 - 放置活化PDMS压模颠倒了（与结构的一侧）在培养皿旁边15毫升管帽。装满三甲基氯硅烷的200微升（TMCS）的上限。关闭培养皿，并让该印模silanize 7分钟。
注：印花税和/或颜色（白色）改变一些临时的变形可以被观察到。该印模将恢复其初始形状在很短的时间和结构将不会受到影响。
注：TMCS产生急性吸入和皮肤的毒性，是高度易燃（点火倒叙能够越过相当大的距离发生）。因此，它应该在通风橱中使用远离源小号点火。 - 放置在旋转涂布机的结构PDMS邮票上攻了。放几微升的液体PDMS一小滴（约20微升）（1:10重量/重量交联剂：预聚合物）上的结构的顶部。旋涂以1500rpm进行30秒的结构的顶部淀积的PDMS薄层。
注意：如果印记不符合旋涂机夹头的地方在一个培养皿的盖子上面的印章在其中心的小孔。 - 放置在烤箱印模在65℃下4小时，以固化沉积旋涂的PDMS层。
- 通过将PDMS压模颠倒了一个玻璃盖玻片＃激活薄的PDMS层，一起25 0毫米直径，使用氧等离子体清洁30秒。迅速进行到下一个步骤。
注意：与其它的厚度，形状盖玻片，和尺寸可以作为良好。但是，某些细胞结构可能是困难的，这取决于所选盖玻片厚度和客观的可视化放大和/或NA和/或工作距离。检查目标数据表。 - 在接触放置印章（与薄旋涂层的一侧）与玻璃盖玻片。按围绕印模的表面用镊子轻轻所有使“粘合”。最后，保持对印章的顶部有一个恒定的压力约10秒。
- 30分钟轻轻'剥离'的印记，以盖玻片为'解放'eggcups'后（ 见图1）。用乙醇和干燥的彻底冲洗。如果PDMS“eggcups”不上玻璃盖玻片附着好（ 也就是他们的'unpeeling“步骤中分离），考虑调整等离子清洗机的设置和步骤1.3.1.5重启。
注：这一步是微妙的。为了要注意避免薄PDMS层的盖玻片和/或剥离的破坏。 - 胶的1毫米×1固化的PDMS中的一小片（手柄）毫米×在3体积毫米在含有液体的PDMS一小滴盖玻片的边缘，并作为前固化的PDMS。这将有利于样品的操作之后（参见图1）。这个步骤是可选的。
- 激活通过氧等离子处理所制造的PDMS压模30秒。临时存储活化邮票成封闭的培养皿，以防止灰尘沉积。
- 策略2
- 亲水通过氧等离子处理所制造。PDMS压模30秒。临时存储的激活邮票在一个封闭的培养皿，以防止灰尘沉积。
注：调整曝光时间，如果被用于等离子体等气体。 - 在15瓦特，30秒亲水的直径25毫米的玻璃盖玻片＃0氧等离子体处理。迅速进行到下一个步骤。
注意：与其它的厚度，形状盖玻片，和尺寸可以作为良好。然而，蜂窝结构将难以根据所选择的盖玻片的厚度和客观特征的可视化（见上文注）。 - 旋涂的PDMS（1:10的一小滴w / w的交联剂：预极化ymer）几微升到盖玻片的。旋涂层以1,500rpm进行30秒，约50微米的最终厚度。
- 胶1毫米×1毫米×3mm的固化的PDMS在体积小片（手柄）与液体PDMS一小滴盖玻片的边缘，并作为前固化的PDMS。这将有利于样品的操作之后（参见图1）。这个步骤是可选的。
- 暂时存放在涂PDMS-盖玻片到一个干净的擦拭培养皿内的灰尘沉积保护。
- 穿上每张邮票的顶部硅烷化试剂一滴并让它蒸发1-2分钟。然后，晾干下的N 2流。
注意：在此步骤中，可以在蒸发过程中可以观察到该印模的临时变形。用N 2干燥，而不微观结构的任何永久变形后的印模将恢复其原始形状。 - 滴在顶部轻轻硅烷化邮票PDMS-旋涂存储在培养皿玻璃盖玻片。确保双方都在接触时完全平行。请勿按压或将其放置到PDMS涂层盖玻片后移动的印记。
- 放置培养皿样品中的真空为1-2小时，以去除气泡。
注意：确保样品完全水平，以避免戳位移。避免也振动可能由真空泵造成的。 - 放置在烤箱的样品在65℃下4小时。
- 轻轻的，撕下邮票透露“eggcups”。用乙醇和干燥的彻底冲洗。
需要实践在这一点上：注意。避免薄PDMS层的盖玻片和/或脱落破损注意。
- 亲水通过氧等离子处理所制造。PDMS压模30秒。临时存储的激活邮票在一个封闭的培养皿，以防止灰尘沉积。
- 策略1
2.引入细胞进入“Eggcups”
为了引进哺乳动物细胞内的'eggcups“，PDMS表面NE编与细胞外基质的粘附蛋白官能化。这个例子使用纤连蛋白，但其他感兴趣的蛋白质，如胶原，也可以使用。
- 亲水在氧等离子体清洁器的'eggcups'30秒。
注：如有需要优化的参数。 - 准备在PBS 1X的20微克毫升牛源来源的解决方案-1纤维连接蛋白。
- 消毒'eggcups'用UV 5分钟。存款纤维连接蛋白溶液一小滴（约20-50微升），以覆盖整个“eggcups”区域，并在室温下孵育1小时。保护从干燥的样品。
- 轻轻地冲洗了“eggcups'用PBS 1X。重复3次。
注：该样品是准备在黑暗中立即或使用储存在4℃数周。 - 介绍的圆柱形定做塑料片63毫米高，外部半径为26毫米和7毫米的半径尺寸到50毫升管（见图2）20
注意：使用UV-灭菌物品或消毒他们在先使用。
注：这件作品可以在实验室中容易制造。或者通过任何可用的机加工车间。 - 放将13ml该管内细胞培养基（ 见表1）。该介质应填写至少2厘米的圆柱形片以上，以确保样品完全浸没。
注：对于特定细胞类型的详细信息，以及其他模型系统，如酵母或C.线虫胚胎，并使用相应的介质，参见第5和表1中 。所描述的协议是对海拉，NIH3T3细胞，以及其他细胞系（ 见表1）进行了优化。 - 介绍轻轻管与平行里面'eggcups'到塑料片的上侧。用锋利的镊子持有使用PDMS手柄样本。轻轻按压盖玻片，直到它坐落在塑料片，联合国的上侧顶直到它完全浸入（ 见图2）。
注：建议使用锋利的直镊子。具有弯曲镊子，样品的操作是困难的，并可能导致破损。 - 培养细胞，直到在P60培养皿中80-100％汇合，并通过胰蛋白酶处理收集它们。
注：细胞可以是野生型，转染或与感兴趣的药物治疗。
注：避免细胞聚集体，这将避免单细胞进入'eggcups'的形成。为了优化这一步，吸管和胰酶消化下来后彻底。 - 重新悬浮细胞到5ml培养基。吸取上的“eggcups'的前200微升细胞。
注意：删除细胞中心尽可能对'eggcups“的顶部，但避免了身体接触。这将防止破损和/或样品的损伤。 - 离心1800 XG为2分钟。
注：第一次离心后，检查麦克风roscope的'eggcups'的填充比率。 - 吸管再次200上的'eggcups'和离心机的顶部细胞微升在1800 xg离心2分钟。为了优化的填充比率重复，共三次。
注：最后离心后，检查用显微镜“eggcups'的填充比率。如果需要的话，重复填充+离心步骤，直到达到所希望的填充百分比。 - 删除使用拿着手柄PDMS大幅镊子从管样品。请务必要在这是在“eggcups”不持有“令人不安的”细胞小心（ 见图2）。
- 将样品在一个培养皿中。冲洗通过上下吹打三次轻轻旁边的微观结构阵列的每一侧（总共4侧）以除去过量的不属于在'eggcups'细胞。
注：移液过强可能释放部分细胞出从'eggcups“。 - 用新鲜培养基更换培养基除去nonattached细胞。
注：在此步骤中可以添加感兴趣的药物。 - 修复细胞或时间推移imaging.See步4.1做好准备。
Cytokinetic闭环：在“Eggcups”活动细胞动力学3.观察
注意：此示例使用这些转染MYH10-GFP和Lifeact-mcherry肌球蛋白和肌动蛋白HeLa细胞，分别细胞有丝分裂过程中所涉及的cytokinetic闭环的关键活性分子。该装置用的直径25微米的微腔制备。对于自己的观察，使用落射荧光倒置显微镜，配备了60X油浸物镜（1.40 NA，DIC，计划APO）和GFP（肌球蛋白）和TxRed（肌动蛋白）滤波器。备选地，使用一个直立共聚焦显微镜，配备了25X或63X HCX IR APO升水目标（0.95 NA）。对于这个EXAmple，强烈建议使用双胸苷块，有丝分裂块或丝分裂摇断法21-24同步细胞。
注：用于'eggcups“的PDMS的厚度允许各种既倒和直立放置显微镜目标的用法。
- 地点“eggcups'变成显微镜保持器并用1ml 10％FCS的L-15观察介质的填充。为了避免蒸发，放置在支架的顶部上的玻璃盖或在medium.Select的60X油浸物镜的顶部应用矿物油的薄层。
注：L-15介质是足够的非CO 2大气压。还注意到，DMEM中一些化合物是自体荧光。当使用这种介质时，建议通过用1-2小时的高亮度灯照亮它以光漂白的荧光化合物。
注：使用DIC成像时避免使用塑料盖。 - 将持有人与'eggcups“安装前后和在显微镜VATION网上平台。小心集中使用明场光直到“eggcups'和细胞在观察同一平面上。
- 打开软件和调整参数。选择过滤器TxRed和GFP肌动蛋白和肌球蛋白;调整曝光时间为每个通道。一个典型的采集速率为5秒的两个通道。
注：曝光时间可以具有根据所使用的设置，染料或其他感兴趣的细胞器进行调整。 - 选择感兴趣的区域，寻求利用无论是GFP或TxRed通道cytokinetic环。聚焦准确。
注：环是在肌球蛋白清晰和更容易识别。 - 运行在两个通道的自动采集，直到该环完全关闭。
注意：有些漂白可以观察到。调整以减少它在显微镜参数。
4.修正了观察细胞器进入“Eggcups”
此步骤之前或之后，在步骤＃3中进行。细胞可以直接固定在离心步骤之后和染色为感兴趣的细胞器，或在显微镜观察后。这个例子显示了NIH3T3细胞高尔基体，细胞核和肌动蛋白纤维的“eggcups'染色。
- 在“Eggcups”细胞固定
- 准备3％多聚甲醛（PFA）和温暖的37℃。从50毫升管（或显微镜持有人）删除'eggcups“样本，并将其放在一个P35培养皿中。用PBS 1X冲洗一次。
注：协议为3％多聚甲醛的制备是广泛可用在别处。
注意：使用丁腈手套和保护眼睛PFA的准备过程中。 - 彻底去除PBS和下降1×3％PFA和孵化17分钟。除去PFA，用1ml的PBS 1X中漂洗两次。使用1-毫升0.5％三叔通透细胞上3分钟，并用PBS 1×洗涤两次5分钟。
- 准备3％多聚甲醛（PFA）和温暖的37℃。从50毫升管（或显微镜持有人）删除'eggcups“样本，并将其放在一个P35培养皿中。用PBS 1X冲洗一次。
- 在“Eggcups”细胞染色
- 孵育在1与初级抗体的兔多克隆抗Giantin高尔基体染色细胞1:500稀释在PBS中。放置的抗体溶液100μl的下降到塑料薄膜片，并培育细胞中的'eggcups'内倒置45分钟。
注：带罩，防止干燥保护样品。 - 小心松开“Eggcups”，将它们放入一个P35培养皿。冲洗3次，每次5分钟，用PBS 1×。
- 制备在PBS鸡尾酒与第二抗体的Cy3的山羊抗兔（1:1,000）中，用鬼笔环肽的Alexa Fluor 488（1：200）染色的肌动蛋白应力纤维。
- 孵育的抗体溶液加入100μl滴细胞在塑料薄膜片和孵育细胞'eggcups'内倒置45分钟。
- 发行仔细“eggc跌宕“，将它们放入一个P35培养皿。冲洗3次，每次5分钟，用PBS 1×。
- 孵育放置的1微克毫升-1的DAPI的PBS100μl的下降到塑料薄膜片细胞细胞核染色和孵育细胞'eggcups'内倒置45分钟。该步骤可以与步骤4.2.3进行。
- 小心松开“eggcups”，将它们放入一个P35培养皿。冲洗3次，每次5分钟，用PBS 1×。
- 安装细胞使用15微升甘油：PBS（1:1体积/体积）上的标准显微镜玻片上，密封该样品与指甲油，以避免干燥。
注：根据“eggcups'的厚度，安装可能很困难。建议将样品存放然后成P35培养皿在PBS，从干燥的保护。
- 孵育在1与初级抗体的兔多克隆抗Giantin高尔基体染色细胞1:500稀释在PBS中。放置的抗体溶液100μl的下降到塑料薄膜片，并培育细胞中的'eggcups'内倒置45分钟。
- 显微镜观测
注：在这个例子中一个堂堂正正的共聚焦显微镜使用，配备了PMT和混合探测器。一个25X或63点¯xHCX IR APO升水目标（0.95 NA）被选择，以提供样品的广泛的领域，并显示高含量筛选的应用程序的设备的适用性。- 选择25X 63X或水的目标。
注意：不同的目标可根据不同的应用和信号可以使用。但推荐的高数值孔径物镜的使用。 - 将固定样本与“eggcups”，仔细用明光（相衬或DIC），直到“eggcups'和细胞中观察的平面焦点。
- 打开软件和调整参数。选择过滤器GFP，Cy3和DAPI肌动蛋白，高尔基体和细胞核的观察，分别;调整曝光时间所有通道。
注：曝光时间可能会根据不同的设置进行调整。 - 选择和聚焦于感兴趣的区域;开始图像捕获（ 见图3）。
- 选择25X 63X或水的目标。
- 裂变与芽殖酵母细胞
注意：此示例使用这些标记RLC1-mcherry和CHD-GFP分别为肌球蛋白和肌动蛋白，裂殖酵母细胞。芽殖酵母细胞不会荧光标记在这里。对于裂殖酵母观测使用倒置旋转盘共聚焦显微镜。 100倍HCX PL APO CS油浸物镜（1.4 NA）用于所有的收购。可替代地，将细胞也用装有20X相衬空气客观LCPlanFl（0.4 NA）的倒相差显微镜观察。在本实施例中，协议是对两种类型的细胞是相同的。- 如上所述准备“eggcups”表面。裂变和出芽酵母细胞中，制备5微米的直径腔（ 见表1）。在这种情况下，表面并不需要与粘附蛋白官能化。
注：该灌装CAn使用锥形“eggcups”进行优化。这种形状捕获并保留避免在离心后漂洗步骤释放的细胞。填充百分比在大约80％是最佳的。这些圆锥形'eggcups'可以通过深反应离子蚀刻13的装置来制造。 - 在适当的培养基中培养酵母细胞（ 见表1），直到达到在0.2和0.8的范围内的光密度（OD）。超声处理的酵母细胞的培养物以除去聚集物。
- 通过离心插入酵母细胞中“eggcups”。用于离心4毫升适当外径培养的细胞中加入到管与'eggcups'。第一次离心后，轻轻摇动管重新暂停其不在'eggcups'细胞，而在“eggcups”细胞不受到干扰。无需再次打开管，离心和重复此步骤两次。这确保了沉积从文化到空的微腔细胞并会增加填充率。
注意：当用酵母工作，建议以预热在实验过程中的离心分离机的工作温度
注：该协议可以在这里停顿了一下，后来持续到12小时。在这种情况下，存储在工作温度下的样品并覆盖它，以防止蒸发。 - 将“eggcups”在显微镜座，并填写与成像过滤消毒媒体的持有人。现在冲洗细胞用相同的介质，直到浮动酵母细胞被有效地除去。注意不要在漂洗过程中扰乱“eggcups'细胞。
- 选择100X油客观，谨慎关注。打开软件和调整参数。对于裂殖酵母中，选择肌动蛋白和肌球蛋白的过滤器GFP和TxRed和调整曝光时间两个通道。一个典型的采集速率为3秒。
注：根据荧光团，标记的类型和设置，曝光时间为其他系统而变化。
- 如上所述准备“eggcups”表面。裂变和出芽酵母细胞中，制备5微米的直径腔（ 见表1）。在这种情况下，表面并不需要与粘附蛋白官能化。
- 线虫胚胎
注：此示例使用C.线虫胚胎25-30微米，宽50-55微米长。如在25所示的胚胎中培养。如何操纵C.一个简单的可视化协议线虫可以在26找到。使用装有40X空气目标0.55 NA的倒置相差显微镜下进行观察。- 以上所描述和25微米直径制备'eggcups'表面（ 见表1）。在这种情况下，表面并不需要与粘附蛋白官能化。
- 文化C.线虫胚胎在适当培养基中（ 见表1）。
- 如上所述通过离心将胚胎'eggcups“使用超纯水作为培养基（见2.6至2.12）。
注意：胚胎'行为'通常在超纯水中的实验的持续时间。可替代地用于长期实验生理M9的缓冲区。 - 冲洗上述（见2.14）的样品。放置'eggcups'变成显微镜座。选择40X空中目标，并认真关注。打开软件和调整参数。选择3秒的采集速率。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
该'eggcups'（EC）是一种新型的高含量筛选方法，它允许导向细胞和胚胎的可视化在3D环境。此外，某些细胞过程，这是很难在标准2D（平面）培养物来观察，可以通过这种新的方法观察到的。 图1a显示了EC微细加工步骤的概要（参见章节1中的上述协议）。该方法简便，快捷，高效，无需特殊设备的任何要求。 图1b和1c显示了一个大型的图片和“eggcups”分别放大的扫描电子显微镜图像。如可以观察到的，它们的形状和大小是非常规则。这种方法是非常灵活的;不同形状和尺寸可以容易地制造，并且适合于不同的模型系统。以下面的方式被选择的'eggcups'尺寸：尺寸其中发生分裂的细胞，测定二维表面：它们具有球形形状并且它们的直径取作的良好指示对于EC直径。例如细胞分裂过程中'eggcups'长和定向沿其长轴细胞。这个尺寸取决于系统 - 细胞和胚胎 - 所以此尺寸应在每种情况下进行评估。
图2示出所需要的材料（ 图2a）和步骤一步协议（ 图2b）关于如何使用“eggcups'（也参见在上述协议第2节）。欧共体与权益（或其他模型系统）细胞的充盈是非常简单和快速。通常情况下，它需要小于20-30分钟，其中还包括对细胞胰蛋白酶消化的时间。在填充后，样品可以用来研究活动进程（实时成像）或可以是固定的和染色intere的细胞器的可视化ST（也见第3和第4在上述的协议）。
在平坦的表面，细胞表现出异质反应和细胞器的极端表型。事实上，已经表明，肌动蛋白应力纤维（和其它细胞器）是在培养条件1工件。为了证明这一假设，我们培养既三维'eggcups'和上平坦表面和比较不同细胞器，即肌动蛋白应力纤维，高尔基体和核的表型NIH3T3细胞。 图3显示的细胞是如何组织的一个例子在这两种配置。在乳油，将细胞分布在示出一个均匀的球形样表型（ 图3a）的有序数组。上平坦的表面，细胞显示典型的无序，扩散和多相形态（ 图3b）。也有在骨架结构显著差异。特别是，细胞R上16; eggcups'显示相比平坦表面应力纤维的数量的减少。这是在三维进一步证实重建，其中没有明显的应力纤维是可见的（参见图3c - D）图像。这证实了一些蜂窝结构在2D培养物放大。这也与在体内 ，其中应力纤维不能被识别进行观察一致。
高尔基体还示出了在根据不同的培养条件它们的表型显著变化（参见图4）。二维文化高尔基体通常显示的扩展型'拥抱'原子核周围，而在“eggcups”它显示了一个更紧密的表型（ 见图4A - B）。为了模拟一个药物筛选操作，我们还评估药物对细胞上两种环境中培养的效果。我们选择成为内地II型肌球蛋白y方法，因为它破坏了肌动蛋白应力纤维和可能对高尔基形态（参见图3c - D）的效果。因为高尔基毗邻细胞核，这种药物也可能会对它的结构的效果。我们首先观察到，与此药物处理的细胞相比，野生型（WT）细胞（参见图3c - D）表现出较少定期和均一的形态。然后，我们比较和定量上'eggcups'和在平坦的表面（参见图4c）中观察到的高尔基表型。我们观察到，在二维表面细胞多呈扩展的表型而在“eggcups”细胞表现出较为致密的表型。我们并没有观察到，虽然WT和II型肌球蛋白处理的细胞之间的显着差异。
最后，在2D表面细胞核是随机取向，而对于在EC细胞是正交相取向于XY平面中都WT和II型肌球蛋白治疗的细胞（ 见图5A - C）。这突出该装置的定向细胞器，类似于用于定向在酵母和哺乳动物细胞10,12,13的cytokinetic环的观察平面的方法的前应用的强度。我们终于研究细胞核球形如何（定义为ψ= [π 三分之一 6V N 2/3] / A N，其中V n是细胞核的体积和正其表面积）受到影响取决于培养条件和在用II型肌球蛋白的细胞的治疗; 图5d示出ψ的相应分布。我们并没有观察到的野生平 VS WT EC的差异，这表明欧盟在不影响细胞的正常球形。然而，我们观察到比较WT 乳油时差Blebb EC表明欧共体被揭示在2D掩蔽药物的实际效果。
使用“eggcups'活细胞研究还允许这是不标准的文化可见新颖的活动进程的鉴定。我们铺板的细胞在EC和可视化的细胞分裂。 图6显示了cytokinetic环闭合的图像的细胞有丝分裂期间的序列。该'eggcups'装置允许该环的一个完整的可视化，而 标准的2D培养物只示出了对应于一个单一平面10两个区域。使用2D培养Z堆叠图像的序列的环的重建可以做到27，但重要的信息丢失。质量被减少由于低Z的分辨率和动态过程不能得到解决。肌动蛋白和肌球蛋白都在力产生细胞分裂的关键蛋白。它们的动态可知道BÈ成像和在2D培养（ 图6a）的研究，而用“eggcups'则立即显现出来。我们已经确定了新的结构和过程：在HeLa细胞中，我们发现肌球蛋白17的周期性积累。这些积累径向移动作为环正在关闭（ 图6b）。在裂殖酵母中我们也发现肌球蛋白和肌动蛋白的不均匀性（ 图6c，右）17。相反，我们在HeLa细胞中看到，他们关闭期间旋转环上。速度是在微米分钟-1的范围，就不会为z重建与标准显微镜解析。最后cytokinetic环可以通过染色的部件进一步被研究。我们发现，有磷酸的环中（ 图6d）的附近的积累。我们也可以显示anillin在环（ 图6E）colocalizing。通过染色的细胞在这个方向，WË表明anillin显示也是不均匀分布。
该'eggcups'也被应用到不同的模型系统：我们报道哺乳动物细胞，裂殖酵母，但我们也测试了芽殖酵母和C.线虫 （ 见图7A - E）。在这种情况下，该协议被改编为在培养基方面每个特定的系统，空腔大小和形态（ 见表1）。作为一个例子，锥形V形“eggcups'是用于有效地12固定裂殖酵母的最佳形态，代替完全圆柱形（或U形），用于哺乳动物细胞13的形状。这使得在生命科学研究领域的潜在应用测试不同的细胞骨架药物的疗效。这证明了开发方法的灵活性和可靠性。
此外，细胞的高度有序布置允许一个方便，自动读出单个细胞的荧光。我们通过将在'eggcups'（ 图8a）表达GFP NIH3T3细胞说明这一点。单元位置可以容易地识别和相应的表达水平进行测量。 图8b示出荧光信号的分布。这可以应用到任何读出（免疫荧光，荧光报道在细胞例如）。
图1：“eggcups”的制作 （ 一 ）复制成型“eggcups”的制作过程示意图说明：（1）倒在SU-8模具液体的PDMS和治愈它。 （二）剪下邮票从表面小心取出，然后等离子激活它silanize它。 （三）倒在硅烷化邮票的液体硅橡胶ð离心它以获得薄的PDMS层。 （四）固化的PDMS层之后，等离子体同时激活，与PDMS覆盖印模和玻璃盖玻片。 （五）血浆地结合运用柔和，均匀的压力。 （六）等离子体结合后，小心地取出邮票揭开“eggcups”表面。 （七）为简化在接下来的步骤中的处理，增加一个小的PDMS手柄件。通过用液体PDMS胶合它和（ⅷ）固化它，然后在烤箱结合的PDMS片盖玻片。 （ 二 ）25毫米盖玻片与PDMS'eggcups'和手柄的图像。 PDMS“eggcups”（ 三 ）扫描电子显微镜图像。 “eggcups'的中心之间的距离为30微米，其直径约25微米。（左）顶视图（右）”Eggcups'被切割成图像内的一部分。 请点击此处争夺 WA更大的版本这个数字。
图2：（ 一 ）所需EC填充单元。 （1）50毫升管; （2）的圆柱形片（俯视图和侧视图）; （3）细胞培养基; （4）'eggcups'; （5）尖锐的镊子。 （ 二 ）欧盟灌装过程示意图。 （ⅰ）一个圆筒形件首先被引入到50ml管中并填充有13个ml的细胞培养液中。接着，（ii）该'eggcups'被轻轻敷使用尖锐的镊子使用小的PDMS片操纵EC圆筒件的顶部。 （三）在适当的密度细胞吸取到欧盟的顶部。 （ⅳ）将细胞在离心'eggcups'引入的。 （五）最后，将样品轻轻地从管释放出来，这是准备使用。 M /文件/ ftp_upload / 51880 / 51880fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图3：三维'eggcups'和2D平坦表面细胞表型的比较。共聚焦显微镜（25X水客观，0.95的NA，徕卡）是（a）EC NIH3T3细胞形成的有序阵列，并示出一个均匀的球形表型，并在（B）标准的2D平面培养的图像，随机异构表型分布。细胞染色为肌动蛋白（绿色），高尔基（橙色）和细胞核（蓝色）。比例尺= 100微米。对WT和II型肌球蛋白处理细胞平坦的表面上EC和（d）细胞（ 三 ）三维重建。比例尺= 20微米。880 / 51880fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图4：NIH3T3 研究高尔基体的表型上（ 一 ）平板和（b）EC细胞高尔基型分类的原理图和样品图像。细胞被归类为压实，这取决于α-值扩展或分散。 （ 三 ）高尔基表型的量化。比例尺= 10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：
图6： 现场固定样品和使用“eggcups”两个系统cytokinetic环的详细研究 （ 一 ）采用标准的2D 体外培养的cytokinetic环的时序。只有两个动蛋白（Lifeact-mcherry，红色）和肌球蛋白亮点（GFP标记，绿色）都在HeLa细胞卵裂沟（比例尺= 10微米）可见。 （ 二 ）时间关闭在HeLa细胞中的cytokinetic环的有丝分裂过程中使用“eggcups'序列。的图像显示的肌动蛋白（红色）和肌球蛋白（绿色）。 “Eggcups”允许还是肌球蛋白积累的鉴定。一个例子是突出了一个箭头。 （比例尺= 5微米）。 （ 三 ）cytokinetic环也可以在裂殖酵母可视化。（左 ）细胞位于在一个平面上，所述CYTO动力学环是仅作为两个点可见于“eggcups'（右）的细胞：整个封闭件可以被捕获。肌动蛋白标记CHD-GFP（比例尺= 2微米）。时间分：秒。 （D - E）染色cytokinetic环的例子。表达HeLa细胞（ 四 ）肌动蛋白的GFP染色用于磷酸酪氨酸（PY），其也示出了在环（比例尺= 5微米）信号。表达GFP（ 五 ）HeLa细胞标记肌球蛋白和Lifeact-mcherry（肌动蛋白）的染色anillin。 Anillin显露在cytokinetic环和较少集中在皮质本地化。它显示共定位与肌动蛋白和肌球蛋白（比例尺= 5微米）。 请点击此处查看该图的放大版本。
80 / 51880fig7.jpg“/>
图7：在'eggcups'到其它细胞类型和模型系统中的应用 （ 一个 ）U2OS（人骨肉瘤）。插图示出了分裂细胞。 （比例尺= 20微米）。 （ 二 ）的NIH3T3细胞表达GFP。差异表达水平可以容易地读出（比例尺= 20微米）。 （ 三 ）SW480细胞（比例尺= 20微米）。 （ 四 ）芽殖酵母;他们的周期时间是不变的。 （比例尺= 10微米）。 （ 五 ）C.线虫蠕虫;（左）在一个平面上（右）在'eggcups'，胚胎是从否则隐藏透视看到。 （比例尺= 10微米）。时间分：秒请点击此处查看该图的放大版本。
图8： 在'eggcups'的阵列结构允许细胞群的自动分析 （ 一 ）的NIH3T3细胞在EC（比例尺= 20微米）。他们有GFP不同的表达水平。 （ 二 ）的单元位置的自动识别允许表达水平的个体分析。它总结了细胞群的GFP表达的柱状图。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 模型系统 | 类型 | 培养基 | 观察中 | “eggcups”直径（μ;米） | 评论/说明 |
| 哺乳动物细胞 | NIH3T3 | 10％BCS高糖DMEM | 10％BCS的L-15 | 20 | 其他的稳定细胞系，例如REF52或MDCK，以及原代细胞系，癌性细胞和/或干细胞还可以在“eggcups'插入。 |
| 海拉 | 10％FCS的高糖DMEM | 10％FCS的L-15的 | 25 | 可以从很多不同的来源。 | |
| U2OS | 10％FCS的高糖DMEM | 10％FCS的L-15的 | 20-25 | 可以从很多不同的来源。 | |
| SW480 | 10％FCS的高糖DMEM | 10％FCS的L-15的 | 17-20 | 可以从很多不同的来源。 | |
| 酵母 | 裂殖酵母 | 洋菜板（YE5S）和液体介质（YE5S和EMM5S） | 过滤消毒EMM介质（参见物料清单） | 五 | 表面不需要与粘合剂蛋白官能化。 |
| 芽殖酵母 | 琼脂平板（YPD）和液体介质（YEPD和SD） | SD存储介质 | 五 | 表面不需要与粘合剂蛋白官能化。 | |
| 胎 | 线虫 | NGM板 | 超纯水 | 25 | 备选地M9培养基可用于长期实验。这种腌液的配方可以在这里找到：http://cshprotocols.cshlp.org/content/2009/5/pdb.rec11798.full?text_only=true |
表 1： 针对不同的模型系统“eggcups'文化条件。上述相关的协议可以很容易地适应通过只更换描述培养条件和'eggcups'的大小。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
副本成形，为了制造“eggcups”使用。的制造过程中不需要清洁室;它是容易和简单，但也有一些实践可能是需要的。具体地，释放PDMS压模是为了生产高品质'eggcups'的一个大的面积中最关键的步骤。由于这个原因，特别小心在这一步骤才能作出。如果这一步失败反复，考虑到优化之前的硅烷化和等离子结合等离子清洗机的参数。硅烷化不足，会导致邮票的PDMS膜粘着强。如果发生此种情况，培养时间与硅烷化试剂可以增加。需要注意的是其它技术和材料可应用于制造的“eggcups'，它可以用一个大范围的配位体（纤连蛋白，明胶，胶原等 ）的官能化。特别是，在聚苯乙烯微腔可以很容易地通过硫化铜制成汤姆制热压印技术。这确保生物相容性和在标准培养皿得到的结果直接比较。同样地，特别护理和实践都需要以优化的填充比率。特别地，漂洗步骤是为了确保没有过量细胞的适当填充，在信号有助于噪声和背景的关键。如果细胞是从空腔容易地除去，可以考虑改变腔的大小或深度。
'Eggcups'提供3D状结构用一个简单的协议细胞和高含量筛选测定法。细胞器和未知活动进程使用标准培养测定可通过在个别的微腔（'eggcups'）插入的单细胞的方法很容易地可视化。取决于模型系统上，大小，形状和它们的尺寸可以很容易地适应。在这种方式哺乳动物细胞，裂殖酵母，出芽酵母和C.线虫 ç一个被操纵和研究，以及任何胚胎例如果蝇 ，小鼠或人类胚胎在体外受精 ，或干例如细胞。
在此设置中单细胞被捕获。这是相对于在体内遇到的上皮组织。然而，这种环境可以在我们的'eggcups'通过与钙黏着蛋白涂覆的侧壁以模仿采用更为灵活的弹性体的细胞 - 细胞接触再现。焦接触将纤连蛋白的沉积在孔的底部被提升。粘附分子的这些各分布应允许在再现体内遇到的蜂窝环境。通过这种方法的一个会接近生理条件。
在我们的测定培养基交换保证。在EC细胞由于缺乏培养基交换的执行短期和长期实验时不显示任何降解。还需要注意的是细胞的EC CAn为直至汇合培养虽然主要关心的是，当单个细胞或胚胎腔进行隔离。
细胞器或整个有机体的方向是透露出新的信息。我们发现在cytokinetic环肌动蛋白和肌球蛋白的不同动态。虽然在裂殖酵母和哺乳动物细胞的cytokinetic环由类似的关键部件，我们将展示这种设置，他们的具体动态是不同的17。这是支持的结果，在这两个系统的闭合机构是不同的。开发和研究这样一个假设，该单元的取向是不可缺少的。在将来的研究中，该装置也可以用来研究在细胞的细胞器组织相关的其他活动。
除此之外，该技术可以在发育生物学大用场。细长的胚胎可以很容易地导向，观察或以限定的方向进一步处理。可能是我们测定不会强加胚胎极性，但高填充比率将允许以提取所需的读出以可靠的方式。共有“eggcups”可能是高含量放映的好设备。
其它培养测定已经被提出。这些方法的范围从多个小区在多孔板2D尺寸，沉积在具有相同形状微图案化粘合剂图案单细胞。然而，它们都不是适合于克服对细胞的细胞器和动力过程1的观察上文详述的限制。
我们的系统今后的改进将使“eggcups”面向产业用途的适用性。作为一个例子，在制药公司药物筛选应用需要使用多孔板14,28的;实施“eggcups”到这样的平台将有可能提高的可靠性测试和结果。因此，高含量，筛选分析将通过使用机器人制药公司（和学术研究实验室）的常用automatized流程进行。这将确保可重复性和可靠性低变异性。基于三维细胞培养测定法的一些商业产品已经出现在市场上突出这种测定法的重要性。最后，这些装置打开个性化药物新观点：来自患者的细胞可以被放置在'eggcups'，和治疗鸡尾酒能在生理环境中进行测试;生物标记读出将使预期要给予患者29的最佳治疗。共细胞和胚胎的物理形状指导腔的结构，我们希望该设备，这种方法将被广泛流传于未来。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
我们承认L. Brino（IGBMC高内涵筛选设备，伊尔基希，法国）为我们提供了抗Giantin抗体，M. Labouesse实验室。为C.线虫 （IGBMC）和B塞拉芬实验室。对芽殖酵母（IGBMC），E帕卢赫和A.海曼荧光灯HeLa细胞（MPI-CBG，德累斯顿），J·莫斯利（达特茅斯医学院）和JQ吴（俄亥俄州立大学）的裂殖酵母细胞; A.饭店Hoel和F Evenou实验的帮助下，里克C.（IBMC，斯特拉斯堡，法国）的技术的帮助下，和JC JEANNOT（飞秒日，法国）在微细的帮助。这项工作是由来自法国国家科学研究中心，斯特拉斯堡大学，Conectus资金的支持，拉基金会倒拉RECHERCHE MEDICALE和斯特拉斯堡的CI-FRC。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ddH20 (ultrapure) | Millipore | - | Use always fresh water. |
| Parafilm (plastic film) | Bemis | PM-999 | Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness. |
| Photo-mask | Selba | - | http://www.selba.ch |
| Silicon wafer | Siltronix | - | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 photoresist | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| SU-8 developer | MicroChem | - | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA |
| Available from multiple companies. | |||
| Sigmacote (siliconizing reagent ) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR |
| harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Chlorotrimethylsilane (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition | |||
| Nitrile gloves | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Available from multiple companies. | |||
| Glass coverslips #0 | Knittel glass | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Very fragile. Manipulate gently. | |||
| Sharp straight tweezers | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Available from multiple companies. | |||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN |
| The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies. | |||
| Microscope glass slides | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Available from multiple companies. | |||
| DMEM high-glucose medium | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Bovine calf serum | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS 1x | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O | |||
| L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Medium for atmospheres without CO2 control | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Penicillin & Streptomycin | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM |
| Petri dish P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
| Petri dish P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Petri dish P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldehyde 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr®ion=FR |
| Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 |
| dissolve powder in 1.5 ml methanol | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 dilution in PBS 1x |
| rabbit polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 dilution in PBS 1x |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
| rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). | 1:500 dilution in PBS 1x | |
| Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 goat anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1,000 dilution in PBS 1x | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr®ion=FR |
| 1 mg/ml for 1 min | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| HeLa cells | - | - | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| NIH3T3 cells | ATCC | - | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| Fission yeast | - | - | For details on strains, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| C. elegans worms | - | - | For details, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| YES (Agar) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| YES (Media) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search |
| For preparation: follow the instructions as given on the box | |||
| EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence. |
| Supplements (for EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search |
| (Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering) | |||
| Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters | Millipore | - | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
References
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies. PLoS ONE. 7, e37548 (2012).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. , (2012).
- Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments. Lab Chip. 11, 805-812 (2010).
- Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies. Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).
- Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 12, 458-465 (2013).
- Legant, W. R., et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat Meth. 7, 969-971 (2010).
- Devices and methods for observing the cell division. Riveline, D., Buguin, A. , WO/2010/092116 (2010).
- Ochsner, M., et al. Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells. Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).
- Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . Riveline, D. , WO2013144302 (2012).
- Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. Riveline, D., Wollrab, V. , WO2013135809 (2012).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).
- Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. Methods in Molecular Biology. Hughes, M. P., Hoettges, K. F. 583, Humana Press. 81-107 (2010).
- Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).
- Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction. Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).
- Yao, X., et al. Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits. Integr Biol. 6, 388-398 (2014).
- Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. The promise of single-cell sequencing. Nat Meth. 11, 25-27 (2014).
- Allen, T. D., et al. Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM). Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).
- Robbins, E., Marcus, P. I. Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations. Science. 144, (1964).
- Whitfield, M. L., et al. Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3" end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).
- Straight, A. F., et al. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science. 299, 1743-1747 (2003).
- Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1). Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).
- Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development. Curr Biol. 20, 322-327 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. JoVE. , e4019 (2012).
- Saha, S., Pollard, T. D. Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast. Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).
- Prestwich, G. D. Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery. Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).
- Futamura, Y., et al. Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification. Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).
