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Bioengineering

एकल कक्षों और 3 डी कारावास में एकल भ्रूण आदेश: उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए एक नई डिवाइस

Published: September 18, 2016 doi: 10.3791/51880
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Laboratory of Cell Physics, Institut de Science et d'Ingénierie Supramoléculaires (ISIS), CNRS and Université de Strasbourg, 2Development and Stem Cells Program, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC), CNRS and Université de Strasbourg

Summary

हम एक डिवाइस और एक नई विधि कोशिकाओं और भ्रूण का अध्ययन करने के लिए रिपोर्ट। एकल कक्षों ठीक microcavity सरणियों में आदेश दिए हैं। उनके 3 डी कारावास 3 डी वातावरण शारीरिक स्थितियों में सामना करने की दिशा में एक कदम है और organelle उन्मुखीकरण अनुमति देता है। सेल आकार को नियंत्रित करके, इस स्थापना परिवर्तनशीलता मानक assays में सूचना को कम करता है।

Abstract

जैविक कोशिकाओं आमतौर पर फ्लैट (2 डी) सतहों मनाया जाता है। इस हालत शारीरिक नहीं है, और phenotypes और आकार अत्यधिक चर रहे हैं। ऐसे वातावरण में कोशिकाओं पर आधारित स्क्रीनिंग इसलिए गंभीर सीमाएं हैं: सेल organelles चरम phenotypes, सेल morphologies और आकार दिखा रहे हैं विषम और / या विशेष सेल अंगों को ठीक से कल्पना नहीं की जा सकती है। इसके अलावा, विवो में कोशिकाओं एक 3 डी वातावरण में स्थित हैं; इस स्थिति में, कोशिकाओं को मुख्य रूप से ऊतक के आसपास के बाह्य मैट्रिक्स के साथ उनकी बातचीत की वजह से अलग phenotypes दिखा। आदेश मानकीकरण और सेल आधारित assays के लिए एक physiologically प्रासंगिक 3 डी वातावरण में एकल कक्षों के क्रम में उत्पन्न करने में, हम यहाँ इन विट्रो 3 डी सेल संस्कृति के लिए microfabrication और एक डिवाइस के आवेदनों की रिपोर्ट। इस डिवाइस microcavities की एक 2 डी सरणी (आमतौर पर 10 5 गुहाओं / 2 सेमी), एकल कक्षों या भ्रूण के साथ भरा प्रत्येक के होते हैं। सेल posiमोर्चे, आकार, polarity और आंतरिक सेल संगठन एक 3 डी वास्तुकला दिखा तो सामान्यीकृत हो जाते हैं। हम पैटर्न के लिए microcavities की एक सरणी प्रतिकृति ढलाई के लिए इस्तेमाल किया, 'eggcups', एक पतली polydimethylsiloxane पर (PDMS) परत एक coverslip पर पालन। Cavities आसंजन की सुविधा के लिए fibronectin के साथ कवर किया गया। प्रकोष्ठों centrifugation द्वारा डाला गया। भरने प्रतिशत प्रत्येक प्रणाली में 80% तक की अनुमति के लिए अनुकूलित किया गया था। कोशिकाओं और भ्रूण व्यवहार्यता की पुष्टि की थी। हम इस तरह के नाभिक और Golgi उपकरण के रूप में सेलुलर अंगों, के दृश्य के लिए इस पद्धति लागू है, और इस तरह के सेल बँटवारा दौरान cytokinetic अंगूठी के बंद होने के रूप में सक्रिय प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए। इस डिवाइस cytokinetic अंगूठी बंद करने और Golgi और नाभिक संरेखण के लिए ठोस phenotypes के दौरान इस तरह समय-समय पर राशि और मायोसिन और actin के inhomogeneities के रूप में नई सुविधाओं, की पहचान करने की अनुमति दी। हम स्तनधारी कोशिकाओं, विखंडन खमीर, नवोदित खमीर, सी के लिए विधि की विशेषता एलिगेंस wप्रत्येक मामले में ith विशिष्ट अनुकूलन। अंत में, इस डिवाइस की विशेषताओं यह विशेष रूप से दवा स्क्रीनिंग assays और व्यक्तिगत दवा के लिए रोचक बना।

Introduction

इन विट्रो सेल आधारित assays में वर्तमान में दो आयामी (2 डी) कर रहे हैं। यह विन्यास स्तनधारी कोशिकाओं के लिए प्राकृतिक नहीं है और इसलिए physiologically प्रासंगिक 1 नहीं है; कोशिकाओं आकार, आकार और विषम phenotypes की विविधता दिखाने के लिए। जब इस तरह के विमान और सेलुलर अंगों के चरम phenotypes (तनाव फाइबर, विशेष रूप से) के भीतर एक अव्यवस्थित वितरण के रूप में स्क्रीनिंग के आवेदन करने के लिए आवेदन किया है, वे अतिरिक्त गंभीर सीमाएं प्रस्तुत करते हैं। यह दवा परीक्षण, जहां उच्च बजट हर साल खर्च कर रहे हैं के लिए नैदानिक ​​परीक्षण में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। जब दवा स्क्रीनिंग के प्रारंभिक दौर में कृत्रिम 2 डी संस्कृति हालत की वजह से पशु मॉडलों के लिए लागू इन दवाओं के अधिकांश हालांकि असफल। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, विशेष सेल अंगों को ठीक से, इस तरह के सेल बँटवारा दौरान cytokinetic actomyosin अंगूठी के रूप में कल्पना की जा सकता है, और आम तौर पर संरचनाओं कि अवलोकन के विमान को सीधा विमान में विकसित हो रहे हैं। कुछनई 2 डी assays के आदेश पर काबू पाने के लिए उपर्युक्त कमियां और cytoskeleton संगठन पर महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि 2,3 देखा गया है में प्रस्तावित किया गया है। हालांकि, इन assays अभी भी मौजूद एक गंभीर सीमा: कोशिकाओं क्या विवो, जहां कोशिकाओं एक 3 डी वास्तुकला उपस्थित में मनाया जाता है के विपरीत एक बहुत ही प्रसार phenotype दिखा। संस्कृति विधि के साथ जुड़े इन कलाकृतियों में इस तरह बढ़ाया तनाव फाइबर 1,4,5 के रूप में गैर-शारीरिक सुविधाओं को गति प्रदान कर सकते हैं।

तीन आयामी सेल संस्कृति assays के कई लाभ प्रदान करते हैं जब की तुलना में 2 डी वातावरण 6.7 करने के लिए। वे physiologically अधिक प्रासंगिक हैं, और परिणाम इसलिए सार्थक कर रहे हैं। एक उदाहरण के रूप में, हाइड्रोजेल में एम्बेडेड कोशिकाओं 3 डी संरचनाओं की तरह दिखा, लेकिन उनकी एक और morphologies 8,9 करने के लिए एक सेल से भिन्न होते हैं। हालांकि, उनके morphologies दूसरे के लिए एक सेल, जो स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों पेचीदा से भिन्न होते हैं। एक वैकल्पिक रणनीति एकल एम्बेड करने के लिए हैmicrofabricated गुहाओं 10,11 में कोशिकाओं। सेल की स्थिति, आकार, polarity और आंतरिक कोशिका संगठन तो सामान्यीकृत बन सकता है। कोशिकाओं के लिए 3 डी की तरह वास्तुकला प्रदान करने के अलावा, microcavities भी उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के अध्ययन 10,12-14 के लिए अनुमति देता है; एकल कक्षों प्रोटीन और सेलुलर अंगों में आदेश दिया जा सकता है और उनके evolutions समानांतर में मनाया जा सकता है। यह नियमितता कोशिकाओं की कम संख्या और बेहतर अस्थायी / स्थानिक संकल्प के साथ अच्छे आँकड़े प्रदान करता है। उपयोगी यौगिकों मज़बूती से पहचान करने के लिए आसान कर रहे हैं।

इस अध्ययन में, हम उच्च सामग्री स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों 10,12,13 के लिए निर्माण और एक नया 3 डी की तरह एकल कक्षों संस्कृति प्रणाली के आवेदन दिखा। डिवाइस elastomeric microcavities (10 5 गुहाओं / 2 सेमी), गढ़ा 'eggcups' (ईसी) की एक सरणी के होते हैं। आयाम और इस काम में चुनाव आयोग की कुल मात्रा अलग-अलग NIH3T3 और हेला कोशिकाओं की खासियत मात्रा करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैंकोशिका विभाजन के दौरान। बेलनाकार - - गुहाओं की आकृति विज्ञान सक्रिय प्रक्रियाओं के दृश्य के लिए ठीक से ओरिएंट सेल आकार के लिए चयन किया जाता है। प्रतिकृति मोल्डिंग एक पतली polydimethylsiloxane (PDMS) परत एक गिलास पर पालन पर चुनाव आयोग की एक सरणी के पैटर्न के लिए प्रयोग किया जाता है coverslip 15,16। प्रकोष्ठों चुनाव आयोग में centrifugation द्वारा पेश कर रहे हैं। हम यहाँ पर एक ही 2 डी कोशिकाओं के साथ तुलना में अवलोकन और 3 डी (ईसी) में सेलुलर अंगों (actin तनाव फाइबर, Golgi तंत्र और नाभिक) को सामान्य बनाने रिपोर्ट (फ्लैट) सतहों। हम भी इस तरह के सेल बँटवारा 17 के दौरान cytokinetic actomyosin अंगूठी के बंद होने के रूप में सक्रिय dynamical प्रक्रियाओं का अवलोकन रिपोर्ट। अंत में, हम इस तरह के नवोदित खमीर, विखंडन खमीर और सी के रूप में कठोर दीवारों, के साथ अन्य प्रणालियों पर इस पद्धति के परिणाम बताते हैं एलिगेंस भ्रूण जो मॉडल प्रणाली की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए हमारी कार्यप्रणाली की प्रयोज्यता की पुष्टि करता है।

हम अगले एक विस्तृत और व्यापक पी पेशआदेश में rotocol बनाना और 3 डी microfabrication के लिए 'eggcups' लागू करने के लिए। हमारा दृष्टिकोण सरल है और एक साफ कमरे की जरूरत नहीं है। हम आशा करते हैं कि इस नई पद्धति दवा स्क्रीनिंग assays और व्यक्तिगत दवा के लिए विशेष रूप से दिलचस्प होगा पेट्री डिश के प्रतिस्थापन में। अंत में, हमारे डिवाइस कोशिकाओं प्रतिक्रियाओं का वितरण कैंसर 18 में या बुनियादी अनुसंधान 19 में उदाहरण के लिए, बाहरी उत्तेजनाओं को अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा।

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Protocol

1. 'Eggcups' के Microfabrication

  1. मास्टर का निर्माण: microcavities ऐरे
    1. 200 डिग्री सेल्सियस के लिए एक 3 'सिलिकॉन वेफर गर्मी नमी के किसी भी उपस्थिति लुप्त हो जाना।
    2. स्पिन कोट SU-8 photoresist की एक पतली परत। वांछित मोटाई और photoresist प्रकार पर निर्भर करता राल और कताई गति की मात्रा समायोजित करें। यह मोटाई 'eggcups' (ईसी) की गहराई हुक्म चलाना होगा। 2800 rpm पर एक 30 माइक्रोन मोटी परत और SU-8 2025, स्पिन कोट के लिए।
    3. पूर्व सेंकना एक 30 माइक्रोन मोटी SU-8 2025 परत के लिए 1 मिनट (चरण 2 में 1) के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर वेफर। photoresist प्रकार और मोटाई के आधार पर वांछित समय अनुकूल है। जानकारी के लिए निर्माता पत्रक की जाँच करें।
    4. पूर्व सेंकना एक 30 माइक्रोन मोटी SU-8 2025 परत के लिए 3 मिनट (2 का चरण 2) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर वेफर। photoresist प्रकार और मोटाई के आधार पर वांछित समय अनुकूल है। जानकारी के लिए निर्माता पत्रक की जाँच करें।
    5. लोडयूवी जोखिम के लिए मुखौटा aligner पर वफ़र। इस पर photolithography मुखौटा रखें। मुखौटा व्यास में 20 माइक्रोन के परिपत्र सुविधाओं (डिस्क) के एक पैटर्न से पता चलता है। एक दूसरे के बीच एक सही संपर्क सुनिश्चित करें।
      नोट: विभिन्न निर्माताओं photolithography मास्क प्रदान करते हैं। स्थानिक संकल्प अंतिम लागत का निर्धारण करेगा। एसीटेट मास्क स्वीकार्य संकल्प (≈10 माइक्रोन) कम कीमत पर उपलब्ध कराते हैं। क्रोमियम मास्क बेहतर संकल्प प्रदान करते हैं लेकिन अधिक महंगे हैं। कोशिकाओं की मात्रा को (photolithography नकाब से) डिस्क के व्यास को अपनाना। मुखौटा पर डिस्क के आयाम डिवाइस में cavities के व्यास का निर्धारण करेगा। छोटे व्यास एक कम भरने को बढ़ावा मिलेगा; बहुत बड़ी व्यास कोशिकाओं सीमित नहीं होंगे। हेला और NIH3T3 कोशिकाओं के लिए, 20 माइक्रोन 25 माइक्रोन तक के व्यास का सुझाव दिया है।
    6. यूवी दीपक से पहले प्रदर्शनी की शक्ति की जाँच करें और तदनुसार जोखिम समय का अनुकूलन। 41.5 सेकंड (या अनुकूलित जोखिम समय) पर लिए चमकाना (तरंग दैर्ध्य = 365 एनएम)250 MJ / 2 सेमी।
      ध्यान दें: SU-8 2025 में एक नकारात्मक photoresist, जिसका अर्थ है कि यूवी से अवगत कराया क्षेत्रों ठीक हो जाएगा। इस मामले में, परिपत्र सुविधाओं काले और बाकी पारदर्शी थे। उलटी दिशा में सकारात्मक photoresist काम: गैर उजागर क्षेत्रों ठीक हो रहे हैं। photoresist तदनुसार का चयन, डिजाइन और फोटो मुखौटा पर निर्भर करता है।
      ध्यान दें: उचित सुरक्षा चश्मे के साथ पराबैंगनी प्रकाश से आंखों की रक्षा।
    7. धीरे photoresist परत से नकाब हटा।
    8. पोस्ट-सेंकना एक 30 माइक्रोन मोटी SU-8 2025 परत के लिए 1 मिनट (चरण 2 में 1) के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर वेफर। पोस्ट-सेंकना एक 30 माइक्रोन मोटी SU-8 2025 परत के लिए 3 मिनट (2 का चरण 2) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर वेफर। photoresist प्रकार और मोटाई के आधार पर वांछित समय अनुकूल है। जानकारी के लिए निर्माता पत्रक की जाँच करें। पोस्ट-पाक के बाद, लगभग 1 मिनट के लिए बेंच पर कमरे के तापमान को शांत वेफर।
    9. स्पिन coater में वेफर की जगह और SU-8 डेवलपर के कुछ मिमी ड्रॉप कवर करने के लिएपूरे वेफर क्षेत्र। 2 मिनट के लिए विकास करना और फिर स्पिन कोट 1000 rpm पर 30 सेकंड के लिए। प्रक्रिया तीन बार दोहराएँ।
    10. 2-propanol से कुल्ला अविकसित SU-8 का पूरी तरह हटाने के लिए सुनिश्चित करें। सफेद क्षेत्रों की सूरत अधूरा विकास का एक संकेत है। यदि हां, तो विकासशील कदम के लिए एक अतिरिक्त समय दोहराएँ।
    11. हार्ड-सेंकना 200 डिग्री सेल्सियस पर वेफर गढ़े microstructures की मजबूती सुनिश्चित करने के लिए। यह कदम वैकल्पिक है।
    12. एक 94 मिमी x 15 मिमी polystyrene पेट्री डिश के अंदर microstructures के साथ 3 'वेफर स्टोर।
      नोट: विशेष रूप से, silanization में, अगले कदम के लिए सतह के उपचार के लिए कोई जरूरत नहीं है।
  2. Polydimethylsiloxane (PDMS) प्रतिकृति का निर्माण: खंभे ऐरे
    1. अच्छी तरह से 1:10 के अनुपात में मिश्रण (डब्ल्यू / डब्ल्यू) पार linker और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब के अंदर 30 ग्राम की कुल के लिए पूर्व बहुलक।
      नोट: 1:10 (वी / वी) अनुपात का प्रयोग भी काम कर रहा है।
    2. करने के लिए 5 मिनट के लिए 1800 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्रहवाई बुलबुले को दूर।
    3. microstructures के शीर्ष पर धीरे PDMS गिरा।
      ध्यान दें: हवा के बुलबुले इस कदम के दौरान दिखाई देते हैं, नमूना 15-20 मिनट के लिए एक वैक्यूम पंप का उपयोग कर देगास।
    4. 4 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में नमूना रखें।
      नोट: पूर्व बहुलक अनुपात: इलाज समय एक साथ पार linker के साथ, उपयोगकर्ताओं के बीच होती है और। इस बार PDMS की कठोरता हुक्म चलाना होगा। यह अधिक से अधिक 2 घंटा के इलाज के लिए और एक निश्चित समय के इलाज के लिए छड़ी करने के लिए सिफारिश की है।
    5. एक छुरी का प्रयोग धीरे बारे में 1 सेमी 2 जो चारों ओर 10 5 microcavities या 'eggcups' भी शामिल है के हित (स्टांप) के क्षेत्र में कटौती करने के लिए।
      नोट: पहली कट PDMS और फिर, यह छील धीरे। एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ PDMS प्रतिकृति की गुणवत्ता की जाँच करें।
  3. प्रतिकृति मोल्डिंग द्वारा 'eggcups' का निर्माण। बाद में, 'eggcups' के निर्माण के लिए दो वैकल्पिक रणनीतियों वर्णित हैं। दोनों प्रोटोकॉल सिमी हैंLAR और समान परिणाम प्रदान:
    1. रणनीति 1
      1. 30 सेकंड के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार द्वारा गढ़े PDMS स्टाम्प सक्रिय करें। अस्थायी रूप से धूल के बयान को रोकने के लिए एक बंद पेट्री डिश में सक्रिय टिकटों स्टोर।
        नोट: यदि प्लाज्मा के लिए अन्य गैसों का उपयोग किया जाता प्रदर्शनी समय को समायोजित करें।
      2. जगह सक्रिय PDMS एक 15 मिलीलीटर ट्यूब की टोपी के बगल में उल्टा अप (संरचनाओं के साथ पक्ष) एक पेट्री डिश में टिकट। (TMCS) Trimethylchlorosilane के 200 μl के साथ टोपी भरें। पेट्री डिश बंद करो और 7 मिनट के लिए स्टाम्प silanize करते हैं।
        नोट: स्टाम्प और / या रंग (सफेद) में परिवर्तन पर कुछ अस्थायी विरूपण देखा जा सकता है। स्टाम्प कम समय में अपने मूल आकार ठीक हो जाएगी और संरचनाओं प्रभावित नहीं होगा।
        नोट: TMCS तीव्र साँस लेना और चमड़े का विषाक्तता पैदा करता है, और (प्रज्वलन फ्लैशबैक काफी दूरी पार करने में सक्षम होने पर हो) के साथ अत्यधिक ज्वलनशील है। नतीजतन, यह स्रोत से दूर एक धूआं अलमारी में इस्तेमाल किया जाना चाहिएप्रज्वलन के एस।
      3. संरचनाओं के साथ स्पिन coater पर PDMS स्टाम्प उल्टा ऊपर रखें। संरचनाओं के शीर्ष पर: एक छोटा सा तरल PDMS की (20 μl के आसपास) कुछ microliters की बूंद (पूर्व बहुलक 01:10 डब्ल्यू डब्ल्यू पार linker /) रखो। 30 सेकंड के लिए 1500 rpm पर स्पिन कोट संरचनाओं के शीर्ष पर PDMS की एक पतली परत जमा करने के लिए।
        ध्यान दें: स्टाम्प इसके केंद्र में एक छोटा सा छेद के साथ स्पिन coater चक जगह एक पेट्री डिश ढक्कन के शीर्ष पर स्टांप फिट नहीं है।
      4. जमा स्पिन में लिपटे PDMS परत का इलाज करने के लिए 4 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में स्टांप रखें।
      5. पतली PDMS परत के साथ एक गिलास coverslip # एक साथ, PDMS स्टाम्प उल्टा ऊपर रखकर सक्रिय करें व्यास में 25 0 मिमी, 30 सेकंड के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा क्लीनर का उपयोग कर। अगले कदम के लिए जल्दी से आगे बढ़ें।
        नोट: अन्य मोटाई, आकार के साथ coverslips, और आयाम के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, कुछ सेलुलर संरचनाओं का चयन किया coverslip मोटाई और उद्देश्य पर निर्भर करता है की कल्पना करने के लिए मुश्किल हो सकता हैबढ़ाई और / या एनए और / या काम की दूरी। उद्देश्य डाटा शीट की जाँच करें।
      6. संपर्क में गिलास coverslip के साथ डाक टिकट (पतली परत के साथ स्पिन में लिपटे पक्ष) रखें। धीरे सब चिमटी के साथ टिकट के सतह के आसपास प्रेस 'संबंध' बनाने के लिए। अंत में, लगभग 10 सेकंड के लिए टिकट के शीर्ष पर लगातार दबाव में रहते हैं।
      7. 30 मिनट धीरे 'छील' 'आजाद कराने' 'eggcups' के क्रम में coverslip के बाहर टिकट के बाद (चित्रा 1 देखें)। इथेनॉल और सूखे के साथ अच्छी तरह कुल्ला। PDMS 'eggcups' अच्छी तरह से कांच coverslip पर पालन नहीं कर रहे हैं (यानी वे 'unpeeling' कदम के दौरान अलग), प्लाज्मा क्लीनर की सेटिंग एडजस्ट करने पर विचार और कदम 1.3.1.5 पर पुनः आरंभ।
        नोट: यह कदम नाजुक है। आदेश में ध्यान दे coverslip और / या पतली PDMS परत की टुकड़ी का टूटना से बचने के लिए।
      8. 1 मिमी एक्स 1 के ठीक PDMS का एक छोटा सा टुकड़ा (संभाल) गोंदमिमी तरल PDMS की एक छोटी सी बूंद के साथ coverslip के किनारे पर एक्स मात्रा में 3 मिमी और पहले की तरह PDMS इलाज। इस नमूने के हेरफेर बाद में सुविधा होगी (चित्रा 1 देखें)। यह कदम वैकल्पिक है।
    2. रणनीति 2
      1. 30 सेकंड के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार द्वारा गढ़े PDMS टिकटों Hydrophilize। धूल के बयान को रोकने के लिए एक बंद पेट्री डिश में अस्थायी रूप से सक्रिय टिकटों स्टोर।
        नोट: यदि प्लाज्मा के लिए अन्य गैसों का उपयोग किया जाता प्रदर्शनी समय को समायोजित करें।
      2. 30 सेकंड के लिए 15 डब्ल्यू पर 25 मिमी व्यास कांच coverslips # 0 ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार Hydrophilize। अगले कदम के लिए जल्दी से आगे बढ़ें।
        नोट: अन्य मोटाई, आकार के साथ coverslips, और आयाम के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, सेलुलर संरचनाओं का चयन किया coverslip मोटाई और उद्देश्य विशेषताओं के आधार पर कल्पना करने के लिए मुश्किल हो जाएगा (ऊपर नोट देखें)।
      3. स्पिन कोट डब्ल्यू डब्ल्यू पार linker / PDMS (1:10 की एक छोटी सी बूंद: पूर्व पोलYmer) कांच coverslips पर कुछ microliters की। 1500 rpm पर स्पिन कोट 30 सेकंड के लिए लगभग 50 माइक्रोन के अंतिम मोटाई के लिए।
      4. एक छोटा सा तरल PDMS की एक छोटी सी बूंद के साथ coverslip के किनारे पर मात्रा में 1 मिमी x 1 मिमी x 3 मिमी के ठीक PDMS का टुकड़ा (संभाल) गोंद और पहले की तरह PDMS इलाज। इस नमूने के हेरफेर बाद में सुविधा होगी (चित्रा 1 देखें)। यह कदम वैकल्पिक है।
      5. अस्थायी रूप से संग्रहीत PDMS लेपित coverslips एक स्वच्छ एक पेट्री डिश के अंदर पोंछ पर धूल बयान से बचाने के लिए।
      6. प्रत्येक टिकट के शीर्ष पर silanizing अभिकर्मक की एक बूंद रखो और इसे 1-2 मिनट के लिए लुप्त हो जाना। फिर, उन्हें 2 एन के एक धारा के तहत सूखी।
        नोट: इस चरण में, टिकट के लिए एक अस्थायी विरूपण वाष्पीकरण के दौरान देखा जा सकता है। स्टाम्प microstructures के किसी भी स्थायी विरूपण के बिना एन 2 के साथ सूखने के बाद अपने मूल आकार ठीक हो जाएगी।
      7. के शीर्ष पर बहुत धीरे silanized स्टाम्प गिराPDMS स्पिन लेपित पेट्री डिश में संग्रहीत गिलास coverslip। सुनिश्चित करें कि दोनों पक्षों ने पूरी तरह से संपर्क के दौरान समानांतर कर रहे हैं। दबाने या PDMS लेपित coverslip पर इसे रखने के बाद स्टांप चलती से बचें।
      8. 1-2 घंटे के लिए शून्य में नमूनों के साथ पेट्री डिश की जगह हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए।
        नोट: सुनिश्चित करें कि नमूने पूरी तरह से मोहर विस्थापन से बचने के लिए क्षैतिज हैं। बचें भी संभावित वैक्यूम पंप की वजह से कंपन।
      9. 4 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में नमूने रखें।
      10. धीरे, 'eggcups' प्रकट करने के लिए स्टाम्प दूर छील। इथेनॉल और सूखे के साथ अच्छी तरह कुल्ला।
        नोट: इस बिंदु पर अभ्यास की जरूरत है। coverslip और / या पतली PDMS परत की टुकड़ी का टूटना से बचने में ध्यान दे।

2. 'Eggcups' में कोशिकाओं का परिचय

आदेश स्तनधारी कोशिकाओं के अंदर 'eggcups', PDMS सतह ne को पेश करने मेंएड्स बाह्य मैट्रिक्स के आसंजन प्रोटीन के साथ क्रियाशील किया जाना है। यह उदाहरण फ़ाइब्रोनेक्टिन लेकिन इस तरह के कोलेजन के रूप में ब्याज की अन्य प्रोटीन, का उपयोग करता है, इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. 30 सेकंड के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा क्लीनर में 'eggcups' Hydrophilize।
    नोट: मापदंडों का अनुकूलन अगर जरूरत है।
  2. गोजातीय स्रोतों से 20 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की पीबीएस 1x में एक समाधान -1 फ़ाइब्रोनेक्टिन तैयार करें।
  3. 5 मिनट के लिए यूवी के साथ 'eggcups' जीवाणुरहित। fibronectin समाधान की एक छोटी सी बूंद (20-50 μl के आसपास) जमा पूरे 'eggcups' क्षेत्र को कवर किया और आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। सूखने से नमूना सुरक्षित रखें।
  4. धीरे कुल्ला पीबीएस 1x के साथ 'eggcups'। 3 बार दोहराएँ।
    नोट: नमूना कई हफ्तों के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत या संग्रहीत का उपयोग करने के लिए तैयार है।
  5. ऊंचाई में 63 मिमी, बाहरी त्रिज्या के 26 मिमी और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में आंतरिक त्रिज्या आयाम 7 मिमी के एक बेलनाकार कस्टम बनाया प्लास्टिक के टुकड़े का परिचय (देखेंचित्रा 2) 20
    चेतावनी: उपयोग यूवी निष्फल आइटम या उन्हें पूर्व के उपयोग बाँझ।
    ध्यान दें: यह टुकड़ा आसानी से प्रयोगशाला में निर्मित किया जा सकता है। या किसी भी उपलब्ध मशीन की दुकान से।
  6. ट्यूब के अंदर सेल संस्कृति के माध्यम से 13 मिलीलीटर रखो (1 टेबल देखें)। मध्यम नमूना की पूरी विसर्जन सुनिश्चित करने के लिए बेलनाकार टुकड़ा ऊपर कम से कम 2 सेमी भरना चाहिए।
    नोट: इस तरह के खमीर या सी के रूप में अन्य मॉडल प्रणाली विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं का विवरण, और के लिए एलिगेंस भ्रूण, और उपयोग के लिए इसी मध्यम, धारा 5 और 1 टेबल को देखें। वर्णित प्रोटोकॉल हेला, NIH3T3 कोशिकाओं, और अन्य सेल लाइनों (1 टेबल देखें) के लिए अनुकूलित किया गया था।
  7. बहुत धीरे प्लास्टिक के टुकड़े के ऊपरी ओर करने के लिए ट्यूब और समानांतर अंदर 'eggcups' का परिचय। तेज चिमटी का प्रयोग नमूना PDMS संभाल का उपयोग कर पकड़। प्रेस धीरे यह जब तक coverslip प्लास्टिक के टुकड़े, संयुक्त राष्ट्र के ऊपरी ओर के शीर्ष पर झूठतिल यह पूरी तरह से डूब जाता है (चित्रा 2 देखें)।
    नोट: यह तेज और सीधे चिमटी का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। घुमावदार चिमटी के साथ, नमूना के हेरफेर के लिए मुश्किल है और टूटना कारण हो सकता है।
  8. संस्कृति कोशिकाओं को एक P60 पेट्री डिश में 80-100% संगम तक और उन्हें trypsinization द्वारा इकट्ठा।
    नोट: कोशिकाओं जंगली प्रकार, ट्रांसफ़ेक्ट या हित के किसी भी दवा से इलाज किया जा सकता है।
    ध्यान दें: सेल समुच्चय जो 'eggcups' में प्रवेश के लिए एकल कक्षों से बचना होगा के गठन से बचें। इस कदम, पिपेट ऊपर और नीचे अच्छी तरह से trypsinization के बाद अनुकूलन के लिए।
  9. 5 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। 'Eggcups' के शीर्ष पर कोशिकाओं के 200 μl पिपेट।
    नोट: 'के रूप में eggcups' के शीर्ष लेकिन शारीरिक संपर्क से बचने पर संभव के रूप में केंद्रित कोशिकाओं गिरा। यह टूटना और / या नमूना के नुकसान को रोकने जाएगा।
  10. 2 मिनट के लिए 1800 XG पर अपकेंद्रित्र।
    नोट: पहले centrifugation के बाद, एक mic में जाँच'Eggcups' के भरने प्रतिशत roscope।
  11. पिपेट 2 मिनट के लिए 1800 XG पर 'eggcups' और सेंट्रीफ्यूज के शीर्ष पर कोशिकाओं की फिर से 200 μl। आदेश भरने प्रतिशत का अनुकूलन करने में तीन बार की कुल के लिए दोहराएँ।
    नोट: पिछले centrifugation के बाद, एक माइक्रोस्कोप के साथ 'eggcups' के भरने प्रतिशत की जाँच करें। यदि आवश्यक हो, वांछित भरने प्रतिशत तक पहुँचने तक भरने + centrifugation कदम दोहराएँ।
  12. ट्यूब से नमूना PDMS संभाल पकड़े तेज चिमटी का उपयोग कर निकालें। 'परेशान' कोशिकाओं जो 'eggcups' में आयोजित की जाती हैं नहीं में सावधान रहने के लिए सुनिश्चित करें (देखें चित्र 2)।
  13. मध्यम के साथ एक पेट्री डिश में नमूना रखें। धीरे microstructure सरणी के प्रत्येक पक्ष (कुल 4 पक्षों) के बगल में ऊपर pipetting द्वारा और तीन बार नीचे कोशिकाओं जो 'eggcups' में नहीं हैं से अधिक दूर करने के लिए कुल्ला।
    ध्यान दें: Pipetting भी दृढ़ता से जारी कर सकते हैं'Eggcups' से बाहर कुछ कोशिकाओं।
  14. nonattached कोशिकाओं को हटाने के लिए ताजा माध्यम के साथ मध्यम बदलें।
    नोट: इस चरण में ब्याज की एक दवा जोड़ा जा सकता है।
  15. कोशिकाओं को ठीक करें या उन्हें समय चूक imaging.See 4.1 कदम के लिए तैयार करते हैं।

Cytokinetic अंगूठी बंद: 'Eggcups' में सक्रिय सेलुलर गतिशीलता के 3. अवलोकन

नोट: इस उदाहरण हेला कोशिकाओं जो मायोसिन और actin के लिए MYH10-GFP और Lifeact-mCherry साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं का उपयोग करता है, क्रमशः, कुंजी सक्रिय कक्ष बँटवारा दौरान cytokinetic अंगूठी बंद में शामिल अणुओं। डिवाइस व्यास में 25 माइक्रोन से microcavities के साथ तैयार है। अपने प्रेक्षण के लिए, एक epifluorescence उलटा माइक्रोस्कोप, इस्तेमाल किया गया था एक 60x तेल उद्देश्य (1.40 एनए, जिला उद्योग केंद्र, योजना ए पी ओ) और GFP (मायोसिन) और TxRed (actin) फिल्टर के साथ सुसज्जित है। वैकल्पिक रूप से एक ईमानदार confocal खुर्दबीन इस्तेमाल किया गया था, एक 25x या 63X HCX आईआर एपीओ एल पानी उद्देश्य (0.95 एनए) के साथ सुसज्जित। इस EXA के लिएmple, यह अत्यधिक डबल thymidine ब्लॉक, mitotic ब्लॉक या mitotic हिला बंद विधि 21-24 का उपयोग करके कोशिकाओं सिंक्रनाइज़ करने के लिए सिफारिश की है।
नोट: 'eggcups' के लिए इस्तेमाल किया PDMS की मोटाई दोनों उल्टे और ईमानदार तैनात सूक्ष्मदर्शी में उद्देश्यों की एक किस्म का उपयोग की अनुमति देता है।

  1. जगह एक खुर्दबीन धारक में 'eggcups' और 10% एफसीएस एल -15 अवलोकन के माध्यम से 1 मिलीलीटर के साथ भरें। वाष्पीकरण से बचने के लिए, धारक के शीर्ष पर एक गिलास ढक्कन जगह या medium.Select 60X तेल उद्देश्य के शीर्ष पर खनिज तेल की एक पतली परत लागू होते हैं।
    नोट: एल 15 मध्यम गैर सीओ 2 वायुमंडल के लिए पर्याप्त है। यह भी ध्यान रखें कि DMEM के कुछ यौगिकों ऑटो फ्लोरोसेंट हैं। इस माध्यम का उपयोग करते हैं, यह 1-2 घंटे के लिए एक उच्च तीव्रता दीपक के साथ यह रोशन द्वारा फ्लोरोसेंट यौगिकों photobleach करने के लिए सिफारिश की है।
    नोट: जब डीआईसी इमेजिंग के साथ काम कर प्लास्टिक पलकों के प्रयोग से बचें।
  2. 'Eggcups' और obser साथ धारक की जगहमाइक्रोस्कोप में छुपा माध्यम। 'Eggcups' जब तक brightfield प्रकाश का उपयोग सावधानी से ध्यान दें, और कोशिकाओं अवलोकन के एक ही विमान में हैं।
  3. सॉफ्टवेयर खोलें और मापदंडों को समायोजित। फिल्टर TxRed और GFP actin और मायोसिन के लिए चयन करें; प्रत्येक चैनल के लिए प्रदर्शनी समय को समायोजित। एक ठेठ अधिग्रहण दर दोनों चैनलों के लिए 5 सेकंड है।
    ध्यान दें: प्रदर्शनी बार इस्तेमाल किया सेटअप, डाई या हित के अन्य सेलुलर अंगों के आधार पर समायोजित किया जा सकता है।
  4. ब्याज की क्षेत्र का चयन करें और एक cytokinetic अंगूठी या तो GFP या TxRed चैनल का उपयोग के लिए चाहते हैं। सही ध्यान दें।
    नोट: अंगूठी मायोसिन में तेज और पहचान करने के लिए आसान है।
  5. दोनों चैनलों में स्वत: अधिग्रहण चलाने के लिए जब तक अंगूठी पूरी तरह से बंद कर दिया है।
    नोट: कुछ photobleaching देखा जा सकता है। ताकि इसे कम करने के लिए माइक्रोस्कोप मापदंडों को समायोजित करें।

'Eggcups' में तय सेलुलर organelles 4. अवलोकन

इस कदम से पहले या # 3 कदम के बाद किया जा सकता है। कोशिकाओं को सीधे centrifugation कदम के बाद तय किया है और ब्याज की organelle के लिए या माइक्रोस्कोप में अवलोकन के बाद सना हुआ जा सकता है। यह उदाहरण 'eggcups' में NIH3T3 fibroblasts पर Golgi उपकरण, नाभिक और actin फाइबर की धुंधला से पता चलता।

  1. 'Eggcups' में कोशिकाओं का निर्धारण
    1. 3% paraformaldehyde (पीएफए) और गर्म 37 डिग्री सेल्सियस तैयार करें। 50 मिलीलीटर ट्यूब (या माइक्रोस्कोप धारक) से 'eggcups' नमूना निकालें और एक P35 पेट्री डिश के अंदर जगह है। पीबीएस 1x के साथ एक बार कुल्ला।
      नोट: 3% paraformaldehyde की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल कहीं और व्यापक रूप से उपलब्ध हैं।
      चेतावनी: पीएफए ​​की तैयारी के दौरान Nitrile दस्ताने और आंखों की सुरक्षा का प्रयोग करें।
    2. पूरी तरह से पीबीएस निकालें और 3% पीएफए ​​के 1 मिलीलीटर छोड़ देता है और 17 मिनट के लिए सेते हैं। पीएफए ​​निकालें और पीबीएस 1X के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार कुल्ला। 0.5% Trit के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर Permeabilize कोशिकाओं3 मिनट के लिए पर और 5 मिनट के लिए पीबीएस 1x के साथ दो बार धो लें।
  2. 'Eggcups' में कोशिकाओं का धुंधला
    1. पीबीएस में 500 कमजोर पड़ने: एक 1 में प्राथमिक एंटीबॉडी खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी Giantin साथ Golgi तंत्र धुंधला के लिए कोशिकाओं को सेते हैं। एंटीबॉडी समाधान की 100 μl बूंद एक प्लास्टिक की फिल्म शीट पर रखें और ऊपर 45 मिनट के लिए नीचे 'eggcups' अंदर की कोशिकाओं को सेते हैं।
      ध्यान दें: एक कवर सुखाने को रोकने के साथ नमूना सुरक्षित रखें।
    2. ध्यान से 'Eggcups' जारी है और उन्हें एक P35 पेट्री डिश में रखें। 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक, पीबीएस 1x से कुल्ला।
    3. और Phalloidin एलेक्सा स्त्राव 488 (1: 200) actin तनाव फाइबर धुंधला करने के लिए: माध्यमिक एंटीबॉडी Cy3 बकरी विरोधी खरगोश (1000 1) के साथ पीबीएस में एक कॉकटेल तैयार करें।
    4. एक प्लास्टिक की फिल्म शीट पर एंटीबॉडी समाधान की 100 μl गिरावट के साथ कोशिकाओं को सेते हैं और उल्टा 45 मिनट के लिए नीचे 'eggcups' अंदर की कोशिकाओं को सेते हैं।
    5. रिलीज ध्यान 'eggcअप 'और उन्हें एक P35 पेट्री डिश में रखें। 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक, पीबीएस 1x से कुल्ला।
    6. एक प्लास्टिक की फिल्म शीट पर 1 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1 पीबीएस में DAPI की 100 μl बूंद रखकर नाभिक धुंधला के लिए कोशिकाओं को सेते हैं और उल्टा 45 मिनट के लिए नीचे 'eggcups' अंदर की कोशिकाओं को सेते हैं। यह कदम कदम 4.2.3 के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है।
    7. ध्यान से 'eggcups' जारी है और उन्हें एक P35 पेट्री डिश में रखें। 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक, पीबीएस 1x से कुल्ला।
    8. नेल पॉलिश के साथ: (1 वी / वी 1) एक मानक माइक्रोस्कोप गिलास स्लाइड पर और नमूना सील सुखाने से बचने के लिए पीबीएस: एक 15 μl ग्लिसरॉल का उपयोग कर माउंट कोशिकाओं।
      नोट: 'eggcups' मोटाई पर निर्भर करता है, बढ़ते मुश्किल हो सकता है। यह पीबीएस में एक P35 पेट्री डिश, सुखाने से संरक्षित में तो नमूना स्टोर करने के लिए सिफारिश की है।
  3. माइक्रोस्कोप अवलोकन
    नोट: इस उदाहरण के लिए एक ईमानदार confocal खुर्दबीन, प्रयोग किया जाता है पीएमटी और हाइब्रिड डिटेक्टरों से लैस। एक 25x या 63 एक्स HCX आईआर एपीओ एल पानी उद्देश्य (0.95 एनए) नमूने के एक व्यापक क्षेत्र प्रदान करते हैं और उच्च सामग्री स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए उपकरण की प्रयोज्यता दिखाने के लिए चयनित किया गया था।
    1. 25X या 63X पानी उद्देश्य का चयन करें।
      नोट: विभिन्न उद्देश्यों आवेदन और संकेत के आधार पर किया जा सकता है। लेकिन उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्यों के उपयोग की सिफारिश की है।
    2. 'Eggcups' के साथ तय नमूना प्लेस और ध्यान 'eggcups' और कोशिकाओं तक brightfield प्रकाश (चरण विपरीत या डीआईसी) का उपयोग अवलोकन के विमान में हैं ध्यान केंद्रित।
    3. सॉफ्टवेयर खोलें और मापदंडों को समायोजित। फिल्टर GFP, Cy3 और DAPI actin के लिए, Golgi और नाभिक अवलोकन, क्रमशः का चयन करें; सभी चैनलों के लिए प्रदर्शनी समय को समायोजित।
      ध्यान दें: प्रदर्शनी समय सेटअप के आधार पर समायोजित किया जा सकता है।
    4. का चयन करें और ब्याज के क्षेत्र ध्यान केंद्रित; छवि पर कब्जा (चित्रा 3 देखें) शुरू करते हैं।
TLE "> 5। खमीर कोशिकाओं के अवलोकन के लिए अनुकूलन और सी एलिगेंस भ्रूण

  1. विखंडन और नवोदित खमीर कोशिकाओं
    नोट: इस उदाहरण के विखंडन खमीर कोशिकाओं जो मायोसिन और actin के लिए क्रमश: RLC1-mCherry और सीएचडी-GFP के साथ टैग कर रहे हैं का उपयोग करता है। नवोदित खमीर कोशिकाओं fluorescently यहाँ लेबल नहीं हैं। विखंडन खमीर अवलोकन के लिए एक औंधा कताई डिस्क confocal खुर्दबीन इस्तेमाल किया गया था। एक 100x HCX पी एल एपीओ सीएस तेल उद्देश्य (1.4 एनए) सभी अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया गया था। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को भी एक औंधा चरण विपरीत एक 20X चरण विपरीत हवा उद्देश्य LCPlanFl (0.4 एनए) के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर मनाया गया। इस उदाहरण में, प्रोटोकॉल दोनों प्रकार की कोशिकाओं के लिए समान है।
    1. जैसा कि ऊपर वर्णित 'eggcups' सतह तैयार करें। विखंडन और नवोदित खमीर कोशिकाओं के लिए, व्यास में 5 माइक्रोन की गुहाओं तैयार (1 टेबल देखें)। इस मामले में, सतह आसंजन प्रोटीन के साथ क्रियाशील करने की आवश्यकता नहीं है।
      नोट: भरने CAn शंक्वाकार 'eggcups' का उपयोग करके अनुकूलित किया। इस आकार कब्जा है और कोशिकाओं centrifugation के बाद rinsing चरण के दौरान जारी करने से परहेज बरकरार रखती है। भरने प्रतिशत के बारे में 80% से कम इष्टतम है। ये शंक्वाकार 'eggcups' दीप प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी 13 के माध्यम से गढ़े जा सकता है।
    2. उचित संस्कृति मीडिया में संस्कृति खमीर कोशिकाओं 0.2 और 0.8 की रेंज में एक ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) तक पहुँचने तक (1 टेबल देखें)। खमीर कोशिकाओं की संस्कृति के समुच्चय को दूर करने के Sonicate।
    3. centrifugation द्वारा 'eggcups' में खमीर कोशिकाओं डालें। centrifugation के लिए, उचित आयुध डिपो में संवर्धित कोशिकाओं के 4 मिलीलीटर 'eggcups' के साथ ट्यूब पर जोड़ा जाता है। पहले centrifugation के बाद, धीरे, ट्यूब हिला कोशिकाओं जो 'eggcups' में नहीं हैं फिर से निलंबित करने के लिए है, जबकि 'eggcups' में कोशिकाओं को परेशान नहीं हैं। ट्यूब, सेंट्रीफ्यूज फिर से खोलने और इस कदम को दो बार दोहराने के बिना। इस बयान सुनिश्चित करता हैखाली microcavities में संस्कृति से कोशिकाओं की और भरने प्रतिशत में वृद्धि होगी।
      नोट: जब खमीर के साथ काम कर रहा है, यह प्रयोगों के दौरान काम कर रहे तापमान को सेंट्रीफ्यूज पूर्व गर्म करने के लिए सिफारिश की है
      नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रुका हुआ जा सकता है और बाद में 12 घंटा तक जारी। इस मामले में, काम कर रहे तापमान पर नमूना दुकान और इसे कवर वाष्पीकरण को रोकने के लिए।
    4. 'Eggcups' एक खुर्दबीन धारक में रखें और इमेजिंग के लिए फिल्टर निष्फल माध्यम के साथ धारक भरें। अब एक ही मीडिया के साथ कोशिकाओं कुल्ला जब तक चल खमीर कोशिकाओं कुशलता से हटा रहे हैं। देखभाल rinsing प्रक्रिया के दौरान 'eggcups' में कोशिकाओं को परेशान करने के लिए नहीं ले लो।
    5. 100X तेल उद्देश्य का चयन करें और सावधानी से ध्यान केंद्रित। सॉफ्टवेयर खोलें और मापदंडों को समायोजित। विखंडन खमीर के लिए, फिल्टर GFP और TxRed actin और मायोसिन के लिए चयन और दोनों चैनलों के लिए प्रदर्शनी समय को समायोजित। एक ठेठ अधिग्रहण की दर 3 सेकंड है।
      नोट: पर निर्भर करता हैfluorophore, टैगिंग के प्रकार और सेट-अप, जोखिम समय अन्य प्रणालियों के लिए भिन्न होता है।
  2. सी एलिगेंस भ्रूण
    नोट: इस उदाहरण सी का उपयोग करता है एलिगेंस भ्रूण 25-30 माइक्रोन चौड़ा और 50-55 माइक्रोन लंबा है। के रूप में 25 में संकेत भ्रूण सुसंस्कृत थे। कैसे सी में हेरफेर करने का एक सरल दृश्य प्रोटोकॉल एलिगेंस 26 में पाया जा सकता है। अवलोकन एक औंधा चरण विपरीत एक 40x हवा उद्देश्य 0.55 एनए के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था।
    1. जैसा कि ऊपर वर्णित है और व्यास में 25 माइक्रोन 'eggcups' सतह तैयार (1 टेबल देखें)। इस मामले में, सतह आसंजन प्रोटीन के साथ क्रियाशील करने की आवश्यकता नहीं है।
    2. संस्कृति सी उचित संस्कृति मीडिया में एलिगेंस भ्रूण (1 टेबल देखें)।
    3. जैसा कि ऊपर वर्णित centrifugation द्वारा 'eggcups' में भ्रूण डालें (2.12 करने के लिए खंड 2.6 देखें) संस्कृति के माध्यम के रूप में ultrapure पानी का उपयोग कर।
      नोट: भ्रूण थे प्रयोग की अवधि के लिए ultrapure पानी में सामान्य रूप से 'व्यवहार कर रही'। वैकल्पिक रूप से लंबी अवधि के प्रयोगों के लिए एक शारीरिक M9 बफर का उपयोग करें।
    4. नमूने के रूप में ऊपर (खंड 2.14 देखें) वर्णित कुल्ला। 'Eggcups' एक खुर्दबीन धारक में रखें। 40X हवा उद्देश्य का चयन करें और सावधानी से ध्यान केंद्रित। सॉफ्टवेयर खोलें और मापदंडों को समायोजित। 3 सेकंड के एक अधिग्रहण दर का चयन करें।

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Representative Results

'Eggcups' (ईसी) एक उपन्यास उच्च सामग्री स्क्रीनिंग पद्धति है जो एक 3 डी वातावरण में उन्मुख कोशिकाओं और भ्रूण के दृश्य की अनुमति देता है। साथ ही, कुछ सेलुलर प्रक्रियाओं, जो मानक 2 डी (फ्लैट) संस्कृतियों में निरीक्षण करने के लिए मुश्किल हो जाता है, इस नई विधि द्वारा मनाया जा सकता है। चित्रा 1 ए चुनाव आयोग microfabrication के लिए प्रक्रिया का एक सारांश पता चलता है (धारा 1 ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल में यह भी देखना )। विधि सरल, तेज, कुशल और विशेष उपकरणों के किसी भी आवश्यकता के बिना है। 1B चित्रा और 1 सी एक बड़े पैमाने पर चित्र और एक बढ़ाया 'eggcups' की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवि क्रमश: चलता। यह देखा जा सकता है, उनके आकार और आकार बहुत ही नियमित कर रहे हैं। यह विधि बहुत लचीला है; अलग आकृति और आकार में आसानी से गढ़े और अलग अलग मॉडल प्रणाली के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। 'eggcups' के आयामों को निम्नलिखित तरीके से चयन किया गया था: आयामकोशिकाओं जो विभाजन से गुजरना के 2 डी सतहों पर मापा गया: वे एक गोलाकार आकार दिया है और उनके व्यास चुनाव आयोग व्यास के लिए एक अच्छा संकेत के रूप में लिया गया था। उदाहरण के लिए कोशिका विभाजन के दौरान'eggcups' बढ़ाना और ओरिएंट उनके लंबे अक्ष के साथ में कोशिकाओं। इस आयाम सिस्टम पर निर्भर करता है - कोशिकाओं और भ्रूण - तो इस आयाम प्रत्येक मामले में मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

चित्रा 2 सामग्री की जरूरत है (चित्रा 2) और एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल (चित्रा 2 बी) कैसे 'eggcups' का उपयोग करने के बारे में पता चलता है (यह भी ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल में धारा 2 देखें)। ब्याज (या अन्य मॉडल प्रणाली) की कोशिकाओं के साथ चुनाव आयोग के भरने के लिए बहुत ही सरल और तेज है। आमतौर पर, यह कम से कम 20-30 मिनट, जो भी सेल trypsinization के लिए समय भी शामिल है लेता है। भरने के बाद, नमूने सक्रिय प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए (लाइव इमेजिंग) का इस्तेमाल किया जा सकता है या तय की और हितों के अंगों के दृश्य के लिए कलंकित किया जा सकताअनुसूचित जनजाति (भी प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित में अनुभाग देखें 3 और 4)।

फ्लैट सतहों पर, कोशिकाओं विषम प्रतिक्रियाओं और सेलुलर अंगों के चरम phenotypes दिखा। वास्तव में, यह सुझाव दिया गया है कि actin तनाव फाइबर (और अन्य सेलुलर organelles) संस्कृति की स्थिति 1 की कलाकृतियों हैं। आदेश में इस परिकल्पना को साबित करने में, हम दोनों 3 डी 'eggcups' पर और फ्लैट सतहों पर और विभिन्न सेलुलर organelles, अर्थात् actin तनाव फाइबर, Golgi तंत्र और नाभिक के phenotypes तुलना NIH3T3 कोशिकाओं सुसंस्कृत। चित्रा 3 कैसे कोशिकाओं को संगठित कर रहे हैं का एक उदाहरण से पता चलता है दोनों विन्यास पर। चुनाव आयोग में, कोशिकाओं एक सजातीय गोलाकार तरह phenotype (चित्रा 3 ए) दिखा एक आदेश सरणी में वितरित कर रहे हैं। फ्लैट सतहों पर, कोशिकाओं ठेठ अव्यवस्थित, प्रसार और विषम आकृति विज्ञान दिखाने (चित्रा 3 बी)। वहाँ भी cytoskeleton ढांचे में महत्वपूर्ण मतभेद हैं। विशेष रूप से, आर पर कोशिकाओं में16; eggcups 'तनाव फाइबर फ्लैट सतहों की तुलना की संख्या में कमी दिखाते हैं। यह आगे 3 डी में पुष्टि की है छवियों, जहां कोई स्पष्ट तनाव फाइबर दिखाई दे रहे हैं (चित्रा -3 सी देख - घ) खंगाला। इस बात की पुष्टि करता है कि कुछ सेलुलर संरचनाओं 2 डी संस्कृतियों में बढ़ाया जाता है। इस विवो जहां तनाव फाइबर की पहचान नहीं की जा सकती में प्रदर्शन टिप्पणियों के साथ समझौते में भी है।

Golgi तंत्र को भी अपने phenotype संस्कृति हालत पर निर्भर करता है में महत्वपूर्ण बदलाव से पता चलता (चित्रा 4 देखें)। (चित्रा 4 ए देख - ख) 2 डी संस्कृतियों पर Golgi उपकरण आम तौर पर यह एक और अधिक ठोस फेनोटाइप से पता चलता है एक विस्तारित phenotype 'को गले लगाते' 'eggcups' में जबकि नाभिक परिधि से पता चलता है। आदेश में एक दवा स्क्रीनिंग में गड़बड़ी अनुकरण करने के लिए, हम भी कोशिकाओं पर दवाओं का असर दोनों के वातावरण पर संवर्धित मूल्यांकन किया है। हम Blebbistatin mainl में चयनितY क्योंकि यह actin तनाव फाइबर बाधित और Golgi आकृति विज्ञान (चित्रा -3 सी देख - घ) पर असर पड़ सकता है। चूंकि Golgi सेल नाभिक के बगल में स्थित है, इस दवा भी अपनी वास्तुकला पर असर पड़ सकता है। हम पहली बार देखा है कि इस दवा के साथ इलाज किया कोशिकाओं जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) कोशिकाओं (चित्रा -3 सी देख - डी) की तुलना में एक कम नियमित रूप से और वर्दी आकृति विज्ञान दिखाया। हम तो तुलना और Golgi phenotype 'eggcups' पर और फ्लैट सतहों (चित्रा 4C देखें) पर मनाया मात्रा। हमने देखा है कि 2 डी सतहों पर कोशिकाओं ज्यादातर एक विस्तारित फेनोटाइप से पता चला है, जबकि पर 'eggcups' कोशिकाओं को एक और अधिक ठोस phenotype दिखाया। हम हालांकि गुम्मट और Blebbistatin इलाज कोशिकाओं के बीच एक स्पष्ट अंतर का पालन नहीं किया।

अंत में, 2 डी सेल नाभिक सतहों पर बेतरतीब ढंग से उन्मुख है, जबकि चुनाव आयोग में कोशिकाओं के लिए यह orthogonally सम्मान के साथ XY विमान को दोनों में उन्मुख हैWT और Blebbistatin इलाज किया कोशिकाओं (चित्रा 5 ए देख - ग)। इस ओरिएंट सेलुलर organelles, खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं 10,12,13 में cytokinetic अंगूठी के अवलोकन के विमान orienting के लिए विधि के एक पूर्व आवेदन करने के लिए इसी तरह की डिवाइस की शक्ति पर प्रकाश डाला गया। हम अंत में अध्ययन कैसे नाभिक गोलाई (के रूप में परिभाषित किया ψ = [π 1/3 6V 2 n / 3] / ए एन, जहां वी एन नाभिक की मात्रा है और एक n इसकी सतह क्षेत्र) प्रभावित था संवर्धन हालत पर निर्भर करता है और Blebbistatin के साथ कोशिकाओं के इलाज पर। चित्रा 5D ψ की समान वितरण से पता चलता है। हम गुम्मट के लिए एक अंतर बनाम गुम्मट चुनाव आयोग फ्लैट है, जो पता चलता है कि चुनाव आयोग कोशिकाओं के सामान्य गोलाई प्रभावित नहीं कर रहे पालन नहीं किया था। हालांकि, हम एक मनायाफर्क पड़ता है जब गुम्मट चुनाव आयोग की तुलना चुनाव आयोग का सुझाव है कि चुनाव आयोग दवा है कि 2 डी में छिपा हुआ है की एक वास्तविक प्रभाव खुलासा कर रहे हैं Blebb करने के लिए।

लाइव सेल 'eggcups' का उपयोग अध्ययनों से यह भी उपन्यास सक्रिय प्रक्रियाओं जो मानक संस्कृतियों में दिखाई नहीं हैं की पहचान की अनुमति। हम चुनाव आयोग में कोशिकाओं को चढ़ाया और कल्पना की कोशिका विभाजन। चित्रा 6 सेल बँटवारा दौरान cytokinetic रिंग बंद होने के चित्रों के एक दृश्य से पता चलता है। जबकि मानक 2 डी संस्कृतियों केवल दो क्षेत्रों में जो एक ही विमान में 10 से मेल खाती है पता चलता है 'eggcups' डिवाइस, अंगूठी का एक पूरा दृश्य की अनुमति देता। 2 डी संस्कृतियों का उपयोग Z ढेर छवियों के एक दृश्य से अंगूठी के पुनर्निर्माण 27 किया जा सकता है, लेकिन महत्वपूर्ण जानकारी खो दिया है। गुणवत्ता कम से कम Z संकल्प और गतिशील प्रक्रियाओं के कारण नहीं सुलझाया जा सकता है। Actin और मायोसिन कोशिका विभाजन के बल पीढ़ी में महत्वपूर्ण प्रोटीन होते हैं। उनकी गतिशीलता ख नहीं कर सकतेई imaged और 2 डी संस्कृति (चित्रा 6A) में अध्ययन किया, 'eggcups' के साथ, जबकि इसे तुरंत पता चला है। हेला कोशिकाओं में हम मायोसिन 17 वर्ष की समय-समय पर राशि पाते हैं: हम उपन्यास ढांचे और प्रक्रियाओं की पहचान की है। के रूप में अंगूठी (चित्रा 6B) बंद हो रहा है ये राशि त्रिज्यात चलते हैं। विखंडन खमीर में हम भी (चित्रा 6C दाएं) मायोसिन और actin में inhomogeneities लगाने के 17। क्या हम हेला कोशिकाओं में देखने के लिए इसके विपरीत, वे बंद होने के दौरान रिंग पर बारी बारी से। गति मिनट -1 माइक्रोन की रेंज में है और मानक माइक्रोस्कोप के साथ जेड पुनर्निर्माण द्वारा ढूढने नहीं होगा। अंत में cytokinetic अंगूठी आगे उसके घटकों के लिए धुंधला द्वारा अध्ययन किया जा सकता है। हम अंगूठी (चित्रा 6D) के आसपास के क्षेत्र में phosphotyrosine का एक संग्रह है कि वहाँ पाते हैं। हम यह भी दिखा सकते हैं कि anillin अंगूठी (चित्रा 6e) में colocalizing है। इस उन्मुखीकरण में कोशिकाओं को धुंधला हो जाना, इनके द्वाराई है कि anillin एक inhomogeneous वितरण प्रकट भी पता चलता है।

'Eggcups' भी अलग अलग मॉडल प्रणाली को लागू किया गया: हम स्तनधारी कोशिकाओं, विखंडन खमीर की सूचना दी, लेकिन हम भी नवोदित खमीर और सी का परीक्षण किया एलिगेंस (- ई चित्रा 7A देखें)। इस मामले में, प्रोटोकॉल संस्कृति मीडिया के मामले में एक विशेष प्रणाली के लिए अनुकूलित किया गया था, गुहाओं आकार और आकृति विज्ञान (1 टेबल देखें)। एक उदाहरण के रूप में, शंक्वाकार वी के आकार का 'eggcups' के बजाय पूरी तरह से बेलनाकार (या यू के आकार का) स्तनधारी कोशिकाओं 13 के लिए इस्तेमाल किया आकार के, कुशलता से 12 विखंडन खमीर immobilizing के लिए इष्टतम आकृति विज्ञान थे। यह जीवन विज्ञान अनुसंधान के क्षेत्र में संभावित आवेदन के साथ अलग अलग cytoskeleton दवाओं के प्रभाव का परीक्षण की अनुमति दी। यह लचीलापन और विकसित पद्धति की विश्वसनीयता को दर्शाता है।

इसके अलावा, कोशिकाओं की अत्यधिक आदेश दिया व्यवस्था अनुमति देता है एकएकल कक्षों के प्रतिदीप्ति के लिए आसान है, स्वचालित पढ़ने के लिए बाहर। हम NIH3T3 कोशिकाओं 'eggcups' (चित्रा 8A) में व्यक्त GFP डालने से यह दर्शाते हैं। सेल की स्थिति को आसानी से पहचाना जा सकता है और इसी अभिव्यक्ति के स्तर को मापा। चित्रा 8b प्रतिदीप्ति संकेतों के वितरण से पता चलता। यह किसी भी (उदाहरण के लिए कोशिकाओं में immunofluorescence, फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से) पढ़ने के लिए बाहर करने के लिए लागू किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: 'eggcups' का निर्माण (क) प्रतिकृति मोल्डिंग द्वारा 'eggcups' के निर्माण प्रक्रिया के योजनाबद्ध विवरण:। (I) SU-8 मोल्ड पर तरल PDMS डालो और इसे इलाज। (Ii) स्टांप बाहर कट और सतह से सावधानी से इसे हटाने, तो यह silanize करने के लिए इसे सक्रिय प्लाज्मा। (Iii) silanized स्टांप एक पर तरल PDMS डालोडी एक पतली PDMS परत प्राप्त करने के लिए यह अपकेंद्रित्र। (Iv) PDMS परत इलाज करने के बाद, प्लाज्मा दोनों, PDMS कवर टिकट और एक गिलास coverslip को सक्रिय करें। (V) प्लाज्मा एक सौम्य, सजातीय दबाव लागू करने से दोनों बाँध। (Vi) प्लाज्मा संबंध के बाद, ध्यान 'eggcups' सतह उजागर करने के लिए डाक टिकट को हटा दें। (सात) अगले चरणों में से निपटने को आसान बनाने के लिए, एक छोटे से PDMS संभाल टुकड़ा जोड़ें। तरल PDMS साथ यह gluing और (आठ) तो इसे इलाज ओवन में से coverslip करने के लिए PDMS टुकड़ा बाँध। (ख) PDMS 'eggcups' और एक संभाल के साथ एक 25 मिमी coverslip की छवि। (ग) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप PDMS 'eggcups' की छवियों। 'Eggcups' के केंद्रों के बीच की दूरी 30 माइक्रोन, और उनके व्यास के बारे में 25 माइक्रोन। (बाएं) शीर्ष दृश्य है। (सही) 'Eggcups' छवि के लिए काट रहे हैं भीतरी भाग। होड़ करने के लिए यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा की वा बड़ा संस्करण।

चित्र 2
चित्रा 2: (क) तत्वों चुनाव आयोग भरने के लिए की जरूरत है। (1) 50 मिलीलीटर ट्यूब; (2) बेलनाकार टुकड़ा (ऊपर की ओर देखने); (3) सेल संस्कृति के माध्यम से; (4) 'eggcups'; (5) तेज चिमटी। (ख) चुनाव आयोग भरने की प्रक्रिया के योजनाबद्ध। (I) एक बेलनाकार टुकड़ा पहले एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में पेश किया और सेल संस्कृति के माध्यम से 13 मिलीलीटर से भरा है। इसके बाद, (ii) 'eggcups' धीरे तेज चिमटी का उपयोग कर छोटे PDMS टुकड़े का उपयोग कर चुनाव आयोग में हेरफेर करने के बेलनाकार टुकड़ा के शीर्ष पर जमा कर रहे हैं। (Iii) उचित घनत्व में कोशिकाओं को चुनाव आयोग के शीर्ष पर pipetted हैं। (Iv) कोशिकाओं centrifugation द्वारा 'eggcups' में पेश कर रहे हैं। (V) अंत में, नमूना धीरे बाहर ट्यूब से जारी है और इसका इस्तेमाल करने के लिए तैयार है। M / फ़ाइलें / ftp_upload / 51880 / 51880fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: 3 डी 'eggcups' और 2 डी फ्लैट सतहों पर सेल phenotypes की तुलना। Confocal माइक्रोस्कोपी (25X पानी उद्देश्य, 0.95 एनए, लीका) एक आदेश सरणी बनाने, और एक सजातीय गोलाकार phenotype दिखा रहा है, और (ख) मानक 2 डी फ्लैट संस्कृति पर पर (क) चुनाव आयोग NIH3T3 कोशिकाओं की छवि, बेतरतीब ढंग से विषम phenotypes के साथ वितरित की। , Golgi (नारंगी) और नाभिक (नीले रंग में) प्रकोष्ठों actin के लिए दाग थे (हरे रंग में)। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। WT और Blebbistatin इलाज कोशिकाओं के लिए फ्लैट सतहों पर चुनाव आयोग और (घ) पर कोशिकाओं के (ग) 3 डी पुनर्निर्माण। स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन।880 / 51880fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: NIH3T3 Golgi तंत्र phenotype के अध्ययन पर (एक) फ्लैट और (ख) चुनाव आयोग की कोशिकाओं के लिए Golgi phenotype के वर्गीकरण के योजनाबद्ध और नमूना छवि।। प्रकोष्ठों, जमा के रूप में वर्गीकृत किया गया बढ़ाया या खंडित α-मूल्य पर निर्भर करता है। (ग) Golgi phenotypes की मात्रा। स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: (क) (बाएं) एक चुनाव आयोग के अंदर एक NIH3T3 सेल के Confocal माइक्रोस्कोपी छवि और actin के लिए दाग (हरे रंग में), Golgi (नारंगी) और नाभिक (नीले रंग में)। (सही) की योजना चुनाव आयोग के अंदर नाभिक उन्मुखीकरण। (ख) (ग) Blebbistatin इलाज कोशिकाओं गुम्मट के लिए चुनाव आयोग के अंदर नाभिक और का कोणीय वितरण। (घ) और गुम्मट और Blebbistatin इलाज कोशिकाओं के लिए दोनों चुनाव आयोग के लिए न्यूक्लियस गोलाई मूल्यों फ्लैट सतहों (पी [गुम्मट चुनाव आयोग -Blebb ईसी] <0.001, पी [Blebb फ्लैट -Blebb ईसी] <०००.१, एन गुम्मट फ्लैट = 47, एन गुम्मट चुनाव आयोग = 94, एन Blebb फ्लैट = 59, एन Blebb चुनाव आयोग = 141 कोशिकाओं)। स्केल बार = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 6: रहते हैं और तय नमूनों में और 'eggcups' का उपयोग कर दो प्रणालियों में cytokinetic अंगूठी का विस्तृत अध्ययन (क) cytokinetic अंगूठी मानक 2 डी में इन विट्रो संस्कृति का उपयोग करने का समय अनुक्रम।। (टैग, हरे GFP) actin (Lifeact-mCherry, लाल) और मायोसिन में केवल दो चमकीले धब्बों हेला कोशिकाओं की दरार कुंड (स्केल बार = 10 माइक्रोन) में दिखाई दे रहे हैं। (ख) समय बँटवारा दौरान हेला कोशिकाओं में cytokinetic की अंगूठी के लिए बंद करने के अनुक्रम 'eggcups' का उपयोग। छवियों actin (लाल रंग में) और मायोसिन (हरा) दिखा। 'Eggcups' अभी भी मायोसिन राशि की पहचान की अनुमति। एक उदाहरण के एक नोक के साथ प्रकाश डाला है। (स्केल बार = 5 माइक्रोन)। (ग) cytokinetic अंगूठी भी विखंडन खमीर में देखे जा सकते हैं। (बाएं) प्रकोष्ठों एक सपाट सतह पर झूठ, Cyto गतिज अंगूठी दो डॉट्स के रूप में ही दिखाई देता है (सही) 'eggcups' में प्रकोष्ठों:। पूरे बंद पर कब्जा कर लिया जा सकता है। एक्टिन सीएचडी-GFP (स्केल सलाखों = 2 माइक्रोन) के साथ लेबल है। मिनट में समय: सेकंड। (घ - ई) दाग cytokinetic छल्ले के उदाहरण हैं। (घ) actin-GFP हेला कोशिकाओं को व्यक्त phosphotyrosine (PY) जो भी अंगूठी (स्केल बार = 5 माइक्रोन) में संकेत से पता चलता है के लिए दाग रहे हैं। (ई) हेला कोशिकाओं व्यक्त GFP टैग की मायोसिन और Lifeact-mCherry (actin) anillin के लिए दाग रहे हैं। Anillin cytokinetic अंगूठी और प्रांतस्था में कम केंद्रित में स्थानीय बनाना पता चला है। यह actin और मायोसिन (स्केल बार = 5 माइक्रोन) के साथ सह स्थानीयकरण से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

80 / 51880fig7.jpg "/>
चित्रा 7:। अन्य प्रकार की कोशिकाओं और मॉडल प्रणाली के लिए 'eggcups' के अनुप्रयोग (क) U2OS (मानव osteosarcoma)। इनसेट एक विभाजन सेल से पता चलता है। (स्केल बार = 20 माइक्रोन)। (ख) NIH3T3 कोशिकाओं व्यक्त GFP। अभिव्यक्ति के स्तर में अंतर को आसानी से पढ़ा जा सकता है (स्केल बार = 20 माइक्रोन)। (ग) SW480 कोशिकाओं (स्केल बार = 20 माइक्रोन)। (घ) नवोदित खमीर; अपने चक्र समय में कोई बदलाव नहीं है। (स्केल बार = 10 माइक्रोन)। (ई) सी एलिगेंस कीड़े;। (बाएं) एक सपाट सतह पर (सही) 'eggcups' में, भ्रूण एक अन्यथा छिपा नजरिए से देखा जाता है। (स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन)। मिनट में समय:। सेकंड में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8 8 चित्रा: 'eggcups' की एक सरणी में संगठन सेल की आबादी का एक स्वचालित विश्लेषण की अनुमति देता है (एक) चुनाव आयोग में NIH3T3 कोशिकाओं (स्केल बार = 20 माइक्रोन)।। वे GFP के विभिन्न अभिव्यक्ति के स्तर की है। (ख) सेल की स्थिति का स्वचालित मान्यता अभिव्यक्ति के स्तर के एक व्यक्ति के विश्लेषण की अनुमति देता है। यह सेल की आबादी का GFP अभिव्यक्ति के हिस्टोग्राम में संक्षेप। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मॉडल प्रणाली प्रकार संस्कृति के माध्यम अवलोकन मझौले 'eggcups' व्यास (μ; मी) टिप्पणियाँ / विवरण
स्तनधारी कोशिकाओं NIH3T3 10% BCS उच्च ग्लूकोज DMEM 10% BCS एल -15 20 ऐसे REF52 या MDCK के रूप में अन्य स्थिर सेल लाइनों, साथ ही प्राथमिक सेल लाइनों, कैंसर कोशिकाओं और / या स्टेम कोशिकाओं को भी 'eggcups' में डाला जा सकता है।
हेला 10% एफसीएस उच्च ग्लूकोज DMEM 10% एफसीएस एल -15 25 कई विभिन्न स्रोतों से उपलब्ध है।
U2OS 10% एफसीएस उच्च ग्लूकोज DMEM 10% एफसीएस एल -15 20-25 कई विभिन्न स्रोतों से उपलब्ध है।
SW480 10% एफसीएस उच्च ग्लूकोज DMEM 10% एफसीएस एल -15 17-20 कई विभिन्न स्रोतों से उपलब्ध है।
ख़मीर विखंडन खमीर आगरप्लेट (YE5S) और तरल मीडिया (YE5S और EMM5S) फिल्टर निष्फल ईएमएम मीडिया (सामग्री की सूची देखें) 5 सतह चिपकने वाला प्रोटीन के साथ क्रियाशील करने की आवश्यकता नहीं है।
नवोदित खमीर अगर प्लेट (YPD) और तरल मीडिया (YEPD और एसडी) एसडी मीडिया 5 सतह चिपकने वाला प्रोटीन के साथ क्रियाशील करने की आवश्यकता नहीं है।
भ्रूण एलिगेंस एन जी एम थाली ultrapure पानी 25 वैकल्पिक रूप से M9 मध्यम लंबी अवधि के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस नमकीन समाधान का नुस्खा यहां पाया जा सकता है: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2009/5/pdb.rec11798.full?text_only=true

तालिका 1: अलग अलग मॉडल प्रणाली के लिए 'eggcups' में संस्कृति की स्थिति। ऊपर से संबंधित प्रोटोकॉल आसानी से अनुकूलित किया जा सकताबस वर्णित संस्कृति की स्थिति और 'eggcups' के आकार की जगह से।

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Discussion

प्रतिकृति मोल्डिंग आदेश 'eggcups' के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया था। निर्माण की प्रक्रिया एक साफ कमरे की जरूरत नहीं है; यह आसान और सरल है, हालांकि कुछ अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है। विशेष रूप से, PDMS टिकट जारी आदेश में उच्च गुणवत्ता 'eggcups' के एक बड़े क्षेत्र का उत्पादन करने में सबसे महत्वपूर्ण कदम है। इस कारण से, विशेष देखभाल इस चरण में लिया जाना है। यदि इस कदम को बार-बार असफल साबित हुई है, silanization और प्लाज्मा बाध्यकारी करने से पहले प्लाज्मा क्लीनर मापदंडों का अनुकूलन करने पर विचार करें। अपर्याप्त silanization PDMS फिल्म के लिए टिकट के मजबूत चिपके को बढ़ावा मिलेगा। यदि यह मनाया जाता है, silanizing अभिकर्मक के साथ ऊष्मायन समय बढ़ाया जा सकता है। ध्यान दें कि अन्य तकनीक और सामग्री 'eggcups' है, जो ligands (फ़ाइब्रोनेक्टिन, जिलेटिन, कोलेजन, आदि) की एक बड़ी रेंज के साथ क्रियाशील किया जा सकता निर्माण करने के लिए लागू किया जा सकता है। विशेष रूप से, polystyrene में microcavities आसानी से ग्राहकों द्वारा गढ़े जा सकता हैटॉम निर्मित गर्म-उभार तकनीक। यह मानक संस्कृति बर्तन में प्राप्त परिणामों के साथ biocompatibility और प्रत्यक्ष तुलना करता है। इसी प्रकार, विशेष देखभाल और अभ्यास के क्रम भरने प्रतिशत अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हैं। विशेष रूप से, rinsing कदम आदेश कोशिकाओं का कोई अतिरिक्त के साथ एक उपयुक्त भरने सुनिश्चित करने के लिए संकेत में शोर और पृष्ठभूमि में योगदान करने में महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं गुहाओं से आसानी से हटा रहे हैं, आकार या गुहाओं की गहराई बदलने के लिए विचार करें।

'Eggcups' कोशिकाओं और उच्च सामग्री स्क्रीनिंग assays के एक सरल प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए 3 डी की तरह वास्तुकला प्रदान करते हैं। सेलुलर organelles और सक्रिय प्रक्रियाओं अज्ञात मानक संस्कृति assays का उपयोग आसानी से व्यक्तिगत microcavities ( 'eggcups') पर एकल कक्षों डालने के माध्यम से देखे जा सकते हैं। मॉडल प्रणाली पर निर्भर करता है, आकार, आकृति और उनके आयाम आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। इस रास्ते में स्तनधारी कोशिकाओं, विखंडन खमीर, नवोदित खमीर और सी एलिगेंस गएक चालाकी और अध्ययन किया जाना है, साथ ही इस तरह के ड्रोसोफिला, चूहों या इन विट्रो निषेचन के लिए मानव भ्रूण, या उदाहरण के लिए स्टेम कोशिकाओं के रूप में किसी भी भ्रूण।

इस सेटअप में एकल कक्षों कब्जा कर रहे हैं। इस विवो में सामना करना पड़ा उपकला ऊतकों के विपरीत है। हालांकि, इस माहौल cadherins साथ कोटिंग ओर दीवारों और अधिक लचीला elastomers का उपयोग करते हुए सेल सेल संपर्कों की नकल करने से हमारे 'eggcups' में reproduced किया जा सकता है। फोकल संपर्कों के कुओं के तल पर फ़ाइब्रोनेक्टिन के बयान से पदोन्नत किया जाएगा। आसंजन अणुओं के इन संबंधित वितरण सेलुलर वातावरण विवो में सामना करना पड़ा reproducing में अनुमति चाहिए। इस विधि से एक शारीरिक शर्तों के दृष्टिकोण होगा।

हमारे परख में मध्यम विनिमय सुनिश्चित किया जाता है। जब दोनों छोटी और लंबी अवधि के प्रयोगों के माध्यम के आदान-प्रदान की कमी की वजह से प्रदर्शन कर चुनाव आयोग में कोशिकाओं को किसी भी गिरावट नहीं दिखाते। यह भी ध्यान दें कि चुनाव आयोग सीए में कोशिकाओंn संगम तक संवर्धित किया जा हालांकि मुख्य ब्याज है, जब अलग-अलग कक्षों या भ्रूण गुहाओं के भीतर अलग कर रहे हैं।

अंगों या पूरे जीवों के अभिविन्यास नई जानकारी का खुलासा किया है। हम cytokinetic रिंग में actin और मायोसिन के विभिन्न गतिशीलता दिखा। हालांकि विखंडन खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं में cytokinetic अंगूठी समान प्रमुख घटकों से बना है, हम इस सेटअप के साथ दिखाने के लिए, कि उनकी विशिष्ट गतिशीलता अलग 17 है। यह परिणाम समर्थन कर रहा है, कि दो प्रणालियों में बंद तंत्र के रूप में अच्छी तरह से अलग है। विकसित करने और इस तरह के एक परिकल्पना की जांच करने के लिए, सेल के उन्मुखीकरण के लिए अपरिहार्य है। भविष्य के अध्ययनों में, इस उपकरण में भी कोशिकाओं में संगठन organelle से संबंधित अन्य घटनाओं की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इसके अलावा, इस तकनीक का विकास जीव विज्ञान में बहुत काम का हो सकता है। लम्बी भ्रूण आसानी से उन्मुख किया जा सकता मनाया या आगे एक परिभाषित अभिविन्यास में इलाज किया।शायद हमारे परख भ्रूण के polarity लागू नहीं होता है, लेकिन उच्च भरने प्रतिशत एक विश्वसनीय ढंग से वांछित पढ़ने के लिए बाहर निकालने के लिए अनुमति होगी। कुल मिलाकर 'eggcups' उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए एक अच्छा उपकरण हो सकता है।

अन्य संस्कृति assays प्रस्तावित किया गया है। इन विधियों multiwell प्लेटों में 2 डी आयाम, समान आकार के साथ micropatterned चिपकने वाला रूपांकनों में जमा करने के लिए एकल कक्षों में कई कोशिकाओं से लेकर। हालांकि, उनमें से कोई भी सीमाओं सेलुलर organelles और dynamical प्रक्रियाओं 1 के अवलोकन पर ऊपर विस्तृत दूर करने के लिए उचित है।

हमारी प्रणाली को भविष्य में सुधार उद्योग उन्मुख प्रयोजनों के लिए 'eggcups' की प्रयोज्यता की अनुमति देगा। एक उदाहरण के रूप में, दवा कंपनियों में दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों multiwell प्लेटों 14,28 के उपयोग की आवश्यकता; इस तरह के प्लेटफार्मों में 'eggcups' को लागू करने के संभावित की विश्वसनीयता में सुधार होगापरीक्षण और परिणाम है। इस तरह, उच्च सामग्री स्क्रीनिंग assays दवा कंपनियों (और शैक्षिक अनुसंधान प्रयोगशालाओं) रोबोट का उपयोग करने का आमतौर पर इस्तेमाल किया automatized प्रक्रियाओं का उपयोग कर प्रदर्शन किया जाएगा। यह कम परिवर्तनशीलता के साथ repeatability और विश्वसनीयता सुनिश्चित करेगा। कुछ व्यावसायिक 3 डी सेल सुसंस्कृत assays पर आधारित उत्पादों को पहले से ही assays के इस तरह के महत्व पर प्रकाश डाला बाजार में दिखाई दिया है। अंत में, इन उपकरणों व्यक्तिगत दवा के लिए नए दृष्टिकोण खुला: मरीज से कोशिकाओं 'eggcups' में रखा जा सकता है, और उपचार कॉकटेल एक मनोवैज्ञानिक वातावरण में परीक्षण किया जा सकता है; बायोमार्कर पढ़ने के लिए बाहर एक इष्टतम उपचार रोगी 29 को दिए जाने की आशा करने के लिए अनुमति देगा। कुल मिलाकर कोशिकाओं और भ्रूण के शारीरिक आकार गुहाओं की वास्तुकला मार्गदर्शन कर रहे हैं, और हमें आशा है कि इस उपकरण है और इस विधि व्यापक रूप से भविष्य में फैल जाएगा।

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम विरोधी Giantin एंटीबॉडी, एम Labouesse लैब के साथ हमें प्रदान करने के लिए एल Brino (IGBMC उच्च सामग्री स्क्रीनिंग की सुविधा, Illkirch, फ्रांस) स्वीकार करते हैं। सी के लिए एलिगेंस (IGBMC) और बी Séraphin लैब। खमीर (IGBMC), विखंडन खमीर कोशिकाओं के लिए फ्लोरोसेंट हेला कोशिकाओं (एमपीआई सीबीजी, ड्रेसडेन), जे Moseley (डार्टमाउथ मेडिकल स्कूल) और JQ वू (ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी) के लिए ई Paluch और ए हैमन नवोदित के लिए; ए Hoel और प्रयोगात्मक मदद के लिए एफ Evenou, तकनीकी मदद के लिए सी रिक (IBMC, स्ट्रासबर्ग, फ्रांस), और microfabrication में मदद के लिए जे.सी. Jeannot (Femto-अनुसूचित जनजाति, फ्रांस)। इस काम CNRS, स्ट्रासबर्ग विश्वविद्यालय, Conectus से धन के द्वारा समर्थित किया गया था, ला ला Recherche Fondation médicale और स्ट्रासबर्ग सीआई-एफआरसी डालना।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ddH20 (ultrapure) Millipore - Use always fresh water.
Parafilm (plastic film) Bemis PM-999 Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness.
Photo-mask Selba - http://www.selba.ch
Silicon wafer Siltronix - http://www.siltronix.com/
SU-8 photoresist MicroChem 2000 series http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm 
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
SU-8 developer MicroChem - http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm 
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information
2-propanol Sigma-Aldrich 19030 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&region=CA
Available from multiple companies.
Sigmacote (siliconizing reagent ) Sigma-Aldrich SL2-25ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&region=FR 
harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. 
Chlorotrimethylsilane (TMCS) Sigma-Aldrich 386529-100ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR  
TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition
Nitrile gloves Kleenguard 57372 http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Available from multiple companies.
Glass coverslips #0 Knittel glass KN00010022593 http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Very fragile. Manipulate gently.
Sharp straight tweezers SPI 0WSSS-XD http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
50 ml tube BD Falcon 352070 http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Available from multiple companies.
PDMS Dow Corning Sylgard 184 kit http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN 
The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies.
Microscope glass slides Dutscher 100001 http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Available from multiple companies.
DMEM high-glucose medium Fisher Scientific 41965-039 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Bovine calf serum Sigma-Aldrich C8056-500ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&region=CA
0.25% Trypsin-EDTA Fisher Scientific 25200-072 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS 1x Fisher Scientific 14200-067 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O
L-15 medium Fisher Scientific 21083-027 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Medium for atmospheres without CO2 control
Fibronectin  Sigma-Aldrich F1141-5MG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Penicillin & Streptomycin Fisher Scientific 15140-122 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM
Petri dish P35 Greiner 627102 http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Petri dish P60 Greiner 628163 http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
Petri dish P94 Greiner 633179 http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldehyde 3 % Sigma-Aldrich P6148-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&region=FR 
Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Triton 0.5 % Sigma-Aldrich 93443-100ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 InVitrogen A12379 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 
dissolve powder in 1.5 ml methanol
Alexa Fluor 647 InVitrogen A21245 1:200 dilution in PBS 1x
rabbit polyclonal anti-Giantin Abcam ab24586 1:500 dilution in PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html 
rabbit anti-anillin Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). 1:500 dilution in PBS 1x
Anti-phosphotyrosine Transduction Lab 610000 http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 goat anti-rabbit  Jackson Immunoresearch 111-166-047 http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp 
1:1,000 dilution in PBS 1x
DAPI Sigma-Aldrich D8417  http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&region=FR 
1 mg/ml for 1 min
Glycerol Sigma-Aldrich G2025 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410-500ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
HeLa cells - - Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
NIH3T3 cells ATCC - Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
Fission yeast  - - For details on strains, contact the corresponding author.  See also Table 1
C. elegans worms - - For details, contact the corresponding author.  See also Table 1
YES (Agar) + 5 Supplements included MP Biomedicals 4101-732 http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search 
For preparation: follow  instructions as given on the box
YES (Media) + 5 Supplements included MP Biomedicals 4101-522 http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search 
For preparation: follow the instructions as given on the box
EMM (Media) MP Biomedicals 4110-012 http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search 
For preparation: follow  instructions as given on the box
Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging MP Biomedicals 4110-012 For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence.
Supplements (for EMM) MP Biomedicals 4104-012 http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search
 (Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering)
Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters Millipore - http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 115 microcavities प्रतिकृति मोल्डिंग Microfabrication उच्च सामग्री स्क्रीनिंग 3-आयाम एकल कक्षों नाभिक Golgi Cytokinetic अंगूठी।
एकल कक्षों और 3 डी कारावास में एकल भ्रूण आदेश: उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए एक नई डिवाइस
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Wollrab, V., Caballero, D., Thiagarajan, R., Riveline, D. Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening. J. Vis. Exp. (115), e51880, doi:10.3791/51880 (2016).

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