Summary
우리는 세포와 배아를 연구하는 장치와 새로운 방법을보고합니다. 단일 세포는 정확하게 마이크로 공동 어레이에 정렬됩니다. 그들의 3D 감금은 생리 학적 조건에서 발생하는 3D 환경을 향한 단계이며 소기관 방향을 수 있습니다. 세포의 모양을 제어함으로써,이 설정은 표준 분석에보고 된 변동성을 최소화 할 수 있습니다.
Abstract
생물 세포는 일반적으로 평면 (2D) 표면에서 관찰된다. 이 조건은 생리적없고, 표현형 및 모양이 매우 다양하다. 이러한 환경에서 세포 기반 스크리닝 따라서 심각한 한계를 가지고 : 세포 소기관은 이종 및 / 또는 특정 세포 소기관이 제대로 시각화 할 수없는 극단적 인 표현형, 세포의 형태 학적 및 크기를 표시합니다. 또한, 생체 내의 세포는 3 차원 환경에서의 위치; 이 상황에서, 세포는 주로하기 때문에 조직의 주변 세포 외 기질과의 상호 작용의 서로 다른 표현형을 보여줍니다. 표준화 및 세포 기반 검정을위한 생리 학적으로 관련 차원 환경에서 하나의 셀의 순서를 생성하기 위해, 여기에서 3D 관내 세포 배양 장치의 미세 가공 및 애플리케이션을보고한다. 이 장치는 마이크로 공동의 2 차원 배열 (일반적으로 10 5 공동 / cm 2), 단일 세포 또는 배아로 가득 각각 구성되어있다. 셀 포지기, 모양, 극성 및 내부 세포 조직은 3 차원 구조를 보여주는 다음 정규화된다. 우리는 커버 슬립에 부착 된 얇은 폴리 디메틸 실록산 상 'eggcups'(PDMS) 층 패턴 마이크로 공동의 배열을 복제 성형을 사용했다. 캐비티가 접착을 촉진하기 피브로넥틴으로 피복 하였다. 균체를 원심 분리에 의해 삽입 하였다. 충전 비율을 80 %까지 허용하는 각 시스템에 대해 최적화되었다. 배아 세포 생존이 확인되었다. 우리는 핵 및 골지 장치와 같은 세포 소기관의 시각화를 위해이 방법을 적용, 이러한 세포 유사 분열 동안 cytokinetic 반지의 폐쇄 활성 프로세스를 연구. 이 장치는 골지체와 핵 정렬에 대한 cytokinetic 링 폐쇄 및 압축 된 표현형 중에 이러한주기적인 축적과 미오신과 액틴의 불균질성과 같은 새로운 기능의 식별을 허용했다. 우리는 포유류 세포, 분열 효모, 출아 효모, C.하는 방법을 특징으로하는 엘레 w각각의 경우에 i 번째 특정 적응. 마지막으로,이 장치의 특성은 약물 스크리닝 분석 및 맞춤 의학에 특히 흥미합니다.
Introduction
시험 관내 세포 - 기반 검정에서의 전류 (2D) 이차원이다. 이 구성은 포유 동물 세포에 대한 자연 아니므 한 생리 관련이 없다; 세포 모양, 크기 및 이기종 표현형의 다양성을 보여줍니다. 같은 비행기 및 세포 소기관의 극단적 인 표현형 (특히 스트레스 섬유) 내에서 무질서한 분포로, 심사 응용 프로그램에 적용 할 때 그들은 추가 심각한 한계를 제시한다. 이는 높은 예산이 매년 소비되는 약물 검사에 대한 임상 시험에서 특히 중요하다. 때문에 약물 검사의 초기 단계에서 인공 2D 문화 조건의 동물 모델에 적용 할 때이 약의 대부분은 비록 실패합니다. 또한,이 방법을 이용하여 특정 세포 소기관 적절 통상 관찰의 평면에 수직 한 평면에서 진화 구조 같은 세포 분열 동안 cytokinetic 액토 마이 오신 고리로서 가시화 될 수 없다. 약간새로운 2 차원 분석은 세포 골격 조직에서 상술 한 단점 중요한 통계는 2,3- 관찰되었다 극복하기 위해 제안되었다. 그러나 이러한 분석은 여전히 존재 하나 심각한 제한 : 세포는 세포가 3 차원 구조를 제시 생체 내에서 관찰되는 것과 대조적으로 매우 확산 표현형을 나타낸다. 배양 방법과 관련이 유물은 강화 된 스트레스 섬유 1,4,5으로 비 생리적 기능을 실행할 수 있습니다.
2D는 6,7 환경에 비해 입체 세포 배양 분석은 여러 장점을 제공한다. 그들은 생리 학적 관련성, 그리고 결과에 따라서 의미가있다. 예를 들어, 히드로 겔에 포함 된 세포는 3 차원 형상의 구조를 표시하지만, 그 모폴로지는 또 다른 하나의 셀에 8,9 다르다. 그러나, 그들의 모폴로지는 심사 응용 프로그램을 복잡하게 다른 하나의 셀에서 차이가있다. 또 다른 전략은 단일 포함하는 것입니다미세 공동 10, 11 셀. 셀의 위치, 모양, 극성 및 내부 세포 조직은 정상화 될 수 있습니다. 세포에 3D와 같은 아키텍처를 제공하는 외에, 마이크로 공동 또한 높은 콘텐츠 스크리닝 연구 10,12-14 수 있습니다; 단셀은 마이크로 어레이 및 세포 내 소기관으로 주문할 수 및 진화가 동시에 관찰 할 수있다. 이 규칙은 세포의 낮은 수 더 나은 시간 / 공간 해상도가 좋은 통계를 제공합니다. 유용한 화합물은 안정적으로 쉽게 식별 할 수 있습니다.
본 연구에서는 높은 콘텐츠 스크리닝 응용 10,12,13 대한 제조 및 새로운 3 차원 형상의 단일 세포 배양 시스템의 애플리케이션을 보여준다. 상기 장치는 탄성 중합체 마이크로 공동 (105 공동 / cm 2), 신조어 'eggcups'(EC)의 배열로 구성된다. 이 작품의 크기 및 EC의 총 부피는 개별 NIH3T3과 헬라 세포의 전형적인 볼륨에 최적화되어 있습니다세포 분열시. 원통형 - - 공동의 형태는 활성 프로세스의 시각화를위한 제대로 동양 세포 형태에 선택됩니다. 15,16 커버 슬립 복제 성형 유리에 부착 된 얇은 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 층 상으로 패턴 EC의 배열을 사용한다. 세포를 원심 분리에 의해 EC에 도입된다. 우리는 2D에서 동일한 세포에 비해 여기 관찰 및 3D (EC)의 세포 소기관 (액틴 스트레스 섬유, 골지 장치 및 핵)의 정상화를보고 (평면)의 표면. 우리는 또한 세포의 유사 분열 17시 cytokinetic 액토 마이 오신 링의 폐쇄로 활동 역학 과정의 관찰을보고합니다. 마지막으로, 우리는 신진 효모, 분열 효모와 C.와 같은 단단한 벽, 다른 시스템에서이 방법의 결과를 보여 모델 시스템의 넓은 범위에가는 방법의 적용 가능성을 확인 간스 배아.
우리는 옆에 상세하고 철저한 페이지를 표시순서 rotocol는 제작 및 3D 미세에 대한 'eggcups'을 적용합니다. 우리의 접근 방식은 간단하고 클린 룸을 필요로하지 않습니다. 우리는이 새로운 방법론은 배양 접시의 교체에, 약물 스크리닝 분석 및 맞춤 의학에 특히 흥미로운 일이 될 것으로 예상된다. 마지막으로, 우리의 장치는 암 (18) 또는 기초 연구 (19), 예를 들어, 외부 자극에 세포 응답의 분포를 연구하는데 도움이 될 것입니다.
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Protocol
'Eggcups'의 1 미세
- 마스터의 제작 : 마이크로 공동 배열
- 습도 중 존재를 증발시켜 200 ° C로 3 '실리콘 웨이퍼를 가열한다.
- 스핀 코트 SU-8 포토 레지스트의 박층. 원하는 두께와 포토 레지스트 타입에 따라 수지와 방사 속도의 볼륨을 조정한다. 이 두께는 'eggcups'(EC)의 깊이를 지시한다. 2,800 rpm에서 30 μm의 두께 층과 SU-8 2025, 스핀 코트하십시오.
- 사전 빵을 30 μm의 두께 SU-8 2025 층 1 분 (2 단계 1) 65 ° C에서 웨이퍼. 바람직한 포토 레지스트의 종류와 두께에 따라 시간을 적응. 자세한 내용은 제조업체의 데이터 시트를 확인합니다.
- 사전 빵을 30 μm의 두께 SU-8 2025 층 3 분 (2의 2 단계) 95 ° C에서 웨이퍼. 바람직한 포토 레지스트의 종류와 두께에 따라 시간을 적응. 자세한 내용은 제조업체의 데이터 시트를 확인합니다.
- 로드UV 노광용 마스크 얼 라이너 용 웨이퍼. 그것에 포토 리소그래피 마스크를 놓습니다. 마스크는 직경 20 ㎛, 순환 기능 (디스크)의 패턴을 보여줍니다. 서로 간의 완벽한 접촉을 확인합니다.
참고 : 다른 제조업체가 포토 리소그래피 마스크를 제공합니다. 공간 해상도는 최종 비용을 결정합니다. 아세테이트 마스크 저비용으로 허용 해상도 (μm의 ≈10)을 제공한다. 크롬 마스크는 더 나은 해상도를 제공하지만 더 비싸다. 세포의 부피 (포토 리소그래피 마스크)에서 디스크의 직경에 적응. 마스크에 디스크의 크기는 장치에서 공동의 직경을 결정합니다. 낮은 충전으로 이어질 것입니다 작은 직경; 너무 큰 직경은 셀을 제한하지 않습니다. 헬라 세포 및 NIH3T3, 20 [㎛] 내지 25의 직경이 제안된다. - UV 램프에 앞서 설명의 전원을 확인하고 그에 따라 노출 시간을 최적화한다. 41.5 초 (또는 최적의 노출 시간)에 대한 (파장 = 365 nm의) 조사250 mJ의 / cm 2.
주 : SU-8 2025은 UV에 노출 영역이 치료된다는 것을 의미 부정적인 포토 레지스트이다. 이 경우, 순환 기능 검정과 나머지 투명이었다. 반대 방향에서 긍정적 인 포토 레지스트 일 : 비 노출 영역이 경화된다. 디자인과 포토 마스크에 따라, 그에 따라 포토 레지스트를 선택합니다.
주 : 적절한 안전 안경 자외선으로부터 눈을 보호합니다. - 부드럽게 포토 레지스트 층으로부터 마스크를 제거한다.
- 포스트 빵을 30 μm의 두께 SU-8 2025 층 1 분 (2 단계 1) 65 ° C에서 웨이퍼. 포스트 빵을 30 μm의 두께 SU-8 2025 층 3 분 (2의 2 단계) 95 ° C에서 웨이퍼. 바람직한 포토 레지스트의 종류와 두께에 따라 시간을 적응. 자세한 내용은 제조업체의 데이터 시트를 확인합니다. 포스트 - 베이킹 후, 약 1 분 동안 벤치 실온까지 냉각 웨이퍼.
- 스핀 코터 웨이퍼를 놓고 다루 SU-8 개발의 몇 mm 드롭전체 웨이퍼 영역입니다. 스핀 코트를 1,000 rpm에서 30 초 동안 다음 2 분 동안 개발하고. 과정을 세 번 반복합니다.
- 미개발 SU-8의 완전한 제거를 보장하기 위해 2- 프로판올로 헹군다. 흰색 영역의 모양은 불완전 개발의 표시입니다. 이 경우, 현상 공정을 추가 시간을 반복한다.
- 하드 베이킹 200 ° C에서 웨이퍼 제조 된 미세 구조의 견고성을 보장합니다. 이 단계는 선택 사항입니다.
- 94mm X 15mm의 폴리스티렌 페트리 접시 내부 미세 구조와 3 ''웨이퍼를 저장합니다.
주 : 표면 처리가 필요 다음 단계는 특히 실란 화에 없다.
- 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 복제본의 제작 : 기둥의 배열
- 철저히 1:10의 비율로 혼합 (w / w) 가교제 및 50 ㎖ 튜브 안으로 30g의 총 예비 중합체.
참고 : 1:10 (v / v)의 비율을 사용하여도 노력하고 있습니다. - 5 분 동안 1,800 XG에서 튜브를 원심공기 방울을 제거합니다.
- 마이크로 위에 부드럽게 PDMS를 삭제합니다.
주 : 기포가이 단계에서 나타나는 경우, 15 ~ 20 분간 진공 펌프를 사용하여 샘플을 탈기. - 4 시간 동안 65 ° C 오븐에서 샘플을 놓습니다.
참고 : 사전 폴리머 비율 : 경화 시간이 함께 가교제와 사용자 사이에서 변화합니다. 이 시간은 PDMS의 강성을 지시합니다. 이상 2 시간을 치료하고 고정 경화 시간에 충실하는 것이 좋습니다. - 부드럽게 약 10 5 마이크로 공동 또는 'eggcups'를 포함 약 1cm 2의이자 (스탬프)의 영역을 잘라 메스를 사용합니다.
참고 : 먼저 PDMS를 잘라하고, 조심스럽게 벗겨. 광학 현미경으로 PDMS 복제의 품질을 확인합니다.
- 철저히 1:10의 비율로 혼합 (w / w) 가교제 및 50 ㎖ 튜브 안으로 30g의 총 예비 중합체.
- 복제 성형에 의해 'eggcups'의 제작. 이하, 'eggcups'의 제조에 대한 두 개의 대안적인 전략을 설명한다. 두 프로토콜은 미입니다LAR와 동일한 결과를 제공합니다 :
- 전략 1
- 30 초 동안 산소 플라즈마 처리에 의해 제조 된 PDMS 스탬프 활성화. 분진의 퇴적을 방지하기 위해 밀폐 된 배양 접시에 일시적 활성화 스탬프를 저장한다.
주 : 플라즈마 다른 가스를 사용하는 경우 박람회 시간을 조정합니다. - 활성화 된 PDMS 다음 15 ㎖의 관 뚜껑에 거꾸로까지 (구조와 측면) 페트리 접시에 스탬프 놓습니다. 트리메틸 클로로 실란의 200 μL (TMCS)와 캡을 입력합니다. 페트리 접시를 닫고 7 분 동안 스탬프 silanization합니다을 할 수 있습니다.
참고 : 스탬프 및 / 또는 색 (흰색)의 변화에 일부 임시 변형을 관찰 할 수있다. 스탬프는 짧은 시간에 원래의 형상을 회복하고 구조는 영향을받지 않습니다.
참고 : TMCS 급성 흡입 및 피부 독성을 생산하고 (상당한 거리에 걸쳐 발생할 수 점화 플래시백)와 가연성이다. 따라서,이 소스로부터 멀리 연기 찬장에 사용되어야한다점화의. - 거꾸로 업 구조와 스핀 코터에 PDMS 스탬프를 놓습니다. 구조 위에 : 액체 PDMS의 (20 μl의 주위에) 몇 마이크로 리터의 작은 방울 (사전 고분자 가교제 w / w 1:10)했습니다. 30 초 동안 1500 rpm에서 스핀 코트 구조 위에 PDMS의 얇은 층을 증착한다.
주 : 스탬프 중앙에 작은 구멍 스핀 코터 척 장소를 페트리 접시 뚜껑의 상단에 스탬프를 맞지 않을 경우. - 증착 된 스핀 코팅 PDMS 층을 치료하기 위해 4 시간 동안 65 ° C 오븐에서 스탬프를 놓습니다.
- 30 초 동안 산소 플라즈마 세정기를 이용하여, 유리 커버 슬립 번호와 함께 상승 가입 PDMS 스탬프를 배치하여, 직경 25 mm 공을 얇은 PDMS 층을 활성화. 다음 단계로 신속하게 진행합니다.
주의 : 다른 두께, 형상으로 된 커버, 및 치수도 사용될 수있다. 그러나, 일부 셀룰러 구조 선택된 커버 슬립의 두께 및 목적에 따라 시각화하기 어려울 수확대 및 / 또는 NA 및 / 또는 작업 거리. 객관적인 데이터 시트를 확인합니다. - 접촉 유리 커버 슬립과 스탬프 (얇은 스핀 코팅 층이있는 쪽)을 놓습니다. 부드럽게 모든 핀셋 스탬프의 표면 주위를 눌러 '결합'을 확인합니다. 마지막으로, 약 10 초 동안 우표의 상단에 일정한 압력을 유지합니다.
- 부드럽게 30 분 '껍질', '해방' 'eggcups'하기 위해 coverslip에 밖으로 스탬프 후 (그림 1 참조). 에탄올 건조 깨끗이 씻어. (그들은 ''unpeeling 단계 동안 분리 IE) PDMS 'eggcups'가 아니라, 유리 커버 슬립 상에 부착되지 않은 경우, 플라즈마 세정기의 설정을 조정하는 것을 고려하고, 단계 1.3.1.5에서 다시 시작.
참고 :이 단계는 섬세하고 있습니다. 얇은 PDMS 층의 커버 슬립 및 / 또는 박리의 파손을 방지하기 위해주의. - 1mm × 1의 경화 된 PDMS의 작은 조각 (핸들)을 붙인다mm 액체 PDMS의 작은 드롭 커버 슬립의 가장자리 부피를 3 mm x와 같은 이전의 치료 PDMS. 이것은 (도 1 참조) 이후 샘플의 조작을 용이하게한다. 이 단계는 선택 사항입니다.
- 30 초 동안 산소 플라즈마 처리에 의해 제조 된 PDMS 스탬프 활성화. 분진의 퇴적을 방지하기 위해 밀폐 된 배양 접시에 일시적 활성화 스탬프를 저장한다.
- 전략 2
- 30 초 동안 산소 플라즈마 처리에 의해 제조 된 PDMS 스탬프 Hydrophilize. 분진의 퇴적을 방지하기 위해 밀폐 된 배양 접시에 일시적 활성화 스탬프를 저장한다.
주 : 플라즈마 다른 가스를 사용하는 경우 박람회 시간을 조정합니다. - 30 초 동안 15 W에서 25mm 직경 커버 글라스 # 0 산소 플라즈마 처리를 Hydrophilize. 다음 단계로 신속하게 진행합니다.
주의 : 다른 두께, 형상으로 된 커버, 및 치수도 사용될 수있다. 그러나, 세포 구조가 선택한 coverslip에 두께와 목표 특성에 따라 시각화하기 어려울 것이다 (위주의 참조). - 스핀 코트 가교제 w / w PDMS (1:10 작은 드롭 : 프리 폴ymer)이 커버 글라스 위에 몇 마이크로 리터의. 스핀 코팅을 1,500 rpm에서 30 초 동안 약 50 ㎛의 최종 두께.
- PDMS 액상의 작은 방울 커버 슬립의 가장자리 부피 1mm X 1mm × 3 mm 인 경화 된 PDMS의 작은 조각 (핸들)을 붙인 이전과 PDMS 치료. 이것은 (도 1 참조) 이후 샘플의 조작을 용이하게한다. 이 단계는 선택 사항입니다.
- 깨끗하고 먼지 증착로부터 보호하기 위해 페트리 접시 안에 닦아에 일시적으로 PDMS 코팅 된 커버를 저장합니다.
- 각 우표의 상단에 silanizing 시약 한 방울을 넣고는 1 ~ 2 분 동안 증발 할 수 있습니다. 그런 다음, N 2의 스트림에서 그들을 건조.
주 :이 단계에서, 상기 스탬프의 일시적인 변형이 증착 동안 관찰 될 수있다. 스탬프는 미세 구조의 영구적 인 변형없이 N 2 건조 후 원래의 형상을 회복됩니다. - 의 상단에 매우 부드럽게 실란 스탬프를 삭제페트리 접시에 저장된 유리 커버 슬립을 PDMS 스핀 코팅. 양쪽이 완전히 접촉시 평행되어 있는지 확인합니다. 누르거나 PDMS 코팅 커버 슬립에 그것을 배치 한 후 스탬프를 이동하지 마십시오.
- 공기 방울을 제거하기 위해 1 ~ 2 시간 동안 진공에 샘플 페트리 접시를 놓습니다.
참고 : 샘플 스탬프 변위를 피하기 위해 완전히 수평 있는지 확인합니다. 또한 잠재적으로 진공 펌프에 의한 진동을 피하십시오. - 4 시간 동안 65 ° C 오븐에서 샘플을 놓습니다.
- 조심스럽게, 'eggcups'을 나타 내기 위해 스탬프를 벗겨. 에탄올 건조 깨끗이 씻어.
참고 :이 시점에서 연습이 필요하다. 얇은 PDMS 층의 커버 슬립 및 / 또는 분리의 파손을 방지에주의를 기울이십시오.
- 30 초 동안 산소 플라즈마 처리에 의해 제조 된 PDMS 스탬프 Hydrophilize. 분진의 퇴적을 방지하기 위해 밀폐 된 배양 접시에 일시적 활성화 스탬프를 저장한다.
- 전략 1
2. 'Eggcups'로 셀 소개
포유 동물 세포 내부의 'eggcups', PDMS 표면 북동를 소개하기 위해EDS는 세포 외 매트릭스의 접착 단백질로 작용 화된다. 이 예는 피브로넥틴하지만, 콜라겐 등의 관심을 다른 단백질을 사용, 사용할 수 있습니다.
- 30 초 동안 산소 플라즈마 세정기의 'eggcups'를 Hydrophilize.
참고 : 필요한 경우 매개 변수를 최적화합니다. - 소 소스에서 20 μg의 ml의 PBS의 1 배에서 솔루션 -1 피브로넥틴을 준비합니다.
- 5 분 동안 UV와 함께 'eggcups'을 소독. 전체 'eggcups'영역을 커버하고 RT에서 1 시간 동안 배양 피브로넥틴 용액 (20-50 μL 정도)의 작은 방울을 증착. 건조에서 샘플을 보호합니다.
- 부드럽게 PBS 1X와 'eggcups'을 씻어. 3 번 반복합니다.
참고 : 샘플이 몇 주 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 즉시 또는 저장 사용할 수 있습니다. - 높이 63mm, 외부 반경 26mm 및 50 ㎖ 튜브에 내부 반경 치수 7 mm의 원통형 맞춤 플라스틱 조각을 소개합니다 (그림 2) (20)
주의 : 항목을 자외선 살균 또는 그들에게 이전에 사용을 소독.
참고 :이 작품은 쉽게 실험실에서 제조 할 수있다. 또는 사용 가능한 기계 공장으로. - 관 내부의 세포 배양 배지 13 ml를 넣어 (표 1 참조). 배지 샘플의 완전 침지를 위해 원통형 부재 위에 적어도 2cm를 작성한다.
참고 : 특정 세포 유형의 세부 정보 및 효모 또는 C와 같은 다른 모델 시스템의 경우 엘레 배아 및 사용되는 대응되는 매체는 제 5 및 표 1 참조. 설명 된 프로토콜 인 HeLa, NIH3T3 세포, 기타 세포주 (표 1 참조)에 대해 최적화되었다. - 플라스틱 부재의 상측에 매우 조심스럽게 튜브를 평행 내부 'eggcups'을 소개한다. PDMS의 핸들을 사용하여 샘플을 잡고 날카로운 핀셋을 사용합니다. 눌러 부드럽게 될 때까지 커버 슬립은 플라스틱 조각, 유엔의 상부 위에 놓여완전히 침지 때까지 (도 2 참조).
주 : 날카로운 직선 핀셋을 사용하는 것이 좋습니다. 곡선 핀셋, 샘플의 조작이 어렵고 파손이 발생할 수있다. - 문화 세포 P60 페트리 접시에 80-100% 합류 할 때까지 트립신에 의해를 수집합니다.
참고 : 세포를 형질 전환 또는 관심의 약물로 치료 야생형 될 수 있습니다.
주 : 'eggcups'을 입력 한 셀을 피할 세포 집합체의 형성을 피할 것. 이 단계, 피펫 위아래로 철저하게 트립신 후를 최적화 할 수 있습니다. - 5 ㎖ 배양 용 배지에 세포를 다시 일시. 'eggcups'의 상단에 세포를 200 μl를 피펫.
참고 : 'eggcups'의 최고하지만 신체 접촉을 피에 가능한 중심으로 세포를 삭제합니다. 이 파손 및 / 또는 샘플의 손상을 방지한다. - 2 분 동안 1,800 XG에 원심 분리기.
참고 : 첫 번째 원심 분리 후, 마이크 체크'eggcups'의 충전 비율 roscope. - 피펫 2 분 동안 1,800 XG에서 'eggcups'원심 분리기의 상단에 세포를 다시 200 μL. 충전 비율을 최적화하기 위해 총 3 회 반복한다.
참고 : 마지막으로 원심 분리 후, 현미경으로 'eggcups'의 충전 비율을 확인합니다. 필요한 경우, 원하는 충전 비율에 도달 할 때까지 충전 + 원심 분리 단계를 반복한다. - PDMS의 핸들을 잡고 날카로운 핀셋을 사용하여 튜브에서 샘플을 제거합니다. 'eggcups'에서 개최된다 없습니다 '방해'세포에서주의해야합니다 (그림 2 참조).
- 매체와 페트리 접시에 샘플을 놓습니다. 부드럽게 옆에있는 마이크로 어레이의 각면 (총 4면)까지 피펫 팅에 의해 3 배 아래로 'eggcups'에없는 세포의 과잉을 제거하는 린스.
참고 : 피펫이 너무 강하게 해제 할 수있다'eggcups'밖으로 일부 셀. - nonattached 세포를 제거하는 새로운 매체와 매체를 교체합니다.
참고 :이 단계에서는 관심의 약물을 추가 할 수 있습니다. - 세포를 수정 또는 시간 경과 imaging.See 단계 4.1을 준비합니다.
Cytokinetic 링 폐쇄 'Eggcups'활성 세포 역학의 3 관측
참고 :이 예제는 미오신과 액틴에 대한 MYH10-GFP 및 Lifeact-mcherry로 형질하는 HeLa 세포를 사용하여, 각각 세포 유사 분열하는 동안 cytokinetic 링 폐쇄에 관여하는 주요 활성 분자. 장치는 직경이 25 ㎛ 인 마이크로 공동으로 제조된다. 자신의 관찰를 들어, 표면 형광 거꾸로 현미경이 사용 된 60X 오일 목표 (1.40 NA, DIC, 계획 아포)과 GFP (마이 오신) 및 TxRed (액틴) 필터가 장착. 또는 수직 공 초점 현미경은 25X 또는 63X HCX IR APO L 물 목표 (0.95 NA)를 장착, 사용되었다. 이 엑사에 대한mple, 매우 이중 티미 딘 블록, 유사 분열 블록 또는 유사 분열 흔들림 오프 법 21-24을 사용하여 세포를 동기화하는 것이 좋습니다.
주 : "eggcups '에 사용 된 PDMS의 두께는 반전 직립 위치 현미경 모두 다양한 목적의 사용을 허용한다.
- 찾는 현미경 홀더에 'eggcups'10 % FCS L-15 관측 배지 1 ㎖로 채운다. 증발을 방지하기 위해, 홀더의 상부에 유리 덮개를 배치하거나 medium.Select 60X 오일 대물 위에 미네랄 오일의 얇은 층을 적용한다.
참고 : L-15 매체는 비 CO 2 분위기에 적합합니다. DMEM의 일부 화합물은 자동 형광 있다고도합니다. 이 매체를 사용하는 경우, 1-2 시간 동안 고강도 램프를 조명하여 형광 화합물 photobleach 것을 권장한다.
참고 : DIC 이미징 작업을 할 때 플라스틱 뚜껑을 사용하지 마십시오. - 'eggcups'와 obser와 홀더를 배치현미경의 vation 매체. 'eggcups'까지 시야 광을 이용하여 조심스럽게 초점 세포 관찰의 동일 평면 상에있다.
- 소프트웨어를 열고 매개 변수를 조정합니다. 액틴과 미오신의 필터 TxRed 및 GFP를 선택; 각 채널에 대한 설명 시간을 조정합니다. 일반적인 수집 속도는 두 채널 모두 5 초입니다.
주 : 박람회 시간은 사용 설정, 염료 또는 관심의 다른 세포 소기관에 따라 조정해야 할 수 있습니다. - 관심 영역을 선택하고 GFP 또는 TxRed 채널 중 하나를 사용하여 cytokinetic 반지를 추구합니다. 정확하게 초점을 맞 춥니 다.
주 : 링 마이 오신에 선명하고 인식하기 쉽다. - 링이 완전히 닫힐 때까지 양쪽 채널의 자동 수집을 실행합니다.
참고 : 일부 광표백이 관찰 될 수있다. 를 감소시키기 위해 현미경 파라미터를 조정한다.
'Eggcups'에 고정 세포 소기관 4. 관측
이 단계 전이나 3 단계 이후에 수행 될 수있다. 세포를 직접 원심 분리 단계 후에 고정 관심 소기관 또는 현미경으로 관찰 한 후 염색 할 수있다. 이 예는 'eggcups'에서 NIH3T3 섬유 아 세포의 골지 장치, 핵 및 액틴 섬유의 염색을 보여줍니다.
- 'Eggcups'에서 세포의 고정
- 3 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 따뜻한 37 ° C를 준비합니다. 50 ML 튜브 (또는 현미경 홀더)에서 'eggcups'샘플을 제거하고 P35 페트리 접시 안에 놓습니다. PBS 1X로 한번 씻어.
참고 : 3 % 파라 포름 알데히드의 제조를위한 프로토콜은 다른 곳에서 널리 사용할 수 있습니다.
주의 : PFA의 준비 기간 동안 니트릴 장갑과 눈 보호를 사용합니다. - 완전히 PBS를 제거하고 3 % PFA 1 ㎖를 삭제하고 17 분 동안 품어. 재정법를 제거하고 PBS 1X 1 ㎖로 두 번 씻어. 0.5 % Trit 1 ㎖를 사용하여 세포 Permeabilize 하시려면3 분에서 5 분 동안 PBS 1X로 두 번 씻는다.
- 3 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 따뜻한 37 ° C를 준비합니다. 50 ML 튜브 (또는 현미경 홀더)에서 'eggcups'샘플을 제거하고 P35 페트리 접시 안에 놓습니다. PBS 1X로 한번 씻어.
- 'Eggcups'에서 세포의 염색
- PBS 500 희석 : 1의 기본 항체 토끼 다 클론 항 Giantin와 골지체 염색에 대한 세포를 품어. 플라스틱 필름 시트에 항체 용액 100 ㎕를 드롭을 놓고 거꾸로 45 분 동안 'eggcups'내부의 세포를 배양한다.
주 : 건조를 방지하기 위해 커버 샘플을 보호합니다. - 조심스럽게 'Eggcups'을 출시하고, P35 페트리 접시에 배치합니다. PBS 1X와 3 회, 5 분 각을 씻어.
- 과 (1 : 200) Phalloidin의 알렉사 형석 488과 액틴 스트레스 섬유 염색 용 : 이차 항체 Cy3에 염소 항 - 토끼 (1,000 일)와 PBS에서 칵테일을 준비합니다.
- 플라스틱 필름 시트에 항체 용액 100 ㎕를 드롭 세포를 품어 거꾸로 45 분 동안 'eggcups'내부 세포를 배양한다.
- 릴리스주의 'eggc업 '과 P35 페트리 접시에 배치합니다. PBS 1X와 3 회, 5 분 각을 씻어.
- 플라스틱 필름 시트에 1 μg의 ml의 -1 PBS에서 DAPI의 100 ㎕를 드롭 배치 핵 염색에 대한 세포를 품어 거꾸로 45 분 동안 'eggcups'내부 세포를 배양한다. 이 단계는 단계 4.2.3로 수행 될 수있다.
- 조심스럽게 'eggcups'을 출시하고, P35 페트리 접시에 배치합니다. PBS 1X와 3 회, 5 분 각을 씻어.
- 건조를 방지하기 위해 매니큐어 샘플을 (1 V / V 1) 표준 현미경 유리 슬라이드 및 밀봉 PBS : 15 μL의 글리세롤을 사용하여 마운트 세포.
참고 : 'eggcups'두께에 따라 설치하는 것은 어려울 수 있습니다. 건조로부터 보호 PBS에서 P35 페트리 접시로 다음 샘플을 저장하는 것이 좋습니다.
- PBS 500 희석 : 1의 기본 항체 토끼 다 클론 항 Giantin와 골지체 염색에 대한 세포를 품어. 플라스틱 필름 시트에 항체 용액 100 ㎕를 드롭을 놓고 거꾸로 45 분 동안 'eggcups'내부의 세포를 배양한다.
- 현미경 관찰
참고 :이 예를 들어 수직 공 초점 현미경이 사용되는 PMT 및 하이브리드 탐지기가 장착. 25X 또는 (63) X HCX IR APO L 물 대물 (NA 0.95)가 샘플의 넓은 시야를 제공하고 높은 콘텐츠 스크리닝 애플리케이션을위한 장치의 적용을 보여주기 위해 선택되었다.- 25X 또는 63X 물 목표를 선택합니다.
주 : 프로그램 신호에 따라 서로 다른 목적에 사용될 수있다. 그러나 높은 개구 목적의 사용을 권장합니다. - 'eggcups'로 고정 된 샘플을 놓고주의 깊게 관찰의 평면에있는 'eggcups'셀 때까지 브라이트 라이트 (위상 대비 또는 DIC)을 사용하여 초점을 맞 춥니 다.
- 소프트웨어를 열고 매개 변수를 조정합니다. 필터 GFP, Cy3에와 DAPI 액틴을위한, 골지 각각 핵 관찰을 선택합니다; 모든 채널에 대한 설명 시간을 조정합니다.
주 : 박람회 시간은 설정에 따라 조정해야 할 수 있습니다. - 선택과 관심 영역에 초점; 이미지 캡처 (그림 3 참조)를 시작합니다.
- 25X 또는 63X 물 목표를 선택합니다.
- 분열과 신진 효모 세포
참고 :이 예제는 각각 미오신과 액틴에 대한 RLC1-mcherry 및 CHD-GFP로 태그 분열 효모 세포를 사용합니다. 신진 효모 세포는 형광 여기에 표시되지 않습니다. 분열 효모 관찰 역 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용 하였다. 100X HCX PL APO CS 오일 목표 (1.4 NA)는 모든 인수에 사용되었다. 대안 적으로, 셀은 20 배의 위상 콘트라스트 공기 대물 LCPlanFl (0.4 NA)를 구비 한 반전 위상 대조 현미경을 사용하여 관찰 하였다. 이러한 예에서, 프로토콜은 두 세포 유형이 동일하다.- 상술 한 바와 같이 'eggcups'표면을 준비합니다. 분열 및 출아 효모 세포의 경우, 직경 5 ㎛ 인 공동을 제조 (표 1 참조). 이 경우, 표면은 접착 단백질로 작용 화 될 필요가 없다.
참고 : 충전 캘리포니아n 개의 원뿔 'eggcups'를 사용하여 최적화 될 수있다. 이 형상은 캡처하고 원심 분리 후 헹굼 단계에서 해제 피 세포를 유지합니다. 비율을 충전하면 약 80 %에 최적입니다. 이러한 원추형 'eggcups'은 딥 반응성 이온 에칭 (13)의 수단에 의해 제조 될 수있다. - 적절한 배양 배지에서 배양 된 효모 세포는 0.2 내지 0.8의 범위 내의 광학 밀도 (OD)에 도달 할 때까지 (표 1 참조). 집계를 제거하는 효모 세포의 문화를 초음파 처리.
- 원심 분리에 의해 'eggcups'에서 효모 세포를 삽입합니다. 원심 분리에 적절한 OD에서 배양 세포를 4 ㎖의 'eggcups'로 튜브에 첨가한다. 'eggcups'에서 세포가 방해받지 동안 첫 번째 원심 분리 후, 부드럽게의 'eggcups'에없는 세포를 다시 일시 중단 튜브를 흔들. 다시 튜브, 원심 분리기를 열고 두 번이 단계를 반복하지 않고. 이 성막을 보장빈 마이크로 공동으로 문화에서 세포의과 충전 비율을 증가 할 것이다.
참고 : 효모로 작업 할 때, 그것은 실험 동안 작동 온도로 예열 원심 분리기에 추천
참고 :이 프로토콜은 여기를 일시 중지하고 나중에 12 시간까지 계속 될 수있다. 이 경우에는, 가공 온도에서 샘플을 저장하고, 증발을 방지하도록 커버. - 현미경 홀더에 'eggcups'을 놓고 이미징을위한 필터 멸균 매체와 홀더를 입력합니다. 부동 효모 세포를 효율적으로 제거 될 때까지 지금 같은 미디어로 세포를 씻어. 헹굼 과정에서 'eggcups'에서 세포를 방해하지 않도록주의하십시오.
- 100X 오일 목적을 선택하고주의 깊게 초점을 맞 춥니 다. 소프트웨어를 열고 매개 변수를 조정합니다. 분열 효모를 들어, 액틴과 미오신의 필터 GFP 및 TxRed를 선택하고 두 채널에 대한 설명 시간을 조정합니다. 전형적인 취득 비율은 3 초입니다.
참고 :에 따라형광, 태그의 종류 및 설정, 노출 시간은 다른 시스템에 대해 변화한다.
- 상술 한 바와 같이 'eggcups'표면을 준비합니다. 분열 및 출아 효모 세포의 경우, 직경 5 ㎛ 인 공동을 제조 (표 1 참조). 이 경우, 표면은 접착 단백질로 작용 화 될 필요가 없다.
- C.는 배아 엘레 간스
참고 :이 예제는 C를 사용 25 ~ 30 μm의 폭 길이 50-55 μm의 엘레 배아. (25)에 나타낸 바와 같이, 배아는 배양 하였다. C. 조작하는 방법의 간단한 프로토콜 시각 엘레은 26에서 찾을 수 있습니다. 관찰은 40X 공기 대물 0.55 NA를 구비 한 반전 위상 대조 현미경을 사용하여 수행 하였다.- 상술 직경 25 μm의로 'eggcups'면을 제조 (표 1 참조). 이 경우, 표면은 접착 단백질로 작용 화 될 필요가 없다.
- 문화 C. 적절한 배양 배지에서 배아 간스 (표 1 참조).
- 전술 한 바와 같이 원심 분리하여 'eggcups'에서 배아를 삽입 (2.12 섹션 2.6 참조) 배지로 초순수를 사용.
주 : 배아 실험 기간 동안 정상적으로 초순수에 "행동"하였다. 대안 장기 실험 생리 M9 버퍼를 사용한다. - (섹션 2.14 참조) 전술 한 바와 같이 샘플을 씻어. 현미경 홀더에 'eggcups'를 놓습니다. 40X 공기 목적을 선택하고주의 깊게 초점을 맞 춥니 다. 소프트웨어를 열고 매개 변수를 조정합니다. 3 초의 수집 속도를 선택합니다.
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Representative Results
'eggcups'(EC)는 3 차원 환경에서 배향 배아 세포의 가시화를 허용하는 신규 한 고 함량의 스크리닝 방법이다. 또한, 표준 2 차원 (평면) 배양 물에서 관찰하기 어려운 몇몇 세포 과정은이 새로운 방법에 의해 관찰 할 수있다.도 1a (제 1 전술 한 프로토콜도 참조 EC 미세 가공하기위한 절차의 개요를 나타낸다 ). 상기 방법은도 1B. 간단한 빠르고 효율적인 특수 장비의 필요없이 임의이며 1c는 대형 포토 각각 'eggcups'의 확대 된 주사 전자 현미경 이미지를 나타낸다. 이 관찰 될 수있는 바와 같이, 그 형상 및 크기가 매우 규칙적. 이 방법은 매우 유연; 다른 모양 및 크기를 쉽게 제조되고 다른 모델 시스템에 적용될 수있다. 'eggcups'의 치수는 다음과 같이 선택되었다 : 치수이들이 구형 있고 그 직경은 EC 직경에 대한 좋은 지표로 하였다 : 분열을 거쳐 세포의 2D 표면 상에 측정 하였다. 예를 들어 세포 분열 동안의 긴 축을 따라 'eggcups' 연장과 동양의 세포. 이 차원은 시스템에 따라 달라집니다 - 세포와 배아 - 따라서이 차원은 각각의 경우에 평가되어야한다.
그림 2는 필요한 자료 (그림 2a)와 'eggcups'를 사용하는 방법에 대한 단계별 프로토콜 (그림 2b)를 보여줍니다 (또한 상술 한 프로토콜의 제 2 절 참조). 관심 (또는 다른 모델 시스템)의 세포와 EC의 충전은 매우 간단하고 빠르다. 일반적으로, 또한 세포를 트립신 처리에 대한 시간을 포함하는보다 20-30 분 걸립니다. 충전 후, 샘플 (라이브 영상) 활성화 프로세스를 연구하기 위해 사용되거나 고정 intere의 소기관의 시각화 염색 할 수있다ST는 (위에서 설명 된 프로토콜 섹션을도 3 및도 4 참조).
평평한 표면에서 세포는 이종 반응과 세포 소기관의 극단적 인 표현형을 보여줍니다. 사실, 응력 액틴 섬유 (및 다른 세포 소기관)는 배양 조건 (1)의 생성물이 제안되고있다. 이 가설을 증명하기 위해, 우리는 3D 'eggcups'에 평평한 표면에 서로 다른 세포 소기관, 즉 액틴 스트레스 섬유, 골지체 및 핵의 표현형을 비교하여 두 NIH3T3 세포를 배양 하였다.도 3은 세포가 어떻게 구성되는지의 일례를 나타낸다 두 구성합니다. EC에서 세포가 균일 한 구형 모양의 표현형 (그림 3a)를 보여주는 순서 배열에 배포됩니다. 평평한 표면에서 세포는 일반적인 무질서, 확산 및 이기종 형태 표시 (그림 3B). 세포 골격 구조에서 큰 차이가있다. R에 특정 세포에서16; eggcups '은 평탄면에 비해 스트레스 섬유의 개수의 감소를 나타낸다. 이것은 더 명확한 스트레스 섬유 (- D도 3c 참조) 볼 수없는 이미지를 재구성 3D로 확인할 수있다. 이것은 일부 세포 구조가 2D 문화에서 확대되어 있는지 확인합니다. 이것은 스트레스 섬유를 식별 할 수없는 생체 내에서 수행되는 관측과 일치도.
골지체는 배양 조건에 따라 자신의 표현형에 상당한 변화를 나타낸다 (도 4 참조). 2D 문화의 골지 장치는 일반적으로는 더 압축 된 표현형을 보여줍니다 'eggcups'에있는 반면, 핵 주변을 '수용'확장 된 표현형을 보여줍니다 (그림 4a 참조 - B). 약물 선별 조작을 시뮬레이션하기 위해, 우리는 두 환경에서 배양 된 세포에 대한 약물의 효과를 평가 하였다. 우리는 Blebbistatin의 mainl을 선택Y는 액틴 스트레스 섬유를 방해하고 골지 형태 (도 3c 참조 -을 D)에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 골지 옆 세포 핵에 위치하고 있기 때문에,이 약물은 또한 구조에 영향을 미칠 수있다. 우리는 먼저이 약물로 치료 세포가 야생형 (WT) 세포 (- D도 3c 참조)에 비해 덜 규칙적이고 균일 한 형태를 보여 주었다 관찰했다. 우리는 그 다음 비교 'eggcups'과 평면 (도 4c 참조) 관찰 골지 표현형을 정량화. 우리는 2D는 표면에 'eggcups'세포가 더 압축 된 표현형을 보여 주었다에 반면 세포는 대부분 확장 된 표현형을 보여 주었다 관찰했다. 우리는 WT와 Blebbistatin 처리 된 세포 사이에 눈에 띄는 차이가 있지만 관찰되지 않았다.
2D는 세포핵을 표면에 EC 셀이 직교 모두에서 XY 평면에 대해 배향되는 반면, 마지막으로, 랜덤 배향WT 및 Blebbistatin는 (- C도 5a 참조) 세포를 처리 하였다. 이 효모 및 포유 동물 세포에서 10,12,13 cytokinetic 링의 관측 평면 배향 방법의 전 애플리케이션과 유사 오리엔트 세포 소기관에 장치의 강도를 강조한다. 드디어 핵 구형 방법 공부 (ψ = 정의 V의 n은 핵의 부피이고, N의 표면적 / A N [1 / 3의 6V N 2 / 3 π]) 배양 조건에 따라 영향을받은 및 Blebbistatin와 세포의 치료시.도 5d는 ψ의 해당 분포를 보여줍니다. 우리는 EC 세포의 정상적인 구형 영향을 미치지 않는 것을 알 수 WT EC 대 평면 WT에 대한 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, 우리는 관찰차이 WT EC를 비교 EC는 EC가 2D에서 마스크 약물의 실제 효과를 드러내는 것을 제안 Blebb합니다.
'eggcups'를 사용하여 라이브 세포 연구는 또한 표준 문화에서 볼 수없는 새로운 활성 프로세스를 식별 할 수 있습니다. 우리는 EC 셀 도금도 6은 세포 분열 동안 cytokinetic 폐환 이미지의 시퀀스를 도시 세포 분열. 가시화. 표준 2D 문화는 하나의 단일면 (10)에 해당하는 두 개의 영역을 보여줍니다 반면 'eggcups'장치는 반지의 완벽한 시각화 할 수 있습니다. 2 차원 배양을 이용하여 Z 스택 이미지 시퀀스로부터 링의 재구성은 27 일 수 있지만, 중요한 정보가 손실된다. 낮은 Z 해상도와 동적 프로세스에 해결 될 수없는 때문에 품질은 감소된다. 액틴과 미오신은 세포 분열의 힘 생성에 중요한 단백질이다. 그들의 역학 ㄱ 수 없습니다전자 이미징 및 2D 문화 (도 6a)에서 공부 'eggcups'와 반면에 즉시 공개된다. 우리가 마이 오신 (17)의주기적인 축적을 찾을 HeLa 세포에서 우리는 새로운 구조와 프로세스를 확인했다. 반지 (도 6b)를 닫고 이러한 축적은 반경 방향으로 이동합니다. 분열 효모에서 우리는 또한 (오른쪽도 6c) 17 미오신과 액틴의 불균질성을 찾을 수 있습니다. 우리는 HeLa 세포에서 보는 것과 달리, 그들은 폐쇄하는 동안 링에 회전합니다. 속도는 분 -1 ㎛의 범위 인 표준 현미경 Z 재구성에 의해 변환 될 수 없다. 마지막으로 cytokinetic 링은 추가 구성 요소에 대한 염색하여 공부하실 수 있습니다. 우리는 링 (그림 6D)의 주변에 포스의 축적이 있다는 것을 찾을 수 있습니다. 우리는 또한 anillin 링 (그림 6E)에 colocalizing되어 표시 할 수 있습니다. w는이 방향에서 세포를 염색하여전자가 anillin 또한 균일 분포를 보여줍니다 알 수있다.
우리는 포유 동물 세포 분열 효모를보고 있지만, 우리는 또한 신진 효모와 C.을 테스트하십시오 'eggcups'는 또한 다른 모델 시스템에 적용 하였다 엘레은 (- 전자도 7a 참조). 이 경우, 프로토콜은 배지의 관점에서 각각의 특정 시스템에 적합하고, 공동의 크기 및 형태 (표 1 참조). 예를 들어, 원추형 V '는 eggcups'이 아닌 포유 동물 세포 (13)이 완전히 원통형 (혹은 U 자형을)를 사용 형상 효율적 12 분열 효모의 고정화를위한 최적의 형태를 모양의 있었다. 이는 생명 공학 연구에서 잠재적 애플리케이션과 상이한 골격 약물의 효과를 테스트 할 수 있었다. 이것은 개발 방법의 유연성 및 신뢰성을 보여준다.
또한, 세포의 고도로 정렬 된 배열이 허용하는단일 세포의 형광 쉽게, 자동 판독. 우리는 'eggcups'(도 8a)에서 GFP를 발현하는 NIH3T3 세포를 삽입하여이를 설명한다. 셀의 위치를 쉽게 인식 할 수 있고, 해당 발현 수준을 측정 하였다.도 8b는 형광 신호의 분포를 나타낸다. 이것은 (예를 들어 세포에서 면역 형광 리포터) 모든 판독에 적용될 수있다.
그림 1 : 'eggcups'의 제작 (a)에 복제 성형에 의해 'eggcups'의 제작 과정의 도식 설명 :. (내가)는 SU-8 금형에 액체 PDMS를 붓고을 치료. (ⅱ) 스탬프를 잘라 표면에서 조심스럽게 제거, 다음을 silanization합니다 그것을 활성화 프라즈마. (ⅲ) 실란 화 스탬프 온 액체 PDMS를 붓고PDMS 박막 층을 얻기 위해이를 원심 거라고. (ⅳ) PDMS 층을 경화 한 후, 플라즈마가 모두 상기 PDMS 덮여 스탬프와 유리 커버 슬립을 활성화. (V) 플라즈마는 부드럽고 균일 한 압력을 적용하여 동시에 결합한다. (ⅵ) 플라즈마 본딩 후, 조심스럽게 'eggcups'면을 발견 할 수있는 스탬프를 제거합니다. (ⅶ), 다음 단계의 처리를 단순화 작은 PDMS 핸들 부분을 추가합니다. 액체 PDMS와 함께 접착 및 (VIII) 오븐에서 다음을 치료하여 커버 슬립에 PDMS 조각을 결합한다. (b)는 PDMS 'eggcups'와 손잡이와 25mm의 coverslip에의 이미지입니다. PDMS 'eggcups'의 (c) 주사 전자 현미경 사진. 'eggcups'의 중심 사이의 거리가 30 μm의, 그들의 직경 약 25 μm의. (왼쪽) 상위 뷰입니다. (오른쪽) 'Eggcups는'이미지로 절단하는 내부. 경쟁하려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 WA 더 큰 버전.
그림 2 (a)는 EC 작성에 필요한 요소입니다. (1) 50 ㎖ 튜브; (2) 원통형 조각 (상단과 측면보기); (3) 세포 배양 배지; (4) 'eggcups'; (5) 날카로운 핀셋. (b) 상기 EC 작성 절차의 개략도. (I)의 원통형 부분은 먼저 50 ㎖ 튜브에 넣고 세포 배양 배지 13 ㎖로 충전된다. 다음으로, (ii) 상기 'eggcups은'살짝 PDMS 작은 조각을 사용하여 EC를 조작 날카로운 핀셋을 이용하여 상기 원통형 부재의 상부에 증착된다. (ⅲ) 적절한 밀도로 세포를 EC 위에 피펫 팅한다. (ⅳ) 세포를 원심 분리에 의한 'eggcups'에서 소개된다. (V) 마지막으로, 시료를 부드럽게 튜브로부터 해제하고 사용 준비가된다. m / 파일 / ftp_upload / 51880 / 51880fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 3D 'eggcups'및 2D 평면에 세포 표현형의 비교. 공 초점 현미경 (25X 물 대물 0.95 NA 라이카) (a) EC에 NIH3T3 세포 정렬 된 어레이를 형성하여 균일 한 구형의 표현형을 도시하고, (b) 표준 2D 평면 배양에서의 이미지, 임의로 이종 표현형 배포. 세포 (녹색) 액틴을 위해 염색, 골지체 (오렌지)과 핵 (파란색). 스케일 바는 100 μm의 =. WT 및 Blebbistatin 처리 된 세포 평평한 표면에 EC 및 (d)에 세포의 (c)는 3D 재구성. 스케일 바는 20 μm의 =.880 / 51880fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : NIH3T3 Golgi기구 표현형 연구 (A) 평면 및 (b) EC에 셀에 대한 골지 표현형 분류의 회로도 및 샘플 이미지입니다.. 세포는 α-값에 따라 확장 또는 조각, 압축으로 분류 하였다. 골지 표현형 (c) 정량. 스케일 바는 10 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 :
그림 6 : 라이브 고정 샘플 및 'eggcups'를 사용하여 두 시스템에서 cytokinetic 반지의 자세한 연구 표준 2D 체외 배양를 사용하여 cytokinetic 링의 (a)는 시간 순서.. (녹색 태그 GFP) 액틴 (Lifeact-mcherry, 적색)과 미오신 만이 밝은 점은 헬라 세포의 분열 밭고랑 (스케일 바 = 10 μm의)에서 볼 수 있습니다. 'eggcups'를 이용하여 유사 분열 동안 HeLa 세포에 cytokinetic 링 클로저의 (b)는 시간 순서. 이미지는 (빨간색) 액틴과 미오신 (녹색)를 보여줍니다. 'Eggcups'는 여전히 미오신 축적의 식별을 할 수 있습니다. 하나의 예는 화살표로 강조 표시됩니다. (스케일 바 = 5 μm의). (다) cytokinetic 링도 분열 효모으로 시각화 할 수있다. (왼쪽) 세포는 평평한 표면에 거짓말의 사이토 운동 반지는 두 개의 점으로 만 볼 수 있습니다 'eggcups'에서 (오른쪽) 셀 :. 전체 폐쇄 캡처 할 수 있습니다. 굴지는 CHD-GFP (스케일 바 = 2 μm의)으로 표시됩니다. 분 시간 : 초. (D - E) 염색 cytokinetic 고리의 예. 헬라 세포를 표현 (d)는 액틴-GFP는 링 (스케일 바 = 5 μm의)에 신호를 보여줍니다 포스 (PY)에 대한 스테인드된다. GFP를 표현 (전자) 헬라 세포는 마이 오신과 Lifeact-mcherry (말라가) anillin에 대한 염색 태그. Anillin은 cytokinetic 링과 피질에 덜 집중에 현지화 드러났습니다. 그것은 액틴과 미오신 (스케일 바 = 5 μm의)와 공동 현지화를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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도 7. 기타 세포 유형과 모델 시스템으로 'eggcups'적용 (a) U2OS (인간 골육종). 삽입 된이 분할 셀을 보여줍니다. (스케일 바 = 20 μm의). (b) GFP를 발현하는 NIH3T3 세포. 발현 수준의 차이는 쉽게 (스케일 바 = 20 μm의) 판독 할 수있다. (다) SW480 세포 (스케일 바 = 20 μm의). (d)에 신진 효모; 그 사이클 시간은 변하지 않는다. (스케일 바 = 10 μm의). (마) C. 엘레 웜,. 평평한 표면에 (왼쪽) (오른쪽) 'eggcups'에서, 배아는 달리 숨겨진 관점에서 볼 수있다. (스케일 바는 10 μm의 =). 분 시간 :. 초 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 : 'eggcups'의 배열의 조직은 세포 인구의 자동화 된 분석을 할 수의 (a) EC에 NIH3T3 세포 (스케일 바 = 20 μm의).. 그들은 GFP의 상이한 발현 수준을 갖는다. (b) 셀의 위치의 자동 인식은 발현 수준의 각각의 분석을 허용한다. 그것은 세포 인구의 GFP 발현의 히스토그램에 요약되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 모델 시스템 | 유형 | 문화 매체 | 관측 중간 | 'eggcups'직경 (μ;엠) | 댓글 / 설명 |
| 포유 동물 세포 | NIH3T3 | 10 % BCS 고 글루코스 DMEM | 10 % BCS의 L-15 | (20) | 기타 안정 등 REF52 또는 MDCK 세포주로서뿐만 아니라, 차 세포주, 암 세포 및 / 또는 줄기 세포는 'eggcups'에 삽입 될 수있다. |
| 헬라 | 10 % FCS 하이 글루코스 DMEM | 10 % FCS L-15 | (25) | 여러 소스에서 사용할 수 있습니다. | |
| U2OS | 10 % FCS 하이 글루코스 DMEM | 10 % FCS L-15 | 20 ~ 25 | 여러 소스에서 사용할 수 있습니다. | |
| SW480 | 10 % FCS 하이 글루코스 DMEM | 10 % FCS L-15 | 17 ~ 20 | 여러 소스에서 사용할 수 있습니다. | |
| 누룩 | 분열 효모 | 한천플레이트 (YE5S) 및 액체 미디어 (YE5S 및 EMM5S) | 필터 살균 EMM 미디어 (물질의 목록 참조) | (5) | 표면 접착 단백질로 작용 화 될 필요가 없다. |
| 신진 효모 | 한천 플레이트 (YPD)와 액체 미디어 (YEPD과 SD) | SD 미디어 | (5) | 표면 접착 단백질로 작용 화 될 필요가 없다. | |
| 태아 | C. 엘레 | NGM 판 | 초순수 | (25) | 대안 M9 배지 장기 실험에 사용될 수있다. 이 소금 용액의 조리법은 여기에서 찾을 수 있습니다 : http://cshprotocols.cshlp.org/content/2009/5/pdb.rec11798.full?text_only=true |
표 1 : 다른 모델 시스템 'eggcups'문화 조건. 상기 관련 프로토콜을 용이하게 적용될 수있다단지 설명 배양 조건으로 'eggcups'의 사이즈를 교체하여.
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Discussion
복제 성형은 'eggcups'를 제조하기 위해 사용 하였다. 제조 공정은 클린 룸을 필요로하지 않는다; 연습이 필요할 수 있지만 그것은 쉽고 간단합니다. 특히, PDMS 스탬프을 떼면 고품질 'eggcups'의 넓은 영역을 생성하기 위해 가장 중요한 단계이다. 이 때문에, 특별한주의가이 단계에서 수행되어야한다. 이 단계를 반복하여 실패한 경우, 실란 화 플라즈마 결합 전에 플라즈마 클리너 파라미터를 최적화하기 위해 고려한다. 부족 실란 화는 PDMS 필름에 스탬프의 강한 고집으로 이어질 것입니다. 이 관찰되면 silanizing 시약 배양 시간이 증가 될 수있다. 다른 기술 및 물질 리간드 (피브로넥틴, 젤라틴, 콜라겐, 등)의 넓은 범위에 작용 화 될 수있는 'eggcups'를 제조하는데 적용될 수 있다는 것을 유의하여야한다. 특히 폴리스티렌 마이크로 공동 용이 CUS 의해 제조 될 수있다핫 엠보싱 기술을 톰-했다. 이 표준 배양 접시에서 얻어진 결과 생체 적합성과 직접 비교를 보장합니다. 마찬가지로, 특별한 보호와 연습 충전 비율을 최적화하기 위해 필요합니다. 특히, 헹굼 단계는 상기 신호의 노이즈 및 배경에 기여 세포없이 과량의 적절한 충전을 보장하기 위해 중요하다. 세포 공동으로부터 용이하게 제거하는 경우, 공동의 크기 또는 깊이를 변경 고려한다.
'Eggcups'는 간단한 프로토콜을 사용하여 세포 및 하이 콘텐츠 스크리닝 분석법을 3 차원 형상의 구조를 제공한다. 표준 배양 분석을 이용하여 세포 내 소기관 알려지지 활성 프로세스 쉽게 개별 마이크로 공동 ( 'eggcups')에 단 전지의 삽입에 의해 시각화 될 수있다. 모델 시스템에 따라, 크기, 형상 및 치수가 쉽게 구성 될 수있다. 이러한 방식으로 포유 동물의 세포 분열 효모, 신진 효모와 C. 간스의 C는 조작과 공부, 이러한 초파리, 생쥐 또는 체외 수정을위한 인간 배아, 또는 예를 들어 줄기 세포로뿐만 아니라 배아.
이 설정에서 단일 세포 캡처됩니다. 이는 생체 내에서 발생하는 상피 조직과 대조적이다. 그러나, 이러한 환경은 더 유연한 탄성을 이용한 세포 - 세포 접촉을 모방 cadherins와 측벽을 피복하여 우리 'eggcups'에서 복제 될 수있다. 초점 콘택트는 웰의 바닥에 피브로넥틴의 증착에 의해 촉진된다. 접착 분자의 이러한 각각의 배포판은 생체 내에서 발생 셀룰러 환경을 재현 허용해야합니다. 이 방법으로 하나는 생리 학적 조건에 접근합니다.
우리의 분석에서 중간 교환이 보장된다. 때문에 매체 교환의 부족으로 단기 및 장기 모두 실험을 수행 할 때 EC의 세포는 어떤 저하를 표시하지 않습니다. 또한 EC의 캘리포니아에서 그 세포를 참고개별 세포 또는 배아 캐비티 내에 격리 될 때 주요 관심사이지만 N 합류점까지 배양.
세포 기관 또는 전체 유기체의 방향은 새로운 정보를 공개한다. 우리는 cytokinetic 링에서 액틴과 미오신의 다른 역학을 보여줍니다. 분열 효모와 포유 동물 세포에서 cytokinetic 링이 유사한 주요 구성 요소로 구성되어 있지만, 우리는 특정 역학 17 다르다는 것을,이 설정으로 표시됩니다. 이 두 시스템의 폐지기구뿐만 아니라 다른 것을 상기 결과를지지한다. 개발하고 이러한 가설을 조사하기 위해, 세포의 배향이 불가결하다. 앞으로의 연구에서,이 장치는 세포 조직을 소기관 관련된 다른 사건을 조사 할 수있다.
그건 그렇고,이 기술은 발달 생물학에서 잘 사용 될 수 있습니다. 배아 신장 쉽게 관찰 배향 또는 상기 정의 된 방향으로 처리 될 수있다.아마 우리의 분석은 태아의 극성을 부과하지 것이지만, 높은 충전 비율을 확실하게 원하는 판독을 추출 할 수있다. 전부 'eggcups는'높은 콘텐츠 상영을위한 좋은 장치가 될 수있다.
다른 배양 분석이 제안되어있다. 이러한 방법은 동일 형상의 미세 패턴 접착 주제에 기탁 하나의 셀에 멀티 웰 플레이트에서 2D 치수, 여러 세포 이르기까지 다양합니다. 그러나 그들 중 누구도 세포 소기관과 역학 과정 (1)의 관찰에 위에서 설명한 한계를 극복하는 것이 적절하지 않습니다.
우리의 시스템에 대한 향후 개선은 산업 중심의 목적에 'eggcups'의 적용을 허용합니다. 예를 들어, 제약 회사의 신약 스크리닝 응용 프로그램은 멀티 웰 플레이트 14,28의 사용을 필요로; 이러한 플랫폼에 'eggcups'를 구현하는 것은 잠재적으로 신뢰성을 향상시킬테스트 및 결과. 이러한 높은 콘텐츠 심사 분석은 로봇을 사용하여 제약 회사 (학술 연구소)의 일반적으로 사용되는이 자동화 프로세스를 사용하여 수행 될 수있는 바와 같이. 이것은 낮은 변동성과 반복성과 안정성을 보장합니다. 3D 세포 배양 분석에 따라 일부 상용 제품은 이미 분석의이 종류의 중요성을 강조 시장에 등장했다. 마지막으로, 이러한 장치는 맞춤 의학에 대한 새로운 관점을 엽니 환자에서 세포 'eggcups'에 배치 될 수 있고, 치료 칵테일은 생리 학적 환경에서 테스트 될 수있다; 바이오 마커 판독 환자 (29)에게 제공 할 수있는 최적의 치료를 예상 할 수 있습니다. 전부 세포와 배아의 물리적 형태는 공동의 아키텍처를 안내하고 있으며, 우리는 장치 및이 방법이 널리 미래에 확산 될 수 있기를 바랍니다.
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
우리는 안티 Giantin 항체, M. Labouesse 랩으로 우리를 제공하기위한 L. Brino (IGBMC 높은 콘텐츠 상영 시설하여 Illkirch, 프랑스)을 인정합니다. C.에 대한 간스 (IGBMC)와 B Séraphin 연구소. 효모 (IGBMC), 분열 효모 세포에 대한 형광 HeLa 세포 (MPI-CBG, 드레스덴), J. 모슬리 (다트머스 의과 대학)와 JQ 우 (오하이오 주립 대학)에 대한 E. Paluch 및 A. 하이 먼 신진에 대한; A. Hoël과 실험 도움 F. Evenou, 기술 지원을위한 C. 릭 (IBMC, 스트라스부르, 프랑스), 및 미세에 도움 JC Jeannot (펨토 - 일, 프랑스). 이 작품은 CNRS, 스트라스부르 대학, Conectus에서 기금에 의해 지원되었다, 라 파운데이션 부문은 라 공들인 MEDICALE와 스트라스부르의 CI-FRC를 붓는다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ddH20 (ultrapure) | Millipore | - | Use always fresh water. |
| Parafilm (plastic film) | Bemis | PM-999 | Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness. |
| Photo-mask | Selba | - | http://www.selba.ch |
| Silicon wafer | Siltronix | - | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 photoresist | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| SU-8 developer | MicroChem | - | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA |
| Available from multiple companies. | |||
| Sigmacote (siliconizing reagent ) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR |
| harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Chlorotrimethylsilane (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition | |||
| Nitrile gloves | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Available from multiple companies. | |||
| Glass coverslips #0 | Knittel glass | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Very fragile. Manipulate gently. | |||
| Sharp straight tweezers | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Available from multiple companies. | |||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN |
| The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies. | |||
| Microscope glass slides | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Available from multiple companies. | |||
| DMEM high-glucose medium | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Bovine calf serum | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS 1x | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O | |||
| L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Medium for atmospheres without CO2 control | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Penicillin & Streptomycin | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM |
| Petri dish P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
| Petri dish P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Petri dish P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldehyde 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr®ion=FR |
| Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 |
| dissolve powder in 1.5 ml methanol | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 dilution in PBS 1x |
| rabbit polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 dilution in PBS 1x |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
| rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). | 1:500 dilution in PBS 1x | |
| Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 goat anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1,000 dilution in PBS 1x | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr®ion=FR |
| 1 mg/ml for 1 min | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| HeLa cells | - | - | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| NIH3T3 cells | ATCC | - | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| Fission yeast | - | - | For details on strains, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| C. elegans worms | - | - | For details, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| YES (Agar) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| YES (Media) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search |
| For preparation: follow the instructions as given on the box | |||
| EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence. |
| Supplements (for EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search |
| (Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering) | |||
| Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters | Millipore | - | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
References
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