Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Заказ отдельных клеток и Single зародышами в 3D конфайнмента: Новое устройство для высокого содержания скрининга

Published: September 18, 2016 doi: 10.3791/51880
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Laboratory of Cell Physics, Institut de Science et d'Ingénierie Supramoléculaires (ISIS), CNRS and Université de Strasbourg, 2Development and Stem Cells Program, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC), CNRS and Université de Strasbourg

Summary

Мы сообщаем устройство и новый способ для изучения клеток и эмбрионов. Отдельные клетки точно упорядочены в микрополости массивах. Их 3D заключение является шагом на пути к 3D-средах, встречающихся в физиологических условиях и позволяет ориентации органелл. Контролируя форму клетки, эта установка сводит к минимуму изменчивость сообщили в стандартных анализах.

Abstract

Биологические клетки обычно наблюдаются на плоских (2D) поверхностей. Это условие не является физиологическим, и фенотипы и формы весьма разнообразны. Скрининг на основе клеток в таких средах, имеют поэтому серьезные ограничения: клеточные органеллы показывают крайние фенотипы, клеточные морфологию и размеры являются гетерогенными и / или специфических органелл клетки не могут быть должным образом визуализировать. Кроме того, клетки в естественных условиях находятся в 3D - среде; В этой ситуации, клетки показывают различные фенотипы в основном из-за их взаимодействия с окружающей внеклеточного матрикса ткани. Для того , чтобы стандартизировать и произвести заказ единичных клеток в физиологически соответствующей 3D - среде для клеточных анализов, мы сообщаем здесь микротехнологий и применения устройства для экстракорпорального 3D культуры клеток. Это устройство состоит из 2D - массив микрорезонаторами (обычно 10 5 полостей / см 2), каждый из которых заполнен одиночных клеток или эмбрионов. Cell позитивции, форма, полярность и внутренняя организация клеток становится затем нормализуется, показывающий 3D архитектуру. Мы использовали реплики формования с рисунком массив микрорезонаторах, 'eggcups', на тонкую полидиметилсилоксана (PDMS) слой придерживалась на покровное. Полости были покрыты фибронектином, чтобы облегчить адгезию. Клетки были вставлены с помощью центрифугирования. Начинка процент был оптимизирован для каждой системы, позволяющей до 80%. Клеток и эмбрионов жизнеспособность была подтверждена. Мы применили эту методику для визуализации клеточных органелл, таких как ядро ​​и Гольджи, а также изучить активные процессы, такие как закрытие cytokinetic кольца во время клеточного митоза. Это устройство позволило идентифицировать новые функции, такие как периодические накопления и неоднородности миозина и актина во время cytokinetic замыканию кольца и уплотненных фенотипов для Гольджи и ядра выравнивания. Мы охарактеризовали метод для клеток млекопитающих, делящихся дрожжей, многообещающий дрожжей, C. Элеганс шIth конкретных адаптации в каждом конкретном случае. Наконец, характеристики этого устройства делают его особенно интересным для скрининга лекарственных средств анализов и персонализированной медицины.

Introduction

Ток в пробирке клеток на основе анализов являются двухмерными (2D). Эта конфигурация не является естественным для клеток млекопитающих и , следовательно, не является физиологически отношение 1; клетки показывают разнообразие форм, размеров и гетерогенных фенотипов. Они представляют собой дополнительные серьезные ограничения при применении к скрининговых приложений, таких как неупорядоченного распределения в плоскости и экстремальных фенотипов клеточных органелл (стрессовых волокон, в частности). Это особенно важно в клинических исследованиях для тестирования на наркотики, где тратятся высокие бюджеты каждый год. Большинство из этих препаратов, хотя терпеть неудачу при применении к модели на животных из-за искусственного 2D условиях культивирования на ранних стадиях скрининга лекарственных средств. Кроме того, с помощью этого подхода, специфические клеточные органеллы могут не быть должным образом визуализировать, такие как cytokinetic актомиозиновом кольца во время клеточного митоза, и как правило, структуры, которые развиваются в плоскости, перпендикулярной к плоскости наблюдения. Некоторыеновые 2D анализы были предложены для того , чтобы преодолеть вышеупомянутые недостатки и важные идеи по организации цитоскелета были обнаружены 2,3. Тем не менее, эти анализы до сих пор представляют одно серьезное ограничение: клетки показывают очень распространенное фенотип , в отличие от того , что наблюдается в естественных условиях, где клетки , присутствующие 3D - архитектуру. Эти артефакты , связанные с методом культивирования может вызвать не-физиологические особенности , такие как расширенные стрессовые волокна 1,4,5.

Трехмерные анализы клеточных культур обеспечивают множество преимуществ по сравнению с 2D - среды 6,7. Они являются физиологически более актуальной, и результаты поэтому имеет смысл. В качестве примера, клетки , встроенные в гидрогели показывают 3D-подобные структуры , но их морфологию отличаются от одной клетки к другой 8,9. Тем не менее, их морфологию отличаются от одной клетки к другой, что затрудняет скрининговые приложений. Альтернативной стратегией является внедрение единогоКлетки в микроизготовленном полости 10,11. Положение клеток, форма, полярность и внутренняя организация ячейка может затем стать нормализуется. Помимо обеспечения 3D-архитектуры , как к клеткам, микрорезонаторах также позволяет скрининговых исследований с высоким содержанием 10,12-14; отдельные клетки можно заказать в микрочипов и клеточных органелл и их эволюции можно наблюдать параллельно. Эта закономерность дает хорошую статистику с низким числом клеток и улучшению временных / пространственным разрешением. Полезные соединения легче идентифицировать достоверно.

В данном исследовании мы покажем изготовление и применение нового 3D-как системы с одной клетки культуры для высокопроизводительных контента скрининга приложений 10,12,13. Устройство состоит из массива эластомерных микрорезонаторах (10 5 полостей / см 2), придуманное 'eggcups' (ЕК). Размеры и общий объем ЕС в этой работе оптимизированы для типичного объема отдельных NIH3T3 и HeLa клетокво время клеточного деления. Морфология полостей - цилиндрической - выбирается так, чтобы правильно сориентировать формы клеток для визуализации активных процессов. Реплика литье используется для шаблона массив ЕС на тонкую полидиметилсилоксана (PDMS) слоя приклеена на стекло покровное 15,16. Клетки вводятся в ЕС центрифугированием. Мы сообщаем о наблюдении и нормализации клеточных органелл (актиновых стрессовых волокон, аппарат Гольджи и ядро) в 3D (ЕС) по сравнению с теми же клетками на 2D (плоских) поверхностей. Мы также сообщаем о наблюдении активных динамических процессов , таких как закрытие cytokinetic актомиозинового кольца во время клеточного митоза 17. Наконец, мы показываем результаты этой методологии на других системах с жесткими стенками, такими как многообещающий дрожжей, делящихся дрожжей и C. Элеганс эмбрионов что подтверждает применимость нашей методики к широкому спектру модельных систем.

Далее мы представляем подробный и исчерпывающий рrotocol для того, чтобы изготовить и применить 'eggcups' для 3D микротехнологий. Наш подход прост и не нуждается в чистой комнате. Мы ожидаем, что эта новая методика будет особенно интересен для скрининга лекарственных средств анализов и персонализированной медицины, в замене чашек Петри. И, наконец, наше устройство будет полезно для изучения распределения клеток реакций на внешние раздражители, например , при раке 18 или в области фундаментальных исследований 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. микротехнологий из '' Eggcups

  1. Изготовление мастера: микрорезонаторах Массив
    1. Нагреть 3 '' кремниевой пластины, а до 200 ° C, чтобы испарить любое присутствие влаги.
    2. Спин-пальто тонкий слой SU-8 фоторезиста. Регулировка громкости скорости смолы и прядения в зависимости от желаемой толщины и фоторезиста типа. Эта толщина будет диктовать глубину «eggcups» (ЕК). Для толстого слоя 30 мкм и SU-8 2025 года, спин-пальто при 2800 оборотах в минуту.
    3. Предварительно выпекать пластины при температуре 65 ° С в течение 1 мин (шаг 1 из 2) для толстого SU-8 2025 слоя 30 мкм. Адаптировать время, в зависимости от типа фоторезиста и желаемой толщины. Проверьте технический паспорт производителя для деталей.
    4. Предварительно выпекать пластины при 95 ° С в течение 3 мин (шаг 2 из 2) для толстого SU-8 2025 слоя 30 мкм. Адаптировать время, в зависимости от типа фоторезиста и желаемой толщины. Проверьте технический паспорт производителя для деталей.
    5. Загрузитена полупроводниковой пластине маски Aligner для УФ-облучения. Поместите маску фотолитографии на ней. Маска показывает картину круговых признаков (дисков) 20 мкм в диаметре. Обеспечить идеальный контакт друг между другом.
      Примечание: Разные производители предлагают фотолитографии маски. Пространственное разрешение будет определять окончательную стоимость. Ацетат маски обеспечивают приемлемое разрешение (≈10 мкм) при низких затратах. Хром маски обеспечивают более высокое разрешение, но являются более дорогими. Адаптации диаметры дисков (от маски фотолитографии) к объему клетки. Размеры дисков на маске будет определять диаметр полостей в устройстве. Малые диаметры приведет к низким наполнением; слишком большого диаметра не ограничится клеток. Для HeLa и NIH3T3 клетки, диаметры от 20 мкм до 25 мкм, предложены.
    6. Проверьте питание ультрафиолетовой лампы предварительного экспозиции и оптимизировать время экспозиции соответственно. Облучают (длина волны = 365 нм) в течение 41,5 сек (или оптимизированное время экспозиции) в250 мДж / см 2.
      Примечание: SU-8 2025 является отрицательным фоторезиста, что означает, что облученные области к УФ будут вылечены. В этом случае, круговые характеристики были черными и прозрачными остальные. Положительная фоторезиста работа в обратном порядке: не подвергавшихся воздействию регионы излечиваются. Выберите фоторезиста соответствующим образом, в зависимости от конструкции и фото-маску.
      Примечание: Защита глаз от УФ-излучения с соответствующими защитными очками.
    7. Удалить осторожно маску из фоторезиста слоя.
    8. Пост-выпекать пластины при температуре 65 ° С в течение 1 мин (шаг 1 из 2) для толстого SU-8 2025 слоя 30 мкм. Пост-выпекать пластины при 95 ° С в течение 3 мин (шаг 2 из 2) для толстого SU-8 2025 слоя 30 мкм. Адаптировать время, в зависимости от типа фоторезиста и желаемой толщины. Проверьте технический паспорт производителя для деталей. После того, как после выпечки, охлаждения пластины до комнатной температуры на скамейке около 1 мин.
    9. Поместите пластину в спин-нанесения покрытий и падение несколько мм СУ-8 разработчика для покрытиявся область пластины. Разработка в течение 2 мин, а затем спин-пальто при 1000 оборотах в минуту в течение 30 сек. Повторите эту процедуру трижды.
    10. Полоскание с 2-пропанола, чтобы обеспечить полное удаление неразвитой SU-8. Появление белых областей является показателем неполного развития. Если это так, повторите шаг в развивающихся дополнительное время.
    11. Миндальная карамель пластины при 200 ° С, чтобы обеспечить надежность изготавливаемых микроструктур. Этот шаг является необязательным.
    12. Храните 3 '' облатку с микроструктур внутри 94 мм х 15 мм полистирола чашку Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Там нет необходимости для обработки поверхности, в частности силанизацией, для последующих шагов.
  2. Изготовление полидиметилсилоксана (PDMS) Реплика: Столпы Массив
    1. Тщательно перемешать в соотношении 1:10 (вес / вес) сшивающего агента и форполимера в общей сложности 30 г внутрь 50 мл трубки.
      Примечание: Используя соотношение 1:10 (об / об) также работает.
    2. Центрифуга трубки на 1,800 мкг в течение 5 мин доудалить пузырьки воздуха.
    3. Отбросьте мягко на PDMS поверх микроструктур.
      Примечание: Если воздушные пузырьки появляются на этом этапе, Дега образец с использованием вакуумного насоса в течение 15-20 мин.
    4. Поместите образец в сушильном шкафу при температуре 65 ° С в течение 4 часов.
      Примечание: Время отверждения варьируется между пользователями и, вместе с сшивающего: форполимер пропорции. На этот раз будет диктовать жесткость PDMS. Рекомендуется, чтобы вылечить более 2 ч и придерживаться фиксированного времени отверждения.
    5. Используйте скальпель , чтобы аккуратно вырезать область интереса (штампом) около 1 см 2 , который включает в себя около 10 5 микрополостей или "eggcups".
      Примечание: Вырезать сначала PDMS, а затем, очистить его от нежно. Проверьте качество реплики PDMS с помощью оптического микроскопа.
  3. Изготовление '' eggcups путем реплики формования. В дальнейшем две альтернативные стратегии для изготовления «eggcups» описаны. Оба протокола являются Симилар и обеспечивают одинаковые результаты:
    1. Стратегия 1
      1. Активируйте изготовленную PDMS штамп плазменной обработкой кислородом в течение 30 сек. Хранить временно активированные штампы в закрытой чашке Петри, чтобы предотвратить осаждение пыли.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте время экспозиции при использовании других газов для плазмы.
      2. Поместите активированные ПДМС штамп вверх вверх (сторона со структурами) в чашке Петри рядом с крышкой трубки 15 мл. Заполните шапку с 200 мкл триметилхлорсилана (ТМЦ). Закройте чашку Петри и пусть гербовый silanize в течение 7 мин.
        Примечание: Некоторые временная деформация на штампе и / или изменения цвета (белого цвета) можно наблюдать. Марка будет восстанавливать свою первоначальную форму в короткие сроки и структуры, не будут затронуты.
        Примечание: ТМС вызывает острое ингаляционное и чрескожной токсичности, и легко воспламеняется (с ретроспекции зажигания, способного происходить на значительные расстояния). Следовательно, оно должно быть использовано в вытяжном шкафу вдали от источникаs зажигания.
      3. Поместите штамп PDMS на спин-для нанесения покрытий со структурами вверх вверх. Поместите небольшую каплю несколько микролитров (около 20 мкл) жидкого PDMS (1:10 вес / вес сшивающего агента: форполимер) на верхней части конструкции. Спин-пальто при 1500 оборотах в минуту в течение 30 секунд для нанесения тонким слоем PDMS поверх структур.
        Примечание: Если штамп не соответствует спин-Coater Chuck поместить штамп на вершине блюдо крышкой Петри с небольшим отверстием в центре.
      4. Поместите штамп в сушильном шкафу при температуре 65 ° С в течение 4 часов, чтобы вылечить осажденного спин-покрытием PDMS слой.
      5. Включите тонкий слой PDMS путем размещения PDMS штампа с ног вверх, вместе с покровным стеклом # 0 25 мм в диаметре, с использованием кислородной плазмы уборщика в течение 30 сек. быстро переходите к следующему шагу.
        Примечание: покровные с другими толщинами, формы и размеры могут быть использованы также. Тем не менее, некоторые клеточные структуры могут быть трудно визуализировать в зависимости от выбранной толщины покровного и цельувеличение и / или NA и / или рабочее расстояние. Проверьте объективный лист данных.
      6. Место в контакте штампа (сторона с тонким слоем спин-покрытием) с покровным стеклом. Пресс мягко по всей поверхности штампа с помощью пинцета, чтобы сделать «склеивание». И, наконец, поддержания постоянного давления на верхней части штампа около 10 сек.
      7. Через 30 минут аккуратно "кожуре" штамп из покровного для того , чтобы «освободить» «eggcups» (рисунок 1). Тщательно промыть этанолом и сушат. Если PDMS 'eggcups' не очень хорошо придерживалась на покровного стекла (т.е. они отделяют во время '' unpeeling шага), рассмотреть вопрос о корректировке параметров очистителя плазмы и перезапустить на этапе 1.3.1.5.
        Примечание: Этот шаг является деликатным. Обратите внимание, чтобы избежать поломки покровного стекла и / или отрыва тонкого слоя PDMS.
      8. Клей небольшой кусочек (ручка) излеченных PDMS 1 мм х 1мм х 3 мм в объеме на краю покровного стекла с небольшим каплю жидкости PDMS и вылечить PDMS, как и раньше. Это будет способствовать манипуляции образца после этого (см рисунок 1). Этот шаг является необязательным.
    2. Стратегия 2
      1. Гидрофилизации сфабрикованные PDMS штампы плазменной обработкой кислородом в течение 30 сек. Магазин временно активированные марки в закрытой чашке Петри, чтобы предотвратить осаждение пыли.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте время экспозиции при использовании других газов для плазмы.
      2. Гидрофилизации 25 мм стекла диаметром покровные # 0 кислорода плазменной обработки при 15 Вт в течение 30 сек. быстро переходите к следующему шагу.
        Примечание: покровные с другими толщинами, формы и размеры могут быть использованы также. Тем не менее, клеточные структуры будет трудно визуализировать в зависимости от выбранной толщины покровного и объективных характеристик (см примечание выше).
      3. Спин-пальто небольшой капли PDMS (1:10 вес / вес поперечной сшивки: предварительно PolYmer) из нескольких микролитров на покровные стекла. Спин-пальто при 1500 оборотах в минуту в течение 30 секунд для окончательной толщины около 50 мкм.
      4. Клей небольшой кусок (ручка) излеченных PDMS от 1 мм х 1 мм х 3 мм в объеме на краю покровного стекла с небольшим каплю жидкости PDMS и вылечить PDMS, как и раньше. Это будет способствовать манипуляции образца после этого (см рисунок 1). Этот шаг является необязательным.
      5. Магазин временно покровные PDMS-покрытием на чистую протереть внутри чашки Петри для защиты от осаждения пыли.
      6. Поместите каплю реагента silanizing на вершине каждой марки и дайте ему испариться в течение 1-2 мин. Затем высушить их в потоке N 2.
        Примечание: На этом этапе может наблюдаться временная деформация штампа в процессе испарения. Марка будет восстанавливать свою первоначальную форму после сушки с N 2 без остаточной деформации микроструктур.
      7. Отбросьте очень мягко Силанизированные печать поверхPDMS-спин покрытием покровного стекла, хранящуюся в чашке Петри. Убедитесь в том, что обе стороны полностью параллельно во время контакта. Избегайте нажатия или перемещения штампа после размещения его на покровное PDMS покрытием.
      8. Поместите чашку Петри с образцами в вакууме в течение 1-2 ч, чтобы удалить пузырьки воздуха.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, что образцы полностью горизонтально, чтобы избежать смещения штампа. Избегайте также колебания, которые могут вызваны вакуумным насосом.
      9. Поместите образцы в сушильном шкафу при температуре 65 ° С в течение 4 часов.
      10. Осторожно, снимите отметку, чтобы выявить "eggcups". Тщательно промыть этанолом и сушат.
        Примечание: Практика в этот момент необходим. Обратите внимание избежать поломки покровное и / или отрыва тонкого слоя PDMS.

2. Введение в клетки в "Eggcups"

Для того чтобы ввести клетки млекопитающих внутри 'eggcups', PDMS поверхности перед дл функционализации с адгезионными белками внеклеточного матрикса. В этом примере используется фибронектин, но другие белки, представляющие интерес, такие как коллаген, можно было бы использовать.

  1. Гидрофилизации 'eggcups' в кислородной плазме очистителя в течение 30 сек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизация параметров, если это необходимо.
  2. Приготовьте раствор в PBS 1x 20 мкг мл -1 фибронектин из источников говяжьи.
  3. Стерилизовать "eggcups" с УФ в течение 5 мин. Перевод небольшой капли (около 20-50 мкл) раствора фибронектина, чтобы покрыть всю область 'eggcups' и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Защита образца от высыхания.
  4. Полоскание мягко на '' eggcups с PBS 1x. Повторите 3 раза.
    Примечание: Образец готов немедленно или хранить использовать при температуре 4 ° С в темноте в течение нескольких недель.
  5. Введем цилиндрическую заказные пластиковый лист 63 мм в высоту, 26 мм и внешним радиусом 7 мм внутренних размеров радиуса в 50 мл трубки (смРисунок 2) 20
    ВНИМАНИЕ: Использование УФ-стерилизованные предметы или стерилизовать их перед использованием.
    Примечание: Эта часть может быть легко изготовлен в лабораторных условиях. или с помощью любого доступного машинного цеха.
  6. Поместите 13 мл клеточной культуральной среды внутри трубки (таблица 1). Среда должна заполнить по крайней мере, на 2 см выше цилиндрической части, чтобы обеспечить полное погружение образца.
    Примечание: Для получения дополнительной информации о конкретных типах клеток и других модельных систем , таких как дрожжи или C. Элеганс эмбрионов, а соответствующая среда , используемая, смотрите раздел 5 и в таблице 1. Описанный протокол был оптимизирован для HeLa, клетки NIH3T3, и других линий клеток (таблица 1).
  7. Введение очень осторожно анализировать "eggcups" внутри трубы и параллельно верхней стороне пластиковой части. Используйте острые щипчики для того чтобы держать образец, используя ручку PDMS. Нажмите мягко покровное, пока она лежит на верхней части верхней стороны пластмассовую деталь, ипсезам , он полностью погружен (рисунок 2).
    Примечание: Рекомендуется использовать острые и прямые пинцетом. С помощью пинцета изогнутыми, манипуляция образца затруднено и может привести к поломке.
  8. Культуры клеток до 80-100% слияния в P60 Петри и собрать их трипсином.
    Примечание: клетки могут быть дикого типа, трансфицированные или обрабатывают любым препаратом, представляющей интерес.
    Примечание: Во избежание образования клеточных агрегатов, которые позволят избежать отдельных клеток, чтобы войти в "eggcups". Для оптимизации этого шага, пипетки вверх и вниз после того, как тщательно трипсином.
  9. Повторное приостановить клеток в культуральной среде, 5 мл. Пипетировать 200 мкл клеток в верхней части "eggcups".
    Примечание: Отбросьте клетки, как по центру, как это возможно на вершине 'eggcups', но избежать физического контакта. Это позволит предотвратить поломки и / или повреждения образца.
  10. Центрифуга при 1800 мкг в течение 2 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После первого центрифугирования, проверьте в микрофонroscope заправочной процент "eggcups".
  11. Пипетка снова 200 мкл клеток в верхней части 'eggcups' и центрифуге при 1800 х г в течение 2 мин. Повторить в общей сложности три раза, чтобы оптимизировать процент заполнения.
    Примечание: После последнего центрифугирования, проверить с помощью микроскопа заправочной процент "eggcups". При необходимости, повторите наполняющего + центрифугирования шаги до достижения желаемого процентного заполнения.
  12. Удалить образец из пробирки, используя острые щипчики, удерживающие ручку PDMS. Убедитесь в том , чтобы быть осторожным в не «возмущающих» клеток , которые проводятся в «eggcups» (рисунок 2).
  13. Поместите образец в чашку Петри со средой. Ополосните, чтобы удалить избыток клеток, которые не являются в "eggcups 'пипетированием вверх и вниз три раза аккуратно рядом с каждой стороны (всего 4 стороны) массива микроструктурой.
    Примечание: Раскапывание слишком сильно может освободитьнекоторые клетки из 'eggcups'.
  14. Замените среду свежей средой для удаления nonattached клеток.
    Примечание: На этом этапе можно добавить препарат интерес.
  15. Fix клетки или подготовить их к покадровой стадии imaging.See 4.1.

3. Наблюдение активной клеточной динамики в «Eggcups»: Cytokinetic кольцо Закрытие

Примечание: В этом примере используются клетки HeLa, которые трансфицированы MYH10-GFP и Lifeact-mcherry для миозина и актина, соответственно, ключевые активные молекулы, участвующие в cytokinetic замыканию кольца во время клеточного митоза. Устройство готовят с микрополостях 25 мкм в диаметре. Для их наблюдения, был использован эпифлуоресцентной инвертированный микроскоп, оснащенный объективом масла 60X (1.40 NA, ДИК, Plan Apo) и GFP (миозин) и TxRed (актиновых) фильтры. В качестве альтернативы был использован в вертикальном положении конфокальный микроскоп, оснащенный 25X или цели L воды 63X НСХ ИК APO (0,95 NA). Для этого EXAmple, настоятельно рекомендуется синхронизировать клетки с помощью двойной блок тимидина, митотический блок или митотическую вытряхиваемого метод 21-24.
Примечание: Толщина PDMS, используемых для «eggcups» позволяет использовать разнообразие целей как в перевернутой и вертикально расположенных микроскопов.

  1. Место '' eggcups в держатель микроскопа и залейте его 1 мл 10% FCS L-15 наблюдений среды. Для того, чтобы избежать испарения, поместите стеклянную крышку на верхней части держателя или нанести тонкий слой минерального масла поверх medium.Select объектива 60X нефти.
    Примечание: L-15 среда является достаточным для не-СО 2 атмосферы. Отметим также, что некоторые соединения DMEM являются авто- флуоресцентный. При использовании этой среды, рекомендуется photobleach флуоресцентные соединения, при освещении его с высокой лампой интенсивности в течение 1-2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования пластиковых крышек при работе с изображениями DIC.
  2. Поместите держатель с 'eggcups' и obserвации среда в микроскоп. Фокус осторожно с использованием светлого света до тех 'eggcups', и клетки находятся в одной плоскости наблюдения.
  3. Откройте программное обеспечение и настроить параметры. Выберите фильтры TxRed и GFP для актина и миозина; отрегулировать время экспозиции для каждого канала. Типичная скорость приема составляет 5 сек для обоих каналов.
    Примечание: Время экспозиции, возможно, придется быть скорректирована в зависимости от настроек используемого красителя или других клеточных органелл, представляющих интерес.
  4. Выберите интересующую область и искать для cytokinetic кольца, используя либо GFP или канал TxRed. Фокус точно.
    Примечание: Кольцо острее в миозина и легче распознать.
  5. Запуск автоматического приобретения в обоих каналах, пока кольцо не будет полностью закрыта.
    Примечание: могут наблюдаться некоторые фотообесцвечивание. Отрегулируйте параметры микроскопа, чтобы уменьшить его.

4. Наблюдение стационарных клеточных органелл в "Eggcups"

Этот шаг может быть выполнена до или после того, как шаг # 3. Клетки могут быть непосредственно фиксированной после стадии центрифугирования и окрашивают для органеллы интереса или после наблюдения в микроскоп. Этот пример показывает окрашивание Гольджи, ядра и актиновых волокон на NIH3T3 фибробластов в "eggcups".

  1. Фиксацию клеток в "Eggcups"
    1. Подготовьте 3% параформальдегида (PFA) и теплым при температуре 37 ° C. Удалить образец '' eggcups из 50 мл трубки (или держатель микроскопа) и поместите его внутри P35 Петри. Полоскание один раз с PBS 1X.
      Примечание: Протоколы для подготовки 3% параформальдегидом широко доступны в другом месте.
      ВНИМАНИЕ: во время подготовки PFA Используйте нитриловые перчатки и защитные очки.
    2. Удалить полностью в PBS и падение 1 мл 3% PFA и инкубировать в течение 17 мин. Удалите PFA и дважды промыть 1 мл PBS 1X. Клетки проницаемыми с использованием 1 мл 0,5% Тритв течение 3 мин и мыть два раза с PBS 1X в течение 5 мин.
  2. Окрашивание клеток в "Eggcups"
    1. Инкубируйте клетки для Гольджи окрашивания с первичным антителом кроличьей поликлональной анти-Giantin в разведении 1: 500 в PBS. Поместите каплю 100 мкл раствора антитела на пластиковый пленочный лист и инкубировать ячейки внутри "eggcups" вверх дном в течение 45 мин.
      Примечание: Защита образца с крышкой для предотвращения высыхания.
    2. Осторожно освободите "Eggcups" и поместить их в P35 Петри. Промыть 3 раза, 5 мин каждый, с PBS 1x.
    3. Готовят коктейль в PBS с вторичным антителом Су3 козы к антителам кролика (1: 1000), а также с фаллоидином Alexa Fluor 488 (1: 200) для окрашивания актиновых стрессовых волокон.
    4. Инкубируйте клетки с каплей 100 мкл раствора антитела на пластиковый пленочный лист и инкубировать клетки внутри "eggcups" вверх дном в течение 45 мин.
    5. Выпуск тщательно 'eggcвзлетов "и поместить их в P35 Петри. Промыть 3 раза, 5 мин каждый, с PBS 1x.
    6. Инкубируйте клетки для ядра окрашиванием размещения капли 100 мкл 1 мкг мл -1 DAPI в PBS на пластиковый пленочный лист и инкубировать клетки внутри "eggcups" вверх дном в течение 45 мин. Этот шаг может быть выполнен с шагом 4.2.3.
    7. Осторожно освободите "eggcups" и поместить их в P35 Петри. Промыть 3 раза, 5 мин каждый, с PBS 1x.
    8. Клетки Mount, используя 15 мкл глицерина PBS (1: 1 об / об) на стандартном микроскопа стекло и уплотнение образца с лаком для ногтей, чтобы избежать высыхания.
      Примечание: В зависимости от толщины 'eggcups', монтаж может быть затруднено. Рекомендуется хранить затем образец в P35 Петри в PBS, защищенном от высыхания.
  3. Микроскоп Наблюдение
    Примечание: В данном примере используется в вертикальном положении конфокальный микроскоп, оснащенный PMT и гибридных детекторов. 25X или 63 Цель л воды X НСХ ИК APO (0,95 NA) был выбран, чтобы обеспечить широкое поле образца и показать применимость устройства для высокого содержания скрининга приложений.
    1. Выбор цели в 25X или 63X воды.
      Примечание: Различные цели могут быть использованы в зависимости от применения и сигнала. Но рекомендуется использование высоких целей числовой апертуры.
    2. Поместите установленного образца с «eggcups» и сосредоточиться осторожно, используя свет светлого (фазового контраста или DIC) до '' eggcups и клетки находятся в плоскости наблюдения.
    3. Откройте программное обеспечение и настроить параметры. Выберите фильтры GFP, Cy3 и DAPI для актина, Гольджи и ядро ​​наблюдения, соответственно; отрегулировать время экспозиции для всех каналов.
      Примечание: Время экспозиции, возможно, придется быть скорректированы в зависимости от настройки.
    4. Выберите и сфокусировать интересующую область; начать захват изображения (смотри рисунок 3).
TLE "> 5. Адаптация для наблюдения дрожжевых клеток и C. Элеганс эмбрионов

  1. Деление и почкованием клетки дрожжей
    Примечание: В этом примере используются дрожжевые клетки деления, которые помечены RLC1-mcherry и КБС-GFP для миозина и актина, соответственно. Бутонизации дрожжевые клетки не флуоресцентную метку здесь. Для наблюдения делящихся дрожжей использовали перевернутый вращающийся диск конфокальной микроскопии. Объектив масла 100X HCX PL APO CS (1.4 NA) использовался для всех приобретений. В качестве альтернативы, клетки также наблюдали с использованием инвертированного фазового контрастного микроскопа оснащенную объективом 20X фазовым контрастом воздуха LCPlanFl (0,4 NA). В этом примере, протокол идентичен для обоих типов клеток.
    1. Подготовьте поверхность 'eggcups', как описано выше. Для деления и многообещающий дрожжевых клеток, подготовить полости 5 мкм в диаметре (см таблицу 1). В этом случае поверхность не должна быть функционализированные с адгезионными белками.
      Примечание: Наполнение чап быть оптимизированы с помощью конических 'eggcups'. Эта форма захватывает и удерживает клетки, избегая высвобождения во время полоскания стадии после центрифугирования. Заполнение процент оптимумом около 80%. Эти конические 'eggcups' могут быть изготовлены с помощью глубокой реактивное ионное травление 13.
    2. Культура клеток дрожжей в надлежащей культуральной среде (см таблицу 1) до достижения оптической плотности (OD) в диапазоне от 0,2 до 0,8. Разрушать ультразвуком культуры клеток дрожжей для удаления агрегатов.
    3. Вставьте дрожжевые клетки в «eggcups» путем центрифугирования. Для центрифугирования, 4 мл культивируемых клеток в соответствующей OD добавляется на трубку с 'eggcups'. После первого центрифугирования, осторожно встряхните пробирку, чтобы повторно приостанавливать клетки, которые не находятся в «eggcups», в то время как клетки в «eggcups» не нарушается. Не открывая трубки, центрифуга снова и повторить этот шаг дважды. Это обеспечивает осаждениеклеток из культуры в пустые микрополости и увеличит процент заполнения.
      Примечание: При работе с дрожжами, рекомендуется предварительно нагревать центрифуга до рабочей температуры во время экспериментов
      Примечание: Протокол может быть приостановлена ​​здесь и продолжалось до 12 часов позже. В этом случае, хранить образцы при рабочей температуре и покрыть ее, чтобы предотвратить испарение.
    4. Place 'eggcups' в держателе микроскопа и заполнить держатель с фильтром стерилизовать среды для работы с изображениями. Теперь промойте клетки с той же среде, пока клетки дрожжей, плавающие не будут удалены эффективно. Позаботьтесь, чтобы не нарушить клетки в "eggcups" во время процесса промывки.
    5. Выберите цель 100X масла и тщательно сосредоточиться. Откройте программное обеспечение и настроить параметры. Для получения делящихся дрожжей, выберите фильтры GFP и TxRed для актина и миозина и регулировать время экспозиции для обоих каналов. Типичная скорость приема составляет 3 сек.
      Примечание: В зависимости отфлуорофор, тип мечения и настройки, время экспозиции изменяется для других систем.
  2. C. Элеганс Эмбрион
    Примечание: В этом примере используется C. Элеганс эмбрионов шириной 25-30 мкм и длиной 50-55 мкм. Эмбрионы культивируют , как указано в 25. Простой визуальный протокол , как манипулировать C. Элеганс можно найти в 26. Наблюдение проводилось с использованием инвертированного фазово-контрастный микроскоп, оборудованный объективом воздуха 40X 0,55 NA.
    1. Подготовьте поверхность 'eggcups' , как описано выше , и 25 мкм в диаметре (см таблицу 1). В этом случае поверхность не должна быть функционализированные с адгезионными белками.
    2. Культура C. Элеганс эмбрионов в надлежащей культуральной среде (таблица 1).
    3. Вставьте эмбрионов в "eggcups" путем центрифугирования, как описано выше (смотри раздел 2.6 2.12) с использованием сверхчистой воды в качестве культуральной среды.
      Примечание: Эмбрионы "себя", как правило, в сверхчистой воде в течение всего срока эксперимента. В качестве альтернативы используют физиологический буфер М9 для долгосрочных экспериментов.
    4. Промыть образец, как описано выше (смотри раздел 2.14). Поместите 'eggcups' в держатель микроскопа. Выберите цель 40X воздуха и тщательно сосредоточиться. Откройте программное обеспечение и настроить параметры. Выберите скорость приема 3 сек.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В '' eggcups (ЭК) являются новая методология высокое содержание-скрининг, который позволяет визуализировать ориентированных клеток и эмбрионов в среде 3D. Кроме того, некоторые клеточные процессы, которые трудно наблюдать в стандартных 2D (плоских) культур, можно наблюдать с помощью этого нового метода. На рисунке 1а показана сводка процедуры для микротехнологий EC (см также раздел 1 в описанном выше протоколе ). Метод прост, быстро, эффективно и без каких - либо требований специального оборудования. Рисунок 1b и 1c показывает крупномасштабную картину и в увеличенном масштабе помощью сканирующего электронного микроскопа изображение 'eggcups' соответственно. Как можно заметить, их форма и размер очень регулярно. Этот метод очень гибкий; различные формы и размеры могут быть легко изготовлены и приспособлены для различных модельных системах. Размеры'eggcups' были выбраны следующим образом: размерыклеток, которые претерпевают деление были измерены на 2D поверхности: они имеют сферическую форму и диаметр их был взят в качестве хорошей индикации для диаметра EC. Клетки в'eggcups' удлиненных и Orient вдоль своей длинной оси во время клеточного деления, например. Этот размер зависит от системы - клеток и эмбрионов - так что этот аспект следует оценивать в каждом конкретном случае.

На рисунке 2 показан материал , необходимый (рисунок 2а) и протокол шаг за шагом (рис 2b) о том , как использовать 'eggcups' (см также раздел 2 в описанном выше протоколе). Наполнение ЕС с клетками, представляющим интерес (или других модельных систем) очень просто и быстро. Как правило, она занимает менее 20-30 мин, которая также включает в себя время для клеток трипсином. После заполнения, образцы могут быть использованы для изучения активных процессов (живой изображений) или могут быть зафиксированы и окрашивали для визуализации органеллах Интерей (смотри также разделы 3 и 4 в протоколе, описанном выше).

На плоских поверхностях, клетки демонстрируют гетерогенные реакции и крайние фенотипы клеточных органелл. На самом деле, было высказано предположение , что актиновые стрессовые волокна (и другие клеточные органеллы) являются артефактами условий культивирования 1. Для того чтобы доказать эту гипотезу, мы культивировали NIH3T3 клетки как на 'eggcups' 3D и на плоских поверхностях и сравнили фенотипы различных клеточных органелл, а именно актиновых стрессовых волокон, Гольджи и ядер. На рисунке 3 показан пример того , как организованы клетки на обеих конфигурациях. В ЕС, клетки распределены в упорядоченном массиве , показывающий однородную сферическую-подобный фенотип (рис 3а). На плоских поверхностях, клетки показывают типичную неупорядоченное, распространение и гетерогенную морфологию (рис 3b). Существуют также значительные различия в структурах цитоскелета. В частности, клетки на R16; eggcups 'показывают снижение количества стрессовых волокон по сравнению с плоскими поверхностями. Это подтверждается еще и в 3D реконструированы изображения , где нет четких напряжений волокна не видны (см Фигура 3С - d). Это подтверждает, что некоторые клеточные структуры увеличиваются в 2D культурах. Это также согласуется с данными наблюдений , проведенных в естественных условиях , где стресс волокна не могут быть идентифицированы.

Устройство Гольджи также показывает значительные различия в их фенотипа в зависимости от условий культивирования (смотри рисунок 4). Устройство Гольджи на 2D культурах , как правило , показывает расширенный фенотип "охватывает" периферии ядра , тогда как в «eggcups» он показывает более уплотненный фенотип (рис 4а - б). Для того, чтобы моделировать манипуляции скрининга лекарственных средств, мы также оценивали влияние препаратов на клетки, культивируемые на обеих средах. Мы выбрали Blebbistatin mainlу , потому что он разрушает актиновые стресс волокон и может иметь влияние на Гольджи морфологии (см Фигура 3С - d). Поскольку Гольджи расположен рядом с ядром клетки, этот препарат может также оказать влияние на его архитектуру. Сначала мы наблюдали , что клетки , обработанные этим препаратом показали менее регулярной и единообразным морфологии по сравнению с дикого типа (WT) клеток (смотри рисунок 3в - d). Затем мы сравнили и количественно фенотип Гольджи наблюдается на «eggcups» и на плоских поверхностях (смотри рисунок 4в). Мы заметили, что на 2D поверхности клетки показали в основном расширенный фенотип, тогда как на клетки 'eggcups' показали более уплотненный фенотип. Мы не наблюдали, хотя поразительное различие между WT и Blebbistatin-обработанных клеток.

И, наконец, на 2D поверхности в ядро ​​клетки случайным образом ориентированы в то время как для клеток в ЭК она ортогонально ориентированы относительно плоскости XY в обоихWT и Blebbistatin обработанных клеток (рис 5а - с). Это подчеркивает прочность устройства для ориентирования клеточных органеллах, подобно бывшим применения метода для ориентации плоскости наблюдения cytokinetic кольца в дрожжах и клетках млекопитающих 10,12,13. В конце концов мы изучали , как сферичность ядро (определяется как ψ = [π 1/3 6В N 2/3] / A N, где V п является объем ядра и А п площадь его поверхности) была затрагиваемой в зависимости от условий культивирования и при лечении клеток с Blebbistatin. на рисунке 5d показаны соответствующие распределения ф. Мы не наблюдали разницы для WT плоский против WT ЕС, который показывает , что ЕС не влияет на нормальную сферичности клеток. Тем не менее, мы наблюдалиразница при сравнении WT ЕК Blebb ЕС свидетельствует о том , что ЕС раскрывают реальное действие препарата , который маскируется в 2D.

исследования живых клеток с использованием 'eggcups' позволяют также выявление новых активных процессов, которые не видны в стандартных культурах. Мы высевали клетки в EC и визуализировали деление клеток. На рисунке 6 показана последовательность изображений cytokinetic замыканию кольца в процессе клеточного митоза. 'Eggcups' устройство позволяет полную визуализацию кольца, в то время как стандартные 2D культуры показывает только две области , в которых соответствует одной плоскости 10. Реконструкция кольца из последовательности изображений Z-стека с использованием 2D культур можно сделать 27, но важная информация теряется. Качество снижается из-за низкого разрешения г и динамических процессов не могут быть решены. Актина и миозина являются ключевыми белки в генерации силы клеточного деления. Их динамика не может бе и изучены изображается в 2D культуре (рис 6а), в то время как с «eggcups» он сразу же показал. Мы определили новые структуры и процессы: в клетках HeLa мы находим периодические скопления миозина 17. Эти скопления движутся радиально , как кольцо закрывается (рисунок 6б). В делящихся дрожжей мы также находим неоднородности в миозина и актина (рис 6в, справа) 17. В отличие от того, что мы видим в клетках HeLa, они вращаются на кольцо во время закрытия. Скорость находится в диапазоне мкм мин -1 и не будет разрешаться путем г реконструкции со стандартными микроскопами. Наконец cytokinetic кольцо может быть дополнительно изучены с помощью окрашивания для его компонентов. Мы обнаружили , что там происходит накопление фосфотирозина в непосредственной близости от кольца (рис 6D). Мы можем также показать , что anillin является colocalizing в кольце (рис 6е). Путем окрашивания клеток в этой ориентации, Wе показывают, что anillin показывает также неоднородное распределение.

В '' eggcups были также применены к различных модельных системах: мы сообщали клетки млекопитающих, делящихся дрожжей, но мы также протестировали многообещающий дрожжей и C. Элеганс (см рисунок 7а - е). В этом случае протокол был адаптирован для каждой конкретной системы с точки зрения культуральных сред, полостей размер и морфологию (таблица 1). В качестве примера, конический V -образный '' eggcups были оптимальная морфология для эффективного 12 иммобилизации делящихся дрожжей, а не полностью цилиндрические (или U-образную форму) форма используется для клеток млекопитающих 13. Это позволило испытывать влияние различных препаратов цитоскелета с потенциалом применения в Life Science исследования. Это демонстрирует гибкость и надежность разработанной методологии.

Кроме того, весьма упорядоченное расположение клеток позволяетлегко, автоматизированное считывание флуоресценции одиночных клеток. Проиллюстрируем это путем введения клеток NIH3T3 , экспрессирующие GFP в «eggcups» (рис 8а). Положение ячейки может быть легко узнаваемы и соответствующий уровень экспрессии измеряют. Рисунок 8b показывает распределение сигналов флуоресценции. Это может быть применен к любому считыванию (иммунофлюоресценции, флуоресцентных репортеры в клетках, например).

Рисунок 1
Рисунок 1: Изготовление 'eggcups' (а) Схематическое описание процедуры изготовления '' eggcups по реплике под давлением:. (I) проливать жидкость PDMS на СУ-8 плесени и вылечить его. (II) Вырежьте штамп и аккуратно удалите его с поверхности, а затем активировать его в плазме крови, чтобы silanize его. (III) проливать жидкость PDMS на силанизированы помечатьd центрифугируйте, чтобы получить тонкий слой PDMS. (IV) После отверждения слой PDMS, плазмы активации обоих, PDMS покрытую печать и покровного стекла. (V) Плазменный связывают как с применением нежную, гомогенную давление. (VI) После плазменного склеивания, удаления тщательно штамп, чтобы раскрыть поверхность 'eggcups. (VII) Для упрощения обработки в следующих шагах, добавить небольшой кусочек PDMS ручку. Свяжите кусок PDMS к покровным склеиванием его с жидкими PDMS и (VIII), вылечить его затем в духовке. (Б) Изображение 25 мм покровное с PDMS 'eggcups' и ручкой. (С) сканирующим электронным микроскопом изображения '' eggcups PDMS. Расстояние между центрами «eggcups» составляет 30 мкм, а их диаметр около 25 мкм. (Слева) Вид сверху. (Справа) '' Eggcups вырезают изображения внутренняя часть. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы ви ва большую версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: (а) элементы , необходимые для заполнения EC. (1) 50 мл трубки; (2) цилиндрической формы (сверху и вид сбоку); (3) среда для культивирования клеток; (4) 'eggcups'; (5) острые щипчики. (Б) Схема процедуры заполнения EC. (I) цилиндрический кусок сначала вводят в 50 мл пробирку и заполнены 13 мл клеточной культуральной среды. Далее, (II) в '' eggcups осторожно наносят поверх цилиндрической детали с помощью острых пинцет для манипулирования EC с помощью небольшого PDMS кусок. (III) Клетки в надлежащей плотности пипеткой на верхней части EC. (IV) Клетки вводят в «eggcups» путем центрифугирования. (V) И, наконец, образцы осторожно выпустили из трубки и она готова к использованию. м / файлы / ftp_upload / 51880 / 51880fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Сравнение клеточных фенотипов на 3D 'eggcups' и 2D плоских поверхностей. Конфокальной микроскопии (цель 25X воды, 0,95 NA, Leica) изображение NIH3T3 клеток на (а) ЕС , образующих упорядоченный массив, и показывая однородную сферическую фенотип, и на (б) стандартной 2D плоской культуры, распределены случайным образом с разнородными фенотипов. Клетки окрашивали для актина (зеленый цвет), Гольджи (оранжевым цветом) и ядро ​​(в синем). Масштабные полоски = 100 мкм. (С) 3D реконструкция клеток ЭК и (г) на плоских поверхностях для WT и Blebbistatin-обработанных клеток. Шкала бар = 20 мкм.880 / 51880fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Изучение NIH3T3 Гольджи фенотипа Схема и образец изображение Гольджи фенотипа классификации клеток на (а) плоские и (б) ЕС.. Клетки были классифицированы как уплотнен, продлены или фрагментирован в зависимости от альфа-значения. (С) Количественная Гольджи фенотипов. Шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: (а) (слева) конфокальной микроскопии изображение клетки NIH3T3 внутри ЭК и окрашивали для актина (зеленый цвет), Гольджи (оранжевым цветом) и ядро (голубого цвета). (справа) Схема ядер ориентации внутри ЕС. (Б) угловое распределение ядер внутри ЕС для WT и (с) Blebbistatin-обработанных клеток. (D) значения сферичности зародышем для WT и Blebbistatin-обработанных клеток как для ЕС и плоских поверхностей (P [WT EC -Blebb EC] <0,001, P [плоский Blebb -Blebb EC] <000,1; п = WT плоский 47, п WT EC = 94, п = Blebb плоским 59, п Blebb EC = 141 клеток). Шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 6: Подробное изучение cytokinetic кольца в живых и фиксированных образцов и в двух системах , использующих 'eggcups' (а) последовательность Время cytokinetic кольца с использованием стандартной 2D культуры в пробирке.. Только две яркие пятна в актина (Lifeact-mcherry, красный) и миозина (GFP помеченных, зеленый) видны в расщеплении борозду клеток HeLa (Шкала бар = 10 мкм). (Б) временная последовательность закрытия для cytokinetic кольца в клетках HeLa во время митоза с помощью "eggcups". Изображения показывают актин (красным цветом) и миозин (зеленый). 'Eggcups' позволяют идентифицировать еще миозина скоплениями. Одним из примеров выделяется стрелкой. (Шкала бар = 5 мкм). (С) cytokinetic кольцо также может быть визуализированы в делящихся дрожжей. (Слева) клетки лежат на плоской поверхности, цито Кинетическая кольцо видна только в виде двух точек (справа) Ячейки в «eggcups»:. все замыкание могут быть захвачены. Актина метят КБС-GFP (масштаб баров = 2 мкм). Время в мин: сек. (D - е) Примеры окрашенных cytokinetic колец. (D) актин-GFP экспрессирующих клеток HeLa окрашивали для фосфотирозина (PY) , который также показывает сигнал в кольце (Масштаб бар = 5 мкм). (Е) HeLa клетки , экспрессирующие GFP помеченный миозина и Lifeact-mcherry (актин) окрашивают для anillin. Anillin раскрывается для локализации в cytokinetic кольце и менее концентрированным в коре головного мозга. Он показывает совместную локализацию с актина и миозина (Шкала бар = 5 мкм). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

80 / 51880fig7.jpg "/>
Рис . 7: Применение «eggcups» к другим типам клеток и модельных систем (а) U2OS (остеосаркома человек). На врезке разделительную ячейку. (Шкала бар = 20 мкм). (Б) NIH3T3 клетки , экспрессирующие GFP. Разница в уровнях экспрессии может быть легко считываться (Масштаб бар = 20 мкм). (С) SW480 клетки (Шкала бар = 20 мкм). (D) почкующихся дрожжей; их длительность цикла не меняется. (Шкала бар = 10 мкм). (Е) С. Элеганс червей;. (слева) на плоской поверхности (справа) в "eggcups", эмбрион видно из иначе скрытой перспективы. (Шкала баров = 10 мкм). Время в мин:. Сек Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть большую версию этой фигуры.

Рисунок 8 Рисунок 8: Организация в массиве 'eggcups' позволяет автоматизированный анализ клеточной популяции (а) NIH3T3 клетки в ЕС (Шкала бар = 20 мкм).. Они имеют различные уровни экспрессии GFP. (Б) Автоматическое распознавание положения клеток позволяет индивидуальный анализ уровня экспрессии. Он суммированы в гистограмме экспрессии GFP популяции клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Модель системы Тип Культура Средняя Наблюдение Средняя '' eggcups диаметра (μ; М) Комментарии / Описание
клетки млекопитающих NIH3T3 10% BCS DMEM высокого глюкозы 10% BCS L-15 20 Другие стабильные клеточные линии, такие как REF52 или MDCK, а также первичные клеточные линии, раковые клетки и / или стволовых клеток, также могут быть вставлены в "eggcups".
HeLa 10% FCS DMEM высокого глюкозы 10% FCS, L-15 25 Доступно из множества различных источников.
U2OS 10% FCS DMEM высокого глюкозы 10% FCS, L-15 20-25 Доступно из множества различных источников.
SW480 10% FCS DMEM высокого глюкозы 10% FCS, L-15 17-20 Доступно из множества различных источников.
дрожжи делящихся дрожжей агарпластинчатые (YE5S) и жидких сред (YE5S и EMM5S) Фильтр стерилизуют EMM СМИ (список материалов) 5 Поверхность не должна быть функционализированные с адгезивными белками.
почкующихся дрожжей Агар пластины (YPD) и жидких сред (YEPD и SD) SD медиа 5 Поверхность не должна быть функционализированные с адгезивными белками.
эмбрион C. Элеганс NGM пластины сверхчистой воды 25 В качестве альтернативы среде М9 может быть использован для длительных экспериментов. Рецепт этого соленого раствора можно найти здесь: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2009/5/pdb.rec11798.full?text_only=true

Таблица 1: Условия культивирования в «eggcups» для различных модельных системах. Выше , связанной с протоколом может быть легко адаптированапутем замены описанных условий культивирования и размер "eggcups".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Реплика формования используется для того, чтобы изготовить "eggcups. Процесс изготовления не нуждается в чистой комнате; это легко и просто, хотя некоторые из них практика может потребоваться. В частности, выпустив PDMS штампа является наиболее важным шагом для получения большой площади высокого качества, 'eggcups'. По этой причине, особое внимание должно быть принято в этом шаге. Если этот шаг несколько раз не удается, считают для оптимизации плазмы чистых параметров до начала работы силанизацией и плазмы связывания. Недостаточная силанизация приведет к сильному налипанию штампа к пленке PDMS. Если это наблюдается, время инкубации с реагентом silanizing может быть увеличена. Обратите внимание , что другие методы и материалы могут быть применены для изготовления «eggcups», которые могут быть функционализированные с большим диапазоном лигандов (фибронектин, желатин, коллаген и т.д.). В частности, в микрополости полистирола могут быть легко изготовлены клитом- сделал метод горячего тиснения. Это обеспечивает биосовместимость и прямое сравнение с результатами, полученными в стандартных блюдах культуры. Аналогичным образом, особое внимание и практика требуются для того, чтобы оптимизировать процент заполнения. В частности, стадию промывки имеет решающее значение для того, чтобы обеспечить надлежащее заполнение без каких-либо избытка клеток, способствуя шума и фона в сигнале. Если клетки легко удаляются из полостей, рассмотреть, чтобы изменить размер или глубину полостей.

'Eggcups' обеспечивают 3D-как архитектуру клеток и скрининга с высоким содержанием, используя простой протокол. Клеточные органеллы и активные процессы неизвестных с использованием стандартных анализов культуры можно легко визуализировать с помощью вставки отдельных клеток на отдельных микрорезонаторах ( 'eggcups'). В зависимости от модели системы, размер, форма и размеры их можно легко адаптировать. Таким образом , клетки млекопитающих, делящихся дрожжей, дрожжи почкованием и C. Элеганс сманипулировать и изучены, а также любые зародыши , такие как дрозофилы, мышей или человеческих эмбрионов для экстракорпорального оплодотворения, или стволовые клетки, например.

В этой установке фиксируются отдельные клетки. Это в отличие от эпителиальных тканей , встречающихся в естественных условиях. Тем не менее, эта среда может быть воспроизведена в наших «eggcups» путем нанесения на боковые стенки с кадхеринами, чтобы имитировать контакты клетка-клетка, используя более гибкие эластомеры. Координационные контакты будут способствовать отложению фибронектина на дне лунки. Эти соответствующие распределения молекул адгезии должны позволить воспроизвести клеточные среды , возникающие в естественных условиях. С помощью этого метода можно было бы подойти к физиологическим условиям.

Средний обмен в нашем анализе обеспечивается. Клетки в ЕС не показывают какого-либо ухудшения при выполнении как краткосрочных, так и долгосрочных экспериментов из-за отсутствия обмена среды. Отметим также, что клетки в CA ECп культивировали до слияния, хотя основной интерес, когда отдельные клетки или эмбрионы изолированы внутри полостей.

Ориентация органелл или целых организмов является выявление новой информации. Показано разную динамику актина и миозина в cytokinetic кольце. Хотя cytokinetic кольцо у делящихся дрожжей и в клетках млекопитающих состоит из подобных ключевых компонентов, мы показываем с этой установкой, что их специфическая динамика отличается 17. Это поддерживает результат, что закрывающий механизм в двух системах отличается также. Для того, чтобы разработать и исследовать такую ​​гипотезу, ориентация ячейки является необходимым условием. В будущих исследованиях, это устройство может быть также использован для исследования других мероприятий, связанных с организацией органелл в клетках.

Кроме того, этот метод может быть очень полезен в биологии развития. Вытянутые эмбрионы могут быть легко ориентироваться, наблюдаемый или подвергнут дополнительной обработке в определенной ориентации.Вероятно, наш анализ не наложит полярность эмбрионов, но высокий процент наполнения позволит извлечь нужную считывающий надежным образом. В общей сложности "eggcups" может быть хорошим устройством для скринингов высокого содержания.

Были предложены и другие анализы культуры. Эти методы варьируются от нескольких ячеек в 2D-размеров в луночные планшеты, в одиночных камерах, депонированных в micropatterned клеевых мотивов с одинаковой формы. Тем не менее, ни один из них не подходит для преодоления ограничений , подробно описанные выше на наблюдении клеточных органелл и динамических процессов 1.

Будущие усовершенствования нашей системы позволит применимость "eggcups" в промышленности, ориентированных на цели. В качестве примера, скрининга лекарственных средств применения в фармацевтических компаний требуют использования луночные планшеты 14,28; реализации «eggcups» в таких платформ будет потенциально повысить надежностьтесты и результаты. Как будет выполняться такие, высокое содержание скрининг-тесты с использованием часто используемых процессов автоматизированные фармацевтических компаний (и научно-исследовательских лабораторий) с использованием роботов. Это позволит обеспечить повторяемость и надежность при работе с низкой изменчивостью. Некоторые коммерческие продукты на основе 3D-клеток, культивируемых анализов уже появились на рынке, подчеркнув важность такого рода анализов. И, наконец, эти устройства открывают новые перспективы для персонализированной медицины: клетки от пациента могут быть помещены в «eggcups», и коктейли лечения могут быть протестированы в физиологической среде; биомаркер считывание позволит предвидеть оптимальное лечение , которое следует уделять пациенту 29. В целом физическая форма клеток и эмбрионов руководите архитектуру полостей, и мы надеемся, что устройство, и этот метод будет широко распространяться в будущем.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Мы не имеем ничего раскрывать.

Acknowledgments

Мы признаем Л. Brino (IGBMC высокое содержание Скрининг центр Illkirch, Франция) за предоставление нам антитела против Giantin, М. Labouesse Lab. для C. Элеганс (IGBMC) и В. Seraphin Lab. для подающих надежды дрожжи (IGBMC), Е. Paluch и А. Хайман для люминесцентных HeLa клеток (MPI-CBG, Дрезден), J. Moseley (Dartmouth Medical School) и JQ Wu (Ohio State University) для дрожжей деления клеток; А. Хоэлу и Ф. Evenou для экспериментальной помощи, С. Рик (IBMC, Страсбург, Франция) за техническую помощь, и JC Жанно (Femto-е, Франция) за помощь в микротехнологий. Эта работа была поддержана за счет средств из CNRS, Университет Страсбурга, Conectus, La Fondation пур ля Recherche MEDICALE и СI-FRC Страсбурга.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ddH20 (ultrapure) Millipore - Use always fresh water.
Parafilm (plastic film) Bemis PM-999 Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness.
Photo-mask Selba - http://www.selba.ch
Silicon wafer Siltronix - http://www.siltronix.com/
SU-8 photoresist MicroChem 2000 series http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm 
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
SU-8 developer MicroChem - http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm 
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information
2-propanol Sigma-Aldrich 19030 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&region=CA
Available from multiple companies.
Sigmacote (siliconizing reagent ) Sigma-Aldrich SL2-25ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&region=FR 
harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. 
Chlorotrimethylsilane (TMCS) Sigma-Aldrich 386529-100ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR  
TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition
Nitrile gloves Kleenguard 57372 http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Available from multiple companies.
Glass coverslips #0 Knittel glass KN00010022593 http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Very fragile. Manipulate gently.
Sharp straight tweezers SPI 0WSSS-XD http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
50 ml tube BD Falcon 352070 http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Available from multiple companies.
PDMS Dow Corning Sylgard 184 kit http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN 
The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies.
Microscope glass slides Dutscher 100001 http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Available from multiple companies.
DMEM high-glucose medium Fisher Scientific 41965-039 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Bovine calf serum Sigma-Aldrich C8056-500ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&region=CA
0.25% Trypsin-EDTA Fisher Scientific 25200-072 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS 1x Fisher Scientific 14200-067 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O
L-15 medium Fisher Scientific 21083-027 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Medium for atmospheres without CO2 control
Fibronectin  Sigma-Aldrich F1141-5MG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Penicillin & Streptomycin Fisher Scientific 15140-122 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM
Petri dish P35 Greiner 627102 http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Petri dish P60 Greiner 628163 http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
Petri dish P94 Greiner 633179 http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldehyde 3 % Sigma-Aldrich P6148-500G http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&region=FR 
Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Triton 0.5 % Sigma-Aldrich 93443-100ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 InVitrogen A12379 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 
dissolve powder in 1.5 ml methanol
Alexa Fluor 647 InVitrogen A21245 1:200 dilution in PBS 1x
rabbit polyclonal anti-Giantin Abcam ab24586 1:500 dilution in PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html 
rabbit anti-anillin Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). 1:500 dilution in PBS 1x
Anti-phosphotyrosine Transduction Lab 610000 http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 goat anti-rabbit  Jackson Immunoresearch 111-166-047 http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp 
1:1,000 dilution in PBS 1x
DAPI Sigma-Aldrich D8417  http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&region=FR 
1 mg/ml for 1 min
Glycerol Sigma-Aldrich G2025 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410-500ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
HeLa cells - - Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
NIH3T3 cells ATCC - Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
Fission yeast  - - For details on strains, contact the corresponding author.  See also Table 1
C. elegans worms - - For details, contact the corresponding author.  See also Table 1
YES (Agar) + 5 Supplements included MP Biomedicals 4101-732 http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search 
For preparation: follow  instructions as given on the box
YES (Media) + 5 Supplements included MP Biomedicals 4101-522 http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search 
For preparation: follow the instructions as given on the box
EMM (Media) MP Biomedicals 4110-012 http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search 
For preparation: follow  instructions as given on the box
Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging MP Biomedicals 4110-012 For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence.
Supplements (for EMM) MP Biomedicals 4104-012 http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search
 (Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering)
Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters Millipore - http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  2. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).
  3. Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies. PLoS ONE. 7, e37548 (2012).
  4. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  5. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. , (2012).
  6. Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments. Lab Chip. 11, 805-812 (2010).
  7. Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies. Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).
  8. Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 12, 458-465 (2013).
  9. Legant, W. R., et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat Meth. 7, 969-971 (2010).
  10. Devices and methods for observing the cell division. Riveline, D., Buguin, A. , WO/2010/092116 (2010).
  11. Ochsner, M., et al. Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells. Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).
  12. Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . Riveline, D. , WO2013144302 (2012).
  13. Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. Riveline, D., Wollrab, V. , WO2013135809 (2012).
  14. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).
  15. Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. Methods in Molecular Biology. Hughes, M. P., Hoettges, K. F. 583, Humana Press. 81-107 (2010).
  16. Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).
  17. Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction. Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).
  18. Yao, X., et al. Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits. Integr Biol. 6, 388-398 (2014).
  19. Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. The promise of single-cell sequencing. Nat Meth. 11, 25-27 (2014).
  20. Allen, T. D., et al. Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM). Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).
  21. Robbins, E., Marcus, P. I. Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations. Science. 144, (1964).
  22. Whitfield, M. L., et al. Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3" end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).
  23. Straight, A. F., et al. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science. 299, 1743-1747 (2003).
  24. Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1). Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).
  25. Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development. Curr Biol. 20, 322-327 (2010).
  26. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. JoVE. , e4019 (2012).
  27. Saha, S., Pollard, T. D. Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast. Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).
  28. Prestwich, G. D. Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery. Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).
  29. Futamura, Y., et al. Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification. Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).

Tags

Биоинженерия выпуск 115 микрорезонаторах копия Molding микротехнологий высокого содержания скрининга 3 Габаритные размеры единичные клетки Nucleus Гольджи Cytokinetic кольцо.
Заказ отдельных клеток и Single зародышами в 3D конфайнмента: Новое устройство для высокого содержания скрининга
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wollrab, V., Caballero, D.,… More

Wollrab, V., Caballero, D., Thiagarajan, R., Riveline, D. Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening. J. Vis. Exp. (115), e51880, doi:10.3791/51880 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter