Abstract
Il successo di un piccolo modello animale per studiare malattia critica è, in parte, a seconda della capacità del modello per simulare la condizione umana. Intra-tracheale inoculazione di una quantità nota di batteri è stata utilizzata con successo per riprodurre la patogenesi della polmonite che poi si sviluppa in sepsi. Monitoraggio dei parametri emodinamici e fornendo trattamento clinico standard con infusione di antibiotici, liquidi e farmaci per mantenere la pressione del sangue è fondamentale per simulare terapia di supporto di routine in questo modello, ma per farlo è necessario sia arterioso e accesso vascolare venoso. Dettagli Il video la tecnica chirurgica per l'impianto carotide e cateteri comuni vena giugulare in un topo anestetizzato. A seguito di un periodo di recupero 72 ore, gli animali saranno nuovamente anestetizzati e collegati ad un setup cavezza e girevole attaccato all'alloggiamento roditore che collega i cateteri impiantati al sistema di monitoraggio emodinamico. Questa configurazione consente la libera circolazione delratto durante lo studio, mentre continua il monitoraggio delle pressioni, infondendo fluidi e farmaci (antibiotici, vasopressori) e l'esecuzione di prelievi di sangue.
Introduction
Cateterismo arterioso e venoso di ratti è stato a lungo utilizzato nella ricerca di laboratorio. 1, 2 cateterizzazione può essere utilizzato per il monitoraggio dei parametri emodinamici tra cui sistolica, diastolica e pressione arteriosa media (MAP), la frequenza cardiaca (HR) e la pressione venosa centrale (CVP) . 3,4 Inoltre, questi cateteri consentono l'infusione di trattamenti standard o potenziali terapie e prelievo di sangue per analizzare ulteriormente il meccanismo sottostante di una malattia o di trattamento. Pertanto, avendo accesso vascolare in un piccolo modello animale è un fattore critico per lo studio misure di performance cliniche e gli effetti del trattamento.
Per studiare le cause alla base di malattie gravi, è importante sviluppare il primo di un modello per simulare la condizione umana. Intra-tracheale inoculazione di una quantità nota di batteri è stata utilizzata con successo per riprodurre la patogenesi della polmonite, una grave infezione polmonare che poi si sviluppa in sepsi.3, 5 Monitoraggio misure emodinamiche e fornire un trattamento clinica standard è fondamentale per simulare terapia di supporto di routine. Trattamento clinico di serie comprende l'infusione di antibiotici che aiuta a chiarire l'infezione sottostante e la somministrazione di fluidi e di vasopressori, due terapie impiegate in pazienti settici per mantenere la pressione sanguigna. 5-7 accesso vascolare, in particolare l'impianto di cateteri di brevetto è particolarmente importante quando si studia terapie sperimentali per la sepsi.
Per molti anni, la capacità di gestire trattamento clinico standard per roditori è stata limitata dalla disponibilità dei materiali con le proprietà richieste per la costruzione di cateteri impiantabili e la capacità della tecnologia di infusione per trasportare piccoli volumi precisione nel tempo. Inoltre, la capacità di attivare un infuso in risposta al monitoraggio continuo di una misura specifica emodinamico consente un supporto costante e riproducibileModello ard trattamento quando utilizza campione più ampio di dimensioni tipiche di studi su roditori. 8, 9 Queste limitazioni tecnologiche in materiali e hardware di precisione sono stati superati, ma di fornire contemporaneamente terapie di routine durante il monitoraggio dei parametri emodinamici, sia arterioso e accesso vascolare venoso devono essere disponibili.
Dettagli Il video la tecnica chirurgica per l'impianto carotide e cateteri comuni vena giugulare in un topo anestetizzato. A seguito di un periodo di recupero 72 ore, gli animali saranno nuovamente anestetizzati e collegati ad un setup cavezza e girevole attaccato all'alloggiamento roditore utilizzato per collegare i cateteri impiantati al sistema di monitoraggio emodinamico. Durante lo studio, il sistema consente una infusione di fluido basata o fornire un dato volume ad una certa velocità di infusione o un sistema automatizzato che fornisce una velocità di infusione a seconda della pressione arteriosa media rilevata per mantenere un determinato campo di pressione. Il sistema di infusione di fluidoutilizza pompe siringa programmabili che si interfacciano con uscite digitali del sistema di acquisizione dati e sono controllati dal monitoraggio della MAP software. La configurazione tether e girevole permette la libera circolazione del ratto durante lo studio durante il monitoraggio pressioni, infondere fluidi e vasopressori, ed eseguendo prelievi di sangue senza dover manipolare gli animali. Monitoraggio simultaneo di fino a 12 animali strumentati con 2 cateteri ciascuno (nel nostro setup) con l'hardware espandibile per il monitoraggio 24 animali strumentati consente una grande flessibilità per studiare più gruppi stratificati in ogni esperimento.
Questa procedura cateterizzazione può essere utile per le strutture di ricerca che utilizzano modelli di roditori simili che richiedono un accesso vascolare per il monitoraggio, il campionamento e il trattamento per un massimo di 11 giorni. Se la struttura di ricerca considerando questa procedura ha esperienza con i roditori e una struttura di supporto adeguato per il mantenimento di questi animali, allora developing queste competenze possono fornire un risparmio significativo, riducendo il costo totale per ratto cateterizzato da più di $ 180 a meno di 50 dollari (compreso il ratto ingenuo, componenti catetere e costi tecnici) e aumentando la flessibilità di programmazione (ratti naive sono prontamente disponibili vs. calendario di consegna dell'azienda di impiantato ratti). Il successo di questa procedura dipende dalle capacità del singolo di eseguire le catheterizations. Gli animali di formazione necessari per diventare esperti in questo procedimento ha spaziato da 20 a 40 ratti con un tasso di pervietà del catetere risultante del> 90%.
Protocol
Le procedure descritte qui di seguito sono state eseguite nell'ambito di un protocollo approvato dalla cura degli animali e uso Comitato del Centro Clinico presso il National Institutes of Health.
1. Preparazione per la chirurgia
- Gas sterilizzare cateteri e strumenti.
2. Preparare i cateteri
- Lavare i cateteri con glicerolo eparina (250 UI di eparina / 1 ml glicerolo) per garantire la pervietà ed evitare perdite. Inserire estremità del catetere con un tappo metallico (20 ga 15 mm) per mantenere glicerolo eparinizzata.
3. Preparare asettico Workstation
- Utilizzare 70% di alcol per spruzzare i vassoi workstation e strumenti. Utilizzare un telino sterile per coprire la tabella e strumenti vassoi operativi e strumenti posto sul vassoio.
4. Preparare Rats per Chirurgia
- Luogo rat singolarmente in una camera di Lucite e esporre a un anestetico; isoflurano (3-5%) mixcato con l'ossigeno fino incosciente. Rimuovere topo dalla camera e radere la pelliccia da anteriore e posteriore zone del collo. Applicare il lubrificante pomata per gli occhi.
5. Catetere impianto
- Posizionare rat anestetizzati (confermato da un pizzico tep) su un tavolo operatorio riscaldato in posizione ventrale; mettere il naso nel cono naso per mantenere l'anestesia con respirazione spontanea (isoflurane; 3,5%). Pulire delicatamente l'area chirurgica 3 volte alternando l'uso di Betadine e il 70% di alcol. Fare un 0,5 centimetri incisione cutanea mediana tra le scapole con una forbice chirurgica.
- Riposizionare ratto in posizione dorsale; frenare dolcemente le gambe ad ogni lato del tavolo con elastici; mantenere l'anestesia. Mettere due laminati sterile 4x4 garza sotto collo per estendersi troppo poco per una migliore esposizione. Fare un 2 centimetri ventrale incisione cutanea cervicale destra della linea mediana del collo, a livello della clavicola con un bisturi.
6. DirittoVena giugulare Catheterization
- Utilizzando un emostatico, bruscamente sezionare la vena giugulare destra, separare salivari e tessuti linfatici visualizzare e isolare una sezione di 5 mm dal vaso. Utilizzando sutura di seta 4-0, posizionare una cravatta sciolto su entrambe le estremità cranici e caudale della nave per massimizzare l'esposizione della nave. Utilizzando un micro forbice praticare un'incisione chirurgica abbastanza grande per passare il catetere, in linea con il vaso tra le due legature e legare la legatura cranica intorno al vaso.
- Inserire il catetere venoso nel vaso verso il cuore con l'assistenza del micro hook dissezione e pinze e far avanzare il catetere fino a quando tutti segmento PU 3F è nel recipiente. Utilizzare i legature alle estremità craniali e caudali per fissare il catetere alla nave.
7. Sinistra carotide Catheterization
- Utilizzando un emostatico, senza mezzi termini sezionare il muscolo omoioideo longitudinalmente per esporre la carotide sinistra e isolate una sezione 5 mm di nave. Assicurarsi che il nervo vago (di colore bianco) è completamente separato dal arteria. Fare attenzione a non distruggere o rompere il nervo.
- Utilizzando sutura di seta 4-0, posizionare una cravatta allentata all'estremità caudale della nave, legare l'estremità craniale del vaso e posizionare un morsetto bulldog caudalmente sopra la sutura per arrestare il flusso di sangue dopo l'incisione. Utilizzando un micro forbice chirurgica, fare una incisione, abbastanza grande per passare il catetere, in linea con il vaso tra le due legature. Inserire il catetere arterioso verso il cuore, con l'assistenza del micro gancio dissezione e pinze.
- Utilizzare un supporto dell'ago liscia senza serratura per tenere la parte del catetere all'interno del vaso stretto prima di rimuovere il morsetto bulldog. Avanzare il catetere con un paio di pinze mentre allentando supporto dell'ago lentamente finché l'intero segmento PU 2F del catetere è nel recipiente. Legare la legatura caudale sciolto circa il catetere e nave per garantire, ma non così tight da occludere, il catetere.
8. Usando un Hemostat dritto, Tunnel di 5 cm Tubo indietro sottocutanea dietro l'orecchio e attraverso l'incisione tra la scapola. Esteriorizzare i cateteri attraverso il tubo e rimuovere il tubo.
9. Chiudere la ventrale incisione con tre in acciaio inox clip ferita, e la dorsale incisione con 4-0 seta suture per fissare i cateteri esteriorizza in Place.
Monitor 10. post-chirurgica e cura
- Dopo cateterizzazione, interrompere l'anestesia e recuperare il ratto in decubito laterale in una gabbia con biancheria cellulosa. Osservare i topi a intervalli di 2 hr per almeno 4 ore o fino a che non mostra segni di dolore e poi una volta al giorno. Dare Ketoprofene [5 mg / kg, iniezione sottocutanea (SQ)] postare immediatamente procedure e ogni 12 ore se il ratto mostra segni di dolore o disagio. Nella nostra esperienza, non ratti hanno richiesto analgesia supplementare per il dolore dopo la initial iniezione. Caratteristiche osservate che suscitare considerazione per ulteriori dosi di analgesia includono, ma non limitato a; postura anomala; aumento / diminuzione della frequenza respiratoria, unthrifty / ungroomed, infezione / infiammazione del sito di incisione, secrezione oculare, piloerezione ("haircoat spillo"), riduzione di attività in risposta a stimoli acustici o tattili.
NOTA: Ratti recuperati per 72 ore che guadagna> 10 g di peso pre-cateterizzazione saranno arruolati nello studio.
11. Collegamento di Emodinamica Sistema
- Dopo il recupero, l'iscrizione ratti sani (aumento di peso> 10g) nello studio. Mettere ratti in camera di Lucite e anestetizzare come descritto in precedenza.
- Mettere telino sterile sul tavolo operatorio con hemostat sterili, micro pinze, 1 ml siringhe con ago smussato allegati.
NOTA: Le punte della pinza emostatica devono essere ricoperti di gomma per evitare danni al catetere. Mettere topo anestetizzato su un chirurgicatavolo in posizione e luogo ventrale naso nel cono di mantenere l'anestesia (3-5%) con respirazione spontanea. - Morsetto arteriosa e cateteri venosi con un paio di gomma ricoperto hemostats appena sotto spinotti in metallo. Utilizzare un paio di pinze per rimuovere il perno metallico all'estremità del catetere e collegare una siringa da 1 ml riempito con eparina salina con un ago smussato allegata. A sua volta, rimuovere i hemostats e prelevare 0,1 ml per garantire i cateteri sono brevetti.
- Re-morsetto cateteri, rimuovere l'ago e collegare tale scopo ad un catetere più (pre-lavata con soluzione salina eparina) che è collegato ad una girevole e legato sulla cima della gabbia scatola di scarpe. Collegare questi cateteri ai trasduttori per l'acquisizione dei dati e la registrazione, il campionamento, o infusione.
NOTA: Tutti i cateteri sono protette con condotti di primavera arrotolati abbastanza a lungo per consentire la completa gamma di un animale di movimento nella loro gabbia. - Dopo il collegamento del catetere, terminare l'anestesia erecuperare gli animali nella posizione sternale in una gabbia con biancheria cellulosa. Per mantenere la pervietà del catetere arterioso, lavare manualmente le linee con 0,05 ml di soluzione salina eparina (50 UI / ml) ogni 1 ora per 24 ore che coincidono con le valutazioni periodiche degli animali.
12. Prelievo di sangue, monitoraggio della pressione and Drug Administration
- Attaccare siringa vuota a rubinetto collegato ad arteriosa catetere e prelevare 0,6 ml a filo linea. Attaccare la siringa campione, prendere campioni, e restituire il 0,6 ml flush linea seguita da 0,7 ml eparinizzato soluzione fisiologica.
- Utilizzare i dati hardware e software di acquisizione per misurare e registrare MAP e la frequenza cardiaca di continuo.
- Collegare il sistema di consegna della droga automatizzato (ADDS) al catetere venoso.
NOTA: aggiunge regola la velocità di vasopressore infusione (alto, basso, o 0 dose) sulla base del MAP rilevata a pressioni mantenuti entro il normale range fisiologico.
Representative Results
Le variazioni della pressione vascolare vengono trasmessi attraverso il liquido riempito cateteri (Figura 1) e convertiti in segnali elettrici rappresentati dalle forme d'onda emodinamici (figure 2, 3). Senza accesso vascolare, non potrebbe essere fatto di tali misure. Streaming in tempo reale delle forme d'onda permette per il rilevamento e l'analisi dei cambiamenti in un battito per battere base (Figura 2). Compressione la scala temporale delle forme d'onda permette di quantificare i cambiamenti che si verificano nel corso di un periodo più lungo (minuti o giorni) (Figura 3, superiori 4 forme d'onda), che può essere correlato con le variazioni dei tassi vasopressore infusione (Figura 3, inferiori 4 forme d'onda).
Figura 1. Catetere Design: I dettagli dei componenti dei arterioso e venoso cateteri PU, poliuretano;. PE, polietilene (lunghezza del segmento) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. mappa in tempo reale le forme d'onda di 4 roditori tipici 7 giorni successivi alla cateterizzazione oltre 7 secondi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3.-Time compressa MAP forme d'onda di 4 roditori tipici (superiori 4 forme d'onda) 7 giorni dopo la cateterizzazione oltre 1 ora. Quando la mappa è una media (inferiore 4 forme d'onda), tale valore viene utilizzato per attivare AGGIUNGE elevato (<90 mmHg) , basso (<100 mmHg) o interrompere (> 110) Risposta flusso dalla pompa di infusione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Indagare approcci terapeutici ad un modello clinico di malattia renda necessaria la capacità di eseguire con precisione il monitoraggio emodinamico, richiedendo così l'accesso vascolare. Nel nostro modello di sepsi, cateterizzazione arteriosa fornisce monitoraggio della pressione sistemica e cateterizzazione venosa consente l'applicazione della terapia clinica standard. La terapia standard per sepsi comprende l'infusione di antibiotici per trattare l'infezione batterica e l'infusione di fluidi e vasopressori per mantenere la pressione arteriosa nell'intervallo desiderato. Entrambi i cateteri sono utilizzati per il prelievo di sangue. In questo disegno, l'applicazione di infusione programmabile pompe con attivazione automatica della velocità di infusione vasopressore basato su tempo reale significare pressioni arteriose è un progresso rispetto ambito clinico che richiede titolazione manuale dal personale medico e in ambito preclinico rende utilizzare di questa modalità possibile per studiare gran numero di animali trattamento.
. e_content "> Alcune complicazioni sono stati vissuti all'inizio dello sviluppo del modello di queste includeva occlusione parziale sia arteriose e cateteri venosi da oltre serraggio, cravatte su componenti PU2 e PU3, (1-2%); smarrimento del catetere venoso giugulare in un piccolo ramo, (<1%), la morte improvvisa inspiegabile dopo il recupero (nessun trombo polmonare o altri danni d'organo evidenti), (1-2%) ha deliberato, mantenendo concentrazione isoflurano 2-3,5% con O tasso 2 flusso di 2 L / min . Altre complicazioni chirurgiche comuni di emorragia, infezione locale e danno auto-inflitto, non sono state osservate. Una volta che la competenza chirurgica è raggiunto, ogni procedura dovrebbe essere in grado di essere completato in non più di 15 minuti. Il tasso di successo misurato come un sano recupero e cateteri di brevetto, possono essere tenuti a superare il 90%, una volta completamente addestrato. Un animale supplementare è incluso in ogni studio per minimizzare la perdita di dati e il numero totale di animali necessari e rappresentano un catetere che può essere omesso "insolo fusion "o la mortalità a causa di complicazioni.La fase più critica in questa procedura è la progettazione e il posizionamento dei cateteri. I materiali devono essere morbido alla punta per non perforare la parete del vaso senza aggraffatura troppo facilmente. Il corpo del catetere deve essere rigida (di punta) per essere in grado di avanzare nel recipiente sufficientemente ed essere fissata in posizione. La Figura 1 mostra i 3 diametri di tubi che sono collegati per il catetere arterioso e 2 tubi diverso diametro collegato per i cateteri venosi. Questi componenti sono fatti scorrere dentro l'altro di ridurre il diametro del catetere a punta e sono incollati con ancoraggi aggiunti per assicurare il posizionamento del catetere nel vaso o cuore è mantenuta.
Una volta recuperato e collegato al giunto rotante e fermo, il MAP e CVP forme d'onda dovrebbe essere simile ai dati rappresentati in figura 2. Per mantenere arteriosa catetere patency durante il monitoraggio, un filo eparina salina oraria (0,05 ml) deve essere eseguita. Infusione continua mantiene la pervietà del catetere venoso. Durante il collegamento di linea e di colore, particolare attenzione deve essere pagato per garantire l'assenza di bolle d'aria nella linea. Una bolla d'aria di ≥0.1ml può causare un'embolia nel polmone, cervello o altri organi. Forme d'onda emodinamici vengono registrati e analizzati nel corso dello studio. Quando la compressione tempo sull'asse x, la figura 3 mostra l'andamento del MAP e CVP nel corso di 1 ora e le variazioni di frequenza e l'effetto di vasopressori infusione.
La procedura ha diversi limiti potenziali. Nei nostri studi, i cateteri rimangono brevetto per un massimo di 11 giorni. Non si sa per quanto tempo i cateteri rimarrebbero brevetto di là di questo periodo. Per adattare i cateteri come descritto, vi è una dimensione minima vascolare, che correla approssimativamente con peso roditore, richiedendo animali arruolati nello studio sia maggiore200 g. L'uso di un diametro più piccolo catetere comporterebbe aumentando resistenze al flusso riducendo pervietà. Raggiungere misure centrali della pressione venosa necessita preciso posizionamento del catetere nell'atrio sufficiente considerazione per le dimensioni e la crescita durante il periodo di studio, e può essere una sfida.
Una volta masterizzato, il cateterismo vascolare arteriosa e in grado di fornire la base per una vasta gamma di modelli di roditori che richiedono monitoraggio emodinamico, prelievo di sangue, e l'infusione di liquidi o terapie, riducendo al minimo dolore e il disagio durante la strumentazione o la manipolazione una volta recuperati. Infatti, in combinazione con una precedente pubblicazione JOVE 10 descrive cateterizzazione della vena femorale, abbiamo eseguito con successo questo modello con 3 cateteri impiantati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro dissecting forceps | Roboz | RS-8102 | surgical instrument |
| Delicate straight hemostatic forceps | Roboz | RS-7114 | surgical instrument |
| Delicate curved hemostatic forceps | Miltex | 7-4 | surgical instrument |
| Serrefine curved, very delicate micro clamp | Roboz | RS-5471 | surgical instrument |
| Micro dissecting hook | Miltex | 19-220 | surgical instrument |
| Angled on edge micro dissecting spring scissor | Roboz | RS-5618 | surgical instrument |
| Light operating scissor | Roboz | RS-6750 | surgical instrument |
| Scalpel handle and blade (#10) | Cincinnati Surgical | RS-9843 | surgical instrument |
| Pack of 4-0 silk suture with curved needle | Ethicon | FS-2 | surgical instrument |
| Straight micro suturing needle holder | Roboz | RS-6410 | surgical instrument |
| Wound clip | Stoelting | 59027 | surgical instrument |
| Sterile gauze 2"x2" | Dynarex | 3362 | consumable |
| Gauze 4"x4" | Covidien | 2556 | consumable |
| Anesthesia vaporizer | Surgivet | V703001 | equipment |
| Lucite box | Custom | equipment | |
| Isoflurane | Baxter | equipment | |
| Downdraft Table | Airscience | equipment | |
| Table top surgical platform | Custom | equipment | |
| Arterial Catheter | Custom - Scientific Commodities Inc. | consumable | |
| Venous Catheter | Custom - Scientific Commodities Inc. | consumable | |
| Data acquisition system | ADInstruments | Powerlab 16/30 | equipment |
| Data analysis software | ADInstruments | LabChart v7.3 | equipment |
| Programmable infusion pumps | Harvard Apparatus | PHD Ultra | equipment |
References
- Buckingham, R. E. Indwelling catheters for direct recording of arterial blood pressure and intravenous injection of drugs in the conscious rat. J Pharm. Pharmacol. 28 (5), 459-461 (1976).
- Buckle, J. W., Nathaniels, P. W. Proceedings: A dual catheter system for the simultaneous infusion and sampling of the vascular system of the unrestrained rat. J. Physiol. 242 (2), 55P-56P (1974).
- Solomon, S. B., et al. Effective dosing of lipid A analogue E5564 in rats depends on the timing of treatment and the route of Escherichia coli infection. J. Infect. Dis. 193 (5), 634-644 (2006).
- Cui, X., et al. Bacillus anthracis cell wall produces injurious inflammation but paradoxically decreases the lethality of anthrax lethal toxin in a rat model. Intensive Care Med. 36 (1), 148-156 (2010).
- Quezado, Z. M., Natanson, C. Systemic hemodynamic abnormalities and vasopressor therapy in sepsis and septic shock. Am. J. Kidney Dis. 20 (3), 214-222 (1992).
- Perdue, P. W., Kazarian, K. K., Nevola, J., Law, W. R., Williams, T. The use of local and systemic antibiotics in rat fecal peritonitis. J. Surg. Res. 57 (3), 360-365 (1994).
- Qiu, P., et al. The individual survival benefits of tumor necrosis factor soluble receptor and fluid administration are not additive in a rat sepsis model. Intensive Care Med. 37 (10), 1688-1695 (2011).
- Cui, X., et al. Severity of sepsis alters the effects of superoxide anion inhibition in a rat sepsis model. J. Appl. Physiol. 97 (4), 1349-1357 (2004).
- Karzai, W., et al. Protection with antibody to tumor necrosis factor differs with similarly lethal Escherichia coli versus Staphylococcus aureus pneumonia in rats. Anesthesiology. 99 (1), 81-89 (2003).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral Arterial and Venous Catheterization for Blood Sampling, Drug Administration and Conscious Blood Pressure and Heart Rate Measurements. J. Vis. Exp. (59), e3496 (2012).
