Abstract
Succesen med en lille dyremodel til at undersøge kritisk sygdom er delvis afhængig af evnen af modellen til simulering af den menneskelige tilstand. Intratracheal indpodning af en kendt mængde bakterier held har været anvendt til at reproducere patogenesen for lungebetændelse, som derefter udvikler sig til sepsis. Overvågning hæmodynamiske parametre og yde standard klinisk behandling, herunder infusion af antibiotika, væsker og lægemidler til at opretholde blodtrykket er kritisk at simulere rutinemæssig understøttende behandling i denne model, men at gøre det kræver både arteriel og venøs vaskulær adgang. Videoen beskriver den kirurgiske teknik til implantering halspulsåren og fælles halsvene katetre i en bedøvet rotte. Efter en 72 timers restitutionsperiode, dyrene blive re-bedøvet og forbundet med et tøjr og drejelig setup fastgjort til gnaver boliger, der forbinder de implanterede katetre til hæmodynamisk overvågningssystem. Denne opsætning giver mulighed for fri bevægelse afrotte i løbet af undersøgelsen, mens løbende at overvåge pres, infusion væsker og lægemidler (antibiotika, vasopressorer) og udførelse af blodprøvetagning.
Introduction
Arteriel og venøs kateterisering af rotter har længe været anvendt i laboratorieundersøgelser. 1, kan 2 Kateterisering anvendes til overvågning af hæmodynamiske parametre, herunder systoliske, diastoliske og gennemsnitlige arterietryk (MAP), hjertefrekvens (HR) og centralt venetryk (CVP) . 3,4 Desuden er disse katetre tillader infusion af standardbehandlinger eller potentielle behandlinger samt blodprøvetagning at analysere den underliggende mekanisme af sygdom eller behandling. Derfor har vaskulær adgang i en lille dyremodel er kritisk for at studere klinisk præstationsmålinger og behandlingseffekt.
For at undersøge de underliggende årsager til kritisk sygdom, er det vigtigt først at udvikle en model for at simulere den menneskelige tilstand. Intratracheal indpodning af en kendt mængde bakterier held har været anvendt til at reproducere patogenesen af lungebetændelse, en alvorlig lungeinfektion som derefter udvikler sig til sepsis.3, 5 Overvågning hæmodynamiske foranstaltninger og yde standard klinisk behandling er afgørende for at simulere rutinemæssig understøttende behandling. Standard klinisk behandling omfatter infusion af antibiotika som hjælper i clearing den underliggende infektion og administration af væsker og vasopressorer, to behandlinger ansat i septiske patienter til at opretholde blodtrykket. 5-7 vaskulær adgang, specielt implantation af patentansøgninger katetre er især vigtigt, når vi studerer testpræparater terapier for sepsis.
I mange år var evnen til at administrere standard klinisk behandling til gnavere begrænset af tilgængeligheden af materialer med de nødvendige egenskaber til at konstruere implantable katetre og evne til infusion teknologi til at levere små volumener nøjagtigt over tid. Desuden evnen til at udløse en infusion som reaktion på kontinuerlig overvågning af en specifik hæmodynamisk foranstaltning giver mulighed for en ensartet og reproducerbar standerard behandling model ved brug af større stikprøvestørrelser typisk for gnavere. 8, 9 Disse teknologiske begrænsninger i materialer og præcision hardware er blevet overvundet, men samtidigt at give rutinemæssige behandlinger under overvågning hæmodynamiske parametre, skal både arteriel og venøs vaskulær adgang til rådighed.
Videoen beskriver den kirurgiske teknik til implantering halspulsåren og fælles halsvene katetre i en bedøvet rotte. Efter en 72 timers restitutionsperiode, dyrene blive re-bedøvet og forbundet med et tøjr og drejelig setup fastgjort til gnaver boliger bruges til at forbinde de implanterede katetre til hæmodynamisk overvågningssystem. I løbet af undersøgelsen, systemet giver mulighed for en væske infusion enten baseret på at levere en given mængde på et bestemt infusionshastighed eller et automatiseret system, der leverer en infusionshastighed afhængigt gennemsnitlige arterielle tryk registreret for at opretholde en given trykområde. Væsken infusionssystembruger programmerbare sprøjtepumper at grænsefladen med de data erhvervelse systemets digitale udgange og styres af den software, overvåge MAP. Den tøjr og drejelige opsætning tillader fri bevægelse af rotter i løbet af undersøgelsen under overvågning pres, infusion væsker og vasopressorer, og udførelse af blodprøver uden at skulle manipulere dyrene. Samtidig overvågning af op til 12 instrumenterede dyr med 2 katetre hver (i vores setup) med hardwaren kan udvides til at overvåge 24 instrumenterede dyr giver mulighed for en stor fleksibilitet til at studere flere lagdelte grupper i hvert forsøg.
Denne kateterisation procedure kan være gavnlig for forskningsfaciliteter, der bruger lignende gnavermodeller kræver vaskulær adgang til overvågning, prøveudtagning og behandling i op til 11 dage. Hvis forskning facilitet overvejer denne procedure har erfaring med gnavere og en ordentlig støtte struktur for at opretholde disse dyr så developing disse færdigheder kan sikre en betydelig omkostningsbesparelse, hvilket reducerer den samlede pris pr kateteriseret rotte fra mere end $ 180 til mindre end $ 50 (herunder naive rotter, kateter komponenter og tekniske omkostninger) og stigende planlægningsfleksibilitet (naive rotter er let tilgængelige vs. selskab leveringsplan af implanterede rotter). Succesen for denne procedure er afhængig af de færdigheder den enkelte at udføre catheterizations. De uddannelses- dyr kræves for at blive dygtige i denne procedure har varierede mellem 20 og 40 rotter med en resulterende kateter åbenheden på> 90%.
Protocol
De nedenfor beskrevne procedurer blev udført som en del af en protokol godkendt af Animal Care og brug Udvalg for Klinisk Center på National Institutes of Health.
1. Forberedelse til operation
- Gas sterilisere katetre og instrumenter.
2. Forbered Katetre
- Skyl katetere med hepariniseret glycerol (250 IU heparin / 1 ml glycerol) for at sikre åbenheden og undgå lækage. Sæt ende af kateteret med en metal prop (20 ga, 15 mm) til at fastholde hepariniseret glycerol.
3. Forbered Aseptisk Workstation
- Brug 70% alkohol at sprøjte arbejdsstation og instrumentbakker. Brug en steril afdækning til dækning operationsbordet og instrumentbakker og placere instrumenterne på bakken.
4. Forbered Rotter for Kirurgi
- Placer rotte individuelt i en Lucite kammer og udsættes for et bedøvelsesmiddel; isofluran (3-5%) mixed med oxygen indtil bevidstløs. Fjern rotte fra kammeret og barbere skind fra forreste og bageste dele af halsen. Påfør smøremiddel salve til øjnene.
5. Kateter Implantation
- Placer bedøvet rotte (bekræftet ved toe pinch) på en opvarmet kirurgisk bord i den ventrale position; placere næsen i næsekeglen at opretholde anæstesi med spontane respiration (isofluran, 3,5%). Skrub forsigtigt kirurgiske område 3 gange vekslende brug af Betadine og 70% alkohol. Foretag en 0,5 cm midtlinie incision i huden mellem skulderbladene ved hjælp af en kirurgisk saks.
- Flyt rotte i dorsal position; blidt begrænse benene på hver side af bordet ved hjælp af elastikker; opretholde anæstesi. Placer to rullet steril 4x4 gaze under hals til lidt hyperextend for bedre eksponering. Foretag en 2 cm ventral cervikal incision i huden ret af midterlinjen af halsen på niveau med nøglebenet ved anvendelse af en skalpel.
6. HøjreklikHalsvenen Kateterisering
- Ved hjælp af en hæmostat, stumpt dissekere den højre halsvene, udskille spyt og lymfevæv at visualisere og isolere en 5 mm afsnit af beholderen. Brug 4-0 silke sutur, placere en løs slips på begge kraniel og caudale ender af skibet for at maksimere eksponeringen af fartøjet. Ved hjælp af en mikro kirurgisk saks lave et snit stor nok til at passere kateteret i overensstemmelse med beholderen mellem de to ligaturer og binde cranial ligatur omkring beholderen.
- Sæt venekateter i beholderen mod hjertet med bistand af mikro dissekere krog og pincet og fremføre kateteret indtil alt PU 3F segment er i beholderen. Brug ligaturer ved de kraniale og kaudale ender til at fastgøre katetret til fartøjet.
7. Venstre Arteria carotis Kateterisering
- Ved hjælp af en hæmostat, uden omsvøb dissekere omohyoid muskel på langs for at blotlægge den venstre halspulsåre og jegsolate en 5mm sektion af beholderen. Sørg vagus nerve (hvidt) er helt adskilt fra arterien. Pas på ikke at makulere eller bryde nerve.
- Brug 4-0 silkesutur, placere en løs slips på den kaudale ende af beholderen, binde off kraniale ende af beholderen og placere en bulldog klemme kaudalt over suturen for at stoppe blodgennemstrømningen efter indsnit. Ved hjælp af en mikro kirurgisk saks, lave et snit, stor nok til at passere kateteret i overensstemmelse med beholderen mellem de to ligaturer. Sæt arteriekateter mod hjertet med bistand af mikro dissekere krog og pincet.
- Brug en glat nåleholder uden lås til at holde den del af kateteret i beholderen stramt, før du fjerner bulldog klemme. Advance kateteret med en pincet, mens løsne nåleholderen langsomt indtil hele PU 2F segment af katetret er i karret. Bind den løse caudale ligatur omkring kateteret og skib for at sikre, men ikke så Tight som at okkludere, kateteret.
8. Brug en straight Hemostat, Tunnel en 5 cm Tube tilbage Subkutant bag øret og gennem snittet mellem skulderbladene. Eksteriorisere katetrene gennem røret og Fjern Tube.
9. Luk den ventrale Indsnit med tre rustfrit stål sårklemmer og Dorsal Indsnit med 4-0 silkesuturer at sikre de blotlagt Katetre på plads.
10. Post-kirurgisk Monitor og pleje
- Efter kateterisering, opsige anæstesi og genvinde rotte i laterale decubitus position i et bur med cellulose sengetøj. Overhold rotter ved 2 timers intervaller i mindst 4 timer, eller indtil viser ingen tegn på smerte og derefter en gang dagligt. Giv Ketoprofen [5 mg / kg, subkutan injektion (SQ)] umiddelbart efter procedure og hver 12 timer, hvis rotten viser tegn på smerte eller lidelse. Det er vores erfaring, har ingen rotter krævet yderligere analgesi for smerter efter initial injektion. Karakteristika observeret der ville udløse hensyn til yderligere doser af analgesi indbefatter, men ikke begrænset til; unormal kropsholdning; stigning / fald i respirationsfrekvens, utrivelige / ungroomed, infektion / betændelse i incisionssted, øjenflåd, piloerektion ("spiked hårlaget"), reduktion i aktivitet som reaktion på hørbare eller taktile stimuli.
BEMÆRK: Rotter genvindes til 72 timer at få> 10 g fra præ-kateterisation vægt vil blive indskrevet i undersøgelsen.
11. Tilslutning til Hæmodynamiske System
- Efter genvinding, tilmelde sunde rotter (vægtforøgelse> 10 g) i undersøgelsen. Placer rotter i Lucite kammer og bedøver som tidligere beskrevet.
- Placer sterile afdækningsstykke på kirurgisk bord med steril hæmostat, mikro pincet, 1 ml sprøjter med stump nål.
BEMÆRK: Spidsen af arterieklemmen bør dækkes med gummi for at undgå skader på kateteret. Placer bedøvet rotte på et kirurgisktabel i den ventrale position og sted næsen ind næsekeglen at opretholde anæstesi (3-5%) med spontane respiration. - Clamp arterielle og venøse katetre ved hjælp af et par gummi udjævnede hemostats lige under metal stikbenene. Brug en pincet til at fjerne metal pin ved enden af kateteret og vedlægge en 1 ml sprøjte fyldt med heparin saltvand med en stump nål. Til gengæld fjerne hemostats og trække 0,1 ml for at sikre katetrene er patent.
- Re-klemme katetrene, fjernes kanylen og vedhæfte denne ende til en længere kateter (præ-skyllet med heparin saltvand), der er forbundet til en drejelig og tøjret på toppen af skotøjsæske bur. Slut disse katetre til transducerne for dataindsamling og registrering, prøvetagning eller infusion.
BEMÆRK: Alle katetre er beskyttet med spiralfjeder ledninger længe nok til, at et dyrs fuld bevægelse i deres bur. - Efter kateter forbindelse afslutte anæstesi oginddrive dyrene i brystbenet position i et bur med cellulose sengetøj. For at opretholde arteriekateter åbenhed, skylle linjer med 0,05 ml heparin saltvand (50 IU / ml) hver 1 hr i 24 timer, der falder sammen med de regelmæssige vurderinger af dyrene manuelt.
12. Blood Sampling, Pressure Monitoring and Drug Administration
- Fastgør tom sprøjte til stophanen tilsluttet arteriekateter og trække 0,6 ml inline flush. Vedhæft prøve sprøjte, tage prøven, og returnere 0,6 ml inline flush efterfulgt af 0,7 ml hepariniseret saltvand flush.
- Brug af data erhvervelse hardware og software til at måle og registrere MAP og puls kontinuerligt.
- Tilslut automatiseret lægemiddelafgivelsessystem (AIDS) til venekateter.
BEMÆRK: tilføjer justerer hastigheden af vasopressor infusion (høj, lav eller 0 dosis) baseret på MAP opdaget til vedligeholdte tryk i det normale fysiologiske område.
Representative Results
Ændringer i vaskulære tryk overføres gennem væskefyldte katetre (figur 1) og omdannes til elektriske signaler, der er repræsenteret af de hæmodynamiske bølgeformer (figur 2, 3). Uden vaskulær adgang, ikke kunne foretages disse foranstaltninger. Real-time streaming af bølgeformer muliggør detektion og analyse af ændringer på et beat at slå basis (Figur 2). Komprimere tidsskala af kurver giver mulighed for at kvantificere ændringer, der sker over en længere varighed (minutter til dage) (Figur 3, øverste 4 kurver), som kan være korreleret med ændringer i vasopressor infusionshastigheder (Figur 3, lavere 4 kurver).
Figur 1. Kateter Design: Nærmere oplysninger om komponenterne i de arterielle og venøse katetre PU, polyurethan;. PE, polyethylen (segment længde) Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Real-time MAP bølgeformer af 4 typiske gnavere 7 dage efter-kateterisation over 7 sek. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Time-komprimeret MAP bølgeformer af 4 typiske gnavere (øverste 4 bølgeformer) 7 dage efter kateterisation over 1 time. Når kortet gennemsnit (lavere 4 kurver) er, at værdien bruges til at udløse TILFOEJER høj (<90 mmHg) , lav (<100 mmHg) eller stoppe (> 110) strømning svar fra infusionspumpen. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Discussion
Undersøgelse terapeutiske tilgange til en klinisk model af sygdom nødvendiggør evnen til præcist at udføre hæmodynamisk monitorering, således kræver vaskulær adgang. I vores model for sepsis, arteriel kateterisering giver systemisk trykovervågning og venøs kateterisation gør det muligt at anvende standard klinisk behandling. Standard terapi for sepsis omfatter infusion af antibiotika til behandling af bakteriel infektion og infusion af væsker og vasopressorer at opretholde arterietryk inden for det ønskede interval. Begge katetre anvendes til blodprøvetagning. I dette design, anvendelse af programmerbare infusion pumper med automatisk udløsning af vasopressor infusionshastighed baseret på real-time betyde arterielle tryk er et fremskridt i den kliniske omgivelser, der kræver manuel titrering af det medicinske personale og i den præ-kliniske omgivelser gør anvendelse af denne behandlingsmodalitet muligt for at studere store antal dyr.
. e_content "> nogle komplikationer oplevede tidligt i udviklingen af modellen Disse omfattede delvis okklusion af både arterielle og venøse katetre fra over stramning, slips på PU2 og PU3 komponenter, (1-2%), fejlplacering af jugular venekateter i en lille gren (<1%); uforklarlig pludselig død efter genvinding (ingen pulmonal thrombe eller anden organskade indlysende), (1-2%) løst ved at holde isofluran koncentration 2-3,5% med O 2 strømningshastighed på 2 l / min . Andre almindelige kirurgiske komplikationer ved blødning, lokal infektion og selvforskyldt skade blev ikke observeret. Når kirurgisk færdighed er nået, hver procedure bør kunne være afsluttet i højst 15 min. Den succesrate målt som en sund opsving og patentansøgninger katetre, kan forventes at overstige 90%, når fuldt uddannet. En yderligere dyr indgår i hver undersøgelse for at minimere tab af data og det samlede antal dyr, der er nødvendige og udgør en mislykket kateter, der kan være "ikun fusion "eller dødelighed på grund af komplikationer.Det mest kritiske skridt i denne procedure er design og placering af katetre. Materialerne skal være blød ved spidsen for ikke at gennembore karvæggen uden krympning for let. Liget af kateteret skal være stivere (end spidsen) for at kunne rykke ind i beholderen tilstrækkeligt og være fastgjort på plads. Figur 1 viser de 3 diametre rør, der er forbundet til arteriekateter og 2 forskellige diameter rør tilsluttet for venøse katetre. Disse komponenter er gled inden i hinanden for at reducere kateter diameter ved spidsen og er limet sammen med ankre tilsat for at sikre placering af kateteret i karret eller hjerte opretholdes.
Når genvindes og forbundet til drejelige og tøjret, skal kortet, og CVP bølgeformer ligne de data, der er repræsenteret i figur 2. For at opretholde arteriekateter patency under overvågning, bør en timeløn heparin saltvand flush (0,05 ml) skal udføres. Kontinuerlig infusion fastholder venekateter åbenhed. Under line tilslutning og flush, skal lukke opmærksomhed at forsikre der ikke er luftbobler i linjen. En luftboble af ≥0.1ml kan resultere i en blodprop i lungen, hjernen eller andre organer. Hæmodynamiske bølgeformer registreres og analyseres i løbet af undersøgelsen. Ved at komprimere tid i x-aksen, Figur 3 viser ændringerne i MAP og CVP i løbet af 1 time, samt ændringer i rente og effekt af vasopressor infusion.
Proceduren har flere potentielle begrænsninger. I vores undersøgelser, katetrene forbliver patent i op til 11 dage. Det er uvist, hvor lang katetrene ville forblive patent ud over denne periode. At passe til katetre, som beskrevet, der er et minimum vaskulær størrelse, som stort set korrelerer med gnaver vægt, at kræve dyr deltager i denne undersøgelse være større end200 g. Anvendelsen af et mindre kateter diameter vil resultere i stigende resistens mod strømningsreducerende åbenhed. Opnåelse centralt venetryk foranstaltninger kræver præcis kateter placering i atrium tilstrækkelige til at forklare størrelse og vækst i undersøgelsesperioden og kan være en udfordring.
Når mestrer, arteriel og vaskulær kateterisation kan danne grundlag for en bred vifte af gnavermodeller kræver hæmodynamisk monitorering, blodprøveudtagning og infusion af væsker eller behandlinger samtidig minimere enhver smerte og lidelse under instrumentering eller håndtering engang inddrevet. I virkeligheden, i forbindelse med en tidligere JOVE publikation 10 beskriver kateterisering af den femorale vene, har vi med succes udført denne model med 3 implanterede katetre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro dissecting forceps | Roboz | RS-8102 | surgical instrument |
| Delicate straight hemostatic forceps | Roboz | RS-7114 | surgical instrument |
| Delicate curved hemostatic forceps | Miltex | 7-4 | surgical instrument |
| Serrefine curved, very delicate micro clamp | Roboz | RS-5471 | surgical instrument |
| Micro dissecting hook | Miltex | 19-220 | surgical instrument |
| Angled on edge micro dissecting spring scissor | Roboz | RS-5618 | surgical instrument |
| Light operating scissor | Roboz | RS-6750 | surgical instrument |
| Scalpel handle and blade (#10) | Cincinnati Surgical | RS-9843 | surgical instrument |
| Pack of 4-0 silk suture with curved needle | Ethicon | FS-2 | surgical instrument |
| Straight micro suturing needle holder | Roboz | RS-6410 | surgical instrument |
| Wound clip | Stoelting | 59027 | surgical instrument |
| Sterile gauze 2"x2" | Dynarex | 3362 | consumable |
| Gauze 4"x4" | Covidien | 2556 | consumable |
| Anesthesia vaporizer | Surgivet | V703001 | equipment |
| Lucite box | Custom | equipment | |
| Isoflurane | Baxter | equipment | |
| Downdraft Table | Airscience | equipment | |
| Table top surgical platform | Custom | equipment | |
| Arterial Catheter | Custom - Scientific Commodities Inc. | consumable | |
| Venous Catheter | Custom - Scientific Commodities Inc. | consumable | |
| Data acquisition system | ADInstruments | Powerlab 16/30 | equipment |
| Data analysis software | ADInstruments | LabChart v7.3 | equipment |
| Programmable infusion pumps | Harvard Apparatus | PHD Ultra | equipment |
References
- Buckingham, R. E. Indwelling catheters for direct recording of arterial blood pressure and intravenous injection of drugs in the conscious rat. J Pharm. Pharmacol. 28 (5), 459-461 (1976).
- Buckle, J. W., Nathaniels, P. W. Proceedings: A dual catheter system for the simultaneous infusion and sampling of the vascular system of the unrestrained rat. J. Physiol. 242 (2), 55P-56P (1974).
- Solomon, S. B., et al. Effective dosing of lipid A analogue E5564 in rats depends on the timing of treatment and the route of Escherichia coli infection. J. Infect. Dis. 193 (5), 634-644 (2006).
- Cui, X., et al. Bacillus anthracis cell wall produces injurious inflammation but paradoxically decreases the lethality of anthrax lethal toxin in a rat model. Intensive Care Med. 36 (1), 148-156 (2010).
- Quezado, Z. M., Natanson, C. Systemic hemodynamic abnormalities and vasopressor therapy in sepsis and septic shock. Am. J. Kidney Dis. 20 (3), 214-222 (1992).
- Perdue, P. W., Kazarian, K. K., Nevola, J., Law, W. R., Williams, T. The use of local and systemic antibiotics in rat fecal peritonitis. J. Surg. Res. 57 (3), 360-365 (1994).
- Qiu, P., et al. The individual survival benefits of tumor necrosis factor soluble receptor and fluid administration are not additive in a rat sepsis model. Intensive Care Med. 37 (10), 1688-1695 (2011).
- Cui, X., et al. Severity of sepsis alters the effects of superoxide anion inhibition in a rat sepsis model. J. Appl. Physiol. 97 (4), 1349-1357 (2004).
- Karzai, W., et al. Protection with antibody to tumor necrosis factor differs with similarly lethal Escherichia coli versus Staphylococcus aureus pneumonia in rats. Anesthesiology. 99 (1), 81-89 (2003).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral Arterial and Venous Catheterization for Blood Sampling, Drug Administration and Conscious Blood Pressure and Heart Rate Measurements. J. Vis. Exp. (59), e3496 (2012).
