Abstract
El éxito de un modelo de pequeños animales para estudiar la enfermedad crítica es, en parte, depende de la capacidad del modelo para simular la condición humana. La inoculación intra-traqueal de una cantidad conocida de bacterias ha sido utilizado con éxito para reproducir la patogénesis de la neumonía, que luego se convierte en sepsis. Monitoreo de los parámetros hemodinámicos y proporcionar el tratamiento clínico estándar, incluyendo la infusión de antibióticos, líquidos y medicamentos para mantener la presión arterial es fundamental para simular la atención de apoyo rutinario en este modelo pero para ello requiere tanto arteriales como acceso vascular venosa. El video detalla la técnica quirúrgica para la implantación de la arteria carótida y la vena yugular catéteres comunes en una rata anestesiada. Después de un período de recuperación de 72 horas, los animales se volvieron a anestesiar y se conectan a una configuración de sujeción y giratorio unido al alojamiento de roedores que conecta los catéteres implantados al sistema de monitorización hemodinámica. Esta configuración permite la libre circulación de larata durante el estudio mientras se monitorea continuamente las presiones, la infusión de líquidos y fármacos (antibióticos, vasopresores) y llevar a cabo la extracción de sangre.
Introduction
Cateterismo arterial y venoso de las ratas durante mucho tiempo ha sido utilizado en la investigación de laboratorio. 1, 2 cateterismo se puede utilizar para el seguimiento de los parámetros hemodinámicos incluyendo sistólica, diastólica y la presión arterial media (MAP), la frecuencia cardíaca (HR) y la presión venosa central (CVP) 3,4. Además, estos catéteres permiten la infusión de los tratamientos estándar o terapias potenciales, así como tomar muestras de sangre para analizar aún más el mecanismo subyacente de una enfermedad o tratamiento. Por lo tanto, teniendo acceso vascular en un modelo animal pequeño es fundamental para el estudio de las medidas de desempeño clínico y los efectos del tratamiento.
Para el estudio de las causas subyacentes de la enfermedad crítica, es importante desarrollar primero un modelo para simular la condición humana. La inoculación intra-traqueal de una cantidad conocida de bacterias ha sido utilizado con éxito para reproducir la patogénesis de la neumonía, una infección pulmonar grave que luego se convierte en sepsis.3, 5 Monitoreo medidas hemodinámicas y proporcionar el tratamiento clínico estándar es crítico para simular la atención de apoyo rutina. Tratamiento clínico estándar incluye la infusión de antibióticos que ayuda en la limpieza de la infección subyacente y la administración de fluidos y vasopresores, dos terapias empleadas en pacientes sépticos para mantener la presión de la sangre. 5-7 de acceso vascular, específicamente implantación de catéteres de patente es especialmente importante cuando se estudia terapias de investigación para la sepsis.
Durante muchos años, la capacidad de administrar el tratamiento clínico estándar para roedores estaba limitada por la disponibilidad de los materiales con las propiedades necesarias para la construcción de catéteres implantables y la capacidad de la tecnología de infusión para entregar pequeños volúmenes con precisión con el tiempo. Además, la capacidad de desencadenar una infusión en respuesta a la monitorización continua de una medida hemodinámica específica permite un soporte consistente y reproduciblemodelo ard tratamiento al utilizar una muestra más grande de los tamaños típicos de los estudios con roedores. 8, 9 Estas limitaciones tecnológicas en materiales y hardware de precisión se han superado, sino para proporcionar simultáneamente terapias de rutina mientras monitorea los parámetros hemodinámicos, tanto arteriales como acceso vascular venosa deben estar disponibles.
El video detalla la técnica quirúrgica para la implantación de la arteria carótida y la vena yugular catéteres comunes en una rata anestesiada. Después de un período de recuperación de 72 horas, los animales se volvieron a anestesiar y se conectan a una configuración de sujeción y giratorio unido al alojamiento roedor utilizado para conectar los catéteres implantados al sistema de monitorización hemodinámica. Durante el estudio, el sistema permite una infusión de fluido, ya sea basado en la entrega de un volumen dado a una cierta tasa de infusión o un sistema automatizado que proporciona una velocidad de infusión en función de la presión arterial media detectado para mantener un rango de presión dada. El sistema de infusión de fluidoutiliza jeringa programable bombas que interactúan con las salidas digitales del sistema de adquisición de datos y son controlados por el software de seguimiento de la MAP. La configuración de sujeción y giro permite el libre movimiento de la rata durante el estudio, mientras que el control de presiones, la infusión de fluidos y vasopresores, y llevar a cabo el muestreo de sangre sin tener que manipular los animales. Monitoreo simultáneo de hasta 12 animales instrumentados con 2 catéteres cada uno (en nuestra configuración) con el hardware ampliable a monitorear 24 animales instrumentados permite una gran flexibilidad para el estudio de varios grupos estratificados en cada experimento.
Este procedimiento de cateterismo puede ser beneficioso para las instalaciones de investigación que utilizan modelos de roedores similares que requieran acceso vascular para el monitoreo, muestreo y tratamiento para un máximo de 11 días. Si el centro de investigación teniendo en cuenta este procedimiento tiene experiencia con roedores y una estructura de soporte adecuado para el mantenimiento de estos animales luego developing estas habilidades pueden proporcionar un importante ahorro de costes, reduciendo el costo total por rata por sondaje de más de $ 180 a menos de $ 50 (incluyendo rata ingenuo, componentes del catéter y gastos técnicos) y aumentar la flexibilidad de programación (ingenuo ratas son fácilmente disponibles vs. horario expedición de la compañía implantado de ratas). El éxito de este procedimiento depende de las habilidades de la persona que realiza los cateterismos. Los animales de capacitación requeridas para ser competente en este procedimiento ha oscilado entre 20 y 40 ratas con una tasa de permeabilidad del catéter resultante de> 90%.
Protocol
Los procedimientos descritos a continuación se realizaron como parte de un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Centro Clínico de los Institutos Nacionales de Salud.
1. Preparación para la Cirugía
- Gas esterilizar los catéteres e instrumentos.
2. Preparar los catéteres
- Lave los catéteres con glicerol heparinizada (250 UI de heparina / 1 ml de glicerina) para asegurar la permeabilidad y evitar fugas. Enchufe extremo del catéter con un tapón de metal (20 ga, 15 mm) para retener glicerol heparinizada.
3. Preparar aséptica de estación de trabajo
- Utilice alcohol al 70% para rociar las bandejas de estaciones de trabajo y los instrumentos. Utilice un paño estéril para cubrir la mesa y de instrumentos operativos y bandejas lugar instrumentos de la bandeja.
4. Preparar ratas para la cirugía
- Lugar de ratas individualmente en una cámara de Lucite y exponerlo a un anestésico; isoflurano (3-5%) de la mezclaed con oxígeno hasta inconsciente. Retire la rata de la cámara y afeitar la piel de las zonas anterior y posterior del cuello. Aplique un ungüento lubricante para los ojos.
5. Implantación del Catéter
- Coloque rata anestesiada (confirmado por pizca dedo del pie) sobre una mesa quirúrgica calentada en la posición ventral; colocar la nariz en el cono de la nariz para mantener la anestesia con respiración espontánea (isoflurano; 3,5%). Frote suavemente el área quirúrgica 3 veces el uso de Betadine y alcohol al 70% que se alternan. Hacer una incisión en la piel en la línea media de 0,5 cm entre las escápulas usando una tijera quirúrgica.
- Volver a colocar la rata en la posición dorsal; frenar suavemente las piernas a cada lado de la mesa de la utilización de bandas de goma; mantener la anestesia. Coloque dos laminados gasa 4x4 estéril bajo el cuello para extender demasiado poco para una mejor exposición. Hacer un 2 cm ventral incisión en la piel cervical derecha de la línea media del cuello a nivel de la clavícula utilizando un bisturí.
6. DerechoVena yugular Cateterismo
- Utilizando una pinza hemostática, sin rodeos diseccionar la vena yugular derecha, separar el salivales y los tejidos linfáticos para visualizar y aislar una sección de 5 mm de la embarcación. El uso de sutura de seda 4-0, coloque un lazo suelto en ambos extremos craneal y caudal del recipiente para maximizar la exposición de la embarcación. Usando una tijera quirúrgica micro hacer una incisión lo suficientemente grande para pasar el catéter, en línea con el vaso entre las dos ligaduras y atar la ligadura alrededor del vaso craneal.
- Insertar el catéter venoso en el recipiente hacia el corazón con la ayuda del gancho de disección micro y fórceps y avanzar el catéter hasta que todo el segmento de PU 3F es en el recipiente. Utilice las ligaduras en los extremos craneal y caudal para asegurar el catéter al recipiente.
7. Izquierda arteria carótida Cateterismo
- Usando una pinza hemostática, sin rodeos diseccionar omohioideo longitudinalmente para exponer la arteria carótida izquierda y yosolate una sección de 5 mm de la embarcación. Asegúrese de que el nervio vago (de color blanco) estén totalmente separados de la arteria. Tenga cuidado de no triturar o romper el nervio.
- El uso de sutura de seda 4-0, coloque un lazo suelto en el extremo caudal del buque, atar el extremo craneal del recipiente y colocar una pinza bulldog caudalmente por encima de la sutura para detener el flujo de sangre después de la incisión. Usando una tijera quirúrgica micro, hacer una incisión, lo suficientemente grande para pasar el catéter, en línea con el vaso entre las dos ligaduras. Insertar el catéter arterial hacia el corazón con la ayuda del gancho de disección micro y fórceps.
- Utilice un soporte de aguja suave sin bloqueo para sujetar la parte del catéter dentro del recipiente hermético antes de quitar la pinza bulldog. Avanzar el catéter con un par de fórceps mientras afloja soporte de la aguja lentamente hasta que todo el segmento PU 2F del catéter está en el recipiente. Ate la ligadura caudal suelta alrededor del catéter y buque en garantía, pero no tan tight como para ocluir, el catéter.
8. El uso de una pinza hemostática recta, Túnel un tubo de 5 cm de vuelta vía subcutánea detrás de la oreja ya través de la incisión entre las escápulas. Exteriorizar los catéteres a través del tubo y quitar el tubo.
9. Cierre la incisión ventral con tres clips de acero inoxidable de la herida, y el dorsal de la incisión con suturas de seda 4-0 para Asegurar los catéteres exteriorizado en su lugar.
Monitorear y Cuidado 10. Post-quirúrgico
- Tras el cateterismo, terminar la anestesia y recuperar la rata en decúbito lateral en una jaula con ropa de cama de celulosa. Tenga en cuenta las ratas a intervalos de 2 h durante al menos 4 horas o hasta que no muestran signos de dolor y luego una vez al día. Dé ketoprofeno [5 mg / kg, la inyección subcutánea (SQ)] inmediatamente después del procedimiento y cada 12 horas si la rata muestra signos de dolor o angustia. En nuestra experiencia, no hay ratas han requerido analgesia adicional para el dolor después de la initial inyección. Características observadas que provocaría la consideración de dosis adicionales de analgesia incluyen pero no se limitan a; postura anormal; aumento / disminución de la frecuencia respiratoria, unthrifty / descuidado, infección / inflamación del sitio de la incisión, secreción ocular, piloerección ("pelaje de pinchos"), reducción de la actividad en respuesta a los estímulos sonoros o táctiles.
NOTA: Las ratas se recuperaron durante 72 horas que ganar> 10 g de peso antes del cateterismo se inscribieron en el estudio.
11. Conexión al Sistema de hemodinámica
- Después de la recuperación, inscribirse ratas sanas (aumento de peso> 10g) en el estudio. Coloque ratas en cámara de Lucite y anestesiar como se describió anteriormente.
- Coloque campo estéril en la mesa quirúrgica con pinza hemostática estéril, micro pinzas, 1 ml jeringas con aguja roma adjuntos.
NOTA: Las puntas de la pinza hemostática deben ser cubiertas con goma para evitar daños en el catéter. Coloque rata anestesiada en una quirúrgicamesa en la posición y lugar ventral nariz hasta el cono de la nariz para mantener la anestesia (05.03%) con respiración espontánea. - Clamp catéteres arteriales y venosos utilizando un par de pinzas de goma cubiertas apenas por debajo de las clavijas de metal. Use un par de pinzas para retirar el pasador de metal en el extremo del catéter y adjuntar una jeringa de 1 ml llena con solución salina de heparina con una aguja roma adjunto. A su vez, retire las pinzas hemostáticas y retirar 0,1 ml para asegurar que los catéteres son patentes.
- Vuelva a sujetar los catéteres, retire la aguja y coloque este fin a un catéter largo (pre-inundó con solución salina de heparina) que está conectado a un giro y atado en la parte superior de la caja caja de zapatos. Conecte estos catéteres a los transductores para la adquisición de datos y el registro, toma de muestras, o infusión.
NOTA: Todos los catéteres están protegidos con conductos de resorte en espiral durante el tiempo suficiente para permitir la gama completa de un animal de movimiento en su jaula. - Después de conexión de catéter, terminar la anestesia yrecuperar los animales en la posición esternal en una jaula con ropa de cama de celulosa. Para mantener la permeabilidad del catéter arterial, a eliminar manualmente las líneas con 0,05 ml de solución salina de heparina (50 UI / ml) cada 1 hora durante 24 horas, que coinciden con las evaluaciones periódicas de los animales.
12. Muestreo de Sangre, Control de Presión y de la Administración de Drogas
- Conecte la jeringa vacía para llave de paso conectada al catéter arterial y retirar 0,6 ml ras línea. Conecte la jeringa de la muestra, tomar muestras, y devolver el 0,6 ml ras línea seguida por 0,7 ml de solución salina heparinizada.
- Utilizar los datos de hardware y software de adquisición para medir y MAP registro y el ritmo cardíaco de forma continua.
- Conecte el sistema de administración de fármacos automatizado (ADDS) al catéter venoso.
NOTA: ADDS ajusta la velocidad de infusión de vasopresores (alto, bajo o 0 dosis), basado en la MAPA detectó a las presiones mantenidas dentro del rango fisiológico normal.
Representative Results
Cambios en la presión vascular se transmiten a través de los catéteres llenos de fluido (Figura 1) y se convierten en señales eléctricas representadas por las formas de onda hemodinámicos (Figuras 2, 3). Sin acceso vascular, no se podrían hacer estas medidas. Transmisión en tiempo real de las formas de onda permite la detección y el análisis de los cambios en el ritmo para vencer base (Figura 2). La compresión de la escala de tiempo de las formas de onda permite cuantificar los cambios que se producen durante una duración más larga (de minutos a días) (Figura 3, 4 superiores formas de onda) que puede ser correlacionada con los cambios en las tasas de infusión de vasopresores (Figura 3, 4 formas de onda inferiores).
Figura 1. Catéter Diseño: Los detalles de los componentes de los catéteres arteriales y venosos PU, de poliuretano;. PE, polietileno (longitud de segmento) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. En tiempo real ondas MAP de 4 roedores típicos 7 días después de la cateterización más de 7 seg. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. formas de onda Mapa Tiempo-comprimido de 4 roedores típicos (superior 4 formas de onda) 7 días después de la cateterización más de 1 hora. Cuando el MAP se promedia (4 formas de onda inferiores), ese valor se utiliza para desencadenar AGREGA alta (<90 mmHg) , baja (<100 mmHg) o detener (> 110) respuesta del flujo de la bomba de infusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
La investigación de enfoques terapéuticos para un modelo clínico de la enfermedad requiere la capacidad de realizar con precisión el control hemodinámico, por lo que requiere el acceso vascular. En nuestro modelo de sepsis, cateterismo arterial ofrece monitoreo de la presión sistémica y la cateterización venosa permite la aplicación de la terapia clínica estándar. La terapia estándar para la sepsis incluye la infusión de antibióticos para tratar la infección bacteriana y la infusión de fluidos y vasopresores para mantener la presión arterial dentro del intervalo deseado. Ambos catéteres se utilizan para el muestreo de sangre. En este diseño, la aplicación de la infusión programable bombas con accionamiento automático de la velocidad de infusión de vasopresores basado en tiempo real significa presiones arteriales es un avance sobre el entorno clínico que requiere la valoración manual por el personal médico y en la configuración de pre-clínica hace que la uso de esta modalidad posible para el estudio de grandes números de animales tratamiento.
. e_content "> Algunas complicaciones fueron experimentados temprano en el desarrollo del modelo Éstos incluyeron la oclusión parcial de ambos catéteres arteriales y venosos de más de endurecimiento, los lazos de los componentes PU2 y PU3, (2.1%); la mala colocación de catéter venoso yugular en un pequeña rama, (<1%); inexplicable muerte súbita después de la recuperación (sin trombo pulmonar u otro daño a los órganos evidente), (1-2%) resuelto manteniendo la concentración de isoflurano 2-3,5% con O 2 tasa de flujo de 2 L / min . No hubo otras complicaciones quirúrgicas comunes de la hemorragia, infección local y el daño infligido a sí mismo. Una vez que la competencia quirúrgica se logra, cada procedimiento debe ser capaz de ser completado en no más de 15 minutos. La tasa de éxito se mide como una recuperación saludable y catéteres de patente, se puede esperar que superar el 90% una vez plenamente capacitado. Un animal adicional se incluye en cada estudio para minimizar la pérdida de datos y el número total de animales necesarios y dar cuenta de un catéter fallido que puede ser "ensólo fusión "o la mortalidad debido a complicaciones.El paso más crítico en este procedimiento es el diseño y colocación de los catéteres. Los materiales deben ser suave en la punta con el fin de no perforar la pared del vaso sin ser forzados con demasiada facilidad. El cuerpo del catéter tiene que ser más rígido (que la punta) para poder avanzar en el recipiente suficientemente y ser asegurado en su lugar. Figura 1 muestra los diámetros de la tubería 3 que están conectados para el catéter arterial y 2 tubos de diámetro diferente conectado para los catéteres venosos. Estos componentes se deslizan uno dentro de otro para reducir el diámetro del catéter en la punta y se pegan con las anclas añadido para asegurar la colocación del catéter en el vaso o el corazón se mantiene.
Una vez recuperado y conectado a la pieza giratoria y de sujeción, las formas de onda de MAP y PVC deben ser similares a los datos representados en la Figura 2. Para mantener patenc catéter arterialy durante el monitoreo, se debe realizar un lavado con solución salina de heparina por hora (0,05 ml). La infusión continua mantiene la permeabilidad del catéter venoso. Durante la conexión de la línea y el color, se debe prestar mucha atención para asegurar que no haya burbujas de aire en la línea. Una burbuja de aire de ≥0.1ml puede dar lugar a una embolia en el pulmón, el cerebro u otros órganos. Formas de onda hemodinámicas se registraron y analizaron en el transcurso del estudio. Cuando la compresión de tiempo en el eje x, la Figura 3 muestra los cambios en MAP y CVP en el transcurso de 1 hora, así como los cambios en la frecuencia y el efecto de la infusión de vasopresor.
El procedimiento tiene varias limitaciones potenciales. En nuestros estudios, los catéteres permanecen patente para un máximo de 11 días. No se sabe cuánto tiempo los catéteres permanecerían patente más allá de este período. Para ajustar los catéteres como se describe, hay un tamaño mínimo vascular, que se correlaciona más o menos con el peso de roedores, requiriendo animales inscritos en este estudio sea mayor que200 g. El uso de un catéter de diámetro más pequeño se traduciría en el aumento de las resistencias a fluir la reducción de la permeabilidad. La consecución de las medidas centrales de presión venosa requiere la colocación del catéter precisa en el atrio suficiente para tener en cuenta el tamaño y el crecimiento durante el período de estudio y puede ser un desafío.
Una vez dominado, cateterismo arterial y vascular pueden servir de base para una amplia variedad de modelos de roedores que requieren monitorización hemodinámica, toma de muestras de sangre, y la infusión de líquidos o terapias y reducir al mínimo cualquier dolor y angustia durante la instrumentación o manipular una vez recuperado. De hecho, en conjunción con una publicación que describe JOVE 10 cateterización anterior de la vena femoral, hemos realizado con éxito este modelo con 3 catéteres implantados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight micro dissecting forceps | Roboz | RS-8102 | surgical instrument |
| Delicate straight hemostatic forceps | Roboz | RS-7114 | surgical instrument |
| Delicate curved hemostatic forceps | Miltex | 7-4 | surgical instrument |
| Serrefine curved, very delicate micro clamp | Roboz | RS-5471 | surgical instrument |
| Micro dissecting hook | Miltex | 19-220 | surgical instrument |
| Angled on edge micro dissecting spring scissor | Roboz | RS-5618 | surgical instrument |
| Light operating scissor | Roboz | RS-6750 | surgical instrument |
| Scalpel handle and blade (#10) | Cincinnati Surgical | RS-9843 | surgical instrument |
| Pack of 4-0 silk suture with curved needle | Ethicon | FS-2 | surgical instrument |
| Straight micro suturing needle holder | Roboz | RS-6410 | surgical instrument |
| Wound clip | Stoelting | 59027 | surgical instrument |
| Sterile gauze 2"x2" | Dynarex | 3362 | consumable |
| Gauze 4"x4" | Covidien | 2556 | consumable |
| Anesthesia vaporizer | Surgivet | V703001 | equipment |
| Lucite box | Custom | equipment | |
| Isoflurane | Baxter | equipment | |
| Downdraft Table | Airscience | equipment | |
| Table top surgical platform | Custom | equipment | |
| Arterial Catheter | Custom - Scientific Commodities Inc. | consumable | |
| Venous Catheter | Custom - Scientific Commodities Inc. | consumable | |
| Data acquisition system | ADInstruments | Powerlab 16/30 | equipment |
| Data analysis software | ADInstruments | LabChart v7.3 | equipment |
| Programmable infusion pumps | Harvard Apparatus | PHD Ultra | equipment |
References
- Buckingham, R. E. Indwelling catheters for direct recording of arterial blood pressure and intravenous injection of drugs in the conscious rat. J Pharm. Pharmacol. 28 (5), 459-461 (1976).
- Buckle, J. W., Nathaniels, P. W. Proceedings: A dual catheter system for the simultaneous infusion and sampling of the vascular system of the unrestrained rat. J. Physiol. 242 (2), 55P-56P (1974).
- Solomon, S. B., et al. Effective dosing of lipid A analogue E5564 in rats depends on the timing of treatment and the route of Escherichia coli infection. J. Infect. Dis. 193 (5), 634-644 (2006).
- Cui, X., et al. Bacillus anthracis cell wall produces injurious inflammation but paradoxically decreases the lethality of anthrax lethal toxin in a rat model. Intensive Care Med. 36 (1), 148-156 (2010).
- Quezado, Z. M., Natanson, C. Systemic hemodynamic abnormalities and vasopressor therapy in sepsis and septic shock. Am. J. Kidney Dis. 20 (3), 214-222 (1992).
- Perdue, P. W., Kazarian, K. K., Nevola, J., Law, W. R., Williams, T. The use of local and systemic antibiotics in rat fecal peritonitis. J. Surg. Res. 57 (3), 360-365 (1994).
- Qiu, P., et al. The individual survival benefits of tumor necrosis factor soluble receptor and fluid administration are not additive in a rat sepsis model. Intensive Care Med. 37 (10), 1688-1695 (2011).
- Cui, X., et al. Severity of sepsis alters the effects of superoxide anion inhibition in a rat sepsis model. J. Appl. Physiol. 97 (4), 1349-1357 (2004).
- Karzai, W., et al. Protection with antibody to tumor necrosis factor differs with similarly lethal Escherichia coli versus Staphylococcus aureus pneumonia in rats. Anesthesiology. 99 (1), 81-89 (2003).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral Arterial and Venous Catheterization for Blood Sampling, Drug Administration and Conscious Blood Pressure and Heart Rate Measurements. J. Vis. Exp. (59), e3496 (2012).
