Summary
这里描述的是这样一种方法来检测并通过免疫标记线粒体分离从啮齿动物的组织和通过流式细胞仪分析的量化线粒体外膜蛋白质。该方法可以被扩展以评估线粒体亚群的功能方面。
Abstract
方法来检测和监测线粒体外膜蛋白成分在动物组织是研究线粒体生理和病理生理至关重要。该协议描述了线粒体啮齿动物组织中分离出免疫标记是通过流式细胞仪检测的技术。线粒体是从啮齿动物的脊髓中分离并进行快速浓缩步骤，以除去髓磷脂，来自神经组织制备的线粒体级分中的主要污染物。分离的线粒体，然后标记所选择的抗体和荧光标记的二抗。分析流量通过与线粒体特异性染料，其次是检测和免疫标记蛋白定量染色流式细胞仪验证线粒体制剂的相对纯度。该技术具有快速，量化和高吞吐量，允许成千上万的每个样本的线粒体的分析。它可适用于评估新颖p在正常生理条件下，在线粒体表面roteins以及病理过程中，可能会成为错误定位到该细胞器的蛋白质。重要的是，这种方法可以被耦合到荧光指示剂染料对线粒体亚群的某些活动的报告，并为从中枢神经系统（脑和脊髓）以及肝线粒体可行的。
Introduction
线粒体是经过多轮的裂变和聚变，被运到高能源需求的网站，并迅速生理刺激反应1高动态性的细胞器。因为人们越来越认识到不同组织内的线粒体，甚至不同的细胞区室，具有不同的功能配置文件，需要新的方法来识别这些不同的线粒体亚群。
显微术提供了一种方法，通过个别线粒体可以可视化和蛋白质在或在线粒体可以通过免疫2来确定是否存在。然而，用这种方法定量分析是劳动密集和更适合用永生化或原代细胞系的实验。来源于组织的个体的线粒体的研究是显著更加困难和最方法不允许以易于识别线粒体亚群与evalu并发通报BULLETIN线粒体功能3。
为了解决这一难题，一种新颖的方法来immunolabel线粒体分离从啮齿动物组织中，并随后分析通过流式细胞术已经被开发出来。这允许快速检测并定位于线粒体外膜，其相比于分析由显微镜蛋白质的定量，少得多的劳动密集的，并允许以十万计的线粒体中的单个样品的分析。此测定法可用于监测被认为是组成性存在于线粒体的线粒体外膜蛋白质的命运和相对量，蛋白质的募集到线粒体表面，或错误定位在病理条件下，线粒体蛋白的检测。此外，以往的荧光指示剂染料的掺入允许的线粒体功能的某些方面，在不同的线粒体同时评价亚群。
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Protocol
在这项研究中使用的动物严格按照协议（N08001CVsr）批准的中心德RECHERCHE杜中心医院DE L'蒙特利尔大学（CRCHUM）机构委员会动物保护的它遵循概述了加拿大国家标准进行治疗理事会动物护理（CCAC）。
准备执行该协议（ 表1）所需要的所有试剂。关于设备，耗材及供应商的所有其他细节可以在材料清单上找到。
表1缓冲区组成。
1，收集大鼠脊髓
- 深深地麻醉大鼠（只SD）与4％异氟烷。在捏个的验证anaesthetization因缺乏反射ê前爪。通过断头台安乐死的大鼠断头。安乐死该方法优于其他，这可能会歪曲脊髓。
- 切开背部皮肤，以暴露脊柱。切骨剪略高于骨盆脊柱。可视化的脊柱开幕。
- 将10毫升注射器，用200微升枪头（通过在火焰稍微融化附后），充满磷酸盐缓冲液（PBS），到脊柱。
- 通过施加的压力的培养基中量到柱塞冲洗出脊髓。
- 如果任何血液存在于脊髓，在进行下一步骤之前，漂洗用PBS。
注：此方法也被证实为脑和肝。如果包括这些组织中，收集半从安乐死的大鼠的脑和一片肝相等的权重至脊髓。所有其他步骤保持一致。
2，隔离脊髓麻省理工学院ochondria（改编自范德维尔德等。4）
- 收集整个完整的脊髓和地点与5卷（〜3.25毫升）匀浆缓冲液（HB）5毫升玻璃匀浆器。对于分离线粒体的最佳恢复，冰或冷室执行所有步骤。用手均匀的组织，直到没有大块的组织仍然存在，大约8招。置于匀浆中的两（2毫升），三（1.7毫升）的微量离心管中。离心1300 XG在4℃的台式离心10分钟。
- 回收上清液并置于5ml的超离心管。加入750微升（约0.5倍体积）HB到含有颗粒状的离心管中，轻轻地重悬沉淀。重复离心和重悬步骤两次以上。池中的所有上清液（S1A和S1B）到同一个5毫升超速上面管。此步骤用于去除小碎片。
- 汇集离心机使用S1配备了吊桶式腐超速离心机或离心在17000×g离心15分钟，在4℃。
- 保留上清液（S2），用于进一步的处理，如果胞浆部分感兴趣（例如，用于Western印迹分析）。重悬沉淀（P2）的粗线粒体级分，在4毫升HB +的50mM的KCl。离心17000×g离心4℃15分钟的水平转头。弃上清，轻轻悬浮在800微升乙肝颗粒（P3）。
注：线粒体是用HB +的50mM的KCl，以除去任何非特异性线粒体相关的污染物。 - 在新的5毫升超速离心管，加入重悬沉淀（P3），正好800微升。
- 向该试管中加入200微升碘克沙醇（密度梯度介质），从而产生12％的碘克沙醇的终浓度。轻轻的，但通过彻底吸取了P1000的混合管的内容。此外碘克沙醇的第一，然后再悬浮沉淀（P3）可以是优选的，以便充分混合。离心机的ULTracentrifuge在4℃下配备吊桶式转子中以17000×g离心15分钟。
- 注：肝不包含髓鞘，因此，如果仅在肝脏正在处理这一步骤不是必需的。但是，如果肝并发中枢神经系统线粒体进行处理，建议同等对待所有的组织。
- 吸髓磷脂的层在该管的顶部，小心地取出并丢弃上清液。球团可能松动。悬浮在4ml HB沉淀。再次离心在17000 XG在4℃下10分钟。弃上清，悬浮在4毫升HB沉淀。重复离心，去除上清。
- 悬浮最终沉淀（P7）在100-200微升HB和转移到1.7 ml离心管。此示例包含分离线粒体。
- 继续进行蛋白定量。稀释样品并在2％十二烷基硫酸钠（SDS）的标准曲线，以确保线粒体杜里充分溶吴蛋白定量。
3，免疫标记分离线粒体的流式细胞仪
- 对于每一个染色组合进行测试，吸管25微克分离线粒体到1.7 ml离心管。包括在每个实验未染色的样品;并为每个抗体，一定要包括相应的同型对照样本。
- 离心机在17000×g离心2分钟，在4℃下，在台式离心。
- 除去上清，悬浮分离的线粒体在50μl线粒体缓冲液（M缓冲液）于4℃（封闭步骤）补充有10％无脂肪酸BSA的15分钟。
注：在标签，在冰箱中4℃进行孵化。 - 第一抗体（兔抗-Mfn2的，每毫升含20微克）加入到管中，并温育30分钟，在4℃下。
注：用滴定法确定每个抗体的最佳浓度经验。由于变异浓度和/或对urity，不同批次来自同一制造商的同一抗体可能导致不同的结果;因此滴定需要为每个新的大量抗体。 - 在4℃离心17000×g离心2分钟：洗出未结合的抗体。除去上清液，并轻轻悬浮于200μl缓冲液M的颗粒。离心机在5185 XG在4℃下2分钟。除去上清液，重悬在50微升M缓冲沉淀。
- 第二抗体（驴抗兔IgG藻红蛋白（PE），0.5微克每毫升）添加至试管孵育样品30分钟，在4℃，避光。
- 在4℃离心17000×g离心2分钟：洗出未结合的二级抗体。弃上清，重悬在200微升M缓冲沉淀。离心机在5185 XG在4℃下2分钟。除去上清液，重悬在500μlM缓冲沉淀。
- 为确保活动其实都是线粒体，染色分离线粒体用线粒体特异性荧光染料15分钟，在室温下，避光。如果其他功能参数（线粒体跨膜电位或过氧化产物）染色的需要，继续执行步骤4。如果没有，请继续收购步骤5。
注意：验证该第二抗体的发射光谱是与该功能性染料的相容是很重要的。例如，如果验证线粒体纯度用市售染料和类似FITC和跨膜电位与四甲甲酯（TMRM）的光谱特性，一个可行的二级抗体将别藻蓝蛋白（APC：实施例650纳米/ EM 660纳米）。添加补偿控制， 即免疫标记或染色用一个荧光基团，在适用的样本。 - 转移到适合装载流式细胞仪的管子。 （为方便样本量小，微量滴定管放置在3毫升流式细胞仪管。）保持样品在冰上，并立即着手流式细胞仪的采集。
4，含量测定线粒体跨膜电位与线粒体超氧化物生成流式细胞仪
- 验证分离的线粒体通过用100nM TMRM（实施例548纳米/ EM 574纳米）5，染色在步骤3.8，为15分钟，在室温下，避光有一个完整的跨膜电位。对样品和种群，使用TMRM（1〜30纳米）的下部/非淬火浓度之间的跨膜电位的比较，可以更适当6。
- 至于TMRM染色，染色分离线粒体与100纳米TMRM在100微米羰基氰氯苯肼（CCCP）的存在，线粒体解耦联，将线粒体去极化控制。 CCCP的去极化的线粒体所需的浓度可以小于，如果使用较低的染料的浓度。
- 验证分离线粒体产生线粒体超氧由圣用合适的线粒体超氧化物指示器7癌宁，也是在步骤3.8，为15分钟，在室温，避光。
- 作为线粒体超氧化物的产生，色斑分离线粒体用染料在10μM抗霉素A，呼吸链，这将增加线粒体超氧化物生成的复合物III抑制剂的存在下的控制。
5，采集免疫标记与分析分离线粒体流式细胞仪
- 仪器设置：从线性电压切换登录方式，以利分离线粒体，并设置电压的分析（FSC：450; SSC：250）。确保事件被收集在FSC-A（面积）模式以及FSC-W（宽度）和FSC-H（高度），以便能够排除双峰（ 即，两个事件，通过检测器传递的同时）在分析后的数据集合。事件的张数设定为被收集到100,000。获得补偿控制（如适用）。
- 数据采集：数据采集前，避免涡旋样本。代替通过轻轻敲击管混匀。最初收集在低压活动，浇注过程中。门上的总人口。调整直方图的电压相应地，通常是未染色的样品的峰值将对应于第二个十年（10 2）。一旦门被建立，并且样品正在处理中，压力可切换到高。
- 分析：通过绘制FSC-W与FSC的可视化双峰。确定汗衫及双峰。门上的汗衫。通过门控上都与线粒体选择性染料染色阳性事件选择线粒体人口。
- 确定由同型对照背景标记。使用同种型对照样品，测定线粒体人口标记阳性Mfn2的抗体的百分比。
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Representative Results
从大鼠脊髓源性线粒体可以免疫标记与靶向Mitofusin2（Mfn2的），牵连线粒体8的外膜的融合蛋白的抗体。以下隔离和标签带Mfn2的特异性抗体和荧光标记的二抗，线粒体通过流式细胞术（ 图1）进行处理。以下的数据采集，样品是使用流式细胞分析软件，由第一可视化上的点图（ 图2A）的所有收集的事件进行分析。当事件被绘制在FSC，宽度（W）相对于面积（A）（ 图2B）的双峰和单峰是有区别的。一旦汗衫被选择时，栅极线粒体人口经由FSC / SSC（ 图2C），并验证事件由染色阳性线粒体特异性染料的数量共绘制未染色样品的直方图用沾有线粒体SPE样品cific染料。以确定的线粒体事件，放置栅极处的两个峰（ 图2D）的交叉点。对于脊髓制剂，通常> 90％的事件都积极为线粒体特异染料。对于其他组织如肝，〜98％的事件将与染料标记（数据未示出）。仅选择该标签正对线粒体特异性染料的事件后，通过选择一个栅极（Mfn2的+），其包括1％或更少的同种型的标记（ 图2E， 左 ）确定与同种型对照背景标记。均匀地施加该栅极到标记抗体Mfn2的确定线粒体与Mfn2的比例存在于线粒体外膜（ 图2E， 右 ）的所有样本。在该实验中，线粒体的30％来自于脊髓标签的正面为Mfn2的。这里要注意的是，尽管Mfn2的被认为是一种广泛表达的MIT是很重要ochondrial外膜蛋白，其先前尚未定量。此外，Mfn2的在培养的细胞的免疫细胞化学分析，显示个别线粒体9的非均质标记。它也有可能是在Mfn2的表位是不可用的，由于翻译后修饰或由于与自身相互作用或其它结合配偶。值得注意的是，使用的合成肽的N-末端（氨基酸38-55）中的生成在本研究的抗体。有Mfn2的的预测剪接变体缺乏的第一302个氨基酸，尽管该变体还没有被实验确认（的UniProt数据库）。因此，该测定法无法检测可变剪接Mfn2的缺乏N-末端序列，给定所使用的抗体。
线粒体跨膜电位（ΔΨ 米 ）和超氧化物的产生可以在该测定中进行评估。穿过线粒体内膜，有负责WH分离ICH驱动器通过氧化磷酸化生成ATP。 TMRM是阳离子染料，其在线粒体内的膜电位依赖性5累加的，因此可以用作线粒体跨膜电位的记者。大多数线粒体（95％）的是TMRM阳性染色后，相比于未染色的对照（ 图3A）。然而，当解偶联剂CCCP添加有在线粒体能够保留TMRM（ 图3A）的数量显著减少。 CCCP允许离子自由通过跨线粒体膜，实质上破坏电荷的分离和去极化膜。
线粒体释放过氧化物作为氧化磷酸化，从复合物I和电子传递链的三正常副产品。线粒体超氧可以通过被靶向线粒体，成为荧光follo膜渗透性染料进行测量翼超7的反应。功能性线粒体产生超氧相比未染色的样品（ 图3B）基底量。此外，复合物III抑制剂抗霉素A的产量增加超，所看到的右移在花期和一些线粒体较高（通常约10％）是荧光与此线粒体超氧指示剂染料（ 图3B）。
图1原理图的隔离，免疫标记和线粒体的分析。步骤1：收集组织，均质步骤2：在分离过程包含八个离心步骤。髓鞘，中枢神经系统组织的主要遏制是由碘克沙醇（密度梯度介质）和CENTRI稀释线粒体除去fuging，导致髓鞘浮到该管的顶部，而线粒体沉淀步骤3：在分离和定量，线粒体被堵塞，标记的第一抗体和洗涤。缀合至荧光基团的二次抗体，然后加入。未结合的抗体洗去步骤4：此时的荧光染料对线粒体的纯度，或线粒体功能的报告可以添加步骤5：线粒体是现在可以通过流式细胞仪检测。
图2。策略分离线粒体通过流动分析仪。前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）的电压必须为小型活动进行调整，用对数模式这两个参数。 FSC宽度（FSC-W）的数据必须是收集排除双峰。请注意，在大多数流式细胞仪，默认设置为FSC和SSC是线性模式（A），可视化所有收集的事件上点图（B）双峰，2线粒体通过激光在同一时间的推移，可以区分汗衫绘制FSC与FSC-W（线性模式）。事件被排除在外，如果FSC-W的值是在大多数的事件， 即，那些致密云的一部分的两倍以上的平均FSC-W的值。在这道门槛的事件门为单峰（C）同样，在可视化的点积的事件，并在余下的赛事门（D）画出未染色样品的直方图（固体，灰色，填充）和样品沾有线粒体特定的染料（MSD：固体，绿色）。门染色阳性的MSD（MSD +），（五）同型对照，兔IgG的直方图的事件（虚线，黑色）和Mfn2的标记的样品（固体，粉红色）。将门以产生≤1％Mfn2的+对同型对照峰值，这同一门适用于实验样本，以确定事件中Mfn2（Mfn2的+）标记阳性的百分比。 请点击这里查看这个放大版图。
图3含量测定线粒体跨膜电位（ΔΨ 米）和超氧化物的产生由流动分离线粒体术。 （一）在基础条件的所有活动将线粒体与TMRM（固体，黑色）的标签，相比于未染色的对照（固体，灰色，填充），因为染料聚集在线粒体跨膜电位。阿迪该protonophore CCCP（虚线，蓝）的灰消散跨膜电位使线粒体去极化和保留较少的染料相比，在基础条件。数据报告为增量平均荧光强度（ΔMFI），这是未染色的对照，从该样品的平均荧光强度减去的平均荧光强度（B）在基础条件下，线粒体产生超氧化物如氧化的副产物磷酸化。超的这个线粒体源可检测与线粒体超氧化物指标，（MitoO 2：固体，黑色）相比，未染色的对照（固体，灰色，填充）。此外，复合物III抑制剂，抗霉素A的（虚线，橙色）结果增加超氧化物生产，与基线水平相比。数据报告为染色阳性细胞为MitoO 2指标的百分比。K“>请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
这是越来越明显，线粒体是关键球员在正常生理和疾病。虽然免疫可以确定哪些蛋白质在线粒体或在线粒体表面发现了在一定的条件下，对整个人口的平均这个方法报告。此方法不能产生约线粒体亚群或亚群的相对丰度信息。虽然先前已假设所有线粒体创建相等，则该字段被越来越多地认识到在小区内的线粒体在形态和/或函数10方面的广泛变化。
荧光显微镜方法也考虑到线粒体异质性。然而，这种类型的数据的量化是劳动密集型的。此外，该方法更适合于使用培养细胞的研究，如线粒体体内的标签/原位是困难的，由于exces西伯数量目前线粒体，使个体的细胞器的分化本来就很难。在大多数免疫细胞化学实验的协议，也无法同时标记线粒体外膜蛋白和评估线粒体功能由于所需的抗体标记的细胞透化步骤。当前的方法适用于分离的线粒体中，并且因此不需要透化步骤。此外，个别线粒体的可视化是唯一可能通过电子显微镜，它是不适合于线粒体功能的分析。话虽这么说，我们认识到，从组织线粒体的分离导致线粒体网络的破坏，这可能会影响线粒体功能的一些元素。然而，分离的线粒体的功能性方面，从组织中被类似地处理的比较仍然有效。
的组织来源isolat免疫标记的这个方法编线粒体和随后通过流式细胞仪分析可用于快速和量化的方法来检测和监控位于外膜的蛋白质的存在。检测高度丰富的线粒体蛋白（如Mfn2的）是可能的这种技术。同样，该方法能够检测低丰度的蛋白质，只附着在线粒体膜中的疾病，如肌萎缩侧索硬化症（ALS）11的上下文中的错误折叠的SOD1。此外，这种方法可能是有用的，以监视瞬时与线粒体表面相关联的，作为其正常功能的一部分的蛋白质。实例包括动力素相关蛋白-1（DRP1），即招募到线粒体，促进线粒体裂变12和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6），其易位至线粒体，以增加线粒体活性氧物种的胞质蛋白的先天免疫应答13的一部分。
目前该技术是适合仅对位于线粒体表面蛋白，如标准透协议内标签需要的洗涤剂的破坏线粒体的结构完整性。虽然有许多可能的试剂已经尝试（未发表），该免疫标记协议的进一步优化，仍然需要使这个协议适合于检测内线粒体成分。
该技术具有广泛的应用，并且可以被用于检测在存在或招募的一种或多种蛋白以根据不同的实验范式线粒体。此外，线粒体可以共同标记有两种不同的抗体，以及具有荧光指示器11。其它荧光探针也可以掺入到表征线粒体功能的其它方面。例如，可商购的染料并监控线粒体pH为14 15，和ATP水平16顷可能的。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢劳瑞Destroismaisons和出色的技术支持莎拉Peyrard和Dr.Alexandre宝勒访问的流式细胞仪。我们也想感谢蒂莫西·米勒博士，他的贡献就从筹备去除髓鞘。这项工作是由卫生研究院（CIHR）神经肌肉研究合作伙伴，加拿大创新基金会，加拿大ALS协会，基金会弗里克ALS研究，密友基金会和全宗德拉RECHERCHE桑特连接魁北克（CVV）加拿大研究院的支持。无论是CVV和NA是研究学者的全宗德拉RECHERCHE桑特连接魁北克与CIHR新的调查。 SP被蒂姆·诺埃尔助学金来自加拿大的ALS协会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Strain code 400 | Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used. |
| Dounce homogenizer | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ultra-Clear Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | Transparent, thin walled |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 rotor and buckets | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, density gradient medium |
| Fatty acid free Bovine Serum Albumin | Sigma | A8806 | Must be fatty acid free for mitochondria |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 antibody | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| Micro titer tube | Bio-Rad | 223-9391 | For sample acquisition by flow cytometry |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM: Ex 540 nm/Em 600 nm |
| Antimycin A | Sigma | A8874 | |
| LSR II flow cytometer | BD | ||
| BD FACSDiva Software | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | Software used for analysis | |
| BCA protein assay kit | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS |
References
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