Introduction
Hydra is gebruikt voor regeneratie, patroonvorming bestuderen en stamcellen ongeveer 250 jaar 2 Hydra een eenvoudige body opgesteld met drie cellijnen. Ectodermale epitheel, endodermale epitheliale en interstitiële. Het buisvormige lichaam wordt gevormd door de ectodermale en endodermale epitheliale lijnen, die elk een enkele cellaag. Alle epitheliale cellen in de kolom lichaam mitotische. Wanneer epitheelcellen verplaatst naar de uiteinden 3, de kop (mond en tentakels) aan het einde orale of voet (basale schijven) op aboral zij daartoe arresteren in de G2 fase van de celcyclus en veranderen lot van de cel 4. De cellen van het interstitiële lineage verblijf op de tussenruimten tussen de epitheelcellen. Deze lijn wordt ondersteund door multipotente stamcellen die zich in het ectodermale epitheliale laag van het lichaam kolom 5. De interstitiële stamcellen leiden tot drie somatische cell types (zenuwen, klier cellen, en nematocytes) en de kiemcellen 6,7.
Als lid van de phylum Cnidaria, de zuster groep om alle bilateria, Hydra kan licht werpen op fundamentele biologische processen verdeeld onder meercellige dieren. Tot voor kort werden deze pogingen belemmerd door het gebrek aan betrouwbare methoden voor de verstoring van de genfunctie. Echter, met de ontwikkeling van transgene methodologie 1, we zijn nu in staat om optimaal te profiteren van Hydra tot een beter begrip van de fundamentele mechanismen gebruikelijk om meercellige dieren, zoals stamcel functie, regeneratie, en patroonvorming krijgen. Hydra Transgene lijnen worden vastgesteld door injectie van plasmide DNA in embryo, wat resulteert in willekeurige integratie en chimere expressie in een aanzienlijke frequentie van jongen. Een lijn uniforme expressie in een bepaalde lijn kan worden vastgesteld door ongeslachtelijke voortplanting. Het vermogen om klonale vermeerderen transgenic Hydra lijnen is een voordeel boven de meeste diermodellen, die kan worden vermeerderd alleen geslachtelijke voortplanting. Bovendien kunnen transgene cellen gemakkelijk in vivo worden gevolgd door de transparantie van het dier en de afwezigheid van endogene fluorescerende eiwitten 8.
In de zeven jaar sinds de eerste transgene Hydra lijnen werden 1, dergelijke lijnen zijn gebruikt voor een verscheidenheid aan toepassingen. Expressie van proteïnen verschillende celtypen is het mogelijk om celbeweging te volgen, veranderingen in celvorm waarnemen en volgen celtypes zowel wildtype omstandigheden en na chemische verstoring 1,5,9-12. Bovendien expressie van verschillende proteïnen de diverse lineages maakt FACS isolatie van specifieke celpopulaties. Deze techniek is gebruikt voor het sequencen van stamcellen specifiek mRNA en afstammings-specifieke RNA's 13,14. Terwijl de promotor vaneen van de twee Hydra actinegenen is meest gebruikt, enkele celtype specifieke promotors geïdentificeerd en gebruikt om expressie van GFP rijden transgene Hydra 9,11,15,16. In de toekomst zal celtype specifieke promotors zorgen voor waarneming en verzameling van specifieke celtype. Bovendien werd een transgene benadering succes gebruikt om de cis-werkende regulerende elementen van de promoter Wnt3 17 definiëren.
De ontwikkeling van transgene werkwijzen Hydra biedt een robuuste benadering voor het testen van de functie van genen door ectopische expressie, overexpressie en knockdown. Transgene dieren gemaakt die fluorescent-gemerkte eiwitten tot expressie teneinde zowel de functie en cellulaire lokalisatie 18-20 onderzocht. Daarnaast is de expressie van RNA haarspelden in de 3'UTR van een GFP-transgen leidt tot knockdown van doelgenen 21,22. In deze benaderingen GFP moet identificerenen volgen de transgene weefsel tijdens de creatie van de transgene lijn. Het is echter waarschijnlijk dat in sommige gevallen de GFP molecuul zou interfereren met de functie van het gecodeerde eiwit. Een recente studie toont aan dat Hydra genen kan worden geregeld in een operon configuratie, dwz polycistronische transcripten gemaakt, die vervolgens worden gescheiden door trans-spliced leader toevoeging afzonderlijk 23 vertaald. Door een gen dat codeert voor een eiwit of een RNA haarspeld in de stroomopwaartse positie van een operon en een fluorescent eiwit gen in de stroomafwaartse positie, kan een transgeen weefsel te volgen zonder het gen dat voor het eiwit of RNA haarspeld taggen. Deze werkwijze is gebruikt om een RNA haarspeld in een operon configuratie met DsRed2 drukken om te komen gen knockdown 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Voorbereiding van plasmide DNA, naalden en injectie Gerechten
- Bereid het plasmide-DNA met behulp van een High Speed Maxi of Midi kit en concentreer het DNA tot 2,5 mg / ml met ethanol precipitatie. De DNA pellet moet worden opgelost in nuclease-vrij gedeïoniseerd water. Bewaar het DNA in 10-20 pi aliquots bij -20 ° C. (Zie Aanvullende tabel 1 voor een overzicht van beschikbare vectoren)
- Een injectie schotel middels agarose een trog construeren voor het vasthouden van embryo's in een 100 x 15 mm petrischaal.
- Plaats een 75 x 50 glazen microscoop dia in een 100 x 15 mm petrischaal in een hoek. Giet ongeveer 50 ml van 2% agarose gesmolten in Hydra medium 24 in de petrischaal. Als alternatief, giet de agarose in de schaal eerst en drijven een "Micro-injectie Fish Mold" bovenop.
- Nadat de agarose is gestold, verwijder het glaasje of de mal. Als een glasplaatje werd gebruikt, te snijden overtollige agarose weg met een scheermes blade aan een wand te vormen. Giet Hydra medium in de schotel en onmiddellijk te gebruiken of op te slaan bij 4 ° C totdat het nodig is. Opmerking: Injectie gerechten worden hergebruikt indien bewaard bij 4 ° C tussen toepassingen.
- Trek naalden van borosilicaatglas capillairen met een filament op de micropipet trekker met de volgende voorwaarden: verwarmen 525, trek 75, snelheid 100 keer 50 WINKEL de naalden door ze in een smalle strook klei persen in een petrischaal zodat zij die evenwijdig aan de bodem van de schaal.
- Aan de injectie-oplossing bereiden combineren 3 pi 2,5 mg / ml plasmide-DNA-oplossing met 2 ui 10% fenolrood. Vortex de oplossing kort draai vervolgens gedurende 10 minuten bij maximale snelheid in een microcentrifuge om eventuele deeltjes die de naald kunnen verstoppen.
- Onder een dissectiemicroscoop klem de naald enkele millimeters van de tip met een tang om een kleine opening te creëren. Opmerking: Er is enige flexibiliteit in de juiste grootte van de opening omdat de druk kan worden aangepast in stap 3.3 deze variatie tegemoet.
- Plaats de petrischaal zodat houdt de naald in een verticale stand met de punt naar beneden. Plaats de naald met ongeveer 0,5 pi injectie-oplossing door pipetteren vloeistof in het achtereinde van de naald. Laat capillaire werking om de oplossing te trekken naar de punt van de naald.
2 Voorbereiding van embryo's voor Injectie
- Op een dagelijkse basis te scannen de Hydra AEP stam cultuur voor poliepen produceren van eieren. Verzamel deze poliepen en leg ze opzij in een aparte cultuur schotel. Neem deze poliepen om de paar uur gedurende de dag om de voortgang van de vorming van ei bewaken. Wanneer eieren breken door het ectoderm en zitten op een ring van ingetrokken ectodermale cellen zijn ze klaar voor injectie 25. Plaats deze poliepen in een schotel met verschillende Hydra die testes hebben voor ten minste 1 uur voor injectie op voor de bevruchting. Hydra </ Em> mannetjes zaadcellen vrijkomen zonder speciale manipulatie.
- Als vrouwtjes in de AEP kolonie volledig gevormde eieren, die ongeveer 400 micrometer in diameter 25, of 1 tot 8-cellig stadium embryo's, verzamelen ook deze voor injectie. Direct injecteren embryo's die klieven begonnen. Opmerking: Het is niet mogelijk om het verschil tussen de volledig gevormde eieren en eencellige zygoten zeggen, waardoor deze worden geïncubeerd bij mannen vóór injectie.
- Vóór injectie, is het grootste deel van de ouderlijke weefsel boven en onder het embryo met een scalpel met een # 15 blad. Laat alleen embryo met een klein stukje body kolom gehecht te worden gebruikt om de embryo manipuleren tang indien nodig. Opmerking: Het weefsel dat uit de buurt van het embryo wordt ontleed zal regenereren en moet worden opgeslagen om ervoor te zorgen dat de vrouwen blijven in de Hydra kolonie.
- Met behulp van een Pasteur pipet, verplaats's naar de injectie schotel, regelen parallel aan de wand van deagarose trog.
3 Micro-injectie van plasmide DNA
- Monteer de microinjector op een magnetische standaard die zit op een ijzeren plaat. Monteer de injectie houder, dat is het deel van de microinjector dat de naald heeft, op een joystick micromanipulator. Monteer de joystick manipulator aan de ijzeren plaat, met een magnetische voet. Plaats deze gehele set-up op de rechterkant van een dissectie microscoop en plaats de injectie houder zodat het zichtbaar is in het waarnemingsveld.
- Zet de injectie schotel met embryo's onder de dissectiemicroscoop georiënteerd dat de verticale wand van de goot agarose naar links. Steek de naald in de injectiespuit houder en laat de punt van de naald in de Hydra medium in de schaal.
- Draai langzaam de knop van de spuit met de klok mee tot minerale olie vult de top van de naald en een gestage stroom injectieoplossing waargenomen verlaten van de naald in de Hydreen medium. Als de stroom te sterk is, hoe lager de druk door naar links te draaien aan de knop. Oefen deze stap om een geschikte druk, die afhankelijk van de grootte van de naald opening (dat wil zeggen hoe de naald werd geknipt in stap 1.5) routinematig te verkrijgen. Opmerking: Als de stroom te sterk is, zal het embryo niet de injectie overleven.
- Tijdens het bekijken door de microscoop ontleden, verplaatst u de injectie gerecht zodat de eerste embryo zich in het midden van het veld. Verplaats de naald zodat raakt dat embryo. Gebruik de micromanipulator om het embryo met de naald prikken. Opmerking: de verticale wand van de agarose trog zal het embryo te houden van wordt verdrongen door de naald.
- Laat de injectie-oplossing te stromen in het embryo 1 of 2 sec en dan snel te verwijderen van de naald. Als de embryo meerdere cellen, injecteren elke cel afzonderlijk. Tang om de embryo heroriënteren naar de volgende cel lijn met de punt van de naald.
- Na de eerste embryo wordt geïnjecteerd, bewegen de schotel, zodat de volgende embryo is in de injectie en herhaal de procedure; doorgaan totdat alle embryo's geïnjecteerd.
4 kweken en broedeieren van embryo's
- Verplaats alle geïnjecteerde embryo's in een schotel met een paar Hydra die testikels (dit is dat alle embryo bevrucht). Incubeer de embryo's in een 18 ° C incubator, terwijl ze blijven embryogenese.
- Zodra de cuticula stadium is bereikt, beweegt elke geïnjecteerde embryo een individuele well van een 24-wells plaat vol Hydra medium.
- Incubeer de geïnjecteerde embryo's gedurende 2 weken in het donker bij 18 ° C.
- Na de 2 weken incubatietijd, controleer elke geïnjecteerde embryo onder de stereomicroscoop. Noteer alle gevallen waarin de cuticula-stadium embryo losgemaakt van het stukje ouderlijke weefsel en het oorspronkelijke weefsel geregenereerd. Verwijder deze geregenereerd poliep onmiddellijk zodat het niet mistaken voor een nieuwe hatchling.
- Verplaats de schotel van de geïnjecteerde embryo's onder een aquarium licht bij RT. Controleer de platen elke dag en verzamel jongen. Nieuwe jongen zal wit zijn, omdat de typische roze kleur van Hydra poliepen afkomstig van de Artemia ze eten.
- Let op de jongen onder een fluorescentiemicroscoop om transgene expressie te detecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oprichting van transgene Hydra lijnen
Feed transgene jongen om de 2-3 dagen met Artemia naupliën. Hatchlings soms niet eten voor een dag of twee na het uitkomen. Sommige nieuwe jongen zal nooit eten, en dus zal het niet overleven. Als het jong is transgene in ofwel de ectodermale (Figuur 1A) of endodermaal epitheelweefsel, zodat het dier uit te lopen en het verzamelen van de knoppen die de meeste transgene weefsel (Figuur 1B, C) te hebben. Doe dit met de nieuwe knoppen totdat een transgene lijn wordt vastgesteld uniforme expressie van het transgen in zowel de ectodermale (figuur 1D) of endodermale epitheliale lineage. Tegelijkertijd kan een tweede lijn worden aangetoond dat het transgen bevat maar is verder genetisch identiek (Figuur 1B). Deze lijn dient als een negatieve controle voor toekomstige experimenten. Als de transgene weefsel ik niet beweegtnto een knop, is het soms mogelijk de dieren gesneden en laat het zo dat het transgene weefsel in de nieuwe ontluikende zone regenereren. Indien de transgeen weefsel te dicht bij de uiteinden zal waarschijnlijk verloren wordt verplaatst tijdens de normale groei van het dier. Vaak is er niets dat kan worden gedaan in deze zaak. In onze handen, als het transgen is neutraal (dwz, heeft geen invloed op de biologische functie) zijn we in staat om een uniforme epitheliale lijn vast van ongeveer 30% van de Hydra dat luik met epitheliale transgene weefsel. De resterende 70% ofwel sterven of het transgene weefsel verloren. Een endodermale lijn is ongeveer 2-3 keer zo vaak voor als een ectodermale lijn. Als een transgen wordt gebruikt dat biologische functie verstoort, kan dit invloed hebben op de haalbaarheid van de oprichting van een uniforme lijn te hebben. In dergelijke gevallen zal induceerbare promoters zijn essentiële toevoegingen aan de toolkit.
Als het jong is transgenein de tussenliggende lijn, zodat het dier uit te lopen en het verzamelen van de jongen met een toenemend aantal transgene cellen in de interstitiële afstamming. Wees ervan bewust dat het soms niet meteen duidelijk is dat een dier transgeen in de interstitiële lijn, vooral als het ook transgene in een epitheliale afkomst. Het is hoogst onwaarschijnlijk dat een lijn volledig transgene in de interstitiële lijn gewoon zal worden vastgesteld door knopvorming. Indien het vereist dat de interstitiële geslacht volledig transgeen, kan dit worden bewerkstelligd door kloneren in aggregaten van interstitiële stamcellen verarmd dieren, dat de gehele lijn opgesteld vanuit een enkele transgene stamcellen 7.
Wanneer een weefselspecifieke of celtype-specifieke promoter wordt gebruikt om expressie van een fluorescerend eiwit trekken, transgene dieren niet evident gold. Bijvoorbeeld als een promotor die alleen actief is in de tentakels gebruikt waarbij de eerste patch van transgeneweefsel in de kolom lichaam geen fluorescerende cellen worden waargenomen in de hatchling. Dus alle jongen moeten worden gepropageerd om transgene weefsel te worden verplaatst in de tentakels en duidelijk geworden.
Figuur 1 De oprichting van een transgene lijn met uniforme ectodermale epitheliale uitdrukking van DsRed2. (A) Een hatchling met chimeer uitdrukking van een DsRed2 transgen onder controle van een actinepromoter in een patch van ectodermale epitheelcellen. (B) Een van de eerste generatie kiem van de hatchling in paneel A is nu de productie van twee nieuwe knoppen. De knop met een sterretje geen transgene weefsels en werd gebruikt als oprichtende dier een controlelijn die genetisch identiek is aan de transgene lijn, behalve de aanwezigheid van het transgen. (C) een tweede-generatie budgeproduceerd uit de Hydra in paneel B. (D) Een voorbeeld van een poliep uit de transgene lijn die werd opgericht met DsRed2 expressie gedurende het ectoderm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hydra reproduceert routinematig ongeslachtelijk, maar vereist prikkels uit de omgeving naar de productie van gameten beginnen. Deze stimuli zijn niet goed gedefinieerd voor de meeste Hydra soorten en kunnen van stam tot stam. Een belangrijke hindernis voor de productie van transgene Hydra is het verkrijgen van embryo's regelmatig omdat het moeilijk in een laboratoriumomgeving te induceren Hydra seksuele thuis hoort. De AEP stam 25 echter produceert gameten gemakkelijk in het laboratorium en dit is de enige stam die tot nu toe voor het maken van transgene lijnen gebruikt. De meest voorkomende methode voor het induceren van gameten productie is door een dieet manipulatie. Zoals eerder beschreven worden de dieren dagelijks gevoederd gedurende drie weken, uitgehongerd voor 5 dagen, en vervolgens toegevoerd tweemaal per week, gedurende welke tijd gameten wordt geproduceerd 1. Het is ook onze ervaring dat het kweken van AEP Hydra op verticale platen in een aquarium 26, misschien een mor simulerene natuurlijke omgeving leidt tot eierproductie zelfs wanneer dieren voer regelmatig. Daarnaast lijnen verkregen uit AEP zichzelf kruisen produceren soms gameten vaker dan de ouderlijke stam. Dit leidt tot een F1 lijn van AEP is een andere methode voor het verkrijgen van een meer betrouwbare bron van embryo's.
Het percentage van embryo's injectie overleven en ontwikkelen om de cuticula fase hangt af van de gezondheid van de embryo's, de hoeveelheid oplossing geïnjecteerd, en de hoeveelheid schade door de injectie. Met de constante stroom injectie opstelling beschreven in dit protocol, is het moeilijk om de hoeveelheid oplossing die wordt geïnjecteerd in het embryo regelen. In onze handen, ongeveer de helft van het embryo geïnjecteerd zoals hier beschreven met succes te voltooien embryogenese en vormen een cuticula. Hiervan 50-75% luik en die luik, ongeveer 50% ten minste een transgeen weefsel. Daarom 10-20% van de oorspronkelijk geïnjecteerde embryo oplevereneen F1 Hydra met transgene weefsel. De hoeveelheid geïnjecteerde oplossing nauwkeurig kan worden geregeld met duurdere apparatuur zoals de IM-300 microinjector. De oorspronkelijke transgene lijnen werden gemaakt met machines van Eppendorf, die veel precisie manipuleren en injecteren van de embryo toelaat. Hoewel deze nauwkeurigheid een grotere overlevingskans van geïnjecteerde embryo's geven deze kost niet noodzakelijk voor routinematige vaststelling van transgene lijnen.
De integratie van het transgen is willekeurig en zou kunnen voorkomen in meerdere locaties in het genoom of in een tandem array in een enkele locatie. Op basis van de Southern blot analyse werd het aantal integraties geschat op vijf in een epitheliale transgene lijn eerder 1 gemaakt. In een tussenliggende lijn transgene lijn waarin het transgen ondergaat kiembaantransmissie, is aangetoond door genoom dat slechts een enkele kopie van het transgen was integrated (CE Dana en RE Steele, ongepubliceerde waarnemingen). Echter, afgezien van deze twee voorbeelden, is er geen informatie beschikbaar over transgen integratielocaties en kopienummer. Omdat het mogelijk is dat een transgen genfunctie kan onderbreken door mutagenese, zou meer dan een transgene lijn worden bij de analyse van fenotypes bijvoorbeeld RNAi of overexpressie constructen. Het is ook belangrijk op te merken dat transgene expressie constitutief is als gevolg van de doorgaans gebruikte actine gen promoter, en dus transgenen die ernstige of letale fenotypen bij expressie constitutief worden niet behouden. Voor de toekomst zal het belangrijk zijn om een induceerbare systeem van transgene expressie om dit probleem te omzeilen ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een G. Harold & Leila Y. Mathers Award voor HL en een NIH-subsidie (R24 GM080527) om RESCEJ was een NRSA Postdoctoraal (NIH F32GM9037222) en wordt momenteel ondersteund door een Mentored Research Scientist Development Award van de National Institute on Aging (K01AG04435). We willen de reviewers bedanken voor nuttig commentaar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEP Hydra Strain | Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp | ||
| High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | |
| 75 x 50 mm Glass Microscope Slide | Sigma | CLS294775X50 | |
| Microinjection Fish Mold | IBI Scientific | FM-600 | |
| Borosilicate Glass with Filament | Sutter Instrument | BF100-50-10 | O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532 | |
| Jewelers Forceps, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
| Scalpel Blade #15 | Fisher | 50-822-421 | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-500ML | |
| Microinjector | Narishige | IM-9B | |
| Magnetic Stand | Narishige | GJ-1 | |
| Iron Plate | Narishige | IP | |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 |
References
- Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).
- Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. Hydra. Curr Biol. 20, 964-965 (2010).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. Pattern of epithelial cell cycling in hydra. Dev Biol. 148, 602-611 (1991).
- Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra. Differentiation. 35, 181-189 (1987).
- Khalturin, K., et al. Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation. Dev Biol. 309, 32-44 (2007).
- Bosch, T., David, C. Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells. Dev Biol. 121, 182-191 (1987).
- David, C. N., Murphy, S. Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning. Dev Biol. 58, 372-383 (1977).
- Chapman, J. A., et al. The dynamic genome of Hydra. Nature. 464, 592-596 (2010).
- Boehm, A. M., Bosch, T. C. Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra. Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).
- Glauber, K. M., et al. A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra. Development. 140, 4788-4796 (2013).
- Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation. Dev Biol. 313, 13-24 (2008).
- Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra. Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).
- Hemmrich, G., et al. Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity. Mol Biol Evol. , (2012).
- Juliano, C. E., et al. PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).
- Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. Germline stem cells and sex determination in Hydra. Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).
- Milde, S., et al. Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type. Genome Biol. 10, 8 (2009).
- Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).
- Gee, L., et al. beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra. Dev Biol. 340, 116-124 (2010).
- Fraune, S., et al. In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).
- Bridge, D., et al. FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris. PLoS One. 5, e11686 (2010).
- Boehm, A. M., et al. FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).
- Franzenburg, S., et al. MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).
- Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution. PLoS One. 7, e31643 (2012).
- Lenhoff, H. M. Hydra: Research Methods. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 4 29-34 (1983).
- Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells. Dev Biol. 224, 326-338 (2000).
- Lenhoff, H. M. Hydra: Research Methods. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 8 53-62 (1983).
