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Biology

Generazione di transgenici Published: September 11, 2014 doi: 10.3791/51888

Introduction

Hydra è stato utilizzato per studiare la rigenerazione, formazione di pattern, e cellule staminali per circa 250 anni 2 Hydra ha un piano corpo semplice che consiste di tre linee cellulari:. Epiteliale ectodermica, endodermico epiteliale, e interstiziale. Il corpo tubolare è formato dalla ectodermica e linee dell'epitelio endodermico, ciascuno dei quali è un singolo strato di cellule. Tutte le cellule epiteliali della colonna corpo sono mitotico. Quando le cellule epiteliali vengono spostati nelle estremità 3, la testa (bocca e tentacoli) alla fine della bocca o il piede (disco basale) alla fine aborale, arrestano nella fase G2 del ciclo cellulare e cambiate destino cellulare 4. Le cellule della linea interstiziale risiedono negli interstizi tra le cellule epiteliali. Questa linea è sostenuta da cellule staminali multipotenti che si trovano nello strato epiteliale ectodermica della colonna corpo 5. Le cellule staminali interstiziali danno origine a tre cel somaticaTipi L (nervi, cellule della ghiandola, e nematocytes) e le cellule germinali 6,7.

Come membro del phylum Cnidari, il gruppo sorella a tutti bilaterians, Hydra può far luce sui processi biologici fondamentali condivisi tra gli animali multicellulari. Fino a poco tempo, questi sforzi sono stati ostacolati dalla mancanza di metodi affidabili per la perturbazione della funzione del gene. Tuttavia, con lo sviluppo della metodologia transgenica 1, siamo ora in grado di sfruttare appieno Hydra per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi di base comuni ad animali pluricellulari, come ad esempio la funzione delle cellule staminali, la rigenerazione, e patterning. Linee transgeniche Hydra sono stabiliti mediante iniezione di DNA plasmidico in embrioni, che si traduce in integrazione casuale ed espressione chimerico in frequenza sostanziale di larve. Una linea con l'espressione uniforme in un particolare lignaggio può essere stabilita per propagazione asessuata. La capacità di propagare clonale transgENIC Hydra righe è un vantaggio rispetto alla maggior parte dei modelli animali, che possono essere propagate solo da riproduzione sessuale. Inoltre, cellule transgeniche possono essere seguiti facilmente in vivo a causa della trasparenza dell'animale e l'assenza di proteine ​​fluorescenti endogene 8.

Nei sette anni dalla prima linea Hydra transgeniche sono state effettuate 1, tali linee sono stati utilizzati per una varietà di applicazioni. Espressione di proteine ​​fluorescenti in diversi tipi di cellule ha permesso di monitorare il movimento delle cellule, osservare cambiamenti di forma delle cellule, e tenere traccia destini cellulari sia in condizioni di tipo selvatico e dopo perturbazione chimica 1,5,9-12. Inoltre, l'espressione di proteine ​​fluorescenti differenti nelle diverse linee consente FACS isolamento di specifiche popolazioni cellulari. Questa tecnica è stata utilizzata per la sequenza di mRNA specifici di cellule staminali e le specifiche del lineage piccoli RNA 13,14. Mentre il promotore diuno dei due geni di actina Hydra è stato più utilizzato, a poche cellule di tipo promotori specifici sono stati identificati e utilizzati per guidare l'espressione di GFP in transgenici Hydra 9,11,15,16. In futuro, i promotori specifici delle cellule di tipo permetteranno l'osservazione e la raccolta di qualsiasi tipo di cellula specifico. Inoltre, un approccio transgenico è stato usato con successo per definire cis-agenti elementi regolatori del promotore Wnt3 17.

Lo sviluppo di metodi transgenici in Hydra fornisce un valido approccio per testare la funzione dei geni dall'espressione ectopica, sovraespressione, e atterramento. Gli animali transgenici sono stati fatti che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato, al fine di esaminare sia la funzione e la localizzazione cellulare 18-20. Inoltre, l'espressione di forcine RNA nel 3'UTR di un transgene GFP conduce atterramento di geni bersaglio 21,22. In questi approcci è necessaria GFP per identificaree monitorare il tessuto transgenico durante la creazione della linea transgenica. Tuttavia, è probabile che in alcuni casi la molecola GFP potrebbe interferire con la funzione della proteina tag. Uno studio recente dimostra che i geni Hydra possono essere organizzati in una configurazione operone, cioè, trascrizioni policistronici sono fatti, che vengono poi separati da trans-impiombato Inoltre leader e tradotto separatamente 23. Inserendo un gene codificante una proteina o una forcina RNA nella posizione a monte di un operone e un gene della proteina fluorescente nella posizione a valle, si può tracciare tessuto transgenico senza dover codificare il gene codificante la proteina o RNA hairpin. Questo metodo è stato utilizzato per esprimere un tornante RNA in una configurazione operone con DsRed2 al fine di raggiungere gene knockdown 14.

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Protocol

1 Preparazione di DNA plasmidico, aghi, e piatti iniezione

  1. Preparare il DNA plasmidico utilizzando un kit Maxi alta velocità o Midi e concentrare il DNA a 2,5 mg / ml mediante precipitazione in etanolo. Il pellet di DNA deve essere sciolto in acqua deionizzata priva di nucleasi. Conservare il DNA in 10-20 microlitri aliquote a -20 ° C. (Vedi Tabella supplementare 1 per un elenco di vettori disponibili)
  2. Fare un piatto di iniezione utilizzando agarosio per costruire un trogolo per lo svolgimento di embrioni in una capsula di Petri di 100 x 15 mm.
    1. Posizionare un vetrino da microscopio 75 x 50 vetro in un piatto 100 x 15 mm Petri in un angolo. Versare circa 50 ml di 2% agarosio sciolto in Hydra medio 24 nella piastra di Petri. In alternativa, versare l'agarosio nel piatto prima e galleggiare un "Microiniezione pesce Mold" in alto.
    2. Dopo l'agarosio si è solidificato, rimuovere il vetrino o lo stampo. Se è stato utilizzato un vetrino, tagliare via l'eccesso di agarosio con un bla rasoiode per formare un muro. Versare Hydra media nel piatto e utilizzare immediatamente o conservarlo a 4 ° C fino al momento dell'uso. Nota: i piatti iniezione possono essere riutilizzati se conservato a 4 ° C tra usi.
  3. Tirare aghi da capillari in vetro borosilicato con un filamento sul estrattore micropipetta con le seguenti condizioni: scaldare 525, tirare 75, velocità 100, tempo 50. Conservare gli aghi di loro premendo in una stretta striscia di argilla in una capsula di Petri tale che siano tenuto parallelo al fondo del piatto.
  4. Per preparare la soluzione iniettabile, combinare 3 ml di / soluzione di DNA plasmidico ml 2,5 mg con 2 ml di 10% di rosso fenolo. Vortex la soluzione brevemente e poi girare per 10 min alla massima velocità in una microcentrifuga per rimuovere eventuali particelle che potrebbero intasare l'ago.
  5. Sotto un microscopio da dissezione, agganciare l'ago a pochi millimetri dalla punta con una pinza per creare una piccola apertura. Nota: Vi è una certa flessibilità nella dimensione appropriata del apertozione perché la pressione può essere regolata nel passaggio 3.3 per accogliere questa variazione.
  6. Porre la capsula di Petri in modo che sta tenendo l'ago in posizione verticale con la punta verso il basso. Caricare l'ago con circa 0,5 ml di soluzione iniettabile pipettando liquido nell'estremità posteriore dell'ago. Lasciare azione capillare per tirare la soluzione nella punta dell'ago.

2 Preparazione di embrioni per iniezione

  1. Su base giornaliera eseguire la scansione della cultura ceppo Hydra AEP per polipi producono uova. Raccogliere questi polipi e metterli da parte in un piatto di cultura separata. Osservare questi polipi ogni poche ore durante il giorno per monitorare l'andamento della formazione dell'uovo. Quando le uova si rompono attraverso l'ectoderma e si siedono su un anello di cellule ectodermiche retratti sono pronti per l'iniezione 25. Posizionare questi polipi in un piatto con diversi Hydra che hanno testicoli per almeno 1 ora prima dell'iniezione per consentire la fecondazione. Hydra </ Em> maschi rilascerà spermatozoi senza alcuna manipolazione speciale.
  2. Se le femmine si trovano nella colonia AEP con uova completamente formate, che sono circa 400 micron di diametro 25, o da 1 a 8 celle embrioni stadio, raccogliere anche questi per l'iniezione. Iniettare immediatamente gli embrioni che hanno iniziato scissione. Nota: Non è possibile capire la differenza tra le uova completamente formate e zigoti unicellulari, quindi questi devono essere incubate con i maschi prima dell'iniezione.
  3. Prima dell'iniezione, rimuovere la maggior parte del tessuto parentale sopra e sotto l'embrione utilizzando un bisturi con lama # 15. Lasciare solo l'embrione con un piccolo pezzo di colonna corpo attaccato, da utilizzare per manipolare l'embrione con una pinza se necessario. Nota: Il tessuto che viene sezionato dalla embrione si rigenera e dovrebbe essere salvato per garantire che le femmine rimangono nella colonia di Hydra.
  4. Usando una pipetta Pasteur, spostare embrioni al piatto di iniezione, disponendole parallele alla parete dellaattraverso agarosio.

3. Microiniezione di DNA plasmidi

  1. Montare il microinjector su un supporto magnetico che si siede su una lastra di ferro. Montare il supporto di iniezione, che è la parte del microinjector che contiene l'ago, su un micromanipolatore joystick. Montare il manipolatore joystick per la piastra di ferro, con un supporto magnetico. Posizionare questo intero set-up sul lato destro di un microscopio da dissezione e posizionare il supporto di iniezione in modo che sia visibile nel campo di osservazione.
  2. Porre la capsula iniezione con embrioni al microscopio da dissezione, orientato in modo tale che la parete verticale della vasca agarosio è a sinistra. Inserire l'ago nel supporto di iniezione e abbassare la punta dell'ago nel mezzo Hydra nel piatto.
  3. Ruotare lentamente la manopola della siringa in senso orario fino olio minerale riempie la parte superiore dell'ago e un flusso continuo di soluzione iniettabile si osserva uscire l'ago nel Hydrun mezzo. Se il flusso è troppo forte, abbassare la pressione ruotando la manopola in senso antiorario. Pratica questo passo per ottenere ordinariamente una pressione adeguata, che dipende dalle dimensioni dell'apertura dell'ago (cioè, come l'ago è stato fermato nella fase 1.5). Nota: Se il flusso è troppo forte, l'embrione non sopravviverà l'iniezione.
  4. Durante la visualizzazione attraverso il microscopio da dissezione, spostare il piatto iniezione, in modo che il primo embrione è al centro del campo. Spostare l'ago in modo che sia a contatto con quella dell'embrione. Utilizzare il micromanipolatore per perforare l'embrione con l'ago. Nota: La parete verticale della vasca agarosio manterrà l'embrione di essere messo da parte dal ago.
  5. Lasciare che la soluzione iniettabile di fluire in embrione 1 o 2 secondi e poi rimuovere l'ago rapidamente. Se l'embrione ha più di una cella, iniettare ogni cella singolarmente. Usare pinze per riorientare l'embrione per allineare la cella successiva con la punta dell'ago.
  6. Dopo il primo Embryo viene iniettato, spostare il piatto in modo che la prossima embrione è nella posizione di iniezione e ripetere la procedura; continuare fino a quando sono state iniettate tutti gli embrioni.

4. coltura e cova di embrioni

  1. Spostare tutti gli embrioni iniettati in un piatto con un paio di Hydra che hanno testicoli (questo è quello di garantire che tutti gli embrioni sono fecondati). Incubare gli embrioni in un 18 ° C incubatore mentre continuano embriogenesi.
  2. Una volta raggiunta la fase della cuticola, spostare ogni embrione iniettato ad un pozzo individuale di una piastra da 24 pozzetti riempiti con Hydra medie.
  3. Incubare gli embrioni iniettati per 2 settimane al buio a 18 ° C.
  4. Dopo il periodo di incubazione 2 settimane, controllare ogni embrione iniettato sotto il microscopio da dissezione. Nota casi in cui l'embrione cuticola stadio ha staccati dal piccolo pezzo di tessuto parentale e il tessuto dei genitori ha rigenerati. Rimuovere questo polipo rigenerato immediatamente in modo che non è mistaken per un nuovo cucciolo.
  5. Spostare il piatto di embrioni iniettati sotto una luce acquario a temperatura ambiente. Controllare le piastre ogni giorno e raccogliere larve. Le nuove larve saranno bianco perché il tipico colore rosa di polipi Hydra nasce dalla Artemia di cui si nutrono.
  6. Osservare i piccoli sotto un microscopio a fluorescenza per rilevare l'espressione del transgene.

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Representative Results

Stabilire linee transgeniche Hydra

Alimentare larve transgeniche ogni 2-3 giorni con Artemia nauplii. I piccoli a volte non mangiano per un giorno o due dopo la schiusa. Alcuni nuovi nascituri saranno mai mangiare, e quindi non sopravviverà. Se il cucciolo è transgenico sia nel ectodermica (Figura 1A) o tessuto epiteliale endodermico, permettere all'animale di germoglio e raccogliere le gemme che hanno il tessuto più transgenico (Figura 1B, C). Continuare a fare questo con i nuovi germogli fino a quando una linea transgenica viene stabilita con l'espressione uniforme del transgene sia nel ectodermica (Figura 1D) o endodermica lignaggio epiteliale. Contemporaneamente, una seconda linea può essere stabilito che non contiene il transgene ma è altrimenti geneticamente identici (Figura 1B). Questa linea serve come controllo negativo per esperimenti futuri. Se il tessuto transgenico non si muove into una gemma, a volte è possibile tagliare l'animale e permettono di rigenerare in modo che il tessuto transgenico sarà nella nuova zona in erba. Tuttavia, se il tessuto transgenico è troppo vicino alle estremità sarà probabilmente perso in quanto si sposta durante la normale crescita dell'animale. Spesso non c'è nulla che può essere fatto in questo caso. Nelle nostre mani, se il transgene è neutrale (cioè, non ha alcun impatto sulla funzione biologica) siamo in grado di stabilire una linea epiteliale uniforme da circa il 30% di Hydra che si schiudono con il tessuto epiteliale transgenici. Il restante 70% sia morire o il tessuto transgenico è perso. Una linea endodermico è di circa 2-3 volte più comuni come una linea ectodermica. Se un transgene viene utilizzata che sconvolge funzione biologica, questo può avere un impatto sulla fattibilità della creazione di una linea uniforme. In questi casi, i promotori inducibili saranno aggiunte essenziali per il toolkit.

Se il cucciolo è transgenicanel lignaggio interstiziale, permettere all'animale di germoglio e raccogliere i piccoli con un numero crescente di cellule transgeniche nel lignaggio interstiziale. Essere consapevoli del fatto che a volte non è immediatamente chiaro che un animale è transgenico nel lignaggio interstiziale, soprattutto se è anche transgenico in un lignaggio epiteliale. E 'altamente improbabile che una linea completamente transgenica nel lignaggio interstiziale sarà stabilito semplicemente per gemmazione. Se è necessario che il lignaggio interstiziale essere pienamente transgenica, questo può essere realizzato mediante la clonazione di animali in aggregati di cellule-staminali impoverito interstiziale tale che l'intero lignaggio è stabilito da una singola cellula staminale transgenici 7.

Nei casi in cui un tipo specifico promotore tessutale o cellulare viene utilizzato per guidare l'espressione di una proteina fluorescente, animali transgenici potrebbero non essere evidenti inizialmente. Ad esempio, se viene utilizzato un promotore che è attivo solo nei tentacoli e la patch iniziale di transgenicotessuto è nella colonna corpo, non le cellule fluorescenti sarà visto nella schiusa. Così tutti i neonati devono essere propagate per consentire il tessuto transgenico di essere spostato nei tentacoli e diventare evidente.

Figura 1
Figura 1 Creazione di una linea transgenica con l'uniforme espressione epiteliale ectodermica di DsRed2. (A) Un cucciolo con espressione chimerico di un transgene DsRed2 sotto il controllo di un promotore actina in una patch di cellule epiteliali ectodermiche. (B) Una gemma di prima generazione dalla schiusa in pannello A ora sta producendo due nuovi germogli. Il germoglio marcato con un asterisco ha tessuto transgenico ed è stato utilizzato come animale fondazione per una linea di controllo che è geneticamente identica alla linea transgenica, eccetto per la presenza del transgene. (C) Una gemma di seconda generazioneprodotto dalla Hydra a pannello B. (D) Un esempio di un polipo dalla linea transgenica che è stato istituito con l'espressione DsRed2 tutta l'ectoderma. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Hydra riproduce asessualmente di routine, ma richiede stimoli ambientali per iniziare la produzione di gameti. Questi stimoli non sono ben definiti, per la maggior parte delle specie Hydra e possono differire da ceppo a ceppo. Un ostacolo significativo alla produzione di transgenico Hydra è l'ottenimento di embrioni su base regolare, perché può essere difficile in un ambiente di laboratorio per indurre Hydra per diventare sessuale. Il ceppo AEP 25, tuttavia, produce gameti facilmente in laboratorio e questo è l'unico ceppo che è stato finora utilizzato per la fabbricazione linee transgeniche. Il metodo più comune per indurre la produzione di gameti è di manipolazione dieta. Come descritto in precedenza, gli animali devono essere nutriti ogni giorno per tre settimane, affamati per 5 giorni, e poi nutriti due volte alla settimana, durante la quale gameti tempo saranno prodotti 1. E 'stata anche la nostra esperienza che coltura AEP Hydra su piastre verticali in un acquario 26, forse simulando una more ambiente naturale, porta alla produzione di uova, anche quando gli animali sono alimentati a intervalli regolari. Inoltre, le linee ottenute da AEP auto-croci a volte producono gameti più regolarmente ceppo. Così stabilire una linea F1 di AEP è un altro metodo possibile per ottenere una fonte più affidabile di embrioni.

La percentuale di embrioni che sopravvivono iniezione e si sviluppano allo stadio cuticola dipende dalla salute degli embrioni, la quantità di soluzione iniettata, e la quantità di danno fatto da iniezione. Con il costante flusso di iniezione set-up descritto in questo protocollo, è difficile controllare la quantità di soluzione che viene iniettata nel embrione. Nelle nostre mani, circa la metà degli embrioni iniettati come descritto qui completare con successo l'embriogenesi e formare una cuticola. Di questi, il 50-75% tratteggio e di quelli che si schiudono, circa il 50% avrà almeno alcuni tessuti transgenici. Pertanto, il 10-20% degli embrioni inizialmente iniettati cedeun Hydra F1 con il tessuto transgenico. La quantità di soluzione iniettata può essere controllata con precisione con attrezzature più costose come microinjector IM-300. Le linee transgeniche originali sono stati realizzati con materiale di Eppendorf, che permette una grande precisione nel manipolare e iniettare l'embrione. Mentre questo livello di accuratezza può dare un tasso di sopravvivenza più elevato di embrioni iniettati, questa spesa non è necessario per la creazione di routine di linee transgeniche.

L'integrazione del transgene è casuale e potrebbe potenzialmente verificarsi in più posizioni nel genoma o in una matrice tandem in un unico luogo. Sulla base di analisi Southern blot, il numero di integrazioni è stato stimato in cinque in una linea transgenica epiteliale creato in precedenza 1. In una linea transgenica lignaggio interstiziale in cui il transgene subisce trasmissione germinale, è stato dimostrato dal sequenziamento del genoma che solo una singola copia del transgene è stato integrated (CE Dana e RE Steele, osservazione inedito). Tuttavia, a parte questi due esempi, non ci sono informazioni riguardanti i siti di integrazione transgene disponibili e copiare il numero. Poiché è possibile che un transgene potrebbe interrompere la funzione del gene per mutagenesi inserzionale, più di una linea transgenica deve essere fatta quando si analizzano fenotipi da, per esempio, o RNAi iperespressione costrutti. E 'anche importante notare che l'espressione del transgene è costitutiva quando guidato dal popolare promotore del gene actina, e quindi transgeni che portano a fenotipi gravi o letali se espresso costitutivamente non verrà mantenuto. Per il futuro, sarà importante sviluppare un sistema inducibile di espressione del transgene per aggirare questo problema.

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Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da un G. Harold e Leila Y. Mathers Premio per HL e una sovvenzione NIH (R24 GM080527) per RESCEJ stato un NRSA Postdoctoral Fellow (NIH F32GM9037222) ed è attualmente supportato da un Mentored Research Scientist Development Award dal National Institute on Aging (K01AG04435). Vorremmo ringraziare i revisori per utili commenti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AEP Hydra Strain Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
High Speed Maxi Kit Qiagen 12662
100 x 15 mm Petri Dishes BD Falcon 351029
75 x 50 mm Glass Microscope Slide Sigma CLS294775X50
Microinjection Fish Mold IBI Scientific FM-600
Borosilicate Glass with Filament Sutter Instrument BF100-50-10 O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-97
Phenol Red Sigma P3532
Jewelers Forceps, Durmont #5 Sigma F6521
Scalpel Blade #15 Fisher 50-822-421
Mineral oil Sigma M8410-500ML
Microinjector Narishige IM-9B
Magnetic Stand Narishige GJ-1
Iron Plate Narishige IP
Joystick Micromanipulator Narishige MN-151

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References

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Biologia Molecolare , Transgenico microiniezione l'iperespressione del gene gene knockdown
Generazione di transgenici<em&gt; Hydra</em&gt; Da Embryo microiniezione
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Juliano, C. E., Lin, H., Steele, R. E. Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection. J. Vis. Exp. (91), e51888, doi:10.3791/51888 (2014).

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