Introduction
Hydraは再生、パターン形成を研究し、約250年2のための幹細胞に使用されているHydraは 3つの細胞系統からなるシンプルなボディープランがあります。外胚葉上皮、内胚葉上皮と間質を。管状体は、単一の細胞層でそれぞれが外胚葉と内胚葉上皮系統によって形成される。体内の欄の上皮細胞のすべてが有糸分裂である。上皮細胞は、尾方端に経口端部または足に四肢3、ヘッド（口および触手）（基礎円板）に変位するとき、それらは、細胞周期のG2期で停止させると、細胞の運命4を変更する。間質細胞系統の細胞は、上皮細胞間の隙間内に存在する。この系統は、本体コラム5の外胚葉上皮層に位置している多能性幹細胞でサポートされています。間質幹細胞を3セルの体細胞を生じさせるLタイプ（神経、腺細胞、およびnematocytes）と生殖細胞6,7。
門刺胞動物、すべてbilateriansの姉妹グループの一員として、Hydraは多細胞動物の間で共有の基本的な生物学的プロセスに光を当てることができます。最近まで、これらの努力は、遺伝子機能の摂動のための信頼できる方法の欠如により妨げられた。しかし、トランスジェニック手法1の開発を、私たちは今、幹細胞機能、再生、およびパターニングなどの多細胞動物に共通する基本的なメカニズムのよりよい理解を得るためにハイドラを最大限に活用することができます。トランスジェニックヒドララインは、孵化のかなりの頻度でランダムな組み込みおよびキメラ発現をもたらす胚へのプラスミドDNAの注射によって確立される。特定の系列に均一発現とラインが無性繁殖によって確立することができる。クローン的transgを増殖させる能力ENIC ヒドララインは、有性生殖により増殖することができる動物モデルの大部分よりも有利で ある。また、トランスジェニック細胞は、動物の透明性および内因性蛍光タンパク質8が存在しない場合にインビボで容易に追跡することができる。
第一のトランスジェニックヒドラ線が1行われたので、7年間、そのような線は、さまざまな用途に使用されてきた。異なる細胞型における蛍光タンパク質の発現は、細胞の動きを追跡する細胞形状の変化を観察し、野生型条件および化学的摂動1,5,9-12後の両方において細胞の運命を追跡することが可能となった。また、さまざまな系統の異なる蛍光タンパク質の発現は、特定の細胞集団のFACS単離を可能にする。この技術は、幹細胞特異的mRNAおよび系統特異的低分子RNA 13,14の配列決定のために使用されてきた。プロモーターの一方2 ヒドラアクチン遺伝子の一つは、最も広く使用されているいくつかの細胞型特異的プロモーターを同定し、トランスジェニックヒドラ 9,11,15,16でGFPの発現を駆動するために使用されている。将来的には、細胞型特異的プロモーターは、任意の特定の細胞型の観察および回収を可能にする。また、トランスジェニックアプローチは、成功しWnt3をプロモーター17のシス作用調節エレメントを定義するために使用された。
ハイドラにおけるトランスジェニック方法の開発が異所性発現、過剰発現、およびノックダウンにより遺伝子の機能をテストするための堅牢なアプローチを提供します。トランスジェニック動物は、機能および細胞局在18-20の両方を検討するために、蛍光標識タンパク質を発現することが行われている。また、GFP導入遺伝子の3'UTR中のRNAヘアピンの発現は、標的遺伝子21,22のノックダウンにつながる。これらのアプローチでは、GFPを識別するために必要とされているトランスジェニックラインの作成中にトランスジェニック組織を追跡します。しかしながら、いくつかのケースではGFP分子は、タグ付きタンパク質の機能を妨害する可能性がある。最近の研究では、 イドラ遺伝子がオペロン構成に配置することができることを実証する、 すなわち、多シストロン性転写物はその後、トランス-スプライスリーダーを添加することにより分離し、個別に23翻訳される、作製される。タンパク質またはオペロンと下流位置における蛍光タンパク質遺伝子の上流位置でヘアピンRNAをコードする遺伝子を配置することによって、人は、タンパク質またはRNAヘアピンをコードする遺伝子をタグ付けすることなく、トランスジェニック組織を追跡することができる。この方法は、14遺伝子ノックダウンを達成するためにDsRed2のとオペロン構成のRNAヘアピンを発現するために使用されてきた。
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Protocol
プラスミドDNA、針及び注射料理の調製
- 高速マキシやミディキットを用いてプラスミドDNAを調製し、エタノール沈殿を用いて溶液を2.5mg / DNAに集中する。 DNAペレットをヌクレアーゼフリーの脱イオン水に溶解されるべきである。 -20℃で10〜20μlのアリコート中のDNAを保管してください。 （入手可能なベクターのリストについては、 補足表1を参照してください）
- 100×15ミリメートルペトリ皿に胚を保持するためのトラフを構築するためにアガロース用いて射出料理を作る。
- 角度で100×15ミリメートルペトリ皿に75×50ガラス顕微鏡スライドを配置します。ペトリ皿にヒドラ媒体 24内で溶融、2％アガロースの約50ミリリットル注ぐ。あるいは、第皿にアガロースを注ぎ、トップの「マイクロインジェクション魚モールド」をフロート。
- アガロースが固化した後、ガラススライドや金型を削除します。ガラススライドを使用した場合、剃刀のbla過剰アガロースを切り取るドは、壁を形成する。皿にハイドラ培地を注ぎ、すぐにそれを使用したり、必要になるまで4℃で保管してください。注：使用の間、4℃で保存した場合、注入皿を再利用することができる。
- 彼らがあるように、ペトリ皿中の粘土の狭いストリップにそれらを押すことで、熱525、75を引いて、速度100、時間50店舗針：以下の条件を用いてプラーマイクロピペット上のフィラメントとホウケイ酸ガラスキャピラリーから針を引き出します皿の底に平行に保持。
- 注射液を調製し、10％のフェノールレッドの2μlの2.5 mg / mlのプラスミドDNA溶液を3μlを組み合わせること。溶液を短時間ボルテックスし、次いで針を詰まらせる可能性のある粒子を除去するために微量に最大速度で10分間、それを回す。
- 解剖顕微鏡下で、小さな開口部を作成するためにピンセットで先端から針数ミリメートルのクリップ。注：オープンの適切なサイズに多少の柔軟性があります圧力がこの変化に対応するために、ステップ3.3に調整することができるのでる。
- それは、先端を下にして垂直に針を保持しているように、ペトリ皿を置きます。針の後端に液体をピペッティングすることにより注射液の約0.5μlの針をロードします。毛細管現象を針の先端に解決策を引っ張るようにします。
注射用胚の作製
- 毎日のように卵を生産するためのポリープハイドラ AEP株文化をスキャンします。これらのポリープを収集し、別の培養皿に保管します。卵形成の進行状況を監視するために、日中、これらのポリープを数時間ごとに観察します。卵は外胚葉を突破と後退外胚葉細胞のリングの上に座るとき、彼らは注射の25の準備ができている。受精を可能にするために、注入前に少なくとも1時間精巣を持つ複数のハイドラと皿にこれらのポリープを置きます。 ハイドラ</ em>の男性は、特別な操作を行わずに精子を放出する。
- メスが完全に形成された約400μmの直径が25である、卵、または1〜8細胞期胚とAEPコロニーで発見された場合、また、注射のために、これらを収集します。すぐに切断し始めている胚を注入する。注：これは、完全に形成された卵や単細胞接合体の違いを見分けることができず、従って、これらは、注射前に男性と一緒にインキュベートされるべきである。
- 注射の前に、＃15刃でメスを用いて胚の上下に親の組織の大部分を除去。取付体列の小片でのみ胚を残すが、必要に応じて鉗子で胚を操作するために使用される。注：胚から離れて解剖されている組織が 再生成され、女性はハイドラコロニーに残ることを保証するために保存する必要があります。
- パスツールピペットを用いて、それらの壁に平行に配置し、注入皿に胚を移動アガローストラフ。
プラスミドDNAの3マイクロインジェクション
- 鉄板に座っ磁気スタンドにインジェクターをマウントします。ジョイスティックマイクロマニピュレーターで、針を保持しているマイクロインジェクターの一部であるインジェクションホルダーをマウントします。マグネチックスタンドで、鉄板にジョイスティックマニピュレータをマウントします。解剖顕微鏡の右側にあるこの全体のセットアップを置き、観察視野に表示されているように、注射ホルダーを配置します。
- アガローストラフの垂直壁が左にあるように配向解剖顕微鏡下で胚を注射料理を置きます。インジェクションホルダーに針を挿入し、皿にハイドラ媒体への針の先端を下げる。
- 鉱物油は、針の上部を満たし、注射液の安定した流れがHydrに針を出観察されるまでゆっくりと時計回りの方向に注射器のノブを回すミディアム。ストリームが強すぎると、反時計回りにノブを回して圧力を下げる。日常（針がステップ1.5にクリップされたか、すなわち ）針開口部の大きさに依存する適切な圧力を得るために、このステップを練習。注：ストリームが強すぎると、胚は注入を生き残ることはありません。
- 解剖顕微鏡を通して見ながら最初の胚は、フィールドの中心にあるように、注射用の皿を移動します。それがその胚に触れているように、針を移動します。針で胚を貫通するマイクロマニピュレーターを使用してください。注：アガローストラフの垂直壁は、針でわき押されてから胚を維持します。
- 注射液は、胚1または2秒に流入し、その後すぐに針を除去することを許可します。胚は複数のセルを有する場合、個別のセルを注入する。針の先端で次のセルを整列させるために胚を再配向するために鉗子を使用してください。
- 最初エンブリーの後oは次胚が注入位置となるように皿を移動し、手順を繰り返し、注入される;すべての胚が注入されるまで継続する。
4。胚の培養および孵化
- 精巣を持つ少数のハイドラと皿に注入した胚のすべてを移動します（これはすべての胚が受精していることを確認することです）。彼らは胚形成を継続しながら、18℃のインキュベーター内で胚をインキュベートする。
- キューティクル段階に達すると、 ハイドラ媒体が充填された24ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ注入された胚を移動させる。
- 18℃の暗所で2週間注入した胚をインキュベートする。
- 2週間の潜伏期間の後、解剖顕微鏡下でそれぞれ注入された胚をご確認ください。キューティクル段階の胚は、親組織の小片から切り離されており、親の組織が再生していたいずれの場合に注意してください。それはマイルにならないように、すぐにこの再生されたポリープを削除する新しい雛のためにstaken。
- RTで水槽の光の下で注入した胚の皿を移動します。毎日のプレートを確認し、孵化を収集します。 ハイドラポリープの典型的なピンク色は、彼らが食べるアルテミアから来ているので、新孵化は白になります。
- 導入遺伝子の発現を検出するために、蛍光顕微鏡下で孵化を観察します。
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Representative Results
トランスジェニックハイドララインの確立
アルテミアノープリウスを2〜3日ごとジェニック孵化フィード。孵化は時に孵化後一日か二日のために食べてはいけない。いくつかの新しい孵化は食べることはありませんので、生き残ることはありません。雛は、外胚葉（ 図1A）または内胚葉上皮組織のいずれかでトランスジェニックであれば、動物はほとんどのトランスジェニック組織（ 図1B、C）を持っている芽を芽を収集することができます。トランスジェニック系統は、外胚葉（ 図1D）または内胚葉上皮細胞系統のいずれかで導入遺伝子の均一な表情で確立されるまで、新たな芽でこれを行うに進みます。同時に、第2行は、導入遺伝子を含むが（ 図1B）、それ以外の遺伝的に同一でないことを確立することができる。この行は、将来の実験の陰性対照として役立つ。トランスジェニック組織は私を移動していない場合つぼみNTO、それが動物をカットし、それがトランスジェニック組織は新しい出芽ゾーンになりますように再生することができるようにすることが可能な場合がある。トランスジェニック組織は四肢に近すぎる場合には、動物の正常な成長の間に変位するようにしかし、それは可能性が失われます。しばしば、この場合に行うことができるものは何もない。導入遺伝子が中立であれば私たちの手では、 ハイドラの約30％から均一な上皮回線を確立することができる（ すなわち、生物学的機能に与える影響はありません）は、上皮ジェニック組織とハッチ。残りの70％が死亡するいずれかまたはトランスジェニック組織が失われます。内胚葉ラインは約2〜3倍の外胚葉ラインと同じくらい一般的です。導入遺伝子は生物学的機能を破壊するよう使用されている場合、これは、均一なラインを確立する可能性に影響を及ぼす可能性がある。このような場合には、誘導性プロモーターは、キットに不可欠の追加であろう。
雛は、トランスジェニックである場合間質性系統で、動物が出芽し、間質細胞系列での遺伝子導入細胞の数が増加して孵化を収集できる。時にはそれが、上皮細胞系統にトランスジェニックである場合は特に、動物は、間質細胞系列トランスジェニックであることがすぐに明らかではないことに注意してください。これは、間質細胞系列では完全にトランスジェニック系統は出芽するだけで確立される可能性はほとんどありません。それは間質性系統が完全にトランスジェニックであることが要求される場合、これは全体の系統が単一のトランスジェニック幹細胞7から確立されるように、間質幹細胞が枯渇した動物からの凝集物中にクローニングすることにより達成することができる。
組織または細胞型特異的プロモーターは、蛍光タンパク質の発現を駆動するために使用されるケースでは、トランスジェニック動物は、最初は明らかでないかもしれない。たとえば、唯一の触手に活性であるプロモーターが使用される場合およびトランスジェニックの初期パッチ組織は蛍光細胞が雛で見ません、本体コラムにあります。したがって、すべての孵化は、トランスジェニック組織が触手に変位して明らかになることができるように伝播される必要がある。
DsRed2のの均一な外胚葉上皮発現がトランスジェニック系統を確立します。図。 （A）は外胚葉上皮細胞のパッチ内のアクチンプロモーターの制御下にDsRed2の導入遺伝子のキメラ発現と雛。（B）パネルAの雛から第一世代の芽は、2つの新しい芽を生産している。アスタリスクで標識した芽にはトランスジェニック組織を持たず、導入遺伝子の存在を除いて、トランスジェニック系統と遺伝的に同一である制御ラインの創設動物として使用した。（C）は 、第2世代の芽パネルBのハイドラ （D）外胚葉全体DsRed2の発現に設立されたトランスジェニック系統からのポリープの例から生成された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
Hydraは日常的に無性再現しますが、配偶子の生産を開始する環境刺激を必要とします。これらの刺激はほとんどハイドラ種について、明確に定義されておらず、歪み歪みと異なる場合があります。それは性的になるためにハイドラを誘導するために実験室の設定で困難な場合がありますので、トランスジェニックハイドラの生産に重要なハードルは定期的に胚を得ることである。 AEP株25は 、しかし、実験室で容易に配偶子を生産し、これは、トランスジェニック系統を作製するためにこれまで使用されてきた唯一の株である。配偶子産生を誘導するための最も一般的な方法は、食事操作によるものである。前述のように、動物は、時間配偶子1を生産される間に、3週間毎日与え5日間飢餓状態にし、その後週に二回供給されるべきである。それはまた、おそらく粗腐植をシミュレート、水槽26内の垂直プレート上AEP ハイドラを培養する私たちの経験をされています電子自然環境、動物を一定間隔で供給される場合でも、卵の産生をもたらす。また、AEP自己交配から得られた線は、時として、親株よりも多く、定期的に配偶子を生産する。このようにAEPのF1ラインを確立することは、胚のより多くの信頼できる情報源を得るための別の可能な方法である。
キューティクルステージに注入を生き残るためには、開発する胚の割合は胚の健康状態に依存して、溶液の量を注入し、注入によるダメージの量。このプロトコールに記載一定のフローインジェクションセットアップでは、胚に注入される溶液の量を制御することは困難である。私たちの手では、胚の約半分は、ここで説明を正常に完了胚として注入し、キューティクルを形成。これらのうち、50〜75％の孵化およびそれらそのハッチの、約50％、少なくともいくつかのトランスジェニック組織を有することになる。そのため、最初に注入された胚の10〜20％が得トランスジェニック組織とF1 ハイドラ 。注入された溶液の量を正確にこのようなIM-300マイクロインジェクターなどのより高価な装置を制御することができる。オリジナルのトランスジェニック系統が操作し、胚を注入するの精度を大いに可能にするエッペンドルフから機器を用いて行った。このレベルの精度は、注入された胚の高い生存率を与える可能性がありますが、この費用は、トランスジェニック系統のルーチンを確立するために必要はありません。
導入遺伝子の組み込みはランダムであり、潜在的にゲノム中または単一の場所でのタンデム配列内の複数の場所で発生する可能性があります。サザンブロット分析に基づいて、積算回数は、以前に作成した1つの上皮のトランスジェニック系統で5と推定された。導入遺伝子が生殖系列伝達を受けている間質細胞系列トランスジェニック系統では、導入遺伝子の単一コピーのみがintであったことをゲノム配列決定によって実証されているegrated（CEダナとREスティール、未発表の観察）。しかし、別にこの2つの例から、導入遺伝子の組込み部位およびコピー数に関する入手可能な情報はない。それは導入遺伝子挿入変異誘発によって遺伝子機能を中断する可能性があるので、例えば、RNAi又は過剰発現構築物からの表現型を分析する場合、複数のトランスジェニック系統がなされるべきである。これは、一般的に使用されるアクチン遺伝子プロモーターによって駆動される場合、導入遺伝子の発現が構成的であることに注意して、したがって、構成的に維持されることはありません発現した場合、重大または致命的な表現型につながるトランスジーンすることも重要です。将来のためには、この問題を回避するために導入遺伝子発現の誘導系を開発することが重要であろう。
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Acknowledgments
この作品は、HLにG.ハロルド＆レイラY.マザーズ賞でサポートされているとRESCEJにNIHの助成金（R24 GM080527）はNRSA博士研究員（NIH F32GM9037222）され、現在国立からの指導研究員開発賞でサポートされていた老化に関する研究所（K01AG04435）。私たちは、有益なコメントを頂いた査読に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEP Hydra Strain | Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp | ||
| High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | |
| 75 x 50 mm Glass Microscope Slide | Sigma | CLS294775X50 | |
| Microinjection Fish Mold | IBI Scientific | FM-600 | |
| Borosilicate Glass with Filament | Sutter Instrument | BF100-50-10 | O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532 | |
| Jewelers Forceps, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
| Scalpel Blade #15 | Fisher | 50-822-421 | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-500ML | |
| Microinjector | Narishige | IM-9B | |
| Magnetic Stand | Narishige | GJ-1 | |
| Iron Plate | Narishige | IP | |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 |
References
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