Introduction
히드라 재생, 패턴 형성을 연구하고, 약 250년 2에 대한 줄기 세포에 사용 된 히드라 세 세포 계보로 구성된 간단한 몸 계획이 있습니다. 외배엽 상피, 내배엽 상피와 간질을. 관형 본체는 하나의 셀 층 각각 외배엽과 내배엽 상피 계통에 의해 형성된다. 신체 열에있는 상피 세포의 유사 분열 모두이다. 상피 세포가 사지 3으로 변위되는 경우, 반구 끝에 경구 단부 또는 피트 (기저 디스크)에서 헤드 (입과 촉수), 이들은 세포주기의 G2 단계에서 체포 세포 운명 4 변경. 간질 혈통의 세포는 상피 세포 사이의 간극 내에 상주. 이 계보는 몸의 열 다섯의 외배엽 상피 층에있는 다 능성 줄기 세포에 의해 지원됩니다. 격자 간 줄기 세포는 체세포 세 CEL을 야기리터 유형 (신경, 동맥 세포 및 nematocytes)와 생식 세포 6,7.
분류학상의 문 자포의 일원으로서, 모든 bilaterians에 자매 그룹은 히드라는 다세포 동물에서 공유 근본적인 생물학적 과정에 빛을 발산 할 수 있습니다. 최근까지, 이러한 노력은 유전자 기능의 신뢰성 섭동 방법의 부족에 의해 방해 하였다. 그러나, 형질 전환 방법 (1)의 발전과 함께, 이제 이러한 줄기 세포 기능, 재생, 및 패터닝과 같은 다세포 동물에 공통의 기본 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 히드라 충분히 활용할 수있다. 형질 전환 하이 드라 라인은 새끼의 상당한 주파수에서 임의의 통합과 키메라 식 결과 배아에 플라스미드 DNA의 주입에 의해 설정됩니다. 특정 계보에 균일 한 표정으로 라인이 무성 전파에 의해 설립 될 수있다. clonally transg을 전파 할 수있는 능력enic 히드라 라인은 유성 생식에 의해 전파 될 수있는 동물 모델의 대다수 위에 장점이다. 또한, 형질 전환 된 세포를 동물에 의한 투명도 및 내인성 형광 단백질 (8)의 부재로 생체 내에서 용이하게 추적 할 수있다.
제 형질 히드라 라인 보낸 7 년 같은 라인이 다양한 애플리케이션에 사용되어, 하나 만들었다. 상이한 세포 유형에서 형광 단백질의 발현이 가능 세포의 움직임을 추적하는 세포 모양의 변화를 관찰하고, 야생형 조건에서 화학적 섭동 1,5,9-12 후 두 세포의 운명을 추적했다. 또한, 다양한 다른 계통의 형광 단백질의 발현은 특정 세포 집단의 FACS 분리 가능하다. 이 기술은 줄기 세포 고유의 mRNA와 혈통 고유의 작은 RNA를 13, 14의 순서 사용되어왔다. 발기인의 동안이 히드라 액틴 유전자 중 하나는 가장 널리 사용되고 몇몇 세포 타입 특이 적 프로모터는 형질 전환 식별 히드라 9,11,15,16에서 GFP의 발현을 구동하기 위해 사용되어왔다. 미래에, 셀 타입 특이 적 프로모터는 특정 세포 유형의 관찰 및 수집을 허용한다. 또한, 형질 전환 방법은 성공적 Wnt3 촉진제 (17)의 시스 - 작용 조절 요소를 정의하는 데 사용 하였다.
히드라 형질 전환 방법의 개발은 이소성 발현, 과다 발현 및 넉다운하여 유전자의 기능을 테스트하기위한 강력한 접근 방식을 제공한다. 형질 전환 동물은 기능 및 셀룰러 지역화 18-20 모두를 조사하기 위하여 형광 표지 된 단백질을 발현하는되었습니다. 또한, GFP 형질 전환 유전자의 3'UTR에 헤어핀 RNA의 발현은 표적 유전자의 녹다운 (21, 22)로 이끈다. 이러한 방식에서 GFP는 식별하기 위해 필요하다및 형질 전환 라인의 작성 중에 유전자 변형 조직을 추적 할 수 있습니다. 그러나, 일부 경우에 GFP 분자 태그 단백질의 기능을 방해 할 가능성이있다. 최근의 연구는 히드라 유전자가 오페론 구조로 배열 될 수 있다는 것을 보여줍니다, 즉 polycistronic 성적 증명서는 트랜스 - 스 플라이 싱 리더 첨가하여 분리하고 별도로 23 번역하는, 만들어집니다. 단백질 또는 오페론 및 하류 위치에 형광 단백질 유전자의 상류 위치에서 RNA의 머리핀을 코딩하는 유전자를 배치함으로써, 하나의 단백질 또는 RNA 머리핀을 코딩하는 유전자를 태그하지 않고 유전자 변형 조직을 추적 할 수있다. 이 방법은 유전자를 넉다운 14 달성하기 위해 DsRed2와 오페론 구성 머리핀 RNA를 발현하기 위해 사용되어왔다.
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Protocol
플라스미드 DNA, 바늘, 및 사출 식기 1 준비
- 전용선 또는 맥시 미디 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 제조하고 ML 에탄올 침전을 사용하여 / 2.5 mg의 DNA를 집중한다. DNA 펠렛 클레아없는 탈 이온수에 용해한다. -20 ° C에서 10 ~ 20 ㎕의 분취 량의 DNA를 저장합니다. (가능한 벡터의리스트 보충 표 1 참조)
- 100 × 15mm 페트리 접시에 배아를 유지하기위한 저점을 구성하는 아가 로스 사용하여 사출 요리를합니다.
- 각도 100 × 15mm 배양 접시에 75 × 50 유리 현미경 슬라이드를 놓습니다. 아가로 오스 페트리 접시에 히드라 매체 (24)에서 용융 2 %의 약 50 ㎖에 붓고. 또한, 첫번째 접시에 아가 로스를 부어 상단에 "미세 주입 물고기 금형"을 떠.
- 아가로 오스가 고형화 된 후, 유리 슬라이드 나 주형을 제거한다. 유리 슬라이드가 사용 된 경우, 면도날 즐로 아가로 오스를 초과 절취드 벽을 형성한다. 접시에 히드라 매체를 붓고 즉시 사용하거나 필요할 때까지 4 ° C에 보관합니다. 참고 : 사용하는 사이에 4 ° C에 저장하는 경우 사출 요리를 재사용 할 수 있습니다.
- 75 당겨, 525을 가열 속도 100 시간들이되도록 배양 접시에 점토의 좁은 스트립으로 그들을 눌러 50 점 바늘 : 다음과 같은 조건을 사용하여 마이크로 피펫 풀러에 필라멘트 붕규산 유리 모세관에서 바늘을 당겨 접시의 바닥에 개최 병렬.
- , 주사액을 제조 10 % 페놀 레드 2 μL로 2.5 ㎎ / ㎖ 플라스미드 DNA 용액을 3 ㎕의 결합. 와동 용액 간략하고 바늘을 막히게 할 수있는 입자를 제거하기 위해 마이크로 원심에서 최대 속도에서 10 분 동안이를 스핀.
- 해부 현미경에서 작은 구멍을 만드 집게로 바늘에게 끝에서 몇 mm 클립. 참고 : 오픈의 적절한 크기의 유연성이 있습니다이 압력 변화를 수용하기 위해 단계 3.3에서 조절 될 수 있기 때문에 보내고.
- 이 팁 아래로 수직으로 바늘을 잡고되도록 페트리 접시를 놓습니다. 바늘의 후단에 액체를 피펫으로 주입 용액의 약 0.5 μL와 바늘을로드. 모세관 작용은 니들의 선단부에 용액을 당길 수있다.
사출을위한 배아의 2 준비
- 매일 계란을 생산 용종의 히드라 AEP 스트레인 문화를 스캔합니다. 이러한 폴립을 수집하고 별도의 배양 접시에 그들을 따로 설정합니다. 달걀 형성의 진행을 모니터하기 위해 하루 동안 이러한 폴립보기 몇 시간마다 관찰한다. 계란 외배엽 뚫고 후퇴 외배엽 세포의 반지에 앉아 때 그들은 주입 25에 있습니다. 수정이 가능하도록 주입하기 전에 적어도 한 시간 동안 고환을 가지고 여러 히드라와 함께 접시에 이러한 폴립을 놓습니다. 히드라 </ 엠> 남성은 특별한 조작없이 정자를 발표 할 예정이다.
- 여성은 약 400 μm의 직경이 25에서, 또는 1 - 8 세포 단계의 배아를 아르 완전히 형성 계란, AEP 식민지에서 발견되는 경우도 주입이를 수집합니다. 즉시 클 리빙을 시작했습니다 배아를 주입. 참고 :이 완전히 형성 계란과 단세포 접합체 사이의 차이를 말할 수 없습니다, 따라서 이러한 사출 이전에 남성 배양해야한다.
- 주입하기 전에 # 15 블레이드와 메스를 사용하여 배아 위 아래 부모 조직의 대부분을 제거합니다. 부착 본체 컬럼의 작은 조각으로 만 배아 남기기 것이 필요한 경우 집게 배아를 조작하는 데 사용된다. 참고 : 재생됩니다 멀리 배아에서 해부과 여성은 히드라 식민지에 남아 있도록 저장해야 조직.
- 파스퇴르 피펫을 사용하여, 그들 벽으로 평행하게 배치, 사출 접시에 배아 이동아가로 오스 통.
플라스미드 DNA의 3 미세 주입
- 철판에 앉아 자기 스탠드에 microinjector를 탑재합니다. 조이스틱 미세 조작기에 바늘을 보유하고 microinjector의 부분 주입 홀더를 탑재합니다. 자기 스탠드, 철판에 조이스틱을 조작하는 사람을 마운트합니다. 해부 현미경의 우측이 전체 세트 업을 배치하고, 관찰 필드에 표시되도록 주입 홀더를 위치.
- 아가 물마루의 수 직벽을 왼쪽으로되도록 배향 해부 현미경으로 배아 주입 접시를 놓는다. 주입 홀더에 바늘을 삽입하고 접시에 히드라 매체에 바늘의 끝을 내립니다.
- 광유는 바늘과 주입 용액의 일정한 흐름의 상단을 채울 때까지 천천히 HYDR로 바늘을 종료 관찰 시계 방향 주사기 손잡이를 돌려매체. 스트림이 너무 강한 경우, 노브를 시계 반대 방향으로 돌려 압력을 낮 춥니 다. 정기적으로 (바늘 단계 1.5에서 잘린 된 방법, 즉) 바늘 구멍의 크기에 따라 적절한 압력을 얻기 위해이 단계를 연습합니다. 참고 : 스트림이 너무 강하면, 배아 주입 생존하지 않을 것이다.
- 해부 현미경을 통해 보면서 제 배아 필드의 중앙에 위치하도록, 사출 접시를 이동. 그것은 그 배아를 만지지 않도록 바늘을 이동합니다. 바늘로 배아를 관통하는 미세 조작기를 사용합니다. 참고 : 아가로 오스 통의 수직 벽 바늘에 의해 밀려되는 배아를 유지합니다.
- 주사액은 배아 1 또는 2 초 내로 유동하고 신속 바늘을 제거 할 수있다. 배아가 둘 이상의 셀이있는 경우, 각각의 셀을 개별적으로 주입. 바늘의 끝과 다음 셀을 정렬하는 배아 방향을 집게를 사용합니다.
- 첫번째 엠브리 후O는 다음 배아 주입 위치에 있도록 접시를 이동 절차를 반복 주입; 모든 배아가 주입 될 때까지 계속합니다.
(4) 배양 및 배아의 부화
- 고환이 몇 히드라와 함께 접시에 주입 된 배아의 모든 이동 (이 모든 배아가 수정 된 것을 확인하는 것입니다). 그들은 배아를 계속하는 동안 18 ° C 배양기에서 배아를 품어.
- 표피 단계에 도달하면, 히드라 매체로 채워진 24 웰 플레이트의 각 웰에 각각 주입 된 배아를 이동합니다.
- 18 ° C에서 어둠 속에서 이주에 대한 주입 된 배아를 품어.
- 이주의 잠복기 후, 해부 현미경 아래의 각 주입 배아를 확인합니다. 표피 단계의 배아는 부모의 조직의 작은 조각에서 분리하고 부모의 조직 재생 어느 곳 사례를 참고. 그것은 마일되지 않도록 즉시 재생 용종을 제거새로운 부화에 staken.
- RT에서 수족관 빛 아래에서 주입 된 배아의 요리를 이동합니다. 매일 판을 확인하고 새끼를 수집합니다. 히드라 폴립의 전형적인 핑크 색상은 그들이 먹는 미아에서 오기 때문에 새 새끼는 흰색 될 것입니다.
- 형질 전환 유전자의 발현을 검출하기 위해 형광 현미경으로 관찰 파묻혀.
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Representative Results
형질 전환 하이 드라 라인 구축
아테 미아 노 플리 우스와 함께 2-3 일마다 형질 전환 새끼 피드. 부화 한 새끼는 때때로 부화 후 하루나 이틀 동안 먹지 않는다. 일부 새 새끼는 살아남지 못할 것이다, 따라서 식사를하지 않으며, 않습니다. 갓 부화가 외배엽 (그림 1A) 중 하나의 형질 전환 또는 내배엽 상피 조직의 경우, 동물이 꽃 봉오리 가장 형질 전환 조직 (그림 1B, C)이 싹을 수집 할 수 있습니다. 형질 전환 라인이 외배엽 (그림 1D) 또는 내배엽 상피 계통 중 하나의 유전자의 균일 한 표정으로 설립 될 때까지 새로운 싹이 작업을 수행하기 위해 계속합니다. 동시에, 두 번째 줄은 형질 전환 유전자를 포함하지만, 그 유전자 (그림 1B)와 동일하지 않도록 설정할 수 있습니다. 이 줄은 향후 실험 대조군 역할을합니다. 형질 전환 조직 내가 이동하지 않는 경우봉오리 NTO, 그것은 동물을 절단하고 유전자 변형 조직은 새로운 신진 영역에있을 것이다 재생성되도록 허용하는 것이 가능할 수도있다. 그러나, 트랜스 제닉 조직이 동물의 정상적인 성장 중에 변위대로 손실 될 가능성이 사지에 너무 가까우면. 종종이 경우에 할 수있는 일은 없습니다. 형질 전환 유전자가 중립 경우 우리 손에서 우리는 히드라의 약 30 %에서 균일 한 상피 라인을 구축 할 수 있습니다 (즉, 생물학적 기능에 영향을주지 않습니다)이 상피 형질 전환 조직과 해치. 나머지 70 %는 죽을 하나 또는 형질 전환 조직 손실됩니다. 내배엽 라인 약 외배엽 라인 2-3 배만큼 일반적이다. 형질 전환 유전자가 생체 기능을 방해하는 데 사용되는 경우, 이는 균일 한 라인을 확립하는 가능성에 영향을 미칠 수있다. 이러한 경우, 유도 성 프로모터는 툴킷에 필수적인 추가 될 것입니다.
부화 형질 전환 인 경우간질 계보에, 동물 봉오리 및 간질 혈통에서 형질 전환 세포의 수가 증가 파묻혀를 수집 할 수있다. 이 상피 계보 형질 전환 또한, 특히 때때로 동물이 침입 계보 형질 전환되어 즉시 명확하지 않다주의하십시오. 그것은 간질 계보에서 완전히 형질 전환 라인이 싹 트는 것만으로 설립 될 가능성이 거의 없습니다. 이 격자 간 혈통 완전히 트랜스 제닉 인 것이 요구되는 경우,이 전체는 단일 혈통 형질 줄기 세포 (7)로부터 확립되도록 격자 간 줄기 세포가 고갈 된 동물로부터 골재에 복제함으로써 달성 될 수있다.
조직 - 또는 세포 - 형 특이 적 프로모터는 형광 단백질의 발현을 구동하는 데 사용되는 경우에, 형질 전환 동물은 초기에 나타나지 않을 수도있다. 만 촉수에 활성 프로모터를 사용하는 경우 예를 형질 전환의 초기 패치조직은 몸의 열에서 더 형광 세포는 부화에서 볼되지 않습니다됩니다. 그래서 모든 파묻혀 형질 전환 조직 촉수로 변위 될 수 있도록하고 분명하게 전파 될 필요가있다.
DsRed2의 균일 한 외배엽 상피 식으로 형질 전환 라인을 구축 그림 1. (A) 외배엽 상피 세포의 패치에서 액틴 프로모터의 제어하에 DsRed2 전이 유전자의 키메라 식 갓 부화 한. (B) 이제 두 개의 새로운 싹을 생산 패널에서 갓 부화에서 제 1 세대의 새싹입니다. 별표로 표시된 봉오리가 더 형질 조직이없고 유전자의 존재를 제외하고, 트랜스 제닉 라인 유 전적으로 동일 제어 선을위한 설립 동물로서 사용 하였다. (C) 제 2 세대 봉오리패널 B의 히드라 (D) 외배엽에 걸쳐 DsRed2 식으로 설립 된 형질 전환 행에서 용종의 예에서 생산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
히드라는 정기적으로 무성하게 재현하지만, 생산 배우자를 시작합니다 환경 자극을 필요로한다. 이러한 자극은 대부분의 하이 드라 종에 대해 잘 정의되지 않고 변형에 변형과 다를 수 있습니다. 성적인 될 히드라을 유도 실험실 환경에서 어려울 수 있기 때문에 형질 히드라의 생산에 상당한 장애물 정기적 배아를 획득한다. AEP 균주 25 그러나, 실험실에서 쉽게 배우자를 생성하고이 지금까지 유전자 변형 라인을 만들기 위해 사용 된 유일한 변형이다. 생식 세포의 생산을 유도하는 가장 일반적인 방법은 다이어트에 의해 조작된다. 전술 한 바와 같이, 동물 오일 절식 3 주 동안 매일 공급해야하고 시간 생식 1을 제조 될 때, 두번 주 공급. 또한 아마도 MOR을 시뮬레이션 수족관 (26)에 수직 판에 AEP 히드라를 배양 우리의 경험이었다즉 자연 환경, 동물을 정기적으로 공급하는 경우에도 산란율로 이끈다. 또한, AEP 자기 교배로부터 얻은 라인은 때때로 부모 균주보다 규칙적 생식 생산. 따라서 AEP의 F1 라인을 구축하는 것은 배아의보다 안정적인 소스를 얻기위한 또 다른 방법입니다.
표피 단계로 주입 생존하고 발전 배아의 비율이 배아의 상태에 따라, 용액의 양을 주입하고, 주입 대미지의 양. 이 프로토콜에 기재된 정 유량 주입 셋업, 그것은 배아에 주입되는 용액의 양을 제어하는 것이 곤란하다. 여기 성공적으로 완료 배아를 설명하고 표피를 형성 우리의 손에, 배아의 약 절반이 주입. 이 중 50~75% 해치 그 해치로는 약 50 %가 적어도 일부 형질 전환 조직이있을 것이다. 따라서, 처음에 주입 된 배아의 10 ~ 20 %가 수득형질 전환 조직과 F1 하이 드라. 주입 된 용액의 양을 정확하게 같은 IM-300 microinjector으로 고가 장비를 제어 할 수있다. 원래 유전자 변형 라인은 조작과 배아를 주입 정밀도의 큰 거래를 할 수 있습니다 에펜 도르프에서 장비를 하였다. 이러한 정확도를 주입 배아의 높은 생존율을 줄 수 있지만,이 비용은 트랜스 제닉 라인 루틴 확립 필요는 없다.
형질 전환 유전자의 통합은 랜덤 잠재적 게놈 또는 단일 위치에서 직렬 배열의 여러 위치에 발생할 수 있습니다. 서던 블롯 분석에 기초하여, 적분의 수는 이전에 생성 한 하나의 형질 전환 라인에 상피 오 추정되었다. 형질 전환 유전자는 생식 세포계 전달을 겪게되는 틈새 혈통 트랜스 제닉 라인에서, 단지 유전자의 단일 카피 INT이었다 게놈 서열 분석에 의해 증명되었다egrated (CE 다나 RE 스틸, 게시되지 않은 관찰). 그러나, 옆이 두 가지 예에서, 정보가 없음에 대한 유전자 통합 사이트와 번호를 복사있다. 이 유전자가 돌연변이에서 삽입하여 유전자 기능을 방해 할 수 있다는 것이 가능하기 때문에, 예를 들면, RNAi의 과발현 또는 구조물로부터 표현형을 분석 할 때, 하나 이상의 형질 전환 라인이 만들어 져야한다. 따라서 그것은 구조적으로 유지되지 않을 것이다 표현할 때 심각하거나 치명적인 표현형을 초래할 일반적으로 사용되는 유전자 액틴 유전자 프로모터에 의해 구동 될 때 그 유전자 발현이 항시 양해하는 것도 중요하며. 미래의 경우,이 문제를 회피하기 위해 유전자 발현의 유도 시스템을 개발하는 것이 중요 할 것이다.
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Acknowledgments
이 작품은 RESCEJ에 HL에 G. 해롤드 & 라일라 Y. 매 더스 수상 및 NIH 보조금 (R24 GM080527)에 의해 NRSA 박사후 연구원 (NIH F32GM9037222가)이었다 지원 현재 전국에서 가르 연구원 개발 대상에서 지원 노화 연구소 (K01AG04435). 우리는 도움이 의견을 검토에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEP Hydra Strain | Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp | ||
| High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | |
| 75 x 50 mm Glass Microscope Slide | Sigma | CLS294775X50 | |
| Microinjection Fish Mold | IBI Scientific | FM-600 | |
| Borosilicate Glass with Filament | Sutter Instrument | BF100-50-10 | O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532 | |
| Jewelers Forceps, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
| Scalpel Blade #15 | Fisher | 50-822-421 | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-500ML | |
| Microinjector | Narishige | IM-9B | |
| Magnetic Stand | Narishige | GJ-1 | |
| Iron Plate | Narishige | IP | |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 |
References
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