Introduction
Hydra foi usado para estudar a regeneração, formação de padrões, e as células-tronco para cerca de 250 anos 2 Hydra tem um plano corporal simples, que consiste de três linhagens de células:. Epitelial ectodérmica, endodérmica epitelial e intersticial. O corpo tubular é formado por o ectodérmico e linhagens epiteliais da endoderme, cada um dos quais é uma camada única de células. Todas as células epiteliais no corpo da coluna são mitótico. Quando as células epiteliais são deslocados para as extremidades 3, a cabeça (boca e tentáculos) na extremidade bucal ou do pé (disco basal) na extremidade aboral, eles prendem na fase G2 do ciclo celular e alterar o destino da célula 4. As células da linhagem intersticial residem dentro dos interstícios entre as células epiteliais. Esta linhagem é apoiada por células-tronco multipotentes que estão localizados na camada epitelial ectodérmica da coluna corpo 5. As células estaminais intersticiais dar origem a três cel somáticatipos l (nervos, células glandulares, e nematocytes) e as células germinativas 6,7.
Como um membro do filo Cnidaria, o grupo irmão de todos os bilaterians, Hydra pode lançar luz sobre os processos biológicos fundamentais compartilhados entre os animais multicelulares. Até recentemente, esses esforços foram impedidos pela falta de métodos confiáveis para a perturbação da função dos genes. No entanto, com o desenvolvimento de metodologia transgênico 1, somos agora capazes de tirar o máximo proveito de Hydra para obter uma melhor compreensão dos mecanismos básicos comuns a animais multicelulares, como a função de células-tronco, regeneração e padronização. Linhas Transgénicas Hydra são estabelecidos por injecção de plasmídeo de ADN em embriões, o que resulta na integração aleatória e expressão quimérico com uma frequência significativa de filhotes. Uma linha com expressão uniforme numa linhagem particular pode ser estabelecida por propagação vegetativa. A capacidade de propagar clonalmente transgenic Hidra linhas é uma vantagem sobre a maioria dos modelos de animais, que pode ser propagado somente por reprodução sexuada. Além disso, as células transgénicas podem ser facilmente rastreados in vivo, devido à transparência do animal e a ausência de proteínas fluorescentes endógenos 8.
Nos sete anos desde as primeiras linhas Hydra transgênicas foram feitas 1, essas linhas foram usados para uma variedade de aplicações. Expressão de proteínas fluorescentes em diferentes tipos de células tornou possível controlar o movimento celular, observar as alterações na forma da célula, e rastrear destinos celulares, tanto em condições de tipo selvagem e depois perturbação química 1,5,9-12. Além disso, a expressão de proteínas fluorescentes diferentes nas diversas linhagens de FACS permite o isolamento de populações de células específicas. Esta técnica tem sido utilizada para o seqüenciamento de mRNAs específicos de células-tronco e de linhagem específica pequenos RNAs 13,14. Enquanto o promotor deum dos dois genes da actina Hidra tem sido mais amplamente utilizado, a poucos tipos de células-promotores específicos foram identificados e utilizados para dirigir a expressão da GFP em Hydra 9,11,15,16 transgénico. No futuro, os promotores específicos do tipo de célula irá permitir a observação e recolha de qualquer tipo de célula específico. Além disso, uma abordagem transgénica foi utilizado com sucesso para definir os elementos reguladores que actuam em cis do promotor Wnt3 17.
O desenvolvimento de métodos transgênicos em Hydra oferece uma abordagem robusta para testar a função dos genes pela expressão ectópica, superexpressão e knockdown. Os animais transgénicos que foram feitos expressar as proteínas marcadas com fluorescência, de modo a examinar tanto a função e localização celular de 18-20. Além disso, a expressão de ARN de gancho de cabelo na 3'UTR de um transgene GFP leva a knockdown de genes alvo 21,22. Nessas abordagens GFP é necessário para identificare rastrear o tecido transgénico durante a criação da linha transgénica. No entanto, é provável que, em alguns casos, a molécula GFP iria interferir com a função da proteína etiquetada. Um estudo recente demonstra que os genes Hydra podem ser dispostas numa configuração operão, por exemplo, transcrições policistrónico são feitos, os quais são então separados por adição líder trans-splicing e traduzidos em separado 23. Ao colocar um gene que codifica uma proteína ou um gancho de cabelo de ARN na posição a montante de um operão e um gene de proteína fluorescente na posição de jusante, pode-se controlar o tecido transgénico sem ter que marcar o gene que codifica a proteína ou RNA hairpin. Este método tem sido utilizado para expressar um gancho de cabelo de ARN de um operão com DsRed2 configuração, a fim de alcançar gene knockdown 14.
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Protocol
1 Preparação de plasmídeo de DNA, agulhas e injeção Pratos
- Prepare o DNA de plasmídeo utilizando um kit de alta velocidade ou Maxi Midi e concentra-se o ADN para 2,5 mg / ml usando a precipitação com etanol. O sedimento de DNA deve ser dissolvido em água livre de nuclease desionizada. Armazenar o ADN em 10-20 mL alíquotas a -20 ° C. (Ver Quadro Suplementar 1 para uma lista de vetores disponíveis)
- Faça um prato de injeção utilizando agarose para construir uma calha para a realização de embriões em uma placa de Petri de 100 x 15 mm.
- Coloque uma lâmina de microscópio de vidro de 75 x 50 em um 100 x 15 mm numa caixa de Petri com um ângulo. Despeje a cerca de 50 ml de 2% de agarose em forma derretida Hidra 24 para a placa de Petri. Alternativamente, despeje a agarose para o prato primeiro e flutuar um "molde microinjeção Fish" no topo.
- Após o ágar ter solidificado, remover a lâmina de vidro, ou o molde. Se foi usada uma lâmina de vidro, corte o excesso de agarose com um bla navalhade formar uma parede. Despeje meio Hydra no prato e usá-lo imediatamente ou armazená-lo a 4 ° C até ser necessário. Nota: pratos de injecção pode ser reutilizado se for armazenado a 4 ° C entre as utilizações.
- Puxar agulhas capilares de vidro de borossilicato com um filamento no puxador de micropipeta usando as seguintes condições: 525 aquecer, puxar 75, a velocidade de 100, o tempo da loja 50. as agulhas, pressionando-os para uma estreita faixa de argila, em uma placa de Petri de tal modo que eles são mantida paralelamente ao fundo do prato.
- Para preparar a solução para injecção, combinar 3 uL de solução de ADN de plasmídeo de 2,5 mg / mL com 2 mL de 10% de vermelho de fenol. Vortex a solução brevemente e em seguida girar durante 10 minutos à velocidade máxima numa microcentrífuga para remover quaisquer partículas que podem entupir a agulha.
- Sob um microscópio de dissecação, o clipe de agulha alguns milímetros da ponta com uma pinça para criar uma pequena abertura. Nota: Existe uma certa flexibilidade no tamanho adequado do abertoing porque a pressão pode ser ajustada na etapa 3.3 para acomodar esta variação.
- Colocar a placa de Petri de modo a que é segura a agulha na posição vertical, com a ponta para baixo. Coloque a agulha com cerca de 0,5 ml de solução de injecção por pipetagem do líquido para dentro da extremidade posterior da agulha. Permitir uma acção capilar para puxar a solução para dentro da ponta da agulha.
2 Preparação de embriões para Injeção
- Em uma base diária digitalizar a cultura tensão Hydra AEP para pólipos produtoras de ovos. Colete estes pólipos e retirá-las em um prato de cultura independente. Observe estes pólipos cada poucas horas durante o dia para monitorar o progresso de formação do ovo. Quando os ovos quebram através do ectoderma e sentar-se em um anel de células ectodérmicas retraídos eles estão prontos para a injeção 25. Colocar estes pólipos em um prato com vários hidra que têm testículos durante pelo menos 1 hora antes da injecção para permitir a fertilização. Hidra </ Em> machos vai liberar esperma sem qualquer manipulação especial.
- Se as fêmeas são encontrados na colónia AEP com ovos completamente formados, que são aproximadamente de 400 um de diâmetro de 25, ou de 1 a 8, embriões nos estágios de células, também recolher estes injectável. Injetar imediatamente embriões que começaram clivagem. Nota: Não é possível dizer a diferença entre os ovos totalmente formadas e zigotos unicelulares, portanto, estes devem ser incubadas com os homens antes da injeção.
- Antes da injecção, remover a maior parte do tecido parental acima e abaixo do embrião utilizando um bisturi, com uma lâmina de # 15. Deixar apenas o embrião com um pequeno pedaço de coluna corpo ligado, para ser utilizada para manipular o embrião com uma pinça, se necessário. Nota: O tecido que é dissecado a partir do embrião irá regenerar e deve ser guardada para assegurar que permanecem fêmeas na colónia Hidra.
- Utilizando uma pipeta de Pasteur, mover os embriões para o prato de injecção, dispondo-os em paralelo à parede docalha de agarose.
3. microinjecção de ADN do plasmídeo
- Monte o microinjetor em um suporte magnético que fica em uma chapa de ferro. Montar o suporte da injecção, que é a parte da microinjector que prende a agulha, em um micromanipulador joystick. Monte o manipulador joystick para a chapa de ferro, com um suporte magnético. Coloque esta todo o conjunto para cima no lado direito de um microscópio de dissecção e posiciona o porta-injecção de modo que seja visível no campo de observação.
- Coloque o prato de injecção com embriões sob o microscópio de dissecação, orientada de tal modo que a parede vertical da calha de agarose é para a esquerda. Inserir a agulha no suporte de injecção e diminuir a ponta da agulha para o meio de Hidra no prato.
- Lentamente, rodar o botão da seringa na direcção dos ponteiros do relógio até que o óleo mineral preenche a parte superior da agulha e um fluxo constante de solução de injecção é observado sai da agulha no hidrum meio. Se o fluxo é muito forte, diminuir a pressão, girando o botão para a esquerda. Praticar este passo para obter rotineiramente uma pressão adequada, o que depende do tamanho da abertura da agulha (ou seja, a forma como a agulha foi cortado no passo 1.5). Nota: Se a corrente é muito forte, o embrião não irá sobreviver a injeção.
- Durante a visualização através de um microscópio de dissecação, movimentar o prato de injecção de modo a que o primeiro embrião está no centro do campo. Mover a agulha de modo que ela está a tocar que embrião. Usar o micromanipulador para perfurar o embrião com a agulha. Nota: A parede vertical da calha agarose vai manter o embrião do que está sendo deixado de lado pela agulha.
- Permitir que a solução de injeção a fluir para o embrião 1 ou 2 segundos e, em seguida, remover a agulha rapidamente. Se o embrião tem mais de uma célula, injectar cada célula individual. Use uma pinça para reorientar o embrião para alinhar a célula seguinte, com a ponta da agulha.
- Após o primeiro embryo é injectado, movimentar o prato de modo a que o lado do embrião está na posição de injecção e repetir o procedimento; continuar até que todos os embriões foram injectados.
4 A cultura ea eclosão dos embriões
- Mover todos os embriões injectados em um prato com algumas hidra que têm testículos (isto é para assegurar que todos os embriões são fertilizados). Incubar os embriões em um 18 ° C incubadora, enquanto eles continuam a embriogênese.
- Uma vez que a fase de cutícula é atingido, mover cada embrião injectado para um poço individual de uma placa de 24 poços cheios com meio de hidra.
- Incubar os embriões injectados durante 2 semanas no escuro a 18 ° C.
- Após o período de incubação duas semanas, verifique cada embrião injetado sob o microscópio de dissecação. Observe quaisquer casos em que o embrião cutícula estágio se soltou do pequeno pedaço de tecido parental eo tecido dos pais tenha regenerado. Remover este pólipo regenerado imediatamente para que ele não é mistaken de um novo filhote.
- Mova o prato de embriões injetados sob a luz do aquário à temperatura ambiente. Verifique as placas de cada dia e recolher filhotes. Novos filhotes será branco porque a cor-de-rosa típico de pólipos Hydra vem da Artemia eles comem.
- Observe os filhotes debaixo de um microscópio de fluorescência para detectar a expressão do transgene.
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Representative Results
Estabelecer linhas de Hydra transgênicos
Alimentar filhotes transgênicas a cada 2-3 dias com náuplios de Artemia. Os filhotes, por vezes, não comer por um ou dois dias após a eclosão. Alguns novos filhotes nunca vai comer, e, portanto, não vai sobreviver. Se o filhote é transgénicos quer na ectodérmica (Figura 1A) ou o tecido epitelial endodérmica, permitir que o animal a germinar e recolher as gemas que têm a maioria dos tecidos transgénicos (Figura 1B, C). Continue a fazer isto com os novos botões até que uma linhagem transgênica é estabelecida com expressão uniforme do transgene tanto no ectodérmica (Figura 1D) ou linhagem epitelial endodermal. Simultaneamente, uma segunda linha pode ser estabelecida de que não contém o transgene, mas caso contrário, é geneticamente idêntico (Figura 1B). Esta linha serve como um controlo negativo em experiências futuras. Se o tecido transgénico não se move into de um broto, que, por vezes, é possível cortar o animal e permitir que a regeneração de tal modo que o tecido transgénico estará na nova zona de brotamento. No entanto, se o tecido transgénico é demasiado estreita nas extremidades que provavelmente serão perdidos, uma vez que se desloca durante o crescimento normal do animal. Muitas vezes, não há nada que pode ser feito neste caso. Em nossas mãos, se o transgene é neutro (ou seja, não tem nenhum impacto sobre a função biológica) somos capazes de estabelecer uma linha epitelial uniforme de cerca de 30% de Hydra que chocam com o tecido epitelial transgênico. Os restantes 70% morrem ou o tecido transgénico é perdida. Uma linha endodermal é de aproximadamente 2-3 vezes mais comum que uma linha ectodérmica. Se um transgene está sendo usado que perturba a função biológica, isto pode ter um impacto sobre a viabilidade da criação de uma linha uniforme. Nesses casos, promotores induzidos serão adições essenciais para o kit de ferramentas.
Se o filhote é transgênicona linhagem intersticial, que os animais possam brotar e recolher os filhotes com um número crescente de células transgênicas na linhagem intersticial. Esteja ciente de que às vezes não é imediatamente claro que um animal é transgênico na linhagem intersticial, especialmente se também é transgênico em uma linhagem epitelial. É altamente improvável que uma linha completamente transgênicos na linhagem intersticial será estabelecida simplesmente por brotamento. Se é necessário que a linhagem intersticial ser totalmente transgénica, isto pode ser conseguido por clonagem de agregados provenientes de animais com depleção de células-tronco intersticial de modo a que toda a linhagem é estabelecida a partir de uma única célula-tronco transgénico 7.
Nos casos em que um promotor específico do tipo de célula ou para tecidos é utilizado para conduzir a expressão de uma proteína fluorescente, animais transgénicos pode não ser evidente inicialmente. Por exemplo, se um promotor que está ativo apenas nos tentáculos é usado eo patch inicial de transgênicostecido é na coluna corpo, ausência de células fluorescentes será visto no filhote. Assim, todos os filhotes precisam ser propagadas para permitir que o tecido transgénico a ser deslocado para os tentáculos e se tornam evidentes.
Figura 1 Estabelecimento de uma linhagem transgênica com expressão epitelial ectodérmica uniforme de DsRed2. (A) Um filhote de expressão quimérica de um transgene de DsRed2 sob o controlo de um promotor de actina em um pedaço de células epiteliais de origem ectodérmica. (B) Um botão de primeira geração do filhote no painel A está agora a produzir dois novos brotos. O botão marcado com um asterisco tem nenhum tecido transgénico e foi usada como o animal fundador para uma linha de controlo que é geneticamente idêntico à linha transgénica, excepto quanto à presença do transgene. (C) Um botão de segunda geraçãoproduzido a partir da Hydra no painel B. (D) Um exemplo de um pólipo da linhagem transgênica, que foi criado com a expressão DsRed2 todo o ectoderma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Hydra rotineiramente reproduz de forma assexuada, mas requer estímulos ambientais para começar gametas produtores. Esses estímulos não são bem definidos para a maioria das espécies de Hydra e podem variar de estirpe para estirpe. Um obstáculo significativo para a produção de Hidra transgénico é a obtenção de embriões numa base regular porque pode ser difícil num ambiente laboratorial para induzir a tornar-se Hydra sexual. A estirpe AEP 25, no entanto, produz gâmetas prontamente no laboratório e esta é a única estirpe que tenha sido utilizado até agora para a tomada de linhas transgénicas. O método mais comum para induzir a produção de gâmetas é através da manipulação da dieta. Como descrito anteriormente, os animais devem ser alimentados diariamente durante três semanas, fome durante 5 dias, e, em seguida, alimentado duas vezes por semana, durante o qual tempo gâmetas será produzido um. Também tem sido nossa experiência que a cultura AEP Hydra em placas verticais em um aquário 26, talvez simulando uma more ambiente natural, leva à produção de ovos, mesmo quando os animais são alimentados a intervalos regulares. Além disso, as linhas obtidas a partir de auto-AEP cruzamentos, por vezes, produzir gâmetas mais regularmente do que a estirpe progenitora. Assim, estabelecendo uma linha de F1 da AEP é outro método possível para a obtenção de uma fonte mais confiável de embriões.
A porcentagem de embriões que sobrevivem injeção e desenvolver para o estágio cutícula depende da saúde dos embriões, a quantidade de solução injetada ea quantidade de danos causados pela injeção. Com a injecção de fluxo constante de configuração descrito neste protocolo, é difícil controlar a quantidade de solução que é injectada para o embrião. Em nossas mãos, cerca de metade dos embriões injetados como descrito aqui embriogênese completa com sucesso e formar uma cutícula. Destes, 50-75% de escotilha e aqueles que eclodem, cerca de 50% terão, pelo menos, parte do tecido transgénico. Portanto, 10-20% dos embriões injectados inicialmente produzirHidra F1 com um tecido transgénico. A quantidade de solução injectada pode ser controlado com precisão, o equipamento mais caro, tais como o microinjector IM-300. As linhas transgénicas originais foram feitas com equipamento de Eppendorf, que permite uma grande precisão na manipulação e injectar o embrião. Enquanto este grau de precisão pode dar uma maior taxa de sobrevivência dos embriões injectados, esta despesa não é necessária para o estabelecimento de linhas transgénicas de rotina.
A integração do transgene é aleatória e pode potencialmente ocorrer em vários locais no genoma ou em uma matriz de conjunto em um único local. Com base na análise de transferência de Southern, o número de integrações foi estimada em cinco em uma linha transgénica epitelial criado anteriormente 1. Em uma linha transgénica linhagem intersticial no qual o transgene é submetido a transmissão da linha germinal, que foi demonstrado por sequenciação do genoma que apenas uma única cópia do gene foi integrated (CE Dana e RE Steele, observação não publicada). No entanto, além destes dois exemplos, não há informações disponíveis sobre locais de integração do transgene e número do exemplar. Uma vez que é possível que um transgene poderia interromper a função do gene, por mutagénese insercional, mais do que uma linha transgénica deve ser feito quando se analisam os fenótipos de, por exemplo, ARNi ou superexpressão construções. É também importante notar que a expressão do transgene é constitutiva quando conduzido pelo promotor do gene da actina utilizada, e, portanto, os transgenes que levam a fenótipos graves ou letais quando expressos constitutivamente não será mantido. No futuro, será importante para o desenvolvimento de um sistema indutivel da expressão do transgene para contornar este problema.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma G. Harold & Leila Y. Mathers Award para HL e uma subvenção NIH (R24 GM080527) para RESCEJ foi um NRSA Pós-Doutorado (NIH F32GM9037222) e está apoiada por uma Scientist Award Desenvolvimento Mentored Pesquisa da National Instituto do Envelhecimento (K01AG04435). Gostaríamos de agradecer aos revisores pelos comentários úteis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEP Hydra Strain | Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp | ||
| High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | |
| 75 x 50 mm Glass Microscope Slide | Sigma | CLS294775X50 | |
| Microinjection Fish Mold | IBI Scientific | FM-600 | |
| Borosilicate Glass with Filament | Sutter Instrument | BF100-50-10 | O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532 | |
| Jewelers Forceps, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
| Scalpel Blade #15 | Fisher | 50-822-421 | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-500ML | |
| Microinjector | Narishige | IM-9B | |
| Magnetic Stand | Narishige | GJ-1 | |
| Iron Plate | Narishige | IP | |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 |
References
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