Introduction
Hydra se ha utilizado para estudiar la regeneración, la formación de patrones, y las células madre para unos 250 años 2 Hydra tiene un plan de cuerpo simple que consiste en tres linajes celulares:. Epitelio ectodérmico, endodérmico epitelial y intersticial. El cuerpo tubular está formado por la ectodérmico y endodérmico linajes epiteliales, cada uno de los cuales es una sola capa de células. Todas las células epiteliales en la columna de la carrocería son mitótico. Cuando las células epiteliales se desplazan en las extremidades 3, la cabeza (boca y tentáculos) en el extremo oral o el pie (disco basal) en el extremo aboral, que detención en la fase G2 del ciclo celular y cambiar el destino celular 4. Las células del linaje intersticial residen dentro de los intersticios entre las células epiteliales. Este linaje es apoyado por las células madre multipotentes que se encuentran en la capa epitelial ectodérmica de la columna de cuerpo 5. Las células madre intersticiales dan lugar a tres cel somáticatipos l (nervios, células de la glándula, y nematocytes) y las células germinales 6,7.
Como miembro del filo Cnidaria, el grupo hermano de todos los bilaterales, Hydra puede arrojar luz sobre los procesos biológicos fundamentales compartidos entre los animales multicelulares. Hasta hace poco, estos esfuerzos fueron obstaculizados por la falta de métodos fiables para la perturbación de la función génica. Sin embargo, con el desarrollo de la metodología transgénico 1, ahora somos capaces de sacar el máximo provecho de Hydra para obtener una mejor comprensión de los mecanismos básicos comunes a los animales multicelulares, como la función de células madre, la regeneración y el patrón. Líneas transgénicas Hydra son establecidos por inyección de plásmido de ADN en embriones, lo que resulta en la integración aleatoria y de expresión quimérico en una frecuencia sustancial de las crías. Una línea con expresión uniforme en un linaje particular puede ser establecida por la propagación asexual. La capacidad de propagar clonalmente transgENIC Hydra líneas es una ventaja sobre la mayoría de los modelos animales, que puede ser propagada sólo por reproducción sexual. Además, las células transgénicas se pueden rastrear fácilmente in vivo debido a la transparencia del animal y la ausencia de proteínas fluorescentes endógenos 8.
En los siete años transcurridos desde las primeras líneas transgénicas Hydra fueron hechas 1, dichas líneas se han utilizado para una variedad de aplicaciones. La expresión de proteínas fluorescentes en diferentes tipos de células ha permitido rastrear el movimiento celular, observar los cambios en la forma de la célula, y la pista destino celular, tanto en condiciones de tipo salvaje y después de la perturbación química 1,5,9-12. Además, la expresión de diferentes proteínas fluorescentes en los diversos linajes permite el aislamiento de FACS de poblaciones celulares específicas. Esta técnica ha sido utilizada para la secuenciación de ARNm específicos de células madre y linaje específico de pequeños RNAs 13,14. Mientras que el promotor deuno de los dos genes de actina Hydra se ha utilizado más ampliamente, unos pocos de tipo celular promotores específicos han sido identificados y se utiliza para controlar la expresión de GFP en transgénicos Hydra 9,11,15,16. En el futuro, promotores específicos de tipo celular permitirá para la observación y la recogida de cualquier tipo de célula específico. Además, un enfoque transgénico se utilizó con éxito para definir los elementos reguladores que actúan en cis del promotor Wnt3 17.
El desarrollo de métodos transgénicos en Hydra proporciona un enfoque robusto para probar la función de los genes por la expresión ectópica, la sobreexpresión, y caída. Los animales transgénicos se han hecho que expresan proteínas fluorescentemente marcadas con el fin de examinar la función y localización celular 18-20. Además, la expresión de ARN horquillas en el 3'UTR de un transgén GFP lleva a desmontables de genes diana 21,22. En estos enfoques se requiere para identificar las buenas prácticas agrariasy rastrear el tejido transgénico durante la creación de la línea transgénica. Sin embargo, es probable que en algunos casos la molécula de GFP podría interferir con la función de la proteína etiquetada. Un estudio reciente demuestra que los genes Hydra pueden ser dispuestos en una configuración operón, es decir, se hacen polycistronic transcripciones, que luego son separados por trans-empalmados Además líder y traducido por separado 23. Mediante la colocación de un gen que codifica una proteína o un ARN de horquilla en la posición aguas arriba de un operón y un gen de proteína fluorescente en la posición aguas abajo, se puede realizar un seguimiento de tejido transgénico sin tener que etiquetar el gen que codifica la proteína o ARN de horquilla. Este método se ha utilizado para expresar una horquilla de ARN en una configuración operón con DsRed2 a fin de lograr gen desmontables 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Preparación de ADN plásmido, agujas, y platos de inyección
- Preparar el ADN de plásmido usando un kit Maxi de alta velocidad o Midi y se concentra el ADN a 2,5 mg / ml utilizando la precipitación con etanol. El sedimento de ADN se debe disolver en agua desionizada libre de nucleasa. Almacene el ADN en 10-20 alícuotas a -20 ° C. (Véase el cuadro 1 complementario para obtener una lista de vectores disponibles)
- Hacer un plato de inyección utilizando agarosa para construir un canal para la celebración de los embriones en una placa de 100 x 15 mm de Petri.
- Colocar un portaobjetos de microscopio de vidrio 75 x 50 en una placa de 100 x 15 mm Petri en un ángulo. Vierta aproximadamente 50 ml de 2% de agarosa fundido en un medio de Hydra 24 en la placa de Petri. Alternativamente, se vierte la agarosa en el plato primero y flotar un "Mold Microinyección Fish" en la parte superior.
- Después de la agarosa se ha solidificado, retirar el portaobjetos de vidrio o el molde. Si se ha utilizado un portaobjetos de vidrio, cortar el exceso de agarosa con un bla de afeitarde para formar una pared. Verter medio Hydra en el plato y utilizar inmediatamente o almacenarlo a 4 ° C hasta que se necesite. Nota: los platos de inyección pueden ser reutilizados si se almacenan a 4 ° C entre usos.
- Tire las agujas de capilares de vidrio borosilicato con un filamento en el extractor de micropipeta usando las siguientes condiciones: calor 525, tire 75, velocidad 100, tiempo 50. Tienda las agujas de comprimirlos en una estrecha franja de tierra batida en un plato de Petri de manera que sean mantenida en paralelo a la parte inferior del plato.
- Para preparar la solución de inyección, combinar 3 l de solución de ADN de plásmido de 2,5 mg / ml con 2 l de 10% de fenol rojo. Vortex la solución brevemente y luego girar por 10 min a velocidad máxima en una microcentrífuga para eliminar las partículas que pueden obstruir la aguja.
- Bajo un microscopio de disección, corte la aguja unos pocos milímetros de la punta con fórceps para crear una pequeña abertura. Nota: Hay una cierta flexibilidad en el tamaño adecuado de la aperturaing porque la presión se puede ajustar en el paso 3.3 para acomodar esta variación.
- Coloque la placa de Petri de modo que se mantiene la aguja en una posición vertical con la punta hacia abajo. Cargar la aguja con aproximadamente 0,5 l de solución de inyección con la pipeta el líquido en el extremo posterior de la aguja. Permitir que la acción capilar para tirar de la solución en la punta de la aguja.
2 Preparación de embriones para inyección
- Sobre una base diaria escanear el cultivo de la cepa Hydra AEP para los pólipos producen huevos. Reunir estos pólipos y déjelos a un lado en una placa de cultivo separado. Observar estos pólipos cada pocas horas durante el día para controlar el progreso de la formación del huevo. Cuando los huevos se rompen a través del ectodermo y se sientan en un anillo de células ectodérmicas retraídos que están listos para inyección 25. Coloque estos pólipos en un plato con varios Hydra que tienen testículos durante al menos 1 hora antes de la inyección para permitir la fertilización. Hydra </ Em> machos lanzará esperma sin ninguna manipulación especial.
- Si las hembras se encuentran en la colonia AEP con los huevos completamente formados, que son aproximadamente 400 micras de diámetro 25, o de 1 a embriones en estadio de 8 células, también recoger estos para inyección. Inmediatamente inyectar embriones que han comenzado escisión. Nota: No es posible establecer la diferencia entre los huevos completamente formadas y cigotos unicelulares, por lo tanto estas deben ser incubadas con los machos antes de la inyección.
- Antes de la inyección, eliminar la mayor parte del tejido parental encima y por debajo del embrión usando un escalpelo con una cuchilla # 15. Dejar sólo el embrión con un pequeño trozo de la columna cuerpo adjunto, que se utiliza para manipular el embrión con pinzas si es necesario. Nota: El tejido que se diseca lejos del embrión regenerará y debe ser guardado para asegurar que las mujeres permanecen en la colonia Hydra.
- Utilizando una pipeta Pasteur, mover el plato de embriones para inyección, disponiéndolos en paralelo a la pared de laa través de agarosa.
3. microinyección de ADN plásmido
- Monte el microinyector en un soporte magnético que se sienta en una placa de hierro. Montar el soporte de inyección, que es la parte de la microinyector que mantiene la aguja, en un micromanipulador joystick. Monte el manipulador joystick a la plancha de hierro, con un soporte magnético. Coloque esta todo el conjunto-en el lado derecho de un microscopio de disección y colocar el soporte de inyección de modo que sea visible en el campo de observación.
- Coloque el plato de la inyección con embriones bajo el microscopio de disección, orientada de tal manera que la pared vertical de la cubeta de agarosa está a la izquierda. Insertar la aguja en el soporte de inyección y bajar la punta de la aguja en el medio Hydra en el plato.
- Girar lentamente el pomo de la jeringa en la dirección de las agujas del reloj hasta que el aceite mineral se llena la parte superior de la aguja y un flujo constante de solución de inyección se observa que sale de la aguja en el hidrun medio. Si la corriente es demasiado fuerte, reduzca la presión girando la perilla a la izquierda. Practicar este paso para obtener de forma rutinaria una presión adecuada, que depende del tamaño de la abertura de la aguja (es decir, cómo se recorta la aguja en el paso 1.5). Nota: Si la corriente es demasiado fuerte, el embrión no sobrevivió a la inyección.
- Mientras observa a través del microscopio de disección, mover el plato de inyección de manera que el primer embrión está en el centro del campo. Mover la aguja de modo que está en contacto con ese embrión. Utilice el micromanipulador para perforar el embrión con la aguja. Nota: La pared vertical de la cubeta de agarosa mantendrá el embrión sea empujado a un lado por la aguja.
- Deje que la solución inyectable fluya hacia el embrión 1 o 2 segundos y luego retire la aguja rápidamente. Si el embrión tiene más de una celda, inyectar cada célula individual. El uso de fórceps para reorientar el embrión para alinear la siguiente celda con la punta de la aguja.
- Después de la primera embryse inyecta o, mover el plato para que la próxima embrión se encuentra en la posición de inyección y repita el procedimiento; continuará hasta que se hayan inyectado todos los embriones.
4. El cultivo y la eclosión de embriones
- Mover todos los embriones inyectados en un plato con algunos Hydra que tienen testículos (esto es para asegurar que todos los embriones son fertilizados). Incubar los embriones en una incubadora a 18 °, mientras continúan la embriogénesis.
- Una vez que se alcanza la etapa de cutícula, mover cada embrión inyectado a un pozo individual de una placa de 24 pocillos con medio lleno Hydra.
- Incubar los embriones inyectados durante 2 semanas en la oscuridad a 18 ° C.
- Después del periodo de incubación de 2 semana, comprobar cada embrión inyectado bajo la lupa. Tenga en cuenta los casos en los que el embrión cutícula etapa ha desprendido de la pequeña muestra de tejido de los padres y el tejido de los padres ha regeneradas. Eliminar este pólipo regenerado inmediatamente de modo que no es mistaken de una nueva cría.
- Mueva el plato de embriones inyectados bajo una luz del acuario a RT. Compruebe los platos cada día y recoger las crías. Nuevas crías serán blancas porque el típico color rosa de pólipos Hydra viene de la Artemia que comen.
- Observar las crías bajo un microscopio de fluorescencia para detectar la expresión del transgén.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El establecimiento de líneas transgénicas de Hydra
Alimente las crías transgénicas cada 2-3 días con nauplios de Artemia. Las crías a veces no comen por un día o dos después de la eclosión. Algunas de las nuevas crías nunca van a comer, y por lo tanto no va a sobrevivir. Si la cría es transgénica ya sea en el ectodérmica (Figura 1A) o tejido epitelial endodérmico, permitir que el animal brote y recoger los brotes que tienen el tejido más transgénicos (Figura 1B, C). Continúe haciendo esto con los nuevos brotes hasta que se establezca una línea transgénica con la expresión del transgén uniforme ni en el ectodermo (Figura 1D) o linaje epitelial endodérmico. Al mismo tiempo, una segunda línea se puede establecer que no contiene el transgén pero por lo demás idénticos genéticamente (Figura 1B). Esta línea sirve como un control negativo para futuros experimentos. Si el tejido transgénico no se mueve into un brote, a veces es posible cortar el animal y permitir que se regenere el tejido de tal manera que transgénico será en la nueva zona en ciernes. Sin embargo, si el tejido transgénico es demasiado cerca de las extremidades es probable que se pierde a medida que se desplaza durante el crecimiento normal del animal. A menudo, no hay nada que se pueda hacer en este caso. En nuestras manos, si el transgen es neutral (es decir, no tiene impacto en la función biológica) que son capaces de establecer una línea epitelial uniforme de aproximadamente el 30% de Hydra que eclosionan con el tejido transgénico epitelial. El 70% restante morir o el tejido transgénico se pierde. Una línea endodérmico es aproximadamente 2-3 veces más comunes como una línea ectodérmica. Si un transgén se está utilizando que altera la función biológica, esto puede tener un impacto en la viabilidad de establecer una línea uniforme. En tales casos, los promotores inducibles serán adiciones esenciales a la caja de herramientas.
Si la cría es transgénicoen el linaje intersticial, que el animal pueda brote y recoger las crías con un número creciente de células transgénicas en el linaje intersticial. Tenga en cuenta que a veces no es claro de inmediato que un animal es transgénico en el linaje intersticial, especialmente si también es transgénico en un linaje epitelial. Es muy poco probable que una línea completamente transgénico en el linaje intersticial se establecerá simplemente ciernes. Si se requiere que el linaje intersticial ser completamente transgénico, esto se puede lograr mediante la clonación de los agregados de células procedentes de animales con depleción de madre intersticial de tal manera que todo el linaje se establece a partir de una sola célula madre transgénico 7.
En los casos donde se usa un promotor específico del tipo de tejido o célula para conducir la expresión de una proteína fluorescente, los animales transgénicos no pueden ser evidentes inicialmente. Por ejemplo, si se usa un promotor que es activo sólo en los tentáculos y el parche inicial de transgénicostejido en la columna de la carrocería, se verá no hay células fluorescentes en el neonato. Así que todas las crías tienen que propagarse a permitir que el tejido transgénico se desplace en los tentáculos y hacerse evidente.
Figura 1. Establecimiento de una línea transgénica con expresión epitelial ectodérmica uniforme de DsRed2. (A) A las crías con la expresión de un transgén quimérico DsRed2 bajo el control de un promotor de actina en un parche de células epiteliales ectodérmicas. (B) Un brote de primera generación a partir de la cría en el panel A es ahora la producción de dos nuevos brotes. La yema marcado con un asterisco no tiene tejido transgénico y fue utilizado como el animal fundador para una línea de control que es genéticamente idéntico a la línea transgénica, excepto por la presencia del transgén. (C) Un brote de segunda generaciónproducido a partir de la Hidra en el panel B. (D) Un ejemplo de un pólipo de la línea transgénica que se estableció con la expresión DsRed2 todo el ectodermo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hydra reproduce asexualmente rutinariamente, pero requiere de estímulos ambientales para comenzar gametos productores. Estos estímulos no están bien definidas-para la mayoría de las especies Hydra y pueden diferir de cepa a cepa. Un obstáculo significativo a la producción de transgénicos Hydra es la obtención de embriones sobre una base regular, ya que puede resultar difícil en un entorno de laboratorio para inducir Hydra para convertirse sexual. La cepa AEP 25, sin embargo, produce gametos fácilmente en el laboratorio y esta es la única cepa que se ha utilizado hasta ahora para la fabricación de líneas transgénicas. El método más común para inducir la producción de gametos es por manipulación de la dieta. Como se ha descrito anteriormente, los animales deben ser alimentados diariamente durante tres semanas, hambre durante 5 días, y luego alimentados dos veces por semana, durante la cual los gametos de tiempo se producen 1. También ha sido nuestra experiencia que el cultivo de AEP Hydra en placas verticales en un acuario 26, tal vez simulando una more medio ambiente natural, conduce a la producción de huevos, incluso cuando los animales son alimentados a intervalos regulares. Además, las líneas obtenidas de auto-cruces AEP veces producen gametos con más regularidad que la cepa madre. De este modo se crea una línea F1 de AEP es otro método posible para la obtención de una fuente más fiable de los embriones.
El porcentaje de embriones que sobreviven desarrollan inyección y a la etapa de la cutícula depende de la salud de los embriones, la cantidad de solución inyectada, y la cantidad de daño causado por la inyección. Con la constante de inyección de flujo configuración descrita en este protocolo, es difícil controlar la cantidad de solución que se inyecta en el embrión. En nuestras manos, aproximadamente la mitad de los embriones inyectados como se describe aquí embriogénesis éxito completo y formar una cutícula. De éstos, 50-75% escotilla y de los que escotilla, aproximadamente el 50% tendrán al menos una parte del tejido transgénico. Por lo tanto, el 10-20% de los embriones inyectados inicialmente dióun Hydra F1 con el tejido transgénico. La cantidad de solución inyectada puede controlarse con precisión con el equipo más caro como el microinyector IM-300. Las líneas transgénicas originales se hicieron con materiales de Eppendorf, que permite una gran precisión en la manipulación e inyectar el embrión. Aunque este nivel de precisión puede dar una mayor tasa de supervivencia de los embriones inyectados, este gasto no es necesario para el establecimiento de rutina de las líneas transgénicas.
La integración del transgén es al azar y potencialmente podría ocurrir en múltiples localizaciones en el genoma o en una disposición en tándem en una única ubicación. Basado en el análisis de transferencia de Southern, el número de integraciones se estimó en cinco en una línea transgénica epitelial creado previamente 1. En una línea transgénica linaje intersticial en el que el transgén se somete a la transmisión de la línea germinal, se ha demostrado por la secuenciación del genoma que sólo una sola copia del transgén era integrated (CE Dana y RE Steele, la observación no publicados). Sin embargo, aparte de estos dos ejemplos, no hay información disponible sobre los sitios de integración del transgén y el número de copias. Dado que es posible que un transgén podría interrumpir la función del gen por mutagénesis de inserción, se debe hacer más de una línea transgénica en el análisis de los fenotipos de, por ejemplo, ARNi o sobreexpresión constructos. También es importante señalar que la expresión del transgen es constitutiva cuando impulsado por el promotor del gen de actina de uso común, y por lo tanto transgenes que conducen a fenotipos graves o letales cuando se expresan constitutivamente no se mantendrá. Para el futuro, será importante desarrollar un sistema inducible de la expresión transgénica de eludir este problema.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una Harold y Leila Y. Mathers G. Premio a HL y una subvención del NIH (R24 GM080527) a RESCEJ era un Postdoctoral Fellow NRSA (NIH F32GM9037222) y actualmente es apoyado por un Premio al Desarrollo Científico Mentored Investigación de la Nacional Instituto del Envejecimiento (K01AG04435). Nos gustaría agradecer a los revisores por sus valiosos comentarios.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEP Hydra Strain | Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp | ||
| High Speed Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| 100 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | |
| 75 x 50 mm Glass Microscope Slide | Sigma | CLS294775X50 | |
| Microinjection Fish Mold | IBI Scientific | FM-600 | |
| Borosilicate Glass with Filament | Sutter Instrument | BF100-50-10 | O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532 | |
| Jewelers Forceps, Durmont #5 | Sigma | F6521 | |
| Scalpel Blade #15 | Fisher | 50-822-421 | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-500ML | |
| Microinjector | Narishige | IM-9B | |
| Magnetic Stand | Narishige | GJ-1 | |
| Iron Plate | Narishige | IP | |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 |
References
- Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).
- Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. Hydra. Curr Biol. 20, 964-965 (2010).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. Pattern of epithelial cell cycling in hydra. Dev Biol. 148, 602-611 (1991).
- Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra. Differentiation. 35, 181-189 (1987).
- Khalturin, K., et al. Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation. Dev Biol. 309, 32-44 (2007).
- Bosch, T., David, C. Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells. Dev Biol. 121, 182-191 (1987).
- David, C. N., Murphy, S. Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning. Dev Biol. 58, 372-383 (1977).
- Chapman, J. A., et al. The dynamic genome of Hydra. Nature. 464, 592-596 (2010).
- Boehm, A. M., Bosch, T. C. Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra. Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).
- Glauber, K. M., et al. A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra. Development. 140, 4788-4796 (2013).
- Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation. Dev Biol. 313, 13-24 (2008).
- Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra. Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).
- Hemmrich, G., et al. Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity. Mol Biol Evol. , (2012).
- Juliano, C. E., et al. PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).
- Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. Germline stem cells and sex determination in Hydra. Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).
- Milde, S., et al. Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type. Genome Biol. 10, 8 (2009).
- Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).
- Gee, L., et al. beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra. Dev Biol. 340, 116-124 (2010).
- Fraune, S., et al. In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).
- Bridge, D., et al. FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris. PLoS One. 5, e11686 (2010).
- Boehm, A. M., et al. FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).
- Franzenburg, S., et al. MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).
- Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution. PLoS One. 7, e31643 (2012).
- Lenhoff, H. M. Hydra: Research Methods. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 4 29-34 (1983).
- Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells. Dev Biol. 224, 326-338 (2000).
- Lenhoff, H. M. Hydra: Research Methods. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 8 53-62 (1983).
