Protocol
إعداد 1. عينة
- الحصول على عينات تحتوي على فيروس، معربا عن وسيفيراز (هنا VSVΔ51-Fluc كمثال) لالمعايرة ونقل 96 في لوحات جيدا. بالتناوب، نفذ التهابات في 96 جيدا لوحات زراعة الأنسجة وsupernatants استخدام مباشرة.
- ترك عمودين غير المعالجة لإدراج المنحنيات القياسية. للتجارب القيام به مباشرة في لوحات 96 جيدا، عيار في نهاية التجربة (40 ساعة بعد العدوى) أو تخزينها في -80 درجة مئوية، وعيار في وقت لاحق.
2. إعداد الخلايا لفيروس متساهل المعايرة
- 24 ساعة قبل titering، وإعداد تعليق خلايا فيرو بتركيز 2.5 × 10 5 خلية / مل في Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM) تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 30 ملي HEPES، و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين. ملاحظة: على الرغم من أن هذا البروتوكول يستخدم خلايا فيرو، أي خط خلية متساهل مناسب للعدوى VSV يمكن بالبريد استخدامها.
- البذور 2.5 × 10 4 الخلايا (100 ميكرولتر) في لوحات مسطحة القاع الصلبة البيضاء 96 جيدا باستخدام موزع صفيحة ميكروسكوبية.
- تحضير 12 مل من تعليق خلية في لوحة بالإضافة إلى 5 مل لفتيلة.
- نظيف صفيحة ميكروسكوبية موزع الكاسيت التي كتبها بيغ الأنابيب مع 50 مل من الماء المعقم.
- ملء خطوط صفيحة ميكروسكوبية موزع مع تعليق خلية وترك 5 مل من تعليق خلية تتدفق من خلال.
- تحديد البرنامج الذي سوف تستغني 100 ميكرولتر في كل بئر من 96 لوحة جيدا الجدران البيضاء. الاستغناء، وكرر حسب الضرورة لوحات إضافية. أيضا البذور بضع آبار في 96 لوحة جيدا واضحة مسطحة القاع إذا تم استخدام ألواح الجدران البيضاء غير الشفافة من الأسفل للتحقق من صحة الخلية وكثافة.
- عند الانتهاء، وخلايا دافق مرة أخرى إلى الحاوية الأصلية. تنظيف الكاسيت عن طريق تشغيل 50 مل من الايثانول 70٪ تليها 50 مل من الماء المعقم الدافئ من خلال الأنبوب.
- التأكد من الكاسيت وأنابيب هم ا ف بتنظيف propriately بين الاستخدامات.
- احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة.
3. إعداد منحنى قياسي الفيروسي
- إعداد منحنى مستوى VSVΔ51-Fluc في المصل خالية DMEM مثل أن تركيز النهائي من وحدات اللوحة تشكيل (PFU) لكل مل بعد نقل على خلايا فيرو على النحو التالي: 10 8 PFU / مل، 10 7 PFU / مل، 10 6 PFU / مل، 10 5 PFU / مل، 10 4 PFU / مل، 10 3 PFU / مل، 10 2 PFU / مل، و 10 1 PFU / مل. إعداد 50 ميكرولتر من كل تركيز في لوحة خلايا فيرو بالإضافة إلى 10٪ إضافية.
ملاحظة: سوف العيار الحجمي للسهم فيروس وسيفيراز تحتاج إلى تقييم بطريقة كلاسيكية 10 من أجل توليد منحنى القياسية التي تسمح للالكمي المطلق. خلاف ذلك الكمي النسبي لا يمكن أن يتحقق دون معلومات دقيقة عن طريق تحديد عيار تعسفا عيار الفيروسية مقرهاعلى الخطوات التخفيف. على سبيل المثال قد يتم تعيين التخفيف الأول من المنحنى القياسي إلى 10 8 وحدات الفيروسية و1/10 تخفيف التالي إلى 10 7 وهلم جرا. في هذا السياق، ينبغي للمرء التعبير عن القيم باعتبارها التغيير أضعاف مقارنة على عينة محددة مسبقا كما الكمي المطلق لن تكون دقيقة.
4. نقل عينة Supernatants على خلايا متساهل
- تحقق خلايا فيرو مطلي في واضحة القاع 96 لوحة جيدا تحت المجهر الخفيفة للتأكد من أن الطبقات الوحيدة هي لا يقل عن 95٪ متموجة.
- نقل 25 ميكرولتر من العينة طاف على خلايا فيرو المصنفة في لوحات بيضاء الجدران. لا نقل supernatants في الأعمدة 2 المخصصة لمنحنيات القياسية. ملاحظة: يمكن أن يتم ذلك في وقت واحد لجميع الآبار على لوحة واحدة باستخدام معالج السائل 96 قناة.
- استخدام متعدد القنوات 8- أو 12 قناة pipettor، إضافة 25 ميكرولتر من كل تخفيف من منحنى القياسية أعد الخطوة 3 لخلايا فيرو فيالأعمدة المخصصة 2.
- لوحات أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 430 XG في RT.
- احتضان لمدة 5 ساعة عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة.
تقييم 5. من بقاء الخلية
- ملاحظة: عند بدءا من supernatants تم الحصول عليها من التجارب العدوى به في واضحة لوحات 96 بشكل جيد، والنمو عينة يمكن تقييم مسبق لالكمي مع مؤشر صبغ بقاء الخلية مثل ريسازورين.
- إضافة ريسازورين في مبلغ يساوي 10٪ من حجم في كل بئر من 96 لوحة جيدا من العينات التي تحتوي على الفيروسات والخلايا. تشمل خلية فقط يتحكم وكذلك مراقبة وسائل الإعلام الوحيد لتحديد القيمة ل 100٪ و 0٪ على التوالي جدوى.
- بعد 2-4 ساعة (فترة حضانة سوف تختلف اعتمادا على نوع من الخلايا وعلى تركيز مسحوق المتاحة تجاريا أو يعاد للصباغة)، وقراءة وتسجيل الإشارات باستخدام قارئ لوحة مضان (530-560 الإثارة، 590 الانبعاث). تقرير خلية viabiliتي واي لعينة وفقا للصيغة النسبية الأيض النشاط = ((اختبار عينة إشارة - السلبية إشارة التحكم) / (خلية السيطرة إلا إشارة - إشارة سلبية السيطرة)) × 100٪
6. إعداد الركيزة luciferin
- 30 دقيقة قبل نهاية الحضانة 5 ساعة، وإعداد وسيفيرين للحصول على حل / مل 2 ملغ في الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS). إعداد 2.5 مل لكل لوحة زائد اضافي 2 مل. حماية الحل بعيدا عن الضوء. ملاحظة: يمكن أيضا أن تكون مستعدة لوسيفيرين في وقت سابق من اليوم وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
7. القراءة ضوء بارد
- بعد فترة الحضانة 5 ساعة، إضافة 25 ميكرولتر من وسيفيرين إلى كل بئر من خلايا فيرو في لوحات الصلبة البيضاء. إضافة وسيفيرين يدويا أو مع موزع آلي متكامل في luminometer. ملاحظة: استخدام أداة برصيد نقطة واحدة ونهاية الوحيدة يقرأ قد يتطلب إضافة وسيفيراز تحلل BUF متوافقفر قبل إضافة الركيزة وسيفيرين لتحسين الاتساق.
- قراءة لوحات مع المعلمات التالية:
- يهز لمدة 5 ثانية.
- الانتظار 30 ثانية.
- قراءة التلألؤ في قيمة ثابتة المناسبة حساسية / التعرض. إذا كان الخيار متاح في الصك، واستخدام متعدد نقطة يقرأ (على سبيل المثال، 3 × 3 مصفوفة) لتحسين دقة.
- سجل وحفظ شدة إضاءة الحيوية كميا.
- إذا تم استخدام موزع الآلي لإضافة وسيفيرين تطهير وسيفيرين ورئيس الخطوط مع الماء المعقم الدافئ.
تحليل البيانات 8.
- للحصول على نتائج دقيقة، حل الانحدار غير الخطية لتوليد معادلة هيل من المنحنيات القياسية. تطبيق هذه المعادلة على عينات titered لحساب الوحدات التعبير الفيروسية. بعض الفيروسات أو حالات قد ينتج منحنى القياسية مع وجود علاقة خطية. في هذه الحالة حل للمعادلة خطية.
Representative Results
ويوضح ملخص سير العمل واصفا طريقة الإنتاجية العالية في الشكل 1 الشكل 2 يوضح نتائج منحنى معيار نموذجي ofVSVΔ51-Fluc. أربعة المعلمة تحليل الانحدار غير الخطية ولدت مؤامرة هيل الذي غير معروف المدخلات PFU (تقدير عيار الفيروسية) يمكن محرف. وتسمى هذه الوحدات يقدر التتر التعبير الفيروسية (VEU). يبين الشكل 3A VEUs والتتر التي تم الحصول عليها عن طريق إجراء فحص اللوحة القياسية مع نفس العينات 10. عينات نشأت من تجربة حيث تم استخدام المواد الكيميائية المختلفة لتعزيز تكرار وانتشار VSVΔ51-Fluc في 786-0 الخلايا. VEUs محرف من منحنى القياسية يجب مضروبا في عامل الذي يقوم على التخفيف من supernatants عينة نقله إلى خلايا فيرو (في هذه الحالة، هو عامل التخفيف 5). يظهر علاقة خطية بين التتر وVEU في الشكل 3B 2 من 0.8083 وبيرسون النتيجة ص من 0.899 (P <0.0001). في الشكل 4، يظهر بيانات السمية لخلايا نموذجية تم الحصول عليها من فحص التمثيل الغذائي للخلايا 786-0 تعامل مع المواد الكيميائية قبل الإصابة VSVΔ51-Fluc. أخيرا، ويبين الشكل 5 منحنيات نموذجية معيار تم الحصول عليها مع مختلف الفيروسات (فيروس الهربس البسيط (HSV)، فيروس اللقاحية والغدة اسوشيتد الفيروسات (AAV)، وكلها تعبر عن اليراع وسيفيراز) ويصف مرات حضانة ودورات تجميد ذوبان الجليد، على النحو المطلوب.
الرقم 1. سير العمل من الإنتاجية العالية titering الفيروسات وفحص السمية الخلوية باستخدام VSV Δ 51 Fluc. (A) البذور 2.5 × 10 4 خلايا فيرو لكل بئر (100 ميكرولتر) واحتضان عند 37 درجة مئوية. (B) 24ساعة في وقت لاحق نقل 25 ميكرولتر من منحنى القياسية إلى خلايا فيرو (2 الأعمدة لكل لوحة) (C) نقل 25 ميكرولتر من العينات المراد titered إلى خلايا فيرو المتبقية. لوحات أجهزة الطرد المركزي واحتضان عند 37 درجة مئوية. (D) في مبلغ يساوي 10٪ من حجم في البئر، إضافة ريسازورين كاشف لوحة تحتوي على عينات الأصلي. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية. (E) بعد 3 دقائق، وقراءة وتسجيل مضان وتقييم السمية الخلوية. (F) بعد 5 ساعة، إضافة 25 ميكرولتر من محلول 2 ملغ / مل من وسيفيرين إلى كل بئر من خلايا فيرو. قراءة التلألؤ وحساب وحدات التعبير الفيروسية.
الشكل 2. المتوقعة منحنى مستوى VSV Δ 51 Fluc. كان لي التعبير وسيفيرازasured 5 ساعة نقل آخر طاف في خمس نقاط مختلفة داخل بئر باستخدام luminometer وأعرب عن تلألؤ بيولوجي في متوسط الوحدات الخفيفة النسبية (RLU). يعني RLU وقد تآمر ضد المدخلات معروف PFU / مل لحل الانحدار غير الخطية وتوليد معادلة هيل. ويبين متوسط اثنين من منحنيات تكرار وأشرطة الخطأ القياسية (ص 2 = 0.9993).
الرقم 3. مقارنة القياسية التتر فحص اللوحة مع تلك التي تم الحصول عليها عن طريق أسلوب الإنتاجية العالية. (A) التتر الفيروسية في PFU / مل حصلت عليها فحص اللوحة القياسية على خلايا فيرو قورنت مع التتر الفيروسية حساب (VEU / مل) من نفس عينات titered باستخدام مقايسة الإنتاجية العالية وسيفيراز. (B) الخطي العلاقة بين VEU / مل وعيار الحصول عبر معيار صفحص LAQUE. وتظهر منحنى الانحدار الخطي ومعامل التحديد (R 2).
الرقم 4. عينة جدوى. جدوى عينة قبل تقرر نقل طاف على خلايا فيرو من خلال تقييم النشاط الأيضي الخلوي باستخدام محلول ريسازورين متاحة تجاريا. كانت القيم مضان الخام تطبيع إلى أن من غير المعالجة والآبار غير المصابة.
الشكل 5. المتوقعة المنحنيات القياسية مع HSV اللقاحية والفيروسات AAV. تم قياس التعبير وسيفيراز في خمس نقاط مختلفة داخل بئر باستخدام luminometer وأعرب عن تلألؤ بيولوجي في RELA متوسطالوحدات الخفيفة TIVE (RLU). (A) تم إضافة منحنى القياسية HSV على خلايا فيرو مطلي 24 ساعة في وقت سابق في مناطق ذات كثافة من 2.5 × 10 4 خلايا لكل بئر (100 ميكرولتر) وقياس وسيفيراز جاء 17 ساعة نقل آخر supernantant (R 2 = 0.9489، ن = 1). تكونت معادلة هيل من خلال حل الانحدار غير الخطية. تمت إضافة منحنى (B) الوقس القياسية على خلايا فيرو مطلي 24 ساعة في وقت سابق من كثافة 2.5 × 10 4 خلايا لكل بئر (100 ميكرولتر) وحضنت لمدة 2.5 ساعة عند 37 درجة C، وبعد ذلك تم أخذ قياسات وسيفيراز (R 2 = 0.9892). فقد تولدت معادلة خطية من خلال حل للالانحدار الخطي. تم إضافة (C) AAV منحنى القياسية على خلايا سرطان الرئة الإنسان (A549) مطلي 24 ساعة في وقت سابق في مناطق ذات كثافة من 2.5 × 10 4 خلايا لكل بئر (100 ميكرولتر) وقياس وسيفيراز وقدم 24 إصابة آخر ساعة. تكونت معادلة هيل من خلال حل الانحدار غير الخطية. المتوسطمن ترد خمسة منحنيات تكرار وأشرطة الخطأ القياسية (R 2 = 0.9926).
Discussion
النهج القائم على وسيفيراز الموصوفة هنا يوفر عددا من المزايا أكثر من غيرها من الطرق القائمة بما في ذلك سهولة والسرعة، ومعدات الحد الأدنى من الحاجة، وبتكلفة منخفضة نسبيا. والمساهم الرئيسي في ذلك هو تجنب خطوة التخفيف التسلسلية. ومع ذلك، مسلسل المشتقات القائم على التخفيف من هذا البروتوكول هي بالتأكيد مجدية واستخدمت مؤخرا لتقييم، معربا عن وسيفيراز التتر إيبولا في الشاشة المضادة للفيروسات الإنتاجية العالية 11. في حين أن أكثر بطبيعتها تستغرق وقتا طويلا وأكثر تكلفة، ويمكن أن توفر هذه التعديلات أكبر النطاق الديناميكي لالكمي الفيروسي عند الضرورة. بالإضافة إلى كونها خاصة مناسبة تماما لتقييم التتر الفيروسية في سياق شاشات عالية الإنتاجية، طريقة القياس الكمي الفيروسي خطوة واحدة وسيفيراز استنادا يولد لدينا تقديرات دقيقة لvirions المعدية في حالة تكرار الفيروسات. وعلاوة على ذلك، قراءات من التألق مع بيانات السمية الخلوية من نفس التجربة تعطي أكثرصورة كاملة عن تأثير الظروف التجريبية على الخلايا المستهدفة، وهي مفيدة بشكل خاص في سياق الفيروسات حال الورم وشاشات المخدرات.
على سبيل المثال يتضح هنا يستخدم السلبي ضفيرة واحدة فيروس RNA تكرار. ومع ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول إلى عدد من تكرار وتكرار غير-الفيروسات مع بعض التعديلات الطفيفة البروتوكول. وهذا يشمل فيروسات الحمض النووي مثل الوقس، HSV، وAAV (انظر الشكل 5). عينات الخلايا المصابة بفيروسات مثل فيروس الوقس على سبيل المثال، تتطلب خطوة فيروس الإفراج قبل الكمي (مثل دورة تجميد ذوبان الجليد واحد على الأقل). عند تطبيق هذه التقنية لفيروسات أخرى، فمن الضروري لتحسين فترة حضانة من نقل طاف الفيروسية أو المحللة لقراءة لوحات من قبل luminometer. وسوف تعتمد هذه المعلمة بشكل رئيسي على دورة النسخ المتماثل للفيروس في خط خلية متساهل وقوة عromoter القيادة التعبير وسيفيراز. من الأفضل القيام بذلك عن طريق استخدام منحنى القياسية الكامل في الخطوة الأمثل. للقيام بذلك، يجب على المرء أن تصيب خط الخلية متساهل المناسب مع مكررات مختلفة من منحنى القياسية وأعدت قراءة كل تكرار في وقت مختلف نقاط بعد نقل. من الناحية المثالية، يتم اختيار نقطة وفترة حضانة الذي يؤدي إلى وجود علاقة خطية بين سجل (RLU) وسجل (عيار) التي تغطي مجموعة وعينة عيار المتوقع. لVSVΔ51-Fluc، وهذا هو عادة من 10 4 PFU / مل -10 7 PFU / مل لفترة حضانة 5 ساعة. إذا كان من المتوقع من عينات التتر أقل أو أعلى، يمكن للمرء ببساطة زيادة أو تقليل فترة حضانة التوالي. بالتناوب، يمكن تخفيفه عينات لتقع ضمن نطاق الكثير كما هو الحال عادة لELISA.
كما ذكر أعلاه، هي مناسبة هذه الطريقة بشكل جيد لأداء شاشات المخدرات الإنتاجية العالية باستخدام مكتبات المخدرات لأن معظم الخطوات التي يمكن الآلي. خلايا يمكن مطلي الإلكترونيةfficiently باستخدام موزع صفيحة ميكروسكوبية الآلي، يمكن إضافة مكتبة المخدرات باستخدام معالج السائل 96 قناة، ويمكن أن يضاف فيروس باستخدام موزع صفيحة ميكروسكوبية وقراءة لوحات باستخدام luminometer الآلي. من الناحية النظرية، وهذا يمكن أيضا أن تتكيف مع 384 بئر أو صيغ أصغر؛ ومع ذلك، فإن القيد لتحقيق هذه الغاية هو عدد الخلايا التي يمكن مطلي، نظرا عدد أقل من خلايا يؤدي إلى مجموعة وأضيق في الخطي من سجل (RLU) لتسجيل الدخول (عيار) العلاقة. أخيرا، وتقييم بقاء الخلية باستخدام ريسازورين أو الأصباغ الأيضية الأخرى يمكن أن تدمج بسهولة في سير العمل، مما يسمح للتمييز من المركبات السامة للخلايا في شاشات المضادة للفيروسات أو تحديد المركبات التي تؤدي إلى قتل التآزر في تركيبة مع الفيروسات 12. ومع ذلك، فإن القيود المفروضة على هذه الطريقة فإن شرط وسيفيراز فيروس التحوير التعبير، وهي ليست دائما ممكنة، وتوافر خط خلية متساهل بما فيه الكفاية. ومع ذلك، فمن المرجح ممكن للتكيفطريقة للاستخدام مع مراسل الجينات الأخرى (مثل GFP) توفير طريقة مراسل الكمي لديه الخطي مناسبة وإشارة إلى نسبة الضوضاء. وعموما، فإن طريقة الإنتاجية العالية وصفها يمكن تعديلها لتناسب العديد من الفيروسات المختلفة ومصممة لتطبيقات متنوعة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | SH30243.01 | |
| Fetal bovine serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | Prepare a 1 mM solution, pH 7.3 |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012B | |
| D-Luciferin potassium salt | Biotium | 10101-2 | |
| 96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3917 | 384-well plates can also be used for higher throughput |
| Synergy Mx | BioTek | SMTBL | Monochromator microplate reader |
| Liquidator96 | Mettler Toledo | LIQ-96-200 | 96 tip manual pipetting system |
| Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters | Mettler Toledo | LQR-200F | Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate |
| Microflo | BioTek | 111-206-21 | Used to plate cells in a 96-well plate |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Scientific | 5210450 | Microplate fluorometer |
References
- Grigorov, B., Rabilloud, J., Lawrence, P., Gerlier, D. Rapid titration of measles and other viruses: optimization with determination of replication cycle length. PLoS One. 6 (e24135), (2011).
- Lizee, G., et al. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- McSharry, J. J. Uses of flow cytometry in virology. Clin Microbiol Rev. 7, 576-604 (1994).
- Watcharatanyatip, K., et al. Multispecies detection of antibodies to influenza A viruses by a double-antigen sandwich ELISA. J Virol Methods. 163, 238-243 (2010).
- Dawson, E. Rapid, Direct Quantification of Viruses in Solution Using the ViroCyt Virus Counter. Journal of Biomolecular Techniques. 23 (S10), (2012).
- Snyder, R. O. AAV and RT-PCR: true or false. Mol Ther. 1, 389-390 (2000).
- Diallo, J. S., Roy, D., Abdelbary, H., De Silva, N., Bell, J. C. Ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses. J Vis Exp. 52, (2011).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl Microbiol. 16, 588-594 (1968).
- Green, M., Loewenstein, P. M. Human adenoviruses: propagation, purification, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. 14 (14C 11), (2006).
- Diallo, J. S., Vaha-Koskela, M., Le Boeuf, F., Bell, J. Propagation, purification, and in vivo testing of oncolytic vesicular stomatitis virus strains. Methods Mol Biol. 797, 127-140 (2012).
- Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
- Diallo, J. S., et al. A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers. Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).
