Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

الجيل المقبل من الأنسجة ميكروأري (ngTMA) بروتوكول للدراسات العلامات البيولوجية

doi: 10.3791/51893 Published: September 23, 2014

Summary

يهدف البروتوكول في تحقيق الاستفادة المثلى من البناء ونوعية ميكروأرس الأنسجة للأبحاث العلامات البيولوجية. ويشمل جوانب التخطيط والتصميم، وعلم الأمراض الرقمي، الشرح الشريحة الظاهري، وarraying النسيج الآلي.

Abstract

يعتمد البحث على العلامات البيولوجية ميكروأرس الأنسجة (TMA). يتم إنتاج الواجبات الشهرية المتكررة عن طريق التحويل من النوى الأنسجة صغيرة من كتلة "المانحة" إلى "المتلقي" كتلة ومن ثم تستخدم لمجموعة متنوعة من التطبيقات العلامات البيولوجية. بناء الواجبات الشهرية التقليدي هو عمالة كثيفة، غير دقيق، وتستغرق وقتا طويلا. هنا، ويرد بروتوكول باستخدام الجيل المقبل من ميكروأرس الأنسجة (ngTMA). ويستند ngTMA على تخطيط وتصميم TMA، علم الأمراض الرقمي، وmicroarraying النسيج الآلي. ويتضح بروتوكول باستخدام مثال من 134 النقيلي مرضى سرطان القولون والمستقيم. وتعتبر الجوانب النسيجية والإحصائية واللوجستية، مثل نوع الأنسجة، والمناطق النسيجية محددة، وأنواع الخلايا لإدراجها في TMA، وعدد من البقع الأنسجة، وحجم العينة، والتحليل الإحصائي، وعدد النسخ TMA. يتم فحص الشرائح النسيجية لكل مريض وتحميلها على منصة رقمية على شبكة الإنترنت. هناك، ينظر آن وأنهمotated (علامة) باستخدام أداة قطرها 0،6-2،0 مم، عدة مرات باستخدام مختلف الألوان للتمييز بين المناطق الأنسجة. يتم تحميل كتل المانحة و12 'المتلقية كتل في الصك. يتم استرداد الشرائح الرقمية ومطابقة الصور لكتلة المانحة. arraying المتكررة من المناطق المشروح تلقائيا أديت يؤدي في ngTMA. في هذا المثال، يتم التخطيط ستة ngTMAs تحتوي على ستة أنواع الأنسجة المختلفة / المناطق النسيجية. والمطلوب نسختين من ngTMAs. ثلاثة إلى أربعة شرائح ليتم فحص كل مريض. 3 يعمل المسح الضوئي ضرورية وأداء بين عشية وضحاها. والمشروح كافة الشرائح. وتستخدم الألوان المختلفة لتمثيل الأنسجة المختلفة / مناطق، وهي مركز الورم، والغزو الجبهة، ورم / سدى، الانبثاث العقدة الليمفاوية، الانبثاث الكبد والأنسجة الطبيعية. 17 الشروح / مصنوعة القضية؛ الوقت لشرح 2-3 دقيقة / حالة. يتم إنتاج 12 ngTMAs تحتوي على 4،556 البقع. Arraying الوقت هو 15-20 ساعة. نظرا الى الدقة والمرونة والسرعة، ngTMA هي قويةأداة لزيادة تحسين نوعية الواجبات الشهرية المستخدمة في البحوث السريرية ومتعدية.

Introduction

على مدى العقدين الماضيين، وكان ميكروأرس الأنسجة (الواجبات الشهرية) لها تأثير ملحوظ على الدراسات التحقيق العلامات البيولوجية. الواجبات الشهرية هي أساسا النسيج "المحفوظات" التي تنتجها نقل المتكررة من الأنسجة النوى الصغيرة، وعادة ما يتراوح حجم 0،6-2،0 مم في القطر، وجزءا لا يتجزأ من البارافين كتل "المانحة إلى TMA" المتلقي "كتلة واحدة (الشكل 1) 1. باستخدام حجم نواة صغيرة، حوالي 500 البقع الأنسجة المختلفة من عدد قليل أو كثير من المرضى مختلفة يمكن المحتشدة في واحدة TMA 2.

استخدام الواجبات الشهرية للدراسات العلامات البيولوجية النذير أو التنبؤية لديه العديد من المزايا. النظر في المثال حيث التعبير عن العلامات البيولوجية البروتين المناعية ليتم تقييمها على 450 مريضا. بدلا من أداء 450 البقع المناعى على 450 الشرائح المريض مقطوع من نفس العدد من القطع، والنوى صغيرة من كل عينة يمكن المحتشدة على واحد Tكتلة MA. ولو أخذت النوى متعددة من كل مريض على حدة، ويتم إنتاج عدد أقل من القطع. هذا له تأثير كبير في التقليل بشكل كبير من التكاليف والموارد الأخرى فضلا عن الحد من الهزال الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك تتيح هذه الدراسات تعمل بشكل مناسب باستخدام عدد كبير من الأنسجة التي يتم تقييمها في ظل نفس الظروف التجريبية.

الواجبات الشهرية لديها العديد من التطبيقات المختلفة. على سبيل المثال، يمكن استخدامها لدراسة مورفولوجية والبروتين التعبير والتعبير RNA والحمض النووي الانحرافات التالية تلطيخ بأصباغ مختلفة، أو بعد المناعية أو مولد اللون وحتى مضان في الموقع التهجين 3-7. وقد استخدمت الدراسات الحديثة أيضا الواجبات الشهرية لاختبار التباين داخل وبين المختبرات في بروتوكولات تلطيخ، ووضع خصوصية أو حساسية الأجسام المضادة لطفرات جينية معينة، وتحديد استنساخ بين الفاحصين من البروتين التعبير في التعاون الدولي

بناء الواجبات الشهرية التقليدية باستخدام الأنسجة المشتقة من المريض هو عملية طويلة متعددة الإجراء خطوة (الشكل 2). ويبدأ في البحث عن الحالات المناسبة الممكنة واختيار الشرائح التشخيص من المحفوظات في معهد علم الأمراض، أو معهد آخر، من حيث استرجاع فيها. الطبيب الشرعي يقيم كل شريحة في حالة ويختار الشريحة الأكثر تمثيلا لأغراض الدراسة. بعد ذلك، يتم وضع علامة على المنطقة ذات الاهتمام باستخدام القلم مباشرة تحت المجهر. هذا غالبا ما يكون صعبا وغير دقيق والنتائج فقط في "التقدير" من حيث ينبغي أن تؤخذ من النسيج اللكمات. بعد ذلك، يتم استرداد الكتل البارافين المقابلة لهذه الشرائح ملحوظ من الأرشيف. يتم إجراء مقارنة سريعة بين كتلة والشرائح. باستخدام arrayer الأنسجة شبه الآلي أو محلية الصنع، واللكم كتلة المانحة في المنطقة يقدر المصالح ونقلها إلى المتلقي TMA كتلة. بناء الواجبات الشهرية باستخدام هذه التقنية arraying هو عمالة كثيفة، تستغرق وقتا طويلا، غير دقيق، وغير مرنة. ويقدر إعداد TMA من 475 نقاط في 3 نسخ ليستغرق حوالي 84 ساعة من العمل.

تم إدخال نهج جديد لبناء الواجبات الشهرية مؤخرا من قبل معهد علم الأمراض في جامعة برن التي تعتمد على ثلاثة عناصر هي: التخطيط والتصميم (أو الاستشارات)، علم الأمراض الرقمي جنبا إلى جنب مع خبرة في علم الأنسجة والآلي TMA arraying 12. معا، ويسمى هذا المفهوم الجيل القادم الأنسجة ميكروأري (ngTMA). أدناه، يوصف بروتوكول للngTMA على أساس مثال على 134 مريضا يعانون من سرطان القولون والمستقيم المنتشر. هنا، والأورام الأولية وكذلك الانبثاث العقدة الليمفاوية والكبد الانبثاث هي أن المحتشدة في ngTMAs لتحليل العلامات البيولوجية لاحق. بالإضافة إلى ذلك، فإن المطلوب النوى الأنسجة صغيرة من كل مريض لاستخراج الحمض النووي في المستقبل.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاق المحلية للمستشفى في Insel، برن، سويسرا (07-10-13). تم الحصول على الأنسجة من البنك ورم برن، معهد علم الأمراض في جامعة برن.

1. التخطيط والتصميم (استشارات)

  1. التفكير في سؤال البحث إلى إجابة. اتخاذ قرار بشأن أنواع الأنسجة ليتم تضمينها في المشروع. تحديد ما هي الهياكل النسيجية المهمة للإجابة على السؤال.
  2. تأكد من القطر الأساسية الأكثر فائدة وعدد من النوى لكل مريض للمشروع. تقرر عدد النسخ من الجيل المقبل من الأنسجة مايكرو صفيف (ngTMA) على أساس كمية من المؤشرات الحيوية ليتم التحقيق فيها.
  3. النظر في الجوانب الإحصائية مثل حجم العينة والتحليل هي التي شيدت بعد ميكروأري الأنسجة (TMA). تحديد عدد من المرضى لإدراجها في دراسة ووضع الأنسجة السيطرة للمجموعة.
  4. استرداد النسيجية (أوالتشخيص) Haematoxylin ويوزين (H & E) الشرائح كل مريض. نستعرض بإيجاز الشرائح وتحديد تلك التي تحتوي على المعلومات والأنسجة ذات الصلة للمشروع.
    ملاحظة: تأكد أقسام جديدة للكتل البارافين، إذا هو المطلوب وصمة عار خاصة أو الشريحة المناعية لمسح الشرائح والشرح، بدلا من H & E الشرائح

2. الضوئي الشريحة

  1. تشغيل الكمبيوتر والماسح الضوئي وبرنامج المسح الشريحة مفتوحة. حدد "الوضع التلقائي" لمسح حقل مشرق من شاشة المعاينة.
  2. انقر على "خيارات المسح الضوئي" لضبط معايير الجودة الشريحة. في هذا الوقت، حدد ما إذا الشرائح والتي سيتم فحصها مباشرة إلى منصة رقمية يمكن الوصول إليها عن طريق شبكة الإنترنت أو إلى محرك أقراص محلي (أو محرك أقراص خارجي) وتعيين أنواع المسح الضوئي وعدد من نقاط التركيز.
  3. انقر على "معلمات ملقم" لمسح ل "مركز القضية". في هذه الخطوة، إضافة المزيد من المجلات، وتسمية كل الشرائح ووضعالمجلد في مركز حالة حيث يجب أن يتم تخزين الشرائح. مجلة كل يحمل ما يصل إلى 25 الشرائح.
  4. فحص الجودة / النظافة من الشرائح النسيجية الفعلية للمسح الضوئي. إذا لزم الأمر، والشرائح نظيفة مع الايثانول 70٪.
  5. تحميل ما يصل إلى 25 الشرائح في مجلة مع التسميات مشيرا إلى الداخل (الشكل 3A)
  6. وضع المجلة في الماسح الضوئي. مجلة لأكثر من واحد، ووضعها على رأس كل منهما الآخر.
  7. بدء مسح الشريحة من خلال النقر على السهم الأخضر (الشكل 3B). عندما يتم فحص جميع الشرائح، وتفريغ المجلات واغلاق البرنامج، وأجهزة الكمبيوتر والشريحة الماسح الضوئي.

3. الرقمية الشريحة الشرح

  1. أدخل عنوان المتصفح لمركز إدارة الشريحة الرقمية وتحميل مجانا الرقمي البرمجيات المشاهد الشريحة.
  2. فتح الرقمي البرمجيات المشاهد الشريحة وحدد المجلد الذي يحتوي على الشرائح الرقمية (الشكل 4A).
  3. إضافة ملاحظات، إعادة ترتيب وإدارة الرقمية وطابل مجلد الشريحة أو تعيين حقوق المستخدم إلى الزملاء أو إضافة مرفقات إلى المجلد.
  4. انقر على المطلوب الشريحة الرقمية التي تظهر في المشاهد الشريحة الرقمية.
  5. باستخدام أداة التكبير، وتقييم الشريحة وإيجاد مجالات الاهتمام للاندماج في ngTMA.
  6. باستخدام "أداة الشرح TMA"، حدد حجم الأساسية المطلوبة ولون الشرح. وضع الشرح على الشريحة الرقمية عن طريق النقر عليه (الشكل 4B).
  7. نقل الشرح للهياكل النسيجية المطلوبة لإدراجها في ngTMA (الشكل 4C).
  8. تكرار هذه العملية من الشرح مرة أخرى باستخدام أداة الشرح، واختيار حجم الأساسية ولون الشرح المطلوب. تكرار عرض الشرائح والشرح على كافة الشرائح في المجلد.
  9. بدلا من ذلك، وضع النوى الأنسجة لPCR إلى 0.2 مل أنابيب بدلا من الاندماج في TMA. تعليم الشرائح باستخدام ألوان مختلفة لتحديدهذه البقع لمزيد من التحليل الجزيئي.
  10. إنشاء قائمة من جميع الحالات مع الشروح والألوان المقابلة الخاصة بهم.

4. الأنسجة ميكروأري البناء

  1. استرداد المقابلة كتل الأنسجة البارافين لجميع الشرائح الرقمية المشروح، فرز كتل في الترتيب المطلوب لmicroarraying الأنسجة.
  2. تأكد من أن كتل الأنسجة لديها الحد الأدنى من 4 مم سمك. إن لم يكن، reembedding من الأنسجة ضروري.
  3. تحويل PC "ON" والأنسجة الآلي أداة microarrayer. افتح البرنامج microarrayer الأنسجة وتوفير اسم للمشروع
  4. إجراء "تغيير أداة" وحدد قطر أداة المطلوبة للمشروع (أي 0.6، 1.0، 1.5، أو 2.0 ملم).
  5. تحميل ما يصل إلى 12 كتل "المتلقي" TMA في الجهاز. إعطاء ID لكل من كتل 12
  6. إنشاء تخطيط TMA لكل كتلة المتلقي. نلاحظ تصميم TMA مع عدد من الصفوف والأعمدة، واستباقخطوط ذ وكذلك المسافة بين النوى. إنشاء تخطيط جديد لكل كتلة المتلقي أو استخدام نفس تخطيط مرارا وتكرارا.
  7. ضع المؤشر على تخطيط كتلة المتلقي لاتخاذ النواة الأولى.
  8. المقبل، وتحميل ما يصل إلى 60 كتل المانحة في microarrayer الأنسجة (الشكل 5A). وضع عشرة كتل في كل صف ألف إلى واو أعط كل كتلة معرف المانحة. مراقبة الصور من كل كتلة المانحة على شاشة الكمبيوتر المكتسبة تلقائيا من قبل microarrayer الأنسجة.
  9. بدءا من الكتلة الأولى، انقر على "الشرائح". مراقبة الشريحة الرقمية المشروح المخزنة في مركز إدارة الشريحة الرقمية (أو على محرك أقراص خارجي) باستخدام عارض الشرائح الرقمية. عرض صورة كتلة المانحة وجنبا إلى جنب الشريحة الرقمية.
  10. تحديد نقاط مرجعية على الصورة كتلة إلى كتلة ركب الصورة المانحة مع الشريحة الرقمية
  11. بعد النقر على "التالي"، ومراقبة شروح على صورة أكبر من الكتلة. (الشكل 5B </ قوي>). انقر فوق شروح لتأكيد وانقر على "ابدأ".
    ملاحظة: هذا يطالب microarrayer الأنسجة لبدء حفر حفرة من 0.6 ملم في القطر في كتلة المتلقي في نقطة الانطلاق المحدد. ثم في الخطوة الثانية، وذلك باستخدام أداة واللكم، والصك اللكمات ثقب في الأنسجة من كتلة المانحة المختارة في المنطقة المشروح وأكد بالضبط. ثم يتم نقلها النوى من الجهة المانحة إلى كتلة المتلقي.
  12. بعد ما يقرب من 500 النوى، وتنظيف الحفر واللكم أداة باستخدام مسحة من الزيلين.
  13. وإذا رغبت النوى الأنسجة (بدلا من اللكمات إلى ngTMA)، انقر على "PCR" أداة للكتلة، وتأكيد ما يصل إلى 4 الشروح وضرب "ابدأ". وهذا لكمة ونقل النوى في أنبوب 0.2 مل.
  14. كرر النقطة 4،9-4،11 مع كتلة المانحة الثاني، وهلم جرا.
  15. بعد استخدام جميع الكتل المانحة، أدخل الجولة الثانية من كتل المانحة (61-120) في ميكروأري الأنسجةإيه ومواصلة الخطوات 4،8-4،11.
  16. تحديث الصور المانحة والمتلقية كتلة في حين تقدم المشروع أثناء الحفر واللكم يحدث (الشكل 5C).
  17. إجراء "تصدير" بعد اكتمال المشروع. تحديد موقع الملف .xslx مع معرفات المانحة والمتلقية كتلة، وتوطين جميع اللكمات داخل TMA فضلا عن تخطيط TMA / التصميم، في المجلد تصديرها. حفظ كافة الصور كتلة المانحة مع كل الشرح فرضه مثل jpg الصور في مجلد تصديرها (الشكل 5D). كتلة TMA النهائي هو بعد ذلك جاهزة.

Representative Results

التخطيط والتصميم

هنا استخدمت سبيل المثال من 134 المرضى الذين يعانون من سرطان القولون والمستقيم المنتشر التي يجري التحقيق لسلسلة معينة من المؤشرات الحيوية. ليس فقط هو ngTMA المخطط لهؤلاء المرضى، ولكن استخراج الحمض النووي تليها تحليل طفرية لبعض الجينات المحددة.

خلال مرحلة تخطيط وتصميم ngTMA، وقد قرر الجوانب التالية. من كل مريض، وسيتم التحقيق النسيجية 6 مناطق مختلفة: مركز الورم، غزو الورم الجبهة، ومناطق أكثف ورم في مهدها (ورم / سدى التفاعل)، الأنسجة الطبيعية، الانبثاث العقدة الليمفاوية والانبثاث الكبد. ثلاثة مراكز في منطقة الورم ورم الأنسجة ومركزين الأنسجة الطبيعية هي التي ينبغي إدراجها في المشروع (ن = 17 نقاط لكل مريض). منذ ومن المقرر أن أكثر من 50 المؤشرات الحيوية يتم التحقيق في هذه المواد المرضى، والمطلوب نسختين من ngTMA نهائي. نظرا لاحتمال صغر حجم العقدة الليمفاوية وdistanر الانبثاث، يتم اختيار نواة صغيرة قطرها 0.6 مم لبناء TMA لجميع الأنسجة.

بالإضافة إلى ذلك، من المقرر أن يتم كل منطقة المحتشدة على حدة، بحيث سيتم إنتاج 6 ngTMAs تحتوي على مناطق مختلفة النسيجية: ngTMA تحتوي على أنسجة من أ) مركز الورم، ب) أمام الغزو، ومناطق ج) ورم في مهدها، د) الأنسجة الطبيعية ، ه) الانبثاث العقدة الليمفاوية، و) الانبثاث الكبد.

لتصميم TMA باستخدام أداة 0.6 ملم، وسيتم اختيار مسافة مريحة من 0.4 ملم بين اللكمات. لتقييم البقع الأنسجة في صفوف طويلة والأعمدة غالبا ما يكون ممل، ويتم اختيار اثنين من التصاميم المختلفة. لكتل الورم مع 3 اللكمات في منطقة الأنسجة، ويتم إنشاء تصميم تحتوي على ستة أجزاء. وهذا يؤدي إلى إجمالي عدد 402 اللكمات الأنسجة. لكمات الأنسجة الطبيعية، 2 اللكمات في حالة هي التي ينبغي إدراجها. يتم اختيار وتخطيط تركيب 432 اللكمات في المجموع.

وعلاوة على ذلك، على كل حال، ما يصل إلى 4وبالإضافة إلى ذلك يمكن لكمات في النوى 0.6 ملم بها ووضعها في أنابيب 0.2 مل. كما سيتم المشروح هذه النوى الأنسجة.

لتلخيص، وسيتم إنتاج 6 ngTMAs من الأنسجة المختلفة (5 × 3 المصفوفات الورم اللكمات اكس 134 مريضا، مجموعة الأنسجة الطبيعية 1 × 2 اللكمات س 134 مريضا) بالإضافة إلى 4 النوى لكل مريض للأنابيب. أخذت معا، ستبذل 2814 شروحه.

بعد ذلك، يتم استرداد المقابلة الشرائح H & E من المرضى المختارين من الأرشيف الشريحة. يتم مراجعة كل حالة على حدة لفترة وجيزة من قبل الطبيب الشرعي ويتم اختيار معظم الشرائح تمثيلية من كل نوع الأنسجة.

المسح الضوئي

تصنع الشرائح الرقمية من كل قسم النسيجي لشرح المستقبل. لهذه الدراسة، 3-4 شرائح الأنسجة هي التي يتم مسحها ضوئيا لكل حالة، أي سرطان القولون والمستقيم الابتدائي، مع أو بدون الأنسجة المجاورة العادية، الانبثاث العقدة الليمفاوية والانبثاث الكبد وربما ليخدع شريحة إضافيةtaining الغشاء المخاطي الطبيعي.

تصل إلى 10 مجلات مختلفة يمكن تحميلها بالكامل في الشريحة الماسح الضوئي. ول250 الشرائح يمكن مسحها في شوط واحد. الوقت لمسح وحجم الشريحة الرقمية يختلف مع أبعاد الأنسجة وعامل الجودة المطلوبة. نطاقات عامل الجودة من 0 إلى 100. هنا، يتم تحديد عامل نوعية 60، لأنها تنتج حجم ملف أصغر المسح الضوئي دون أي خسارة ملحوظة من جودة المسح الضوئي. خزعات صغيرة يمكن مسحها في أقل من 30 ثانية في حين أقسام الأنسجة بأكملها، مثل تلك المستخدمة في هذا المثال قد يستغرق ما بين 2 و 10 دقيقة. حجم الشريحة الرقمية يمكن أن تتراوح أيضا من 2 ميغابايت إلى 2 غيغابايت. باستخدام عامل الجودة من 60، يمسح بين 600 MB و 1 GB يتم إنتاجها.

والمطلوب بين 402 و 536 الشرائح لهذا المشروع تبلغ 3 أشواط المسح. يتم تنفيذ كل تشغيل بين عشية وضحاها. ثمة حاجة إلى نحو 500 غيغابايت من مساحة التخزين. يتم فحص الشرائح مباشرة على منصة رقمية دعا مركز حالة (ngtma.unibe.pathcasecenter). مركز حالة يمكن الوصول إليها من أي مكان مع الوصول إلى شبكة الإنترنت عن طريق إدخال اسم المستخدم وكلمة المرور المعينة.

الشرح

عن الشرح، ينبغي النظر جانبين هما: 1) مناطق الأنسجة المختلفة ينبغي إعطاء ألوان مختلفة والشرح 2) يجب أن تعكس عدد من الشروح عدد النسخ المطلوب من ngTMA نهائي.

في هذه الحالة، تم اختيار 3 مناطق في منطقة الورم لنسخة واحدة. ل2 نسخة، يجب المشروح كل منطقة باستخدام 6 نقاط. هي مفيدة الأخضر لالأنسجة الطبيعية والأزرق للمركز الورم والأصفر للجبهة غزو الورم، والأحمر للمناطق الورم في مهدها (ورم / سدى) التفاعل، أسود لالانبثاث العقدة الليمفاوية، والفيروز لالانبثاث البعيدة والأبيض أخيرا لمناطق ليكون تستخدم الأنابيب. الشرح كل حالة تتطلب 2-3 دقائق.

البناء ngTMA

تتطلب هذه الدراسة 6 ngTMA كتل رس يتم بناؤها في 2 نسخة، مما أسفر عن 12 قطاعا النهائية. الحد الأقصى لعدد كتل المستفيدة التي يمكن دعمها من قبل arrayer هو 12. سوف تحتوي كل كتلة ورم 402 البقع الأنسجة وسوف تحتوي كل كتلة الأنسجة العادي 268 نقاط، أي ما مجموعه 4،556 البقع في جميع أنحاء المشروع بأكمله.

يتم إنشاء تخطيط TMA لكل كتلة المتلقي ويتم حفظ المشروع (أرقام 6A، 6B). 60 كتل الأنسجة يمكن تحميلها في microarrayer الأنسجة بالتوازي. يتم أخذ صورة من كل كتلة المانحة. بدءا من أول كتلة المانحة، يتم استرداد المقابلة المشروح الشريحة الرقمية من مركز حالة. يتم إجراء مطابقة الشريحة، التي يمكن أن يستغرق ما بين 1-3 دقائق. وأكد الشروح ويتم مطالبة arrayer لبدء اللكم (الشكل 7). الأساسية اللكم ونقل ما يقرب من 12 مرة في الثانية. فقدان النوى أثناء هذا الإجراء هو الحد الأدنى. الوقت الإجمالي لarraying هذا المشروع ما يقرب من 24 ساعة، بما في ذلك الوقت لسليدي / مطابقة كتلة وإعادة تحميل الصك. ويوضح بعض الأمثلة على ngTMA في الشكل 8A. ويمكن أيضا النوى للتحليل الجزيئي لاحق لكمة خارج في هذا الوقت (الشكل 8B).

الشكل 1
الشكل 1.) كتلة "المانحة". واللكم النوى من كتلة المانحة بها ونقلها إلى B) كتلة المتلقي، أو الأنسجة ميكروأري (TMA).

الشكل 2
الرقم 2. التقليدي سير العمل ميكروأري الأنسجة. A) يتم استرداد الشرائح النسيجية من الأرشيف وB) تعطى للو الطبيب الشرعي أو الاستعراض. ​​مصنوعة CD) الشروح على الشرائح تشير إلى المنطقة تقدر "للنقل. E) يتم استرداد كتل الأنسجة المقابلة. تتم مقارنة F) كتلة وشريحة لمطابقة، والتي يمكن G) تكون أحيانا مهمة صعبة. HJ يتم نقل مرارا وتكرارا) الأنسجة microarraying ثم يأخذ مكان. K) النوى والتي شيدت L) وTMA النهائي.

الرقم 3
الشكل 3.) ما يصل إلى 25 الشرائح يمكن وضعها في كل مجلة للمسح الضوئي. B) تعديلات على عامل الجودة ويمكن إجراء الحجم. يمكن رصد تقدم المسح الضوئي.

"SRC =" / الملفات / ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg "العرض =" 600 "/>
يمكن تحميل شخصية 4. A) الممسوحة ضوئيا الشرائح على منصة على شبكة الإنترنت، مركز القضية. B) الشرائح الرقمية يمكن عرضها. الأداة الشرح TMA تسمح للمستخدم لاختيار حجم ولون الأساسية اللازمة لالشرح. C) يمكن وضع الشروح مباشرة على الشريحة الرقمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5.) ما يصل إلى 60 كتل يمكن تحميلها في microarrayer الأنسجة، وهي 10 كتل المانحة لكل صف و 12 المتلقين كتل كذلك. B) صورة من كل كتلة المانحة يؤخذ والرقمية وطابيتم استرداد لتر الشريحة. يتم مطابقة كتلة والشرائح وتستخدم الشروح لكتلة اللكم. C) يمكن رصد التقدم المحرز في arraying بينما الصك واللكم. D) بعد يتم تنفيذ اللكم، وتصدير موقع كل بقعة في التخطيط ولكن كما يتم إجراء صورة كل كتلة المانحة مع الشروح المقابلة.

الرقم 6
الشكل 6. واستخدمت هذه تخطيطات TMA للarraying ألف) كتل الورم وB) الأنسجة الطبيعية.

الرقم 7
الرقم 7. قطة من البرنامج microarrayer الأنسجة. على اليسار، إعادة 12يمكن وضع كتل cipient في الصك. في القاع، تؤخذ الصور من كل كتلة المانحة. في الوسط، تخطيط TMA، وجدت على التقدم من اللكم وكذلك صور مكبرة من كل كتلة المانحة مع شروحه.

الرقم 8
الرقم 8. A) بعض الأمثلة على كتل ngTMA تم إنشاؤه حديثا. B) اللكمات النسيج إضافية يمكن اتخاذها للتحليل الجزيئي لاحق. واللكم من هذه النوى ووضعها في أنابيب 0.2 مل.

الرقم 9
الرقم 9. أمثلة على التطبيقات العلامات البيولوجية ngTMA. A) المناعية تلطيخ Ki67 في سرطان القولون والمستقيم. سعادة مزدوجةR2 المناعية / في الموقع التهجين الفحص تبين B) التعبير منخفضة من البروتين (البني) ولا التضخيم من الجين HER2 (أسود) نسبة إلى السنترومير (الحمراء)، C) التعبير عالية من البروتين (البني) وتضخيم الجين HER2 ( السوداء) نسبة إلى السنترومير (الحمراء). D) اللونية الموقع التهجين من HER2 في إظهار النصوص مرنا واحدة في سرطان الثدي ngTMA. E) المناعية لCD8 في سرطان القولون والمستقيم. F) مزدوجة صمة عار المناعية للعلامة عموم cytokeratin AE1 / AE3 (البني. الخلايا السرطانية) وCD68 (الأحمر؛ الضامة) إبراز المكروية الورم في سرطان القولون والمستقيم الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

في هذه الورقة، ويرد بروتوكول للngTMA. ngTMA هو مفهوم المنشأة حديثا لmicroarraying الأنسجة تشمل التخطيط والتصميم، وعلم الأمراض الرقمية والشرح الشريحة وكذلك النسيج الآلي microarraying 12.

مقارنة microarraying الأنسجة التقليدية، ngTMA يوفر مزايا عديدة. في الخطوة الأولى، مرحلة التخطيط والتصميم أمر بالغ الأهمية. وينصب التركيز على الإجابة على سؤال البحث المستهدفة. هذا ينبغي أن تأخذ في الاعتبار القضايا النسيجية (على سبيل المثال، التي الأقاليم وعدد البقع لا أريد أن تشمل؟)، والتخطيط الإحصائي (على سبيل المثال، حجم العينة؟ كيف يمكنني تحليل عينات بلدي وقت لاحق؟) والاعتبارات اللوجستية (على سبيل المثال، كيف العديد من المؤشرات الحيوية، وبالتالي كم عدد نسخ ngTMA؟). يتم إجراء ngTMA محددة لاحتياجات محددة، سواء كان للفحص العلامات البيولوجية والإنتاجية العالية أو يهدف إلى دراسة جوانب محددة بشأن النسيجية سوى عدد قليل من الاكاديمية المختارة جيداوفاق.

واحدة، إن لم يكن، العيب أهم من microarraying الأنسجة التقليدية هو الدقة المنخفضة التي جعلت علامات على الشرائح النسيجية. يتم إجراء دراسة الهياكل النسيجية، خلايا أو مناطق محددة من المستحيل تقريبا. ngTMA يسمح لدقة عالية لأن توضع الشروح مباشرة على الشرائح الرقمية. وهذا يسمح الباحث لتحديد بالضبط الأقاليم على أن لكمات، بما في ذلك خلايا معينة. في هذا المثال، يتم كمات المناطق المختلفة داخل نفس الكتلة من الأنسجة لarraying، مثل مركز الأورام، وأمام الغزو ومجالات التفاعل ورم / سدى أبرزها وجود مجموعات الخلايا السرطانية صغيرة أو حتى الخلايا واحد. ويمكن تحقيق هذه الدقة فقط باستخدام ngTMA. وثالثا، لأن يتم فحص الشرائح في الصعود إلى منصة رقمية على شبكة الإنترنت، مرر عرض ويمكن إجراء التأشير من خلال الكمبيوتر بدلا من المجهر. البرنامج arraying الأنسجة يوفر للمستخدم وديةويمكن تحقيق التفاعل مع درجة عالية من المرونة، وبالتالي تخطيطات مختلفة وتصميم ngTMA. منذ يتم تنفيذ البناء TMA تلقائيا بواسطة الحفر، وهناك حاجة كبيرة لينخفض ​​بشكل ملحوظ التدريب العملي على المناورة ومقدار الوقت للبناء. الوقت لبناء TMA في هذا المثال هنا هو ما بين 24 ساعة. باستخدام نهج TMA التقليدية وتقدير اللكمات في 15 ساعة، فإن هذا المشروع سيستغرق ما يقرب من 304 ساعة.

ngTMA يمكن تطبيقها لدراسة التعبير البروتين، مرنا أو DNA وكذلك مجموعات من هذه الشكل 9 يوضح العديد من هذه التطبيقات إلى المؤشرات الحيوية المحتملة. يمكن تطبيقها المناعية القياسية لتحديد مؤشر انتشار السرطان باستخدام كي 67. ويمكن استخدام نهج موحد للتحقيق في التعبير البروتين وتضخيم الحمض النووي لجينات مثل HER2. الأنسجة يمكن أن تجمع معا على ngTMA واحدة لخفض التكاليف، واستخدام الأنسجة والموارد الأخرىق. بالإضافة إلى ذلك، مرنا اللونية الموقع التهجين لHER2 وجينات أخرى يمكن أن يؤديها في تحديد النصوص مرنا واحدة في عدد كبير من الحالات باستخدام أقل عدد ممكن من شرائح الأنسجة. المناعية من علامات المناعة مثل CD8 يمكن تصور في سياق المكروية الورم. ويمكن أيضا أن تستخدم المناعية مزدوجة لتسليط الضوء على مناطق معينة من الاهتمام مثل التفاعلات بين الخلايا المناعية (المسمى باللون الأحمر) والخلايا السرطانية (المسمى في البني) في الجبهة غزو السرطان. لم يكن من الممكن القبض على هذه المنطقة ذات الاهتمام باستخدام microarraying الأنسجة التقليدية.

ومع ذلك، هذا البروتوكول يحتوي على بعض القيود. التحدي الأكثر أهمية هو التداخل بين كتلة المانحة والشرائح الرقمية. عدة عوامل يمكن أن تؤثر هذه الخطوة. أولا، ينبغي أن تستخدم أحدث قسم من كتلة لمسح الشريحة. في كثير من الحالات، H & E ليس هو القسم الأخير من كتلة المانحة، راذهص عليه هو وصمة عار المناعى أو غيرها. في هذه الحالة، أيضا شريحة الملون يمكن استخدامه طالما يتم مسح وصمة عار مشاركة وشرحها أو H & E الجديد ينبغي. وينبغي أيضا توخي الحذر عند اتخاذ أقسام الأنسجة والأنسجة قد توسع في حمام الماء مما يؤدي إلى مطابقة تحديا من الشرائح وكتلة. ثانيا، في الوقت الراهن مشاريع تقتصر على 12 كتل المتلقي TMA معالجتها في وقت واحد. يجب تعيين مشاريع أكبر تتجاوز 12 الواجبات الشهرية إلى اسم المشروع الثاني. ثالثا، يجب أن يتم الكتل المانحة باستخدام القوالب وأشرطة القياسية كأداة لا يمكن ضبط نفسها إلى أحجام مختلفة. أخيرا، يجب أن الكتل المانحة يتجاوز ارتفاع الحد الأدنى (4 مم) لتحقيق الحفر الأمثل. في بعض الحالات، وهذا يتطلب reembedding من الأنسجة.

مئات المنشورات على مدى السنوات القليلة الماضية تبرز TMA باعتبارها أداة لا تقدر بثمن لأبحاث العلامات البيولوجية. وقد استخدمت الواجبات الشهرية لدراسة الرئة 13، القولون والمستقيم الفAST 14، 15 البروستاتا والبنكرياس 16، 17 المثانة، والمعدة 18 السرطان، على سبيل المثال لا الحصر. عدد متزايد من الكتاب والجمع بين استخدام الواجبات الشهرية مع تبذل تحليل الصور وخطوات كبيرة في هذا الاتجاه 19-21. ولكن، إلى جانب حفنة من المجموعات البحثية التي نشرت أفكار مبتكرة TMA 22-24، تم إيلاء اهتمام يذكر لتحسين أسلوب TMA نفسها. microarrayers النسيج الآلي، مثل ATA-27 بواسطة Estigen / بيتشر لا توفر تصميم وتخطيط المناسب الآلي واللكم الأنسجة. لكن هذا يمثل فقط 1 جانب من جوانب مفهوم ngTMA.

ngTMA هو تحسن كبير على تقنيات microarraying الأنسجة التقليدية. وهو يتضمن خبرة في علم الأنسجة وتصميم TMA مع مرونة علم الأمراض الرقمية ودقة الشروح الرقمية مع سرعة وموثوقية الآلي البناء TMA. مزيج من ngTMوهناك وتحليل الصور لتقييم البروتين والمؤشرات الحيوية الجزيئية أن تكون أداة قوية لزيادة تحسين نوعية البحوث السريرية ومتعدية في المستقبل.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر الجهاز الفني من وحدة أبحاث بالحركة. ماري إيكونومو، خوسيه غالبان، كارولين هامر، دومينيك مولر، ليليان Schöni وفريق المعلوماتية في معهد علم الأمراض في جامعة برن.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pannoramic 250 Flash II 3DHistech Slide scanner
TMA Grandmaster 3DHistech Tissue Microarrayer
Pannoramic Viewer 3DHistech free Slide viewing software
Case Center 3DHistech Digital slide platform

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4, 844-847 (1998).
  2. Tzankov, A., Went, P., Zimpfer, A., Dirnhofer, S. Tissue microarray technology: principles, pitfalls and perspectives--lessons learned from hematological malignancies. Exp Gerontol. 40, 737-744 (2005).
  3. Barlund, M., et al. Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis. J Natl Cancer Inst. 92, 1252-1259 (2000).
  4. Bubendorf, L., et al. Survey of gene amplifications during prostate cancer progression by high-throughout fluorescence in situ hybridization on tissue microarrays. Cancer Res. 59, 803-806 (1999).
  5. Garcia-Caballero, T., et al. Dual-colour CISH is a reliable alternative to FISH for assessment of topoisomerase 2-alpha amplification in breast carcinomas. Breast Cancer Res Treat. 81-89 (2014).
  6. Schraml, P., et al. Tissue microarrays for gene amplification surveys in many different tumor types. Clin Cancer Res. 5, 1966-1975 (1999).
  7. Zlobec, I., et al. Role of RHAMM within the hierarchy of well-established prognostic factors in colorectal cancer. Gut. 57, 1413-1419 (2008).
  8. Hsu, F. D., et al. Tissue microarrays are an effective quality assurance tool for diagnostic immunohistochemistry. Mod Pathol. 15, 1374-1380 (2002).
  9. Marin, C., et al. Detection of BRAF p.V600E Mutations in Melanoma by Immunohistochemistry Has a Good Interobserver Reproducibility. Arch Pathol Lab Med. 71-75 (2014).
  10. Polley, M. Y., et al. An International Ki67 Reproducibility Study. J Natl Cancer Inst. 1897-1906 (2013).
  11. Zlobec, I., Terracciano, L., Jass, J. R., Lugli, A. Value of staining intensity in the interpretation of immunohistochemistry for tumor markers in colorectal cancer. Virchows Arch. 451, 763-769 (2007).
  12. Zlobec, I., Koelzer, V. H., Dawson, H., Perren, A., Lugli, A. Next-generation tissue microarray (ngTMA) increases the quality of biomarker studies: an example using CD3, CD8, and CD45RO in the tumor microenvironment of six different solid tumor types. J Transl Med. 11, 104 (2013).
  13. Yoshida, A., et al. Immunohistochemical detection of ROS1 is useful for identifying ROS1 rearrangements in lung cancers. Mod Pathol. 711-720 (2014).
  14. Droeser, R., et al. Differential pattern and prognostic significance of CD4+, FOXP3+ and IL-17+ tumor infiltrating lymphocytes in ductal and lobular breast cancers. BMC Cancer. 12, 134 (2012).
  15. Fleischmann, A., et al. Androgen receptors are differentially expressed in Gleason patterns of prostate cancer and down-regulated in matched lymph node metastases. Prostate. 71, 453-460 (2011).
  16. Wang, T., et al. Pattern of breast cancer susceptibility gene 1 expression is a potential prognostic biomarker in resectable pancreatic ductal adenocarcinoma. Pancreas. 42, 977-982 (2013).
  17. Fleischmann, A., Rotzer, D., Seiler, R., Studer, U. E., Thalmann, G. N. Her2 amplification is significantly more frequent in lymph node metastases from urothelial bladder cancer than in the primary tumours. Eur Urol. 60, 350-357 (2011).
  18. Zhang, Z. Q., et al. Identification of Annexin A1 protein expression in human gastric adenocarcinoma using proteomics and tissue microarray. World J Gastroenterol. 19, 7795-7803 (2013).
  19. Chaux, A., et al. The epidermal growth factor receptor is frequently overexpressed in penile squamous cell carcinomas: a tissue microarray and digital image analysis study of 112 cases. Hum Pathol. 44, 2690-2695 (2013).
  20. McKenna, S. J., Amaral, T., Akbar, S., Jordan, L., Thompson, A. Immunohistochemical analysis of breast tissue microarray images using contextual classifiers. J Pathol Inform. 4, S13 (2013).
  21. Pages, F., et al. Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer. N Engl J Med. 353, 2654-2666 (2005).
  22. Komiya, A., et al. Application of a new technique, spiral tissue microarrays constructed using needle biopsy specimens, to prostate cancer research. Int J Oncol. 44, 195-202 (2014).
  23. Quintayo, M. A., et al. Virtual tissue microarrays: A novel and viable approach to optimising tissue micro-arrays for biomarker research applied to Ductal Carcinoma in Situ (DCIS). Histopathology. 2-8 (2014).
  24. Torata, N., et al. Tissue tablet method: an efficient tissue banking procedure applicable to both molecular analysis and frozen tissue microarray. Hum Pathol. 45, 143-152 (2014).
الجيل المقبل من الأنسجة ميكروأري (ngTMA) بروتوكول للدراسات العلامات البيولوجية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).More

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter