Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

En næste-generations Tissue Microarray (ngTMA) Protokollen til biomarkør Studies

doi: 10.3791/51893 Published: September 23, 2014

Summary

Protokollen har til formål at optimere konstruktionen og kvaliteten af ​​væv microarrays til biomarkør forskning. Det omfatter aspekter af planlægning og design, digital patologi, virtuel dias kommentering, og automatiseret væv opstillingsindretningen.

Abstract

Biomarkør forskning bygger på væv mikroarrays (TMA). TMA'erne produceres ved gentagen overførsel af små væv kerner fra en "donor" blokken i en "modtager" blok og derefter anvendes til en bred vifte af biomarkør applikationer. Opførelsen af ​​konventionelle TMA'erne er arbejdskrævende, upræcise, og tidskrævende. Her er en protokol ved hjælp af næste generation Tissue Microarrays (ngTMA) skitseres. ngTMA er baseret på TMA planlægning og design, digital patologi og automatiseret væv microarraying. Protokollen er illustreret ved hjælp af et eksempel på 134 metastatiske kræftpatienter kolorektal. Histologiske, statistiske og logistiske aspekter i betragtning, såsom den vævstype, specifikke histologiske regioner og celletyper til optagelse i TMA, antallet af væv pletter, stikprøvestørrelse, statistisk analyse, og antallet af TMA eksemplarer. Histologiske dias for hver patient bliver scannet og uploadet på en web-baseret digital platform. Der er de ses og annotated (markeret) med en diameter på værktøj 0,6-2,0 mm, flere gange med forskellige farver til at skelne vævsområder. Donor blokke og 12 »modtager« blokke er indlæst i instrumentet. Digitale dias hentes og matches til donorblokken billeder. Gentagen opstillingsindretningen af ​​kommenterede regioner udføres automatisk resulterer i en ngTMA. I dette eksempel er seks ngTMAs planlagt indeholdende seks forskellige vævstyper / histologiske zoner. To eksemplarer af de ngTMAs ønskes. Tre til fire dias for hver patient scannes; 3 SCAN løber er nødvendig og udført natten. Alle objektglas kommenteret; forskellige farver bruges til at repræsentere de forskellige væv / zoner, nemlig tumor center, invasion foran, tumor / stroma, lymfeknudemetastaser, levermetastaser, og normalt væv. 17 anmærkninger / tilfælde er lavet; tid til anmærkning 2-3 min / sag. 12 ngTMAs produceres indeholdende 4.556 pletter. Gruppering tid er 15-20 timer. På grund af sin præcision, fleksibilitet og hastighed, ngTMA er en kraftfuldredskab til yderligere at forbedre kvaliteten af ​​TMA'erne anvendes i klinisk og translationel forskning.

Introduction

I løbet af de sidste to årtier, har væv mikroarrays (TMAS) havde en bemærkelsesværdig indflydelse på biomarkør efterforskning undersøgelser. TMA'erne er hovedsagelig væv "arkiver" fremstillet ved gentagen overførsel af små væv kerner, typisk varierer i størrelse fra 0,6 til 2,0 mm i diameter, fra paraffin indlejret "donor" blokke i en enkelt TMA »modtager« blok (Figur 1) 1. Ved hjælp af en lille kerne størrelse, kan cirka 500 forskellige væv pletter fra få eller mange forskellige patienter grupperes i en TMA 2.

Brugen af ​​TMA'erne for prognostiske eller prædiktive biomarkør studier har mange fordele. Betragt eksemplet, hvor ekspression af et protein biomarkør ved immunhistokemi skal evalueres på 450 patienter. Snarere end at udføre 450 immunhistokemiske pletter på 450 patient objektglas sektionerede fra det samme antal blokke, kan små kerner fra hver prøve grupperes på en enkelt TMA blok. Selv om flere kerner er taget fra hver enkelt patient, fremstilles et minimum antal af blokke. Dette har den store effekt på drastisk faldende omkostninger og andre ressourcer samt reducere vævsspild. Derudover dette tillader passende drevne undersøgelser under anvendelse af en lang række væv, der skal vurderes under de samme eksperimentelle betingelser.

TMA'erne har mange forskellige anvendelser. For eksempel kan de anvendes til at undersøge morfologien proteinekspression, RNA-ekspression og DNA aberrationer efter farvning med forskellige farvestoffer eller efter immunhistokemi eller kromogen og endda fluorescens in situ hybridisering 3-7. Nylige undersøgelser har også brugt TMA'erne at teste intra og interkalibrering variation i farvningsprotokoller etablere specificitet eller sensitivitet af antistoffer til specifikke genmutationer, og at bestemme interobserver reproducerbarhed af protein udtryk i internationale samarbejder

Opførelsen af traditionelle TMA'erne hjælp patient-deriverede væv er en lang multi trin procedure (figur 2). Det begynder med en søgning efter mulige relevante tilfælde og udvælgelse af diagnostiske slides fra arkiverne på et institut for patologi, eller andet institut, hvorfra de skal hentes. Patologen evaluerer hvert dias pr sag og vælger den mest repræsentative dias i forbindelse med undersøgelsen. Dernæst regionen af ​​interesse markeret ved hjælp af en pen direkte under mikroskop. Dette er ofte udfordrende og upræcise og resulterer kun i en "vurdering" af hvor væv slag skal tages fra. Næste hentes, paraffinblokkene svarer til disse markerede dias fra arkivet. En hurtig sammenligning mellem blok og slide er lavet. Ved hjælp af en semi-automatiseret eller hjemmelavet væv arrayer er donorblokken udstanset i det anslåede område af interesse og overføres til en modtager TMA blok. Konstruktion af TMA'erne bruge denne Opstillingsindretningen teknik er arbejdskrævende, tidskrævende, upræcise og ufleksible. Forberedelse af en TMA af 475 pladser i 3 eksemplarer skønnes at tage omkring 84 timers arbejde.

En ny tilgang til opførelsen af TMA'erne nylig blev indført ved Patologisk Institut, University of Bern, der bygger på tre elementer: planlægning og design (eller rådgivning), digital patologi kombineret med ekspertise i histologi og automatiseret TMA arraying 12. Tilsammen er dette koncept kaldet næste generation Tissue Microarray (ngTMA). Nedenfor er en protokol til ngTMA beskrives ud fra et eksempel med 134 patienter med metastatisk kolorektal cancer. Her primære tumorer samt lymfeknudemetastaser og levermetastaser skal klædt i ngTMAs til efterfølgende biomarkør analyse. Derudover er små væv kerner fra hver patient ønskes til fremtidig nukleinsyre ekstraktion.

Protocol

BEMÆRK: Denne undersøgelse er blevet godkendt af den lokale etiske udvalg i Insel Hospital, Bern, Schweiz (07-10-13). Væv blev opnået fra Tumor Bank Bern, Patologisk Institut, University of Bern.

1. Planlægning og Design (Consulting)

  1. Tænk på forskning spørgsmål, der skal besvares. Beslut om vævstyper, der skal indgå i projektet. Bestemme, hvad histologiske strukturer er vigtigt at besvare spørgsmålet.
  2. Derefter bestemmes den mest egnede kerne diameter og antallet af kerner per patient for projektet. Beslut om antallet af kopier af den næste generation af Tissue Micro Array (ngTMA) baseret på mængden af ​​biomarkører, der skal undersøges.
  3. Overvej statistiske aspekter såsom stikprøvestørrelse og analyse efter det væv microarray (TMA) er konstrueret. Bestem antallet af patienter til inklusion i studiet og etablere kontrol væv til array.
  4. Hent den histologiske (ellerdiagnostisk) Hæmatoxylin og eosin (H & E) lysbilleder af hver patient. Gennemgå kort dias og identificere dem, der indeholder relevant information og histologi for projektet.
    BEMÆRK: Gør nye dele af paraffinblokke, hvis der ønskes en særlig farve eller immunhistokemi dias til dias scanning og kommentering, i stedet for H & E dias

2. Skub Scanning

  1. Tænd PC og dias scanner og åben scanning software. Vælg "automatisk mode" til lyse felt scanning fra preview-skærmen.
  2. Klik på "Scan indstillinger" for at justere slide kvalitetsparametre. På dette tidspunkt, skal du vælge, om objektglassene at være direkte scannes til den digitale platform tilgængelig via nettet eller på et lokalt drev (eller eksternt drev) og indstille de typer af scanning og antal fokuspunkter.
  3. Klik på "Server parametre" for at scanne til den "sag center". På dette trin, tilføje flere magasiner, mærke alle dias og sætmappen i sag Center, hvor dias skal gemmes. Hvert magasin kan indeholde op til 25 dias.
  4. Kontrollér kvalitet / renholdelse af faktiske histologiske dias til scanning. Rengør om nødvendigt lysbilleder med 70% ethanol.
  5. Læg op til 25 dias pr magasin med etiketterne peger indad (figur 3A)
  6. Anbring bladet i scanneren. For mere end et magasin, skal du placere dem oven på hinanden.
  7. Begynde at scanne dias ved at klikke på den grønne pil (figur 3B). Når alle dias er scannet, aflæsse magasiner og slukke programmet PC og dias scanner.

3. Digitalt Slide annotation

  1. Indtast browserens adresselinje til digital slide management center og downloade den gratis digitale slide viewer-software.
  2. Åbn den digitale dias Viewer-softwaren, og vælg den mappe, der indeholder de digitale dias (figur 4A).
  3. Tilføj noter, omarrangere og styre Digital dias mappe eller tildele brugerrettigheder til kolleger eller føje vedhæftede filer til mappen.
  4. Klik på ønskede digitale dias, som vises i digitale dias fremviser.
  5. Ved hjælp af forstørrelse værktøj, evaluere dias og finde de områder af interesse for integration i ngTMA.
  6. Ved hjælp af 'TMA annotation værktøj «, vælge størrelsen på den ønskede kerne og farve anmærkning. Placer anmærkning på det digitale dias ved at klikke på det (Figur 4B).
  7. Flyt anmærkning til de ønskede histologiske strukturer til inkorporering i ngTMA (figur 4C).
  8. Gentag denne proces med anmærkning igen ved at bruge annotation værktøj, vælge en kerne størrelse og en ønsket anmærkning farve. Gentag dias visning og kommentering på alle dias i mappen.
  9. Alternativt kan placere væv borekerner til PCR i 0,2 ml rør snarere end integration i TMA. Anmærke objektglas ved hjælp af en anden farve til at identificeredisse pletter til yderligere molekylær analyse.
  10. Opret en liste over alle sager med deres tilsvarende anmærkninger og farver.

4. Tissue Microarray Byggeri

  1. Hent de tilsvarende paraffin vævsblokke for alle kommenterede digitale dias, sortere blokke i den ønskede rækkefølge for vævs microarraying.
  2. Sørg for, at vævsblokke har minimum 4 mm tykkelse. Hvis ikke, er det nødvendigt reembedding af væv.
  3. Tænd for pc'en "ON" og automatiseret væv microarrayer instrument. Åbn væv microarrayer software og give et navn til projektet
  4. Udfør en "Tool Change" og vælg den ønskede værktøjsdiameteren for projektet (dvs. 0,6, 1,0, 1,5 eller 2,0 mm).
  5. Læg op til 12 'modtager' TMA blokke ned i maskinen. Giv et id til hver af de 12 blokke
  6. Opret en TMA layout for hver modtager blok. Overhold en TMA design med antallet af rækker, søjler, og træde i stedet fory linjer samt afstanden mellem kerner. Opret et nyt layout for hver modtager blok eller bruge det samme layout gentagne gange.
  7. Placer markøren på modtagerens blok layout til at tage den første kerne.
  8. Dernæst lægge op til 60 donorblokke ind i vævet microarrayer (figur 5A). Placer ti blokke i hver række A til F. Giv hver blok en donor-id. Observere billeder af hver enkelt donor blok på computerskærmen automatisk erhvervet af vævet microarrayer.
  9. Fra og med den første blok, skal du klikke på "Slide". Observer kommenteret digitale dias gemt i den digitale slide management center (eller på det eksterne drev) bruger den digitale dias fremviser. Se billedet af donorblokken og den digitale slide side-by-side.
  10. Vælg referencepunkter på blokken billedet for at lægge donorblokken billedet med den digitale dias
  11. Når du har klikket på "Næste", observere anmærkninger på et større billede af blokken. (Figur 5B </ Strong>). Klik på toppen af ​​anmærkninger for at bekræfte og klikke på "Start".
    BEMÆRK: Dette foranlediger væv microarrayer at starte boring af et hul på 0,6 mm i diameter i modtagerblokken på det valgte udgangspunkt. Så i et andet trin, ved hjælp af stanseværktøjet, instrumentet punches hul i vævet fra den valgte donor blok på det nøjagtige kommenteret og bekræftet region. Kerner overføres derefter fra donor til modtager blok.
  12. Efter cirka 500 kerner, rense boret og stanseværktøjet ved hjælp af en vatpind af xylen.
  13. Hvis der ønskes væv kerner (snarere end slag til en ngTMA), klik på "PCR" værktøj for blokken, bekræfter op til 4 annotationer og klik på "Start". Dette vil slå og overføre kernerne i et 0,2 ml rør.
  14. Gentag punkt 4,9-4,11 med den anden donorblokken, og så videre.
  15. Efter at have brugt alle donorblokkene, indtaste en anden runde af donorblokke (61-120) i vævet microarrayis og fortsætte trin 4,8-4,11.
  16. Opdater donor og modtager blok billeder, mens projektets fremdrift, mens boring og stansning forekommer (figur 5C).
  17. Udfør en "Eksporter", når projektet er afsluttet. Find .xslx fil med donoren og modtageren blok-id'er, lokalisering af alle slag i TMA samt TMA layout / design, i den eksporterede mappe. Gem alle donorblokken billeder med alle overlejret anmærkning som JPG-billeder i den eksporterede mappe (figur 5D). Den endelige TMA blok er derefter klar.

Representative Results

Planlægning og design

Her eksempel 134 patienter med metastatisk kolorektal cancer, der undersøges for en bestemt række af biomarkører blev anvendt. Ikke alene er en ngTMA planlagt for disse patienter, men DNA-ekstraktion efterfulgt af mutationsanalyse for nogle specificeret gen.

Under planlægningen og projekteringen af ​​ngTMA er følgende aspekter blevet besluttet. Fra hver patient, vil 6 forskellige histologiske regioner undersøges: tumor center, tumorinvasion foran, områder tætteste tumor spirende (tumor / stroma interaktion), normale væv, lymfeknudemetastaser og levermetastaser. Tre tumor pletter pr tumorvæv område og to normale væv pletter skal indgå i projektet (n = 17 pladser per patient). Da det er planen, at mere end 50 biomarkører undersøges på denne patient materiale, der er to kopier af den endelige ngTMA ønskes. På grund af den mulige lille størrelse lymfeknude og afstande frat metastaser, er en lille kerne diameter på 0,6 mm for TMA konstruktion for alle væv valgt.

Derudover er det planen, at hver region separat klædt, så 6 ngTMAs indeholder forskellige histologiske områder vil blive produceret: en ngTMA med væv fra a) tumor center, b) invasion foran, c) tumor spirende områder, d) normale væv e) lymfeknudemetastaser, og f) levermetastaser.

For TMA design ved hjælp af en 0,6 mm værktøj, vil en komfortabel afstand på 0,4 mm mellem slag vælges. Da evalueringen af ​​væv pletter i lange rækker og kolonner er ofte trættende, er to forskellige design valgt. For tumorblokke med 3 slag pr vævsareal er et design, der indeholder seks dele oprettet. Dette fører til et samlet antal på 402 væv slag. For normale væv slag, 2 slag per sag skal indgå. Et layout montering 432 slag i alt vælges.

Desuden er der for hvert enkelt tilfælde op til 4kerner på 0,6 mm, vil desuden blive udstanses og anbringes i 0,2 ml rør. Disse væv kerner vil også blive kommenteret.

For at opsummere, vil 6 ngTMAs af forskellige væv produceres (5 tumor arrays x 3 slag x 134 patienter; 1 normal vævsarray x 2 slag x 134 patienter) i tillæg til 4 kerner per patient for rør. Taget sammen, vil 2814 annotationer blive foretaget.

Næste hentes, de tilsvarende H & E slides fra udvalgte patienter fra slide arkivet. Hver sag er kort gennemgået af en patolog og mest repræsentative lysbilleder af hver vævstype er valgt.

Scanning

Digitale lysbilleder af hvert histologisk snit er lavet til fremtidig anmærkning. Til denne undersøgelse, 3-4 væv dias skal scannes pr sag, dvs primær kolorektal cancer, med eller uden tilstødende normale væv, lymfeknudemetastaser og levermetastaser og eventuelt en ekstra dias conTaining normal slimhinde.

Op til 10 forskellige magasiner kan fuldt lastet på slide scanner; derfor 250 dias kan scannes i en enkelt løb. Tid til scanning og digital diasstørrelse varierer med dimensionerne af vævet og kvalitetsfaktor ønskes. Kvalitetsfaktoren går fra 0 til 100. Her er en kvalitet faktor 60 valgt, da det giver en mindre scanning filstørrelse uden nogen mærkbar tab af scanning kvalitet. Små biopsier kan scannes på under 30 sek, mens hele vævssnit, som dem der bruges i dette eksempel kan tage mellem 2 og 10 minutter. Digital diasstørrelse kan også variere fra 2 MB til 2 GB. Ved hjælp af en kvalitet faktor 60, scanner mellem 600 MB og 1 GB er produceret.

Der kræves mellem 402 og 536 slides til dette projekt på i alt 3 Scanning kører. Hver kørsel udføres natten over. Ca. 500 GB lagerplads er nødvendig. Slides scannes direkte på en digital platform kaldet Case Center (ngtma.unibe.pathcasecenter). Sag Center er tilgængelig fra alle steder med adgang til internettet ved at indtaste den udpegede brugernavn og adgangskode.

Annotation

For anmærkning skal to aspekter tages i betragtning: 1) forskellige væv områder bør gives forskellige annotation farver og 2) antallet af anmærkninger bør afspejle antallet af ønskede kopier af den endelige ngTMA.

I dette tilfælde er der udvalgt 3 steder pr tumor område for en enkelt kopi. For 2 eksemplarer skal hver region påtegnes med 6 pletter. Nyttig er grøn for normalt væv, blå for tumor centrum, gul for tumorinvasion foran, rød for områder af tumor spirende (tumor / stroma) interaktion, sort til lymfeknudemetastaser, turkis for fjernmetastaser og endelig hvide regionerne skal være anvendes til rør. Annotation af hver enkelt sag kræver 2-3 min.

ngTMA Byggeri

Denne undersøgelse kræver 6 ngTMA blokke to være konstrueret i 2 eksemplarer, hvilket resulterer i 12 afsluttende blokke. Det maksimale antal modtagende blokke, der kan understøttes af arrayer er 12. Hver tumor blok vil indeholde 402 væv pletter og hver normale væv blok vil indeholde 268 pladser, i alt 4.556 pladser på tværs af hele projektet.

En TMA layout er skabt for hver modtager blok og projektet gemmes (6A, 6B). 60 vævsblokke kan indlæses i vævet microarrayer parallelt; et billede af hver enkelt donor blok er taget. Fra og med den første donor blok, hentes den tilsvarende kommenteret digitale dias fra sag Center. Skub matching udføres, hvilket kan tage mellem 1-3 minutter. Anmærkninger told, og arrayer er bedt om at starte stansning (Figur 7). Core stansning og transfer tid er ca 12 sek. Tab af kerner under denne procedure er minimal. Samlet tid til at gruppere dette projekt er ca 24 timer, inklusive tid til SLIde / blok matching og lastning af instrumentet. Nogle eksempler på ngTMA er illustreret i figur 8A. Kerner til efterfølgende molekylær analyse kan også udstanses på dette tidspunkt (figur 8B).

Figur 1
Figur 1. A) en "donor" blok. Kerner fra donorblokken udstanses og overføres til B) en modtagerblokken eller væv microarray (TMA).

Figur 2
Figur 2. Den konventionelle væv microarray arbejdsgang. A) hentes Histologiske dias fra arkivet og B) givet til patologen f eller revision. CD) Tilføjelser bliver lavet på de dias, der angiver »anslået« region for overførsel. E) De tilsvarende vævsblokke hentes. F) Blok og dias sammenlignes til matchning, hvilket kan G) undertiden være en udfordrende opgave. HJ ) Tissue microarraying derefter finder sted. K) kerner gentagne gange overført og L) en endelig TMA er konstrueret.

Figur 3
Figur 3. A) Op til 25 dias kan placeres i hvert magasin til scanning. B) Regulering til kvaliteten faktor og størrelse kan foretages. Kan overvåges Skanningsstatus.

"Src =" / filer / ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 4. A) scannede dias kan uploades til web-baseret platform, sag Center. B) Digitale slides kan ses. TMA annotation værktøj giver brugeren mulighed for at vælge den kerne størrelse og farve er nødvendig for anmærkning. C) Annotationer kan placeres direkte på den digitale dias. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. A) Op til 60 blokke, kan indlæses i vævet microarrayer, nemlig 10 donorblokke pr række og 12 modtagere blokke så godt. B) Et billede af hver enkelt donor blok er taget, digital dias hentes. Matching af blok og dias er gjort, og annotationer bruges til blok stansning. C) kan overvåges fremskridt opstillingsindretningen mens instrumentet stansning. D) Efter stansning er udført, en eksport af placeringen af hver plet i layoutet, men også et billede af hver enkelt donor blok med tilhørende anmærkninger er foretaget.

Figur 6
Figur 6. Disse TMA layout blev brugt til at gruppere de A) tumorblokke og B) normale væv.

Figur 7
Figur 7. Skærmbillede af vævet microarrayer softwaren. Til venstre, 12 retageren blokke kan placeres i instrumentet. På bunden er der billeder af hver donor blok taget. I centrum, TMA layout, er forløbet af stansning samt forstørrede billeder af hver enkelt donor blok med anmærkninger fundet.

Figur 8
Figur 8. A) Nogle eksempler på nyoprettede ngTMA blokke. B) yderligere væv slag kan tages for efterfølgende molekylær analyse. Disse kerner udstanses og anbragt i 0,2 ml rør.

Figur 9
Figur 9. Eksempler på ngTMA biomarkør applikationer. A) Immunohistokemi farvning af Ki67 i kolorektal cancer. Dual HER2 immunhistokemi / in situ-hybridiseringsassay, der viser B) lav ekspression af protein (brun) og ingen amplifikation af HER2 genet (sort) i forhold til centromeren (rød), C) høj ekspression af proteinet (brun) og amplifikation af HER2 genet ( sort) i forhold til centromer (rød). D) Chromogen in situ-hybridisering af Her2 viser enkelt mRNA-transkripter i brystkræft ngTMA. E) Immunohistokemi for CD8 i tyktarmskræft. F) Dobbelt immunhistokemi pletten for fælleseuropæiske cytokeratin markør AE1 / AE3 (brun, tumorceller) og CD68 (rød;. Makrofager), der fremhæver tumormikromiljøet i kolorektal cancer Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I dette papir, er en protokol til ngTMA skitseret. ngTMA er et nyetableret koncept for væv microarraying involverer planlægning og design, digital patologi og dias kommentering samt automatiseret væv microarraying 12.

Sammenlignet med konventionel væv microarraying, ngTMA byder på mange fordele. I et første trin, planlægning og projektering fase er kritisk. Der er fokus på at besvare en målrettet forskning spørgsmål. Dette bør tage hensyn til de histologiske emner (f.eks, hvilke regioner og hvor mange pletter ønsker jeg at indeholde?), Den statistiske planlægning (f.eks prøve størrelse? Hvordan kan jeg analyserer mine prøver senere?) Og logistiske overvejelser (fx hvordan mange biomarkører og dermed hvor mange ngTMA kopier?). Et specifikt ngTMA er lavet til specifikke behov, uanset om det er for biomarkør screening og højt gennemløb eller beregnet til at undersøge specifikke histologiske aspekter på kun få godt valgt cases.

En, hvis ikke den vigtigst ulempe ved konventionel væv microarraying er den lave nøjagtighed, hvormed markeringer på de histologiske rutschebaner fremstilles. Studiet af specifikke histologiske strukturer, celler eller områder gøres næsten umuligt. ngTMA muliggør høj nøjagtighed fordi anmærkninger placeres direkte på de digitale dias. Dette gør det muligt for forskeren at netop vælge de regioner, der kan stanses, herunder særlige celler. I dette eksempel er forskellige områder inden for samme vævsblok udstanset til gruppering, såsom tumor centrum, invasionen foran og områder af tumor / stroma interaktion fremhævet af tilstedeværelsen af ​​små tumor celleklynger eller endda enkelte celler. Denne nøjagtighed kan kun opnås ved hjælp af ngTMA. For det tredje fordi dias scannes på en web-baseret digital platform, glide visning og indsætning af kommentarer kan ske via computeren end med mikroskopet. Vævet opstillingsindretningen software giver en brugervenliggrænseflade med en høj grad af fleksibilitet, således forskellige layouts og design ngTMA kan opnås. Da TMA konstruktion udføres automatisk ved boring, er der ikke meget behov for hands-on manøvrering og mængden af ​​tid til byggeri er reduceret betydeligt. Tiden for TMA byggeri i dette eksempel her er mellem 24 timer. Ved hjælp af en konventionel TMA tilgang og estimering 15 slag per time, ville dette projekt tage cirka 304 timer.

ngTMA kan anvendes til at studere protein-ekspression mRNA eller DNA såvel som kombinationer af disse. Figur 9 viser flere af disse ansøgninger til potentielle biomarkører. Standard immunhistokemi kan anvendes til at bestemme proliferationsindeks af cancere under anvendelse af Ki-67. Kan anvendes en kombineret tilgang til at undersøge protein-ekspression og DNA forstærkning for gener, såsom HER2. Væv kan samles på en enkelt ngTMA at reducere omkostningerne, brug væv og andre ressourcepersonersek. Desuden kan kromogent mRNA in situ-hybridisering til HER2, og andre gener udføres for at identificere en enkelt mRNA-transkripter i en lang række tilfælde anvender et minimalt antal væv lysbilleder. Immunhistokemi immune markører, såsom CD8 kan visualiseres i forbindelse tumormikromiljøet. Dobbelt immunhistokemi kan også bruges til at fremhæve bestemte områder af interesse såsom samspillet mellem immunceller (mærket med rødt) og tumorceller (mærket i brun) ved invasionen forsiden af ​​kræft. En sådan et område af interesse kunne ikke være blevet taget med konventionel væv microarraying.

Ikke desto mindre denne protokol indeholder nogle begrænsninger. Den vigtigste udfordring er overlapningen mellem donor blok og digital dias. Adskillige faktorer kan påvirke dette trin. For det første bør der anvendes den nyeste afsnit fra blokken for dias scanning. I mange tilfælde, H & E er ikke den sidste sektion af donorblokken rather er en immunhistokemisk eller anden farve. I dette tilfælde også en farvede objektglas kan anvendes, så længe den sidste pletten scannes og kommenteret eller en ny H & E skal foretages. Man skal også træffes, når vævssnit bliver lavet som væv, kan ekspandere i vandbad, som fører til udfordrende matchning af dias og blok. For det andet, i øjeblikket projekter er begrænset til 12 modtagerlande TMA blokke behandles på en enkelt gang. Større projekter, der overstiger 12 TMA'erne skal overdrages til et andet projekt navn. For det tredje skal donorblokkene gøres ved hjælp af faste forme og kassetter som instrumentet kan ikke tilpasse sig til forskellige størrelser. Endelig skal donorblokke overstige den minimale højde (4 mm) for at opnå optimal boring. I nogle tilfælde kræver dette reembedding af væv.

Hundredvis af publikationer i de sidste par år, fremhæver TMA som et uvurderligt værktøj for biomarkør forskning. TMA'erne er blevet brugt til at studere lunge 13, kolorektal 7 breast 14, prostata 15, bugspytkirtel 16, blære 17, og gastriske 18 cancer, for at nævne et par stykker. Et stigende antal forfattere har kombineret brugen af TMA'erne med billedanalyse og betydelige fremskridt der gøres i denne retning 19-21. Men ved siden af en håndfuld af forskergrupper, der har offentliggjort innovative TMA idéer 22-24, lidt opmærksomhed er givet til at optimere TMA teknikken selv. Automatiserede væv microarrayers såsom ATA-27 ved Estigen / Beecher gør giver layout design og hensigtsmæssigt og automatiseret væv stansning. Dette udgør dog kun 1 aspekt af ngTMA konceptet.

ngTMA er en væsentlig forbedring i forhold til konventionelle væv microarraying teknikker. Det inkorporerer ekspertise i histologi og design TMA med fleksibiliteten i digital patologi og præcision af digitale anmærkninger med den hastighed og pålidelighed af automatiserede TMA konstruktion. Kombinationen af ​​ngTMA og billedanalyse til evaluering af protein og molekylære biomarkører vil være et effektivt redskab til yderligere at forbedre kvaliteten af ​​den kliniske og translationel forskning i fremtiden.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke teknisk personale af Translationel Research Unit; Mary Economou José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni og Informatik Team på Patologisk Institut, University of Bern.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pannoramic 250 Flash II 3DHistech Slide scanner
TMA Grandmaster 3DHistech Tissue Microarrayer
Pannoramic Viewer 3DHistech free Slide viewing software
Case Center 3DHistech Digital slide platform

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4, 844-847 (1998).
  2. Tzankov, A., Went, P., Zimpfer, A., Dirnhofer, S. Tissue microarray technology: principles, pitfalls and perspectives--lessons learned from hematological malignancies. Exp Gerontol. 40, 737-744 (2005).
  3. Barlund, M., et al. Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis. J Natl Cancer Inst. 92, 1252-1259 (2000).
  4. Bubendorf, L., et al. Survey of gene amplifications during prostate cancer progression by high-throughout fluorescence in situ hybridization on tissue microarrays. Cancer Res. 59, 803-806 (1999).
  5. Garcia-Caballero, T., et al. Dual-colour CISH is a reliable alternative to FISH for assessment of topoisomerase 2-alpha amplification in breast carcinomas. Breast Cancer Res Treat. 81-89 (2014).
  6. Schraml, P., et al. Tissue microarrays for gene amplification surveys in many different tumor types. Clin Cancer Res. 5, 1966-1975 (1999).
  7. Zlobec, I., et al. Role of RHAMM within the hierarchy of well-established prognostic factors in colorectal cancer. Gut. 57, 1413-1419 (2008).
  8. Hsu, F. D., et al. Tissue microarrays are an effective quality assurance tool for diagnostic immunohistochemistry. Mod Pathol. 15, 1374-1380 (2002).
  9. Marin, C., et al. Detection of BRAF p.V600E Mutations in Melanoma by Immunohistochemistry Has a Good Interobserver Reproducibility. Arch Pathol Lab Med. 71-75 (2014).
  10. Polley, M. Y., et al. An International Ki67 Reproducibility Study. J Natl Cancer Inst. 1897-1906 (2013).
  11. Zlobec, I., Terracciano, L., Jass, J. R., Lugli, A. Value of staining intensity in the interpretation of immunohistochemistry for tumor markers in colorectal cancer. Virchows Arch. 451, 763-769 (2007).
  12. Zlobec, I., Koelzer, V. H., Dawson, H., Perren, A., Lugli, A. Next-generation tissue microarray (ngTMA) increases the quality of biomarker studies: an example using CD3, CD8, and CD45RO in the tumor microenvironment of six different solid tumor types. J Transl Med. 11, 104 (2013).
  13. Yoshida, A., et al. Immunohistochemical detection of ROS1 is useful for identifying ROS1 rearrangements in lung cancers. Mod Pathol. 711-720 (2014).
  14. Droeser, R., et al. Differential pattern and prognostic significance of CD4+, FOXP3+ and IL-17+ tumor infiltrating lymphocytes in ductal and lobular breast cancers. BMC Cancer. 12, 134 (2012).
  15. Fleischmann, A., et al. Androgen receptors are differentially expressed in Gleason patterns of prostate cancer and down-regulated in matched lymph node metastases. Prostate. 71, 453-460 (2011).
  16. Wang, T., et al. Pattern of breast cancer susceptibility gene 1 expression is a potential prognostic biomarker in resectable pancreatic ductal adenocarcinoma. Pancreas. 42, 977-982 (2013).
  17. Fleischmann, A., Rotzer, D., Seiler, R., Studer, U. E., Thalmann, G. N. Her2 amplification is significantly more frequent in lymph node metastases from urothelial bladder cancer than in the primary tumours. Eur Urol. 60, 350-357 (2011).
  18. Zhang, Z. Q., et al. Identification of Annexin A1 protein expression in human gastric adenocarcinoma using proteomics and tissue microarray. World J Gastroenterol. 19, 7795-7803 (2013).
  19. Chaux, A., et al. The epidermal growth factor receptor is frequently overexpressed in penile squamous cell carcinomas: a tissue microarray and digital image analysis study of 112 cases. Hum Pathol. 44, 2690-2695 (2013).
  20. McKenna, S. J., Amaral, T., Akbar, S., Jordan, L., Thompson, A. Immunohistochemical analysis of breast tissue microarray images using contextual classifiers. J Pathol Inform. 4, S13 (2013).
  21. Pages, F., et al. Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer. N Engl J Med. 353, 2654-2666 (2005).
  22. Komiya, A., et al. Application of a new technique, spiral tissue microarrays constructed using needle biopsy specimens, to prostate cancer research. Int J Oncol. 44, 195-202 (2014).
  23. Quintayo, M. A., et al. Virtual tissue microarrays: A novel and viable approach to optimising tissue micro-arrays for biomarker research applied to Ductal Carcinoma in Situ (DCIS). Histopathology. 2-8 (2014).
  24. Torata, N., et al. Tissue tablet method: an efficient tissue banking procedure applicable to both molecular analysis and frozen tissue microarray. Hum Pathol. 45, 143-152 (2014).
En næste-generations Tissue Microarray (ngTMA) Protokollen til biomarkør Studies
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).More

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter