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Medicine

Biomarker अध्ययन के लिए एक अगली पीढ़ी के ऊतक माइक्रोएरे (ngTMA) प्रोटोकॉल

doi: 10.3791/51893 Published: September 23, 2014

Summary

प्रोटोकॉल biomarker अनुसंधान के लिए निर्माण और ऊतक की गुणवत्ता का अनुकूलन करना है. यह योजना और डिजाइन, डिजिटल पैथोलॉजी, आभासी स्लाइड एनोटेशन, और स्वचालित ऊतक arraying के पहलुओं को भी शामिल है.

Abstract

Biomarker अनुसंधान ऊतक (टीएमए) पर निर्भर करता है. Tmas एक 'प्राप्तकर्ता' ब्लॉक में एक 'दाता' ब्लॉक से छोटे ऊतक कोर के दोहराया स्थानांतरण द्वारा निर्मित और फिर biomarker आवेदनों की एक किस्म के लिए उपयोग किया जाता है. पारंपरिक tmas का निर्माण श्रम, गहन imprecise, और समय लेने वाली है. इधर, अगली पीढ़ी के ऊतक का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल (ngTMA) उल्लिखित है. ngTMA TMA योजना और डिजाइन, डिजिटल पैथोलॉजी, और स्वचालित ऊतक microarraying पर आधारित है. प्रोटोकॉल 134 मेटास्टैटिक कोलोरेक्टल कैंसर रोगियों का एक उदाहरण का उपयोग करते हुए यह साफ है. , ऊतकीय सांख्यिकीय और सैन्य पहलुओं ऐसे TMA, TMA प्रतियों के ऊतक धब्बे, नमूना आकार, सांख्यिकीय विश्लेषण की संख्या, और संख्या में शामिल करने के लिए ऊतक प्रकार, विशिष्ट ऊतकीय क्षेत्रों, और प्रकार की कोशिकाओं के रूप में, माना जाता है. प्रत्येक रोगी के लिए ऊतकीय स्लाइड स्कैन और एक वेब आधारित डिजिटल प्लेटफार्म पर अपलोड कर रहे हैं. वहां उन्हें देखा और एन कर रहे हैंotated एक 0.6-2.0 मिमी व्यास उपकरण, ऊतक क्षेत्रों भेद करने के लिए विभिन्न रंगों के प्रयोग से कई बार उपयोग कर (चिह्नित). दाता ब्लॉक और 12 'प्राप्तकर्ता' ब्लॉक साधन में लोड कर रहे हैं. डिजिटल स्लाइड लिया और दाता ब्लॉक छवियों मिलान कर रहे हैं. एनोटेट क्षेत्रों के दोहराया arraying स्वतः एक ngTMA में जिसके परिणामस्वरूप किया जाता है. इस उदाहरण में, छह ngTMAs छह विभिन्न प्रकार के ऊतकों / ऊतकीय क्षेत्रों युक्त योजना बनाई है. NgTMAs की दो प्रतियां वांछित हैं. स्कैन कर रहे हैं प्रत्येक रोगी के लिए चार स्लाइड को तीन; 3 स्कैन रन आवश्यक और रात भर प्रदर्शन कर रहे हैं. सभी स्लाइड एनोटेट कर रहे हैं; अलग अलग रंग अलग ऊतकों / क्षेत्रों, अर्थात् ट्यूमर केंद्र, आक्रमण सामने, ट्यूमर / स्ट्रोमा, लिम्फ नोड मेटास्टेसिस, यकृत मेटास्टेसिस, और सामान्य ऊतक का प्रतिनिधित्व करने के लिए उपयोग किया जाता है. 17 एनोटेशन / मामला बना रहे हैं; टिप्पणी के लिए समय 2-3 मिनट / मामला है. 12 ngTMAs 4556 स्पॉट युक्त उत्पादन कर रहे हैं. समय arraying 15-20 घंटा है. कारण इसकी सटीक, लचीलापन और गति के लिए, ngTMA एक शक्तिशाली हैआगे tmas की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए उपकरण नैदानिक ​​और शोधों में इस्तेमाल किया.

Introduction

पिछले दो दशकों में, ऊतक (tmas) biomarker जांच के अध्ययन पर एक उल्लेखनीय प्रभाव पड़ा है. Tmas आयल एम्बेडेड 'दाता' ब्लॉक से एक भी टीएमए 'प्राप्तकर्ता' ब्लॉक में, अनिवार्य रूप से (चित्रा 1) आमतौर पर व्यास में 0.6 से 2.0 मिमी से आकार में लेकर छोटे ऊतक कोर के दोहराया स्थानांतरण, द्वारा निर्मित ऊतक "अभिलेखागार" हैं 1. एक छोटे मूल आकार का उपयोग करना, कुछ या कई अलग अलग मरीजों से लगभग 500 विभिन्न ऊतकों स्पॉट एक TMA 2 में arrayed जा सकता है.

शकुन या भविष्य कहनेवाला biomarker के अध्ययन के लिए tmas का उपयोग कई फायदे हैं. Immunohistochemistry द्वारा एक प्रोटीन बायोमार्कर की अभिव्यक्ति 450 रोगियों पर मूल्यांकन किया जाना है जहां उदाहरण पर विचार करें. बल्कि ब्लॉक के एक ही नंबर से sectioned 450 रोगी स्लाइड पर 450 immunohistochemical दाग प्रदर्शन से, प्रत्येक नमूने से छोटे कोर एक भी टी पर arrayed जा सकता हैएमए ब्लॉक. एकाधिक कोर प्रत्येक व्यक्ति के मरीज से लिया जाता है, भले ही ब्लॉक के एक न्यूनतम संख्या का उत्पादन कर रहे हैं. यह काफी लागत और अन्य संसाधनों ह्रासमान के साथ ही ऊतक बर्बाद कर कम करने का काफी प्रभाव पड़ता है. ऊतकों की एक बड़ी संख्या का उपयोग कर ही यह उचित संचालित करने की अनुमति देता पढ़ाई एक ही प्रयोगात्मक शर्तों के तहत मूल्यांकन किया जाना.

Tmas कई अलग अलग आवेदन किया है. उदाहरण के लिए, वे आकृति विज्ञान, प्रोटीन अभिव्यक्ति, आरएनए अभिव्यक्ति और विभिन्न रंगों के साथ धुंधला निम्नलिखित डीएनए aberrations अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या स्वस्थानी संकरण 3-7 में immunohistochemistry या वर्णजनीय और भी प्रतिदीप्ति के बाद. हाल के अध्ययनों से भी, धुंधला प्रोटोकॉल में अंतर और interlaboratory भिन्नता का परीक्षण विशिष्टता या विशिष्ट जीन म्यूटेशन के लिए एंटीबॉडी की संवेदनशीलता की स्थापना, और अंतरराष्ट्रीय सहयोग में प्रोटीन अभिव्यक्ति की interobserver reproducibility निर्धारित करने के लिए tmas का इस्तेमाल किया है

रोगी व्युत्पन्न ऊतकों का उपयोग पारंपरिक tmas का निर्माण एक लंबी बहु कदम प्रक्रिया (चित्रा 2) है. यह वे प्राप्त कर रहे हैं, जहां से एक पैथोलॉजी संस्थान, या अन्य संस्थान में एक संभव उचित मामलों के लिए खोज और अभिलेखागार से नैदानिक ​​स्लाइड्स के चयन के साथ शुरू होता है. रोगविज्ञानी मामले के अनुसार प्रत्येक स्लाइड का मूल्यांकन करता है और अध्ययन के प्रयोजनों के लिए सबसे अधिक प्रतिनिधि स्लाइड का चयन करता है. इसके बाद, ब्याज के क्षेत्र खुर्दबीन के नीचे सीधे एक पेन का उपयोग कर के रूप में चिह्नित है. यह अक्सर चुनौतीपूर्ण और imprecise है और केवल ऊतक घूंसे से लिया जाना चाहिए जहां के एक "अनुमान" में यह परिणाम है. इसके बाद, इन चिह्नित स्लाइड को इसी आयल ब्लॉक संग्रह से प्राप्त कर रहे हैं. ब्लॉक और स्लाइड के बीच एक त्वरित तुलना किया जाता है. एक स्वचालित अर्द्ध या घर का बना ऊतक arrayer का उपयोग करना, दाता ब्लॉक ब्याज की अनुमानित क्षेत्र में बाहर मुक्का मारा है और एक प्राप्तकर्ता TMA ब्लॉक में स्थानांतरित. इस arraying तकनीक का उपयोग tmas का निर्माण श्रम गहन, समय लेने वाली है, imprecise, और अनम्य है. 3 प्रतियों में 475 स्थानों में से एक TMA तैयारी काम के बारे में 84 घंटे लग जाने का अनुमान है.

योजना और डिजाइन (या परामर्श), ऊतक विज्ञान में विशेषज्ञता और स्वचालित टीएमए 12 arraying के साथ संयुक्त डिजिटल पैथोलॉजी: tmas का निर्माण करने के लिए एक नया दृष्टिकोण हाल ही में पैथोलॉजी संस्थान, तीन घटकों पर निर्भर करता है कि बर्न विश्वविद्यालय द्वारा शुरू की गई थी. साथ में, इस अवधारणा को अगली पीढ़ी के ऊतक माइक्रोएरे (ngTMA) कहा जाता है. नीचे, ngTMA के लिए एक प्रोटोकॉल मेटास्टैटिक कोलोरेक्टल कैंसर के साथ 134 रोगियों का एक उदाहरण के आधार पर वर्णित है. इधर, प्राथमिक ट्यूमर के साथ ही लिम्फ नोड मेटास्टेसिस और जिगर metastases बाद biomarker विश्लेषण के लिए ngTMAs में arrayed हो रहे हैं. इसके अतिरिक्त, प्रत्येक रोगी से छोटे ऊतक कोर भविष्य न्यूक्लिक एसिड निकासी के लिए वांछित हैं.

Protocol

नोट: इस अध्ययन Insel अस्पताल, बर्न, स्विट्जरलैंड (07-10-13) के स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है. ऊतकों ट्यूमर बैंक पैथोलॉजी के बर्न, संस्थान, बर्न विश्वविद्यालय से प्राप्त किया गया.

1 योजना और डिजाइन (परामर्श)

  1. अनुसंधान प्रश्न के बारे में सोचने के जवाब हो. प्रकार के ऊतकों पर फैसला परियोजना में शामिल किया जाना है. ऊतकीय संरचनाओं सवाल का जवाब करने के लिए महत्वपूर्ण क्या कर रहे हैं निर्धारित करते हैं.
  2. सबसे उपयोगी कोर व्यास और परियोजना के लिए रोगी के प्रति कोर की संख्या का पता लगाएं. बायोमार्कर की राशि के आधार पर अगली पीढ़ी के ऊतक माइक्रो ऐरे (ngTMA) की प्रतियों की संख्या पर फैसला जांच की जाए.
  3. ऊतक माइक्रोएरे (टीएमए) का निर्माण होने के बाद इस तरह के नमूने का आकार और विश्लेषण के रूप में सांख्यिकीय पहलुओं पर विचार करें. अध्ययन में शामिल किए जाने के लिए मरीजों की संख्या का निर्धारण और सरणी के लिए नियंत्रण ऊतकों की स्थापना.
  4. ऊतकीय निकालते हैं (यानैदानिक) Haematoxylin और eosin (एच एंड ई) प्रत्येक मरीज की स्लाइड. संक्षेप में स्लाइड्स की समीक्षा करने और परियोजना के लिए प्रासंगिक जानकारी और ऊतक विज्ञान युक्त लोगों की पहचान.
    नोट: विशेष दाग या immunohistochemistry स्लाइड स्लाइड स्कैनिंग और एनोटेशन के लिए वांछित है बजाय एच एंड ई स्लाइड की, पैराफिन ब्लॉकों के नए वर्गों करें

2 स्लाइड स्कैन

  1. पीसी और स्लाइड स्कैनर और खुले स्कैनिंग सॉफ्टवेयर ऑन करें. पूर्वावलोकन स्क्रीन से उज्जवल क्षेत्र स्कैनिंग के लिए "स्वचालित मोड" का चयन करें.
  2. स्लाइड गुणवत्ता मानकों समायोजित करने के लिए "स्कैन विकल्प" पर क्लिक करें. इस समय, स्लाइड्स सीधे वेब से या एक स्थानीय ड्राइव (या बाहरी ड्राइव) के लिए सुलभ डिजिटल प्लेटफार्म को स्कैन करने के लिए कर रहे हैं कि क्या चयन और स्कैनिंग और ध्यान केंद्रित अंक की संख्या के प्रकार निर्धारित किया है.
  3. "मामला केंद्र" को स्कैन करने के लिए "सर्वर पैरामीटर" पर क्लिक करें. इस चरण में, अधिक पत्रिकाओं जोड़ने सभी स्लाइड लेबल और सेटस्लाइड संग्रहित किया जाना चाहिए जहां मामला केंद्र में फ़ोल्डर. एक पत्रिका के 25 स्लाइड के लिए ऊपर रखती है.
  4. चेक गुणवत्ता / स्कैनिंग के लिए वास्तविक ऊतकीय स्लाइड्स की सफाई. 70% इथेनॉल के साथ आवश्यक, स्वच्छ स्लाइड हैं.
  5. लेबल आवक ओर इशारा करते हुए के साथ पत्रिका के अनुसार 25 स्लाइडों को लोड (चित्रा 3A)
  6. स्कैनर में पत्रिका रखें. एक से अधिक पत्रिका के लिए, एक दूसरे के ऊपर पर उन्हें जगह है.
  7. ग्रीन एरो (3B चित्रा) पर क्लिक करके स्लाइड स्कैनिंग शुरू. सभी स्लाइड स्कैन कर रहे हैं, पत्रिकाओं उतारना और कार्यक्रम, पीसी और स्लाइड स्कैनर बंद.

3 डिजिटल स्लाइड एनोटेशन

  1. डिजिटल स्लाइड प्रबंधन केंद्र के लिए ब्राउज़र पता दर्ज करें और फ्री डिजिटल स्लाइड दर्शक सॉफ्टवेयर डाउनलोड.
  2. डिजिटल स्लाइड दर्शक सॉफ्टवेयर खोलें और डिजिटल स्लाइड्स (चित्रा -4 ए) युक्त फ़ोल्डर का चयन करें.
  3. , नोट्स जोड़ें पुन: व्यवस्थित और Digita का प्रबंधनएल स्लाइड फ़ोल्डर या सहकर्मियों को उपयोगकर्ता अधिकार असाइन या फ़ोल्डर में संलग्नक जोड़ें.
  4. डिजिटल स्लाइड दर्शक में प्रकट होता है जो वांछित डिजिटल स्लाइड पर क्लिक करें.
  5. बढ़ाई उपकरण का उपयोग, स्लाइड मूल्यांकन और ngTMA में एकीकरण के लिए हित के क्षेत्रों को खोजने के.
  6. 'टीएमए एनोटेशन उपकरण' का प्रयोग, वांछित कोर के आकार और एनोटेशन के रंग का चयन करें. (चित्रा 4 बी) पर क्लिक करके डिजिटल स्लाइड पर एनोटेशन रखें.
  7. NgTMA (चित्रा 4C) में शामिल करने के लिए वांछित ऊतकीय संरचनाओं के लिए एनोटेशन ले जाएँ.
  8. एक मूल आकार और एक वांछित टिप्पणी का रंग, एनोटेशन उपकरण का उपयोग कर चयन करके फिर से टिप्पणी की इस प्रक्रिया को दोहराएं. फ़ोल्डर में सभी स्लाइड्स पर स्लाइड देखने और एनोटेशन दोहराएँ.
  9. वैकल्पिक रूप से, TMA में 0.2 मिलीलीटर ट्यूब के बजाय एकीकरण में पीसीआर के लिए ऊतक कोर जगह है. पहचान करने के लिए एक अलग रंग का उपयोग स्लाइड व्याख्याआगे आणविक विश्लेषण के लिए इन स्थानों.
  10. उनके इसी एनोटेशन और रंगों के साथ सभी मामलों की एक सूची बनाएं.

4 ऊतक माइक्रोएरे निर्माण

  1. ऊतक microarraying के लिए वांछित क्रम में ब्लॉक प्रकार, सभी एनोटेट डिजिटल स्लाइड के लिए इसी आयल ऊतक ब्लॉक निकालते हैं.
  2. ऊतक ब्लॉक 4 मिमी मोटाई की एक न्यूनतम है कि सुनिश्चित करें. यदि नहीं, ऊतक के reembedding आवश्यक है.
  3. और स्वचालित ऊतक microarrayer साधन "पर" पीसी बारी. ऊतक microarrayer सॉफ्टवेयर खोलें और इस परियोजना के लिए एक नाम प्रदान
  4. एक "उपकरण बदलने" प्रदर्शन और परियोजना के लिए आवश्यक उपकरण व्यास का चयन (यानी, 0.6, 1.0, 1.5, या 2.0 मिमी).
  5. मशीन में 12 'प्राप्तकर्ता' टीएमए ब्लॉकों को लोड. 12 ब्लॉकों में से प्रत्येक के लिए एक आईडी दे
  6. प्रत्येक प्राप्तकर्ता ब्लॉक के लिए एक TMA लेआउट बनाएँ. पंक्तियाँ, कॉलम, और समाप्त करने की संख्या के साथ एक TMA डिजाइन निरीक्षणवाई लाइनों के साथ ही कोर के बीच की दूरी. प्रत्येक प्राप्तकर्ता ब्लॉक के लिए एक नए लेआउट बनाने के लिए या बार बार एक ही लेआउट का उपयोग करें.
  7. पहले कोर लेने के लिए प्राप्तकर्ता ब्लॉक लेआउट पर कर्सर रखें.
  8. अगला, ऊतक microarrayer (चित्रा 5A) में 60 दाता ब्लॉकों को लोड. प्रत्येक ब्लॉक में एक दाता आईडी दे एफ के लिए प्रत्येक पंक्ति एक में दस ब्लॉकों रखें. ऊतक microarrayer द्वारा स्वचालित रूप से अधिग्रहीत कंप्यूटर स्क्रीन पर प्रत्येक दाता ब्लॉक की छवियों को ध्यान से देखें.
  9. पहले ब्लॉक के साथ शुरू, "स्लाइड" पर क्लिक करें. डिजिटल स्लाइड दर्शक का उपयोग कर डिजिटल स्लाइड प्रबंधन केंद्र में (या बाहरी ड्राइव पर) संग्रहीत एनोटेट डिजिटल स्लाइड का निरीक्षण करें. दाता ब्लॉक की छवि और डिजिटल स्लाइड पक्ष द्वारा साइड देखें.
  10. ब्लॉक छवि पर चयन संदर्भ अंक डिजिटल स्लाइड के साथ दाता ब्लॉक छवि मिलाना
  11. "अगला" क्लिक करने के बाद, ब्लॉक की एक बड़ी छवि पर एनोटेशन निरीक्षण करते हैं. (चित्रा 5 ब </ Strong>). पुष्टि और "प्रारंभ" क्लिक करने के लिए एनोटेशन के शीर्ष पर क्लिक करें.
    नोट: यह चयनित प्रारंभिक बिंदु पर प्राप्तकर्ता ब्लॉक में व्यास में 0.6 मिमी की एक छेद ड्रिलिंग शुरू करने के लिए ऊतक microarrayer संकेत देता है. फिर एक दूसरे चरण में, छिद्रण उपकरण का उपयोग कर, साधन सटीक एनोटेट और पुष्टि की क्षेत्र में चयनित दाता ब्लॉक से ऊतकों में छेद घूंसे. कोर फिर प्राप्तकर्ता ब्लॉक करने के लिए दाता से स्थानांतरित कर रहे हैं.
  12. लगभग 500 कोर के बाद, XYLENE की एक झाड़ू का उपयोग ड्रिल और छिद्रण उपकरण साफ.
  13. ऊतक कोर (बल्कि एक ngTMA में घूंसे से) वांछित हैं, तो, ब्लॉक के लिए "पीसीआर" उपकरण पर क्लिक करें 4 एनोटेशन अप करने के लिए की पुष्टि करें और हिट "प्रारंभ". यह पंच और एक 0.2 मिलीलीटर ट्यूब में कोर स्थानांतरण होगा.
  14. दोहराएँ बिंदु दूसरा दाता ब्लॉक के साथ 4.9-4.11, और इतने पर.
  15. सभी दाता ब्लॉकों का उपयोग करने के बाद, ऊतक माइक्रोएरे में दाता ब्लॉक के एक दूसरे दौर (61-120) दर्जएर और कदम 4.8-4.11 जारी है.
  16. परियोजना प्रगति ड्रिलिंग और छिद्रण (चित्रा 5C) उत्पन्न हो रही है, जबकि जबकि दाता और प्राप्तकर्ता ब्लॉक छवियों को ताज़ा करें.
  17. परियोजना पूर्ण होने के बाद एक "निर्यात" प्रदर्शन करना. दाता और प्राप्तकर्ता ब्लॉक आईडी के साथ .xslx फ़ाइल की स्थिति जानें, निर्यात फ़ोल्डर में TMA भीतर सभी घूंसे के साथ ही TMA लेआउट / डिजाइन के स्थानीयकरण,. निर्यात फ़ोल्डर (चित्रा 5D) में तस्वीरें छवियों के रूप में सभी आरोपित एनोटेशन के साथ सभी दाता ब्लॉक छवियों को बचाओ. अंतिम TMA ब्लॉक फिर तैयार है.

Representative Results

योजना और डिजाइन

यहाँ बायोमार्कर की एक विशेष श्रृंखला के लिए जांच की जा रही है कि मेटास्टेटिक कोलोरेक्टल कैंसर के साथ 134 रोगियों का उदाहरण इस्तेमाल किया गया था. इतना ही नहीं एक ngTMA इन रोगियों के लिए योजना बनाई है, लेकिन डीएनए निष्कर्षण कुछ निर्दिष्ट जीन के लिए mutational विश्लेषण द्वारा पीछा किया जाता है.

NgTMA की योजना और डिजाइन चरण के दौरान, निम्नलिखित पहलुओं का निर्णय लिया गया है. प्रत्येक मरीज से, 6 अलग ऊतकीय क्षेत्रों की जांच की जाएगी: ट्यूमर केंद्र, ट्यूमर आक्रमण सामने, सघनतम ट्यूमर के क्षेत्रों (ट्यूमर / stroma बातचीत), सामान्य ऊतक, लिम्फ नोड मेटास्टेसिस और जिगर metastases नवोदित. ट्यूमर के ऊतक क्षेत्र के अनुसार तीन ट्यूमर धब्बे और दो सामान्य ऊतक स्पॉट परियोजना (एन = रोगी प्रति 17 धब्बे) में शामिल हो रहे हैं. यह 50 से अधिक बायोमार्कर इस मरीज सामग्री पर जांच की जानी है कि योजना बनाई है, अंतिम ngTMA की दो प्रतियां वांछित हैं. कारण लिम्फ नोड और distan के संभावित छोटे आकार के लिएटी मेटास्टेसिस, सभी ऊतकों के लिए TMA निर्माण के लिए 0.6 मिमी की एक छोटी कोर व्यास चुना है.

इसके अतिरिक्त, यह अलग ऊतकीय क्षेत्रों युक्त 6 ngTMAs उत्पादन किया जाएगा इतना है कि प्रत्येक क्षेत्र के लिए अलग से, arrayed किया कि योजना बनाई है: एक ngTMA एक) ट्यूमर केंद्र से ऊतकों युक्त, ख) आक्रमण सामने, ग) ट्यूमर नवोदित क्षेत्रों, घ) सामान्य ऊतक , ई) लिम्फ नोड मेटास्टेसिस, और एफ) यकृत मेटास्टेसिस.

एक 0.6 मिमी उपकरण का उपयोग TMA डिजाइन के लिए, घूंसे के बीच 0.4 मिमी की एक सहज दूरी का चयन किया जाएगा. लंबी पंक्तियों और स्तंभों में ऊतक स्पॉट का मूल्यांकन अक्सर थकाऊ है, दो अलग अलग डिजाइनों चयनित हैं. ऊतक क्षेत्र के प्रति 3 घूंसे से ट्यूमर ब्लॉक के लिए, छह भागों से युक्त एक डिजाइन बनाया जाता है. यह 402 ऊतक घूंसे की कुल संख्या की ओर जाता है. सामान्य ऊतकों घूंसे के लिए, मामले के अनुसार 2 घूंसे शामिल हो रहे हैं. कुल 432 घूंसे फिटिंग एक लेआउट चुन लिया जाता है.

इसके अलावा, प्रत्येक मामले के लिए, अप करने के लिए 40.6 मिमी कोर साथ ही बाहर मुक्का मारा और 0.2 मिलीलीटर ट्यूब में रखा जाएगा. ये ऊतक कोर भी एनोटेट किया जाएगा.

ट्यूब के लिए रोगी प्रति 4 कोर के अलावा, संक्षेप करने के लिए, विभिन्न ऊतकों के 6 ngTMAs उत्पादन किया जाएगा (1 सामान्य ऊतक सरणी एक्स 2 घूंसे x 134 रोगियों 5 ट्यूमर सरणियों एक्स 3 घूंसे 134 रोगियों x). साथ में ले ली, 2814 एनोटेशन बनाया जाएगा.

अगला, चयनित रोगियों से इसी एच ई स्लाइड स्लाइड संग्रह से प्राप्त कर रहे हैं. प्रत्येक मामले संक्षेप में एक रोगविज्ञानी द्वारा समीक्षा की जाती है और प्रत्येक ऊतक प्रकार के सबसे प्रतिनिधि स्लाइड चयन कर रहे हैं.

स्कैनिंग

प्रत्येक ऊतकीय खंड के डिजिटल स्लाइड भविष्य टिप्पणी के लिए बने हैं. इस अध्ययन के लिए, 3-4 ऊतक स्लाइड संभवतः आसन्न सामान्य ऊतकों, लिम्फ नोड मेटास्टेसिस और यकृत मेटास्टेसिस और एक अतिरिक्त स्लाइड चुनाव के साथ या बिना, यानी मामला, प्राथमिक कोलोरेक्टल कैंसर के प्रति स्कैन करने के लिए कर रहे हैंसामान्य म्यूकोसा taining.

अप करने के लिए 10 विभिन्न पत्रिकाओं पूरी तरह से स्लाइड स्कैनर में लोड किया जा सकता है; इसलिए 250 स्लाइड्स एक ही समय में स्कैन किया जा सकता. स्कैनिंग और डिजिटल स्लाइड आकार के लिए समय ऊतक और वांछित गुणवत्ता कारक के आयामों के साथ बदलता रहता है. यह स्कैन गुणवत्ता के किसी भी ध्यान देने योग्य हानि के बिना एक छोटे स्कैन फ़ाइल आकार का उत्पादन से 0 से यहां 100 के लिए गुणवत्ता कारक पर्वतमाला, 60 की गुणवत्ता कारक, चयनित है. लघु बायोप्सी 30 सेकंड के तहत में स्कैन किया जा सकता है, जबकि 2 के बीच और 10 मिनट का समय लग सकता है इस उदाहरण में इस्तेमाल लोगों की तरह पूरे ऊतक वर्गों,. डिजिटल स्लाइड आकार भी 2 एमबी से 2 जीबी तक हो सकती है. 60 के एक गुणवत्ता कारक का प्रयोग, 600 एमबी और 1 जीबी का उत्पादन कर रहे हैं के बीच स्कैन करता है.

402 के बीच और 536 स्लाइड 3 स्कैनिंग रन के कुल योग इस परियोजना के लिए आवश्यक हैं. प्रत्येक रन रात भर किया जाता है. लगभग भंडारण अंतरिक्ष के 500 जीबी की जरूरत है. स्लाइड्स प्रकरण सेंटर नामक एक डिजिटल प्लेटफार्म पर सीधे स्कैन कर रहे हैं (ngtma.unibe.pathcasecenter). मामला केंद्र नामित यूज़रनेम और पासवर्ड दर्ज करके कहीं भी वेब का उपयोग के साथ से पहुँचा जा सकता है.

एनोटेशन

टिप्पणी के लिए, दो पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए: 1) अलग ऊतक क्षेत्रों विभिन्न टिप्पणियों का रंग दिया जाना चाहिए और 2) एनोटेशन की संख्या अंतिम ngTMA की यात्रा की प्रतियों की संख्या को प्रदर्शित करना चाहिए.

इस मामले में, एक एक प्रति के लिए ट्यूमर क्षेत्र के प्रति 3 स्थानों का चयन किया गया है. 2 प्रतियों के लिए, प्रत्येक क्षेत्र में 6 स्पॉट का उपयोग एनोटेट किया जाना चाहिए. उपयोगी दूर मेटास्टेसिस के लिए लिम्फ नोड मेटास्टेसिस, फ़िरोज़ा के लिए काले और क्षेत्रों होने के लिए अंत में सफेद (ट्यूमर / stroma) बातचीत, नवोदित ट्यूमर के क्षेत्रों के लिए लाल, ट्यूमर आक्रमण सामने के लिए पीला, ट्यूमर केंद्र के लिए नीले, सामान्य ऊतक के लिए हरा कर रहे हैं ट्यूबों के लिए इस्तेमाल किया. प्रत्येक मामले की व्याख्या 2-3 मिनट की आवश्यकता है.

ngTMA निर्माण

इस अध्ययन में 6 ngTMA ब्लॉक टी की आवश्यकताओ 12 अंतिम ब्लॉकों में जिसके परिणामस्वरूप, 2 प्रतियों में निर्माण किया. प्रत्येक ट्यूमर ब्लॉक 402 ऊतक स्पॉट में शामिल होंगे और प्रत्येक सामान्य ऊतक ब्लॉक पूरी परियोजना भर में 4556 स्पॉट कुल 268 धब्बे, शामिल होंगे arrayer द्वारा समर्थन दिया जा सकता है कि प्राप्तकर्ता ब्लॉक की अधिकतम संख्या 12 है.

एक TMA लेआउट प्रत्येक प्राप्तकर्ता ब्लॉक के लिए बनाई गई है और परियोजना (आंकड़े 6A, 6B) सहेजा जाता है. 60 ऊतक ब्लॉक समानांतर में ऊतक microarrayer में लोड किया जा सकता है; प्रत्येक दाता ब्लॉक की एक छवि ले लिया है. पहली दाता ब्लॉक के साथ शुरू, इसी एनोटेट डिजिटल स्लाइड मामला केंद्र से लिया गया है. स्लाइड मिलान 1-3 मिनट के बीच ले जा सकते हैं, जो प्रदर्शन किया है. एनोटेशन पुष्टि कर रहे हैं और arrayer (चित्रा 7) छिद्रण शुरू करने के लिए कहा है. कोर छिद्रण और हस्तांतरण के समय लगभग 12 सेकंड है. इस प्रक्रिया के दौरान कोर के नुकसान कम है. इस परियोजना arraying के लिए कुल समय SLI के लिए समय सहित, लगभग 24 घंटा हैडी / ब्लॉक मिलान और साधन की reloading. NgTMA के कुछ उदाहरण चित्रा 8A में सचित्र हैं. बाद में आणविक विश्लेषण के लिए कोर भी इस समय (चित्रा 8B) पर बाहर मुक्का मारा जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 ए) एक 'दाता' ब्लॉक. दाता ब्लॉक से कोर बाहर मुक्का मारा और बी) एक प्राप्तकर्ता ब्लॉक, या ऊतक माइक्रोएरे (टीएमए) में स्थानांतरित कर रहे हैं.

चित्रा 2
रोगविज्ञानी च को दिया चित्रा 2 पारंपरिक ऊतक माइक्रोएरे कार्यप्रवाह. ए) Histological स्लाइड संग्रह और बी से प्राप्त कर रहे हैं) या समीक्षा. सीडी) एनोटेशन हस्तांतरण के लिए 'अनुमान' क्षेत्र का संकेत स्लाइड्स पर किया जाता है. ई) इसी ऊतक ब्लॉक प्राप्त कर रहे हैं. एफ) ब्लॉक और स्लाइड मिलान के लिए तुलना कर रहे हैं, जो जी सकते हैं) कभी कभी एक चुनौतीपूर्ण काम हो. HJ ) ऊतक microarraying तो लेता है जगह. कश्मीर) कोर बार बार स्थानांतरित कर रहे हैं और एल) एक अंतिम TMA निर्माण किया है.

चित्रा 3
25 स्लाइड के लिए ऊपर चित्रा 3 ए) की गुणवत्ता कारक समायोजन) स्कैनिंग. बी के लिए प्रत्येक पत्रिका में रखा जा सकता है और आकार में बनाया जा सकता है. स्कैनिंग प्रगति पर नजर रखी जा सकती है.

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चित्रा 4 ए) स्कैन स्लाइड वेब आधारित मंच, मामला केंद्र. बी) डिजिटल स्लाइड देखा जा सकता है पर अपलोड किया जा सकता है. टीएमए एनोटेशन उपकरण उपयोगकर्ता एनोटेशन डिजिटल स्लाइड पर सीधे रखा जा सकता है) एनोटेशन. सी के लिए आवश्यक मूल आकार और रंग का चयन करने के लिए अनुमति देता है. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
60 ब्लॉकों के लिए ऊपर 5 चित्रा ए) लिया जाता है ऊतक microarrayer, अर्थात् पंक्ति प्रति 10 दाता ब्लॉक और 12 प्राप्तकर्ताओं ब्लॉक के रूप में अच्छी तरह से. ख) प्रत्येक दाता ब्लॉक की एक छवि में लोड कर सकते हैं, digitaएल स्लाइड लिया गया है. ब्लॉक और स्लाइड का मिलान किया जाता है और एनोटेशन ब्लॉक छिद्रण साधन छिद्रण है जबकि arraying की प्रगति पर नजर रखी जा सकती है. सी). डी) के लिए उपयोग किया जाता है छिद्रण प्रदर्शन किया है, के बाद लेआउट में प्रत्येक स्थान के स्थान का निर्यात लेकिन भी इसी एनोटेशन के साथ प्रत्येक दाता ब्लॉक की एक छवि बना है.

चित्रा 6
चित्रा 6. ये TMA लेआउट ए) ट्यूमर ब्लॉक और बी) के सामान्य ऊतकों arraying के लिए इस्तेमाल किया गया.

चित्रा 7
ऊतक microarrayer सॉफ्टवेयर की चित्रा 7. स्क्रीनशॉट. बाएँ पर, 12 पुनःcipient ब्लॉक साधन में रखा जा सकता है. तल पर, प्रत्येक दाता ब्लॉक के चित्र लिया जाता है. केंद्र, TMA लेआउट में, छिद्रण की प्रगति के साथ ही एनोटेशन के साथ प्रत्येक दाता ब्लॉक के बढ़े हुए छवियों पाया जाता है.

चित्रा 8
8 चित्रा ए) नव निर्मित ngTMA ब्लॉक के कुछ उदाहरण. बी) अतिरिक्त ऊतक घूंसे बाद आणविक विश्लेषण के लिए लिया जा सकता है. ये कोर बाहर मुक्का मारा और 0.2 मिलीलीटर ट्यूब में रखा जाता है.

9 चित्रा
चित्रा ngTMA biomarker अनुप्रयोगों के 9 उदाहरण. कोलोरेक्टल कैंसर में Ki67 की ए) Immunohistochemistry धुंधला. दोहरी महामहिमआर 2 immunohistochemistry / सीटू) कम प्रोटीन (ब्राउन की अभिव्यक्ति) और गुणसूत्रबिंदु (लाल) के लिए HER2 जीन (काला) रिश्तेदार का कोई प्रवर्धन बी दिखा संकरण परख; सी) प्रोटीन (ब्राउन) और HER2 जीन प्रवर्धन की उच्च अभिव्यक्ति ( स्तन कैंसर ngTMA में एकल mRNA टेप दिखा HER2 के स्वस्थानी संकरण में गुणसूत्रबिंदु (लाल). डी) वर्णजनीय को काला) रिश्तेदार. कोलोरेक्टल कैंसर में सीडी 8 के लिए ई) Immunohistochemistry. एफ) अखिल cytokeratin मार्कर AE1 / AE3 (ब्राउन के लिए डबल immunohistochemistry दाग, ट्यूमर कोशिकाओं) और CD68 (लाल;. मैक्रोफेज) कोलोरेक्टल कैंसर में ट्यूमर microenvironment पर प्रकाश डाला इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

इस पत्र में, ngTMA के लिए एक प्रोटोकॉल उल्लिखित है. ngTMA योजना और डिजाइन, डिजिटल पैथोलॉजी और स्लाइड एनोटेशन शामिल ऊतक microarraying के रूप में अच्छी तरह से स्वचालित ऊतक microarraying 12 के लिए एक नव स्थापित अवधारणा है.

पारंपरिक ऊतक microarraying की तुलना में, ngTMA कई लाभ प्रदान करता है. पहले कदम में, योजना और डिजाइन चरण के लिए महत्वपूर्ण है. फोकस एक लक्षित अनुसंधान सवाल का जवाब देने पर है. यह ध्यान में रखना चाहिए ऊतकीय मुद्दों (जैसे, कितने धब्बे मैं चाहता है जो क्षेत्रों और शामिल करने के लिए?), सांख्यिकीय नियोजन (जैसे, नमूना आकार? मैं बाद में मेरे नमूनों का विश्लेषण करते हैं?) और साजो विचारों (जैसे, कैसे कई बायोमार्कर और इसलिए कितने ngTMA प्रतियां?). एक विशिष्ट ngTMA यह biomarker स्क्रीनिंग और उच्च throughput के लिए है कि क्या, विशिष्ट जरूरतों के लिए बनाया है या केवल कुछ अच्छी तरह से चयनित कैस पर विशिष्ट ऊतकीय पहलुओं का अध्ययन करने का इरादा हैतों.

एक, यदि नहीं, तो पारंपरिक ऊतक microarraying का सबसे महत्वपूर्ण नुकसान ऊतकीय स्लाइड्स पर निशान बना रहे हैं, जिसके साथ कम सटीकता है. विशिष्ट ऊतकीय संरचनाओं, कोशिकाओं या क्षेत्रों का अध्ययन लगभग असंभव बना दिया है. एनोटेशन डिजिटल स्लाइड पर सीधे रखा जाता है क्योंकि ngTMA उच्च सटीकता के लिए अनुमति देता है. यह ठीक क्षेत्रों का चयन करने के शोधकर्ता विशिष्ट कोशिकाओं सहित, मुक्का मारा जा करने के लिए अनुमति देता है. इस उदाहरण में, एक ही ऊतक ब्लॉक के भीतर विभिन्न क्षेत्रों में इस तरह के छोटे ट्यूमर सेल समूहों या यहां तक ​​कि एकल कक्षों की मौजूदगी से प्रकाश डाला ट्यूमर केंद्र, आक्रमण के सामने और ट्यूमर / stroma बातचीत के क्षेत्रों के रूप में, arraying के लिए बाहर मुक्का मारा जाता है. यह सटीकता केवल ngTMA का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. स्लाइड एक वेब आधारित डिजिटल प्लेटफार्म पर स्कैन कर रहे हैं क्योंकि तीसरे,, देखने के लिए स्लाइड और टिप्पणी कंप्यूटर के माध्यम से करने के बजाय माइक्रोस्कोप के साथ बनाया जा सकता है. ऊतक arraying सॉफ्टवेयर एक उपयोगकर्ता के अनुकूल प्रदान करता हैएक लचीलेपन के उच्च डिग्री, इसलिए विभिन्न लेआउट और ngTMA डिजाइन के साथ इंटरफेस प्राप्त किया जा सकता है. टीएमए निर्माण ड्रिलिंग द्वारा स्वचालित रूप से किया जाता है के बाद से, हाथों पर चालों और निर्माण के लिए समय की मात्रा काफी कम है के लिए थोड़ा की जरूरत है. यहाँ इस उदाहरण में TMA निर्माण के लिए समय 24 घंटा के बीच है. एक पारंपरिक TMA दृष्टिकोण का प्रयोग और घंटा प्रति 15 घूंसे आकलन, इस परियोजना में लगभग 304 घंटे लगेंगे.

ngTMA प्रोटीन अभिव्यक्ति, mRNA या डीएनए के साथ ही इन के संयोजन का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है. 9 संभावित बायोमार्कर के लिए इन आवेदनों में से कई दिखाता चित्रा. मानक immunohistochemistry की-67 का उपयोग कैंसर के प्रसार सूचकांक का निर्धारण करने के लिए लागू किया जा सकता है. ऐसे HER2 के रूप में जीनों के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति और डीएनए प्रवर्धन की जांच के लिए एक संयुक्त दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया जा सकता है. ऊतकों लागत, ऊतक के उपयोग और अन्य संसाधन कम करने के लिए एक एकल ngTMA पर एक साथ इकट्ठा किया जा सकता हैएस. इसके अलावा, HER2 और अन्य जीनों के लिए स्वस्थानी संकरण में वर्णजनीय mRNA ऊतक स्लाइड्स की एक न्यूनतम संख्या का उपयोग कर मामलों की एक बड़ी संख्या में एकल mRNA टेप की पहचान करने के लिए किया जा सकता है. ऐसी सीडी 8 के रूप में प्रतिरक्षा मार्करों के Immunohistochemistry ट्यूमर microenvironment के संदर्भ में देखे जा सकते हैं. डबल immunohistochemistry भी इस तरह के कैंसर के आक्रमण के सामने (भूरे रंग में लेबल) प्रतिरक्षा (लाल रंग में लेबल) कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं के बीच बातचीत के रूप में ब्याज की विशेष क्षेत्रों को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ब्याज के इस तरह के एक क्षेत्र में पारंपरिक ऊतक microarraying का उपयोग कर लिया गया है नहीं कर सका.

बहरहाल, इस प्रोटोकॉल कुछ सीमाएं शामिल हैं. सबसे महत्वपूर्ण चुनौती दाता ब्लॉक और डिजिटल स्लाइड के बीच ओवरलैप है. कई कारकों इस कदम को प्रभावित कर सकते हैं. सबसे पहले, ब्लॉक से नवीनतम अनुभाग स्लाइड स्कैनिंग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. कई मामलों में, एच एंड ई दाता ब्लॉक, अधिक तत्पर के अंतिम खंड नहीं हैअनुसंधान यह एक immunohistochemical या अन्य दाग है. पिछले दाग स्कैन और एनोटेट या एक नया एच ई बनाया जाना चाहिए है के रूप में इस मामले में, यह भी एक दाग स्लाइड के रूप में लंबे समय तक इस्तेमाल किया जा सकता है. ऊतकों स्लाइड और ब्लॉक का चुनौतीपूर्ण मिलान की ओर जाता है जो पानी के स्नान में विस्तार कर सकते हैं के रूप में ऊतक वर्गों किए जा रहे हैं जब ख्याल भी रखा जाना चाहिए. दूसरे, पल में परियोजनाओं को एक ही समय में संसाधित 12 प्राप्तकर्ता TMA ब्लॉक करने के लिए सीमित कर रहे हैं. 12 tmas से अधिक बड़ी परियोजनाओं को एक दूसरी परियोजना के नाम को सौंपा जाना चाहिए. तीसरा, दाता ब्लॉक विभिन्न आकारों के लिए खुद को समायोजित नहीं कर सकते साधन के रूप में मानक के नए नए साँचे और कैसेट का उपयोग किया जाना चाहिए. अंत में, दाता ब्लॉक इष्टतम ड्रिलिंग प्राप्त करने के लिए कम से कम ऊंचाई (4 मिमी) से अधिक होना चाहिए. कुछ मामलों में, यह ऊतकों की reembedding की आवश्यकता है.

पिछले कुछ वर्षों में प्रकाशन के सैकड़ों biomarker अनुसंधान के लिए एक अमूल्य उपकरण के रूप में TMA पर प्रकाश डाला. Tmas फेफड़ों 13, कोलोरेक्टल 7, BRE अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैAST 14, प्रोस्टेट 15, अग्न्याशय 16, मूत्राशय 17, और गैस्ट्रिक 18 तरह के कैंसर, कुछ नाम हैं. लेखकों की संख्या बढ़ रही छवि विश्लेषण और महत्वपूर्ण प्रगति इस दिशा 19-21 में किए जा रहे हैं साथ tmas का उपयोग संयुक्त है. हालांकि, अभिनव TMA विचारों 22-24 प्रकाशित किया है कि अनुसंधान समूहों में से एक मुट्ठी के बगल में, थोड़ा ध्यान TMA तकनीक ही अनुकूलन करने के लिए दिया गया है. ऐसे अता-27 Estigen / बीचर द्वारा के रूप में स्वचालित ऊतक microarrayers, लेआउट डिजाइन और समीचीन और स्वचालित ऊतक छिद्रण प्रदान करते हैं. हालांकि यह ngTMA अवधारणा का केवल 1 पहलू का प्रतिनिधित्व करता है.

ngTMA पारंपरिक ऊतक microarraying तकनीक से काफी सुधार है. यह डिजिटल पैथोलॉजी का लचीलापन और गति और स्वचालित TMA निर्माण की विश्वसनीयता के साथ डिजिटल एनोटेशन की परिशुद्धता के साथ ऊतक विज्ञान और टीएमए डिजाइन में विशेषज्ञता को शामिल किया गया. ngTM का संयोजनप्रोटीन और आणविक बायोमार्कर के मूल्यांकन के लिए एक और छवि विश्लेषण आगे भविष्य में नैदानिक ​​और translational अनुसंधान की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण होगा.

Acknowledgments

लेखकों translational रिसर्च यूनिट के तकनीकी कर्मचारियों को धन्यवाद देना चाहूंगा; मैरी Economou, जोस Galvan, कैरोलीन हथौड़ा, डोमिनिक मुलर, Liliane Schöni और पैथोलॉजी संस्थान में सूचना विज्ञान टीम, बर्न विश्वविद्यालय.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pannoramic 250 Flash II 3DHistech Slide scanner
TMA Grandmaster 3DHistech Tissue Microarrayer
Pannoramic Viewer 3DHistech free Slide viewing software
Case Center 3DHistech Digital slide platform

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Biomarker अध्ययन के लिए एक अगली पीढ़ी के ऊतक माइक्रोएरे (ngTMA) प्रोटोकॉल
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Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).More

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).

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